JP3071857B2 - グルコキナーゼの精製法 - Google Patents
グルコキナーゼの精製法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ザイモモナス属又はバ
チルス属に属する微生物菌体より得ることができる産業
上有用な酵素の１つであるグルコキナーゼを、アフィニ
ティークロマトグラフィーを行うことにより、簡単にか
つ高純度に精製する方法に関するものである。
チルス属に属する微生物菌体より得ることができる産業
上有用な酵素の１つであるグルコキナーゼを、アフィニ
ティークロマトグラフィーを行うことにより、簡単にか
つ高純度に精製する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から、微生物菌体より酵素を採取す
るには、菌体を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−又
はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース、
吸着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイ
ト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に
架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲル
等を種々組み合わせるという煩雑な工程をへていた。そ
のため、製品としての酵素を得るまでに日数がかかるだ
けでなく、クロマトグラフィーの回数が増えることによ
り酵素の回収率の低下が生じていた。
るには、菌体を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−又
はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース、
吸着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイ
ト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に
架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲル
等を種々組み合わせるという煩雑な工程をへていた。そ
のため、製品としての酵素を得るまでに日数がかかるだ
けでなく、クロマトグラフィーの回数が増えることによ
り酵素の回収率の低下が生じていた。
【０００３】最近では、これらカラムクロマトグラフィ
ーの組み合せをできるだけ少なくするために、目的の酵
素を特異的に吸着するようなクロマトグラフィー担体を
用いる、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーを
利用し、それにより比較的短い日数で酵素を精製する方
法も開発されている。
ーの組み合せをできるだけ少なくするために、目的の酵
素を特異的に吸着するようなクロマトグラフィー担体を
用いる、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーを
利用し、それにより比較的短い日数で酵素を精製する方
法も開発されている。
【０００４】例えば、特許公表昭６１−５００２９９号
公報には、プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（商品名）
（一般名：リアクティブレッド８）をセファロースＣＬ
−４Ｂ（商品名）に結合させたアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤が，ザイモモナス・モビリス抽出液よ
りのグルコキナーゼを特異的に，高収率で単離精製でき
ることを示している。
公報には、プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（商品名）
（一般名：リアクティブレッド８）をセファロースＣＬ
−４Ｂ（商品名）に結合させたアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤が，ザイモモナス・モビリス抽出液よ
りのグルコキナーゼを特異的に，高収率で単離精製でき
ることを示している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記の特許公表に記載
の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用に
よりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なくし、
収率よく酵素を精製するという点で優れているが、アフ
ィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価であ
るため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
いかに特異的に、かつ大量の目的酵素を吸着させるかと
いう点に問題があった。
の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用に
よりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なくし、
収率よく酵素を精製するという点で優れているが、アフ
ィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価であ
るため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
いかに特異的に、かつ大量の目的酵素を吸着させるかと
いう点に問題があった。
【０００６】本発明は、この様な従来技術の欠点を解消
し、アフィニティークロマトグラフィーにおけるグルコ
キナーゼの特異的吸着能を上げ、少しの量のアフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着剤で、できるだけ多量のグ
ルコキナーゼを精製できる方法を提供することを目的と
するものである。
し、アフィニティークロマトグラフィーにおけるグルコ
キナーゼの特異的吸着能を上げ、少しの量のアフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着剤で、できるだけ多量のグ
ルコキナーゼを精製できる方法を提供することを目的と
するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着担体としてリアクティブイ
エロー７，リアクティブイエロー８１あるいはリアクテ
ィブオレンジ８４からなる吸着担体を用いることによっ
て、上記の目的が達成されることを見いだし本発明に到
達した。
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着担体としてリアクティブイ
エロー７，リアクティブイエロー８１あるいはリアクテ
ィブオレンジ８４からなる吸着担体を用いることによっ
て、上記の目的が達成されることを見いだし本発明に到
達した。
【０００８】すなわち、本発明はザイモモナス属又はバ
チルス属に属する微生物菌体から得たグルコキナーゼ含
有酵素溶液を、リアクティブイエロー７、リアクティブ
イエロー８１及びリアクティブオレンジ８４からなる群
より選択される少なくとも一種の色素をリガンドとする
水不溶性担体に接触させて、グルコキナーゼを該吸着担
体に吸着させ、ついで吸着したグルコキナーゼを溶離す
ることを特徴とするグルコキナーゼの精製法を要旨とす
るものである。
チルス属に属する微生物菌体から得たグルコキナーゼ含
有酵素溶液を、リアクティブイエロー７、リアクティブ
イエロー８１及びリアクティブオレンジ８４からなる群
より選択される少なくとも一種の色素をリガンドとする
水不溶性担体に接触させて、グルコキナーゼを該吸着担
体に吸着させ、ついで吸着したグルコキナーゼを溶離す
ることを特徴とするグルコキナーゼの精製法を要旨とす
るものである。
【０００９】本発明に用いられているザイモモナス属又
はバチルス属に属する微生物菌体としては、グルコキナ
ーゼ生産能を持つ微生物菌体であればいかなるものでも
利用でき、起源を限定するものではないが、工業的には
保存安定性に優れるグルコキナーゼを大量に産生するザ
イモモナス・モビリス又はバチルス・ステアロサーモフ
ィルスが好ましい。
はバチルス属に属する微生物菌体としては、グルコキナ
ーゼ生産能を持つ微生物菌体であればいかなるものでも
利用でき、起源を限定するものではないが、工業的には
保存安定性に優れるグルコキナーゼを大量に産生するザ
イモモナス・モビリス又はバチルス・ステアロサーモフ
ィルスが好ましい。
【００１０】これらのザイモモナス属又はバチルス属に
属する微生物菌体から得たグルコキナーゼ含有酵素溶液
としては、例えば菌体を水あるいは緩衝液に懸濁させ、
自己消化法、リゾチーム処理法、凍結溶解法、ホモジナ
イザー法、摩砕法あるいは高圧法等で破砕し、遠心分離
して得た上清液を用いればよい。また、場合によっては
除核酸処理して得た溶液を用いてもよい。
属する微生物菌体から得たグルコキナーゼ含有酵素溶液
としては、例えば菌体を水あるいは緩衝液に懸濁させ、
自己消化法、リゾチーム処理法、凍結溶解法、ホモジナ
イザー法、摩砕法あるいは高圧法等で破砕し、遠心分離
して得た上清液を用いればよい。また、場合によっては
除核酸処理して得た溶液を用いてもよい。
【００１１】本発明で用いられるリアクティブイエロー
７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレン
ジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色素
をリガンドとする水不溶性担体は、リアクティブイエロ
ー７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレ
ンジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色
素と水不溶性担体とを結合して作製することができる。
７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレン
ジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色素
をリガンドとする水不溶性担体は、リアクティブイエロ
ー７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレ
ンジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色
素と水不溶性担体とを結合して作製することができる。
【００１２】リアクティブイエロー７、リアクティブイ
エロー８１又はリアクティブオレンジ８４の各色素は、
例えばＩＣＩ社よりそれぞれプロシオンイエローＭＸ−
ＧＲ、プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ又はプロシオンオ
レンジＨ−ＥＲという商標名で市販されているものを用
いることができる。
エロー８１又はリアクティブオレンジ８４の各色素は、
例えばＩＣＩ社よりそれぞれプロシオンイエローＭＸ−
ＧＲ、プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ又はプロシオンオ
レンジＨ−ＥＲという商標名で市販されているものを用
いることができる。
【００１３】本発明に用いられる水不溶性担体として
は、例えばセルロース、デキストラン、アガロース、デ
ンプン等の多糖類の誘導体、ポリアミド類、ポリエステ
ル類、ポリウレタン類等の有機合成ポリマー、ガラスビ
ーズ、ハイドロキシアパタイト等の無機物の誘導体等が
あげられる。特に、これらの中でも、セルロース、デキ
ストラン、アガロース等の多糖類の誘導体が好ましく、
アガロースの誘導体として、ファルマシア社よりセファ
ロースの商標名で市販されているものがより好ましい。
は、例えばセルロース、デキストラン、アガロース、デ
ンプン等の多糖類の誘導体、ポリアミド類、ポリエステ
ル類、ポリウレタン類等の有機合成ポリマー、ガラスビ
ーズ、ハイドロキシアパタイト等の無機物の誘導体等が
あげられる。特に、これらの中でも、セルロース、デキ
ストラン、アガロース等の多糖類の誘導体が好ましく、
アガロースの誘導体として、ファルマシア社よりセファ
ロースの商標名で市販されているものがより好ましい。
【００１４】前記した水不溶性担体にリアクティブイエ
ロー７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティ
ブオレンジ８４を結合させるには、例えば、あらかじめ
水不溶性担体を水に懸濁させておき、これに水不溶性担
体の約１〜２W/W ％に当たるリアクティブ染料を加え、
さらに塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムを加えて室
温付近で数時間から数十時間反応させるという周知の方
法により行うことができる〔トニー・アトキンソン（Ｔ
ｏｎｙ Ａｔｋｉｎｓｏｎ）らの方法、バイオケミカル
・ソサイエティ・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ
ｓ）第９巻、２９０〜２９２頁（１９８１年）〕。
ロー７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティ
ブオレンジ８４を結合させるには、例えば、あらかじめ
水不溶性担体を水に懸濁させておき、これに水不溶性担
体の約１〜２W/W ％に当たるリアクティブ染料を加え、
さらに塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムを加えて室
温付近で数時間から数十時間反応させるという周知の方
法により行うことができる〔トニー・アトキンソン（Ｔ
ｏｎｙ Ａｔｋｉｎｓｏｎ）らの方法、バイオケミカル
・ソサイエティ・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ
ｓ）第９巻、２９０〜２９２頁（１９８１年）〕。
【００１５】前記のようにして得たグルコキナーゼ含有
酵素溶液と、リアクティブイエロー７、リアクティブイ
エロー８１あるいはリアクティブオレンジ８４をリガン
ドとする水不溶性担体とを単に混合するか、あるいはカ
ラムに充填した上記吸着担体に通液することによりグル
コキナーゼを吸着担体に特異的に吸着させることができ
る。この際、溶液のｐＨが低いほど吸着担体へのグルコ
キナーゼの吸着量は増すが、あまりｐＨを低くするとグ
ルコキナーゼが失活しやすくなるため、ｐＨ５〜６．５
特に６から６．５の範囲に調整することが好ましい。
酵素溶液と、リアクティブイエロー７、リアクティブイ
エロー８１あるいはリアクティブオレンジ８４をリガン
ドとする水不溶性担体とを単に混合するか、あるいはカ
ラムに充填した上記吸着担体に通液することによりグル
コキナーゼを吸着担体に特異的に吸着させることができ
る。この際、溶液のｐＨが低いほど吸着担体へのグルコ
キナーゼの吸着量は増すが、あまりｐＨを低くするとグ
ルコキナーゼが失活しやすくなるため、ｐＨ５〜６．５
特に６から６．５の範囲に調整することが好ましい。
【００１６】次に、吸着担体に吸着させたグルコキナー
ゼを溶離させることが必要である。そのためには、まず
グルコキナーゼが吸着した担体を、上記緩衝液で洗浄し
異種蛋白質を充分除いておくことが望ましく、その後、
例えば以下に述べる溶離液を用いてグルコキナーゼを溶
離することで、高純度のグルコキナーゼを得ることがで
きる。
ゼを溶離させることが必要である。そのためには、まず
グルコキナーゼが吸着した担体を、上記緩衝液で洗浄し
異種蛋白質を充分除いておくことが望ましく、その後、
例えば以下に述べる溶離液を用いてグルコキナーゼを溶
離することで、高純度のグルコキナーゼを得ることがで
きる。
【００１７】溶離液としては、例えばアデノシントリリ
ン酸のような基質類を含有する緩衝液も用いられるが、
緩衝液のｐＨを７〜８にするだけで特異的にグルコキナ
ーゼが溶離する。
ン酸のような基質類を含有する緩衝液も用いられるが、
緩衝液のｐＨを７〜８にするだけで特異的にグルコキナ
ーゼが溶離する。
【００１８】
【実施例】次に、本発明を実施例と比較例によって具体
的に説明する。なお、グルコキナーゼの酵素活性は、１
０ｍＭ−グルコース、１ｍＭ−アデノシントリリン酸、
１ｍＭ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５ｍ
Ｍ−塩化マグネシウム及び２単位／ｍＬのグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む２０ｍＭ−イミダゾ
ールと２０ｍＭ−リン酸カルシウムからなる緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）にグルコキナーゼを加えた時の３４０ｎｍの
吸光度の単位時間当たりの増加量の測定より求めたもの
であり、１分当たり１μモルのニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの還元型を生ぜしめる酵素活性を１単位
とした。
的に説明する。なお、グルコキナーゼの酵素活性は、１
０ｍＭ−グルコース、１ｍＭ−アデノシントリリン酸、
１ｍＭ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５ｍ
Ｍ−塩化マグネシウム及び２単位／ｍＬのグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む２０ｍＭ−イミダゾ
ールと２０ｍＭ−リン酸カルシウムからなる緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）にグルコキナーゼを加えた時の３４０ｎｍの
吸光度の単位時間当たりの増加量の測定より求めたもの
であり、１分当たり１μモルのニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの還元型を生ぜしめる酵素活性を１単位
とした。
【００１９】また、酵素タンパク量は、クマシーブリリ
ヤントブルーとの結合により生ずる色調変化を６２０ｎ
ｍで測定することにより求めた。
ヤントブルーとの結合により生ずる色調変化を６２０ｎ
ｍで測定することにより求めた。
【００２０】実施例１、比較例１ ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ２９１９１株の湿菌体
１００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）５００ｍＬに懸濁し、ダイノーミル
細胞破砕装置を用いて細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ
６に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素
抽出溶液５６０ｍＬを得た。
１００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）５００ｍＬに懸濁し、ダイノーミル
細胞破砕装置を用いて細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ
６に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素
抽出溶液５６０ｍＬを得た。
【００２１】また、別に０．４ｇのリアクティブイエロ
ー８１（プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ，ＩＣＩ社製）
を２５ｍＬの水に溶解し、これと２５ｇのセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を７５ｍＬの水に懸濁
した液とを混合し、さらに４Ｍの塩化ナトリウム１５ｍ
Ｌ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム０．１７５ｍＬを加
え、２５℃で５０時間インキュベーションすることによ
り、リアクティブイエロー８１をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤を作製した。
ー８１（プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ，ＩＣＩ社製）
を２５ｍＬの水に溶解し、これと２５ｇのセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を７５ｍＬの水に懸濁
した液とを混合し、さらに４Ｍの塩化ナトリウム１５ｍ
Ｌ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム０．１７５ｍＬを加
え、２５℃で５０時間インキュベーションすることによ
り、リアクティブイエロー８１をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤を作製した。
【００２２】これを充填した内径２ｃｍ、高さ８ｃｍの
カラム（２５ｍＬ容）に先に得た酵素抽出溶液を通じ、
グルコキナーゼが吸着剤当り何単位まで吸着するかを調
べた。５６０ｍＬの酵素抽出溶液のうちカラムへの通液
量が４２０ｍＬになったところから、それ以上のグルコ
キナーゼは吸着されずに素通ってきた。即ち、４２０ｍ
Ｌ中に存在していた１５，０００単位のグルコキナーゼ
が２５ｍＬの吸着剤を充填したカラムに吸着したことと
なり、グルコキナーゼの吸着容量としては６００単位／
ｍＬ−吸着剤となる。
カラム（２５ｍＬ容）に先に得た酵素抽出溶液を通じ、
グルコキナーゼが吸着剤当り何単位まで吸着するかを調
べた。５６０ｍＬの酵素抽出溶液のうちカラムへの通液
量が４２０ｍＬになったところから、それ以上のグルコ
キナーゼは吸着されずに素通ってきた。即ち、４２０ｍ
Ｌ中に存在していた１５，０００単位のグルコキナーゼ
が２５ｍＬの吸着剤を充填したカラムに吸着したことと
なり、グルコキナーゼの吸着容量としては６００単位／
ｍＬ−吸着剤となる。
【００２３】ついで、通液を２ｍＭの塩化マグネシウム
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）を６０ｍＬ通じ非吸
着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝液のｐＨ
を７．２に変えてグルコキナーゼを溶出させた。
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）を６０ｍＬ通じ非吸
着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝液のｐＨ
を７．２に変えてグルコキナーゼを溶出させた。
【００２４】回収されたグルコキナーゼは１４，１００
単位で，吸着したグルコキナーゼよりの回収率は９４％
であった。このようにして得たグルコキナーゼの比活性
値は１０５単位／ｍｇであった。
単位で，吸着したグルコキナーゼよりの回収率は９４％
であった。このようにして得たグルコキナーゼの比活性
値は１０５単位／ｍｇであった。
【００２５】比較のため、アフィニティークロマトグラ
フィー吸着剤として、特許公表昭６１−５００２９９号
公報に示されたプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リア
クティブレッド８）結合セファロースＣＬ−４Ｂを用
い、上記と同様の実験を行った。
フィー吸着剤として、特許公表昭６１−５００２９９号
公報に示されたプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リア
クティブレッド８）結合セファロースＣＬ−４Ｂを用
い、上記と同様の実験を行った。
【００２６】５６０ｍＬの酵素抽出溶液のうちカラムへ
の通液量が１０２ｍＬになったところでグルコキナーゼ
は素通ってきたため、グルコキナーゼの吸着量としては
１４５単位／ｍＬ−吸着剤であった。また吸着剤からの
溶出によって回収されたグルコキナーゼは３，３５０単
位、回収率は９２％、比活性値は１００単位／ｍｇであ
った。
の通液量が１０２ｍＬになったところでグルコキナーゼ
は素通ってきたため、グルコキナーゼの吸着量としては
１４５単位／ｍＬ−吸着剤であった。また吸着剤からの
溶出によって回収されたグルコキナーゼは３，３５０単
位、回収率は９２％、比活性値は１００単位／ｍｇであ
った。
【００２７】実施例２、３、比較例２、３ 実施例１のリアクティブイエロー８１に代えて、リアク
ティブイエロー７（プロシオンイエローＭＸ−ＧＲ、Ｉ
ＣＩ社製）（実施例２）、リアクティブオレンジ８４
（プロシオンオレンジＨ−ＥＲ、ＩＣＩ社製）（実施例
３）、リアクティブレッド５（プロシオンレッドＭＸ−
Ｇ、ＩＣＩ社製）（比較例２）あるいはリアクティブレ
ッド２（プロシオンレッドＭＸ−５Ｂ、ＩＣＩ社製）
（比較例３）を使用する以外は、実施例１と同様の実験
を行った。それらの結果を実施例１及び比較例１の結果
とともに表１にまとめて示した。
ティブイエロー７（プロシオンイエローＭＸ−ＧＲ、Ｉ
ＣＩ社製）（実施例２）、リアクティブオレンジ８４
（プロシオンオレンジＨ−ＥＲ、ＩＣＩ社製）（実施例
３）、リアクティブレッド５（プロシオンレッドＭＸ−
Ｇ、ＩＣＩ社製）（比較例２）あるいはリアクティブレ
ッド２（プロシオンレッドＭＸ−５Ｂ、ＩＣＩ社製）
（比較例３）を使用する以外は、実施例１と同様の実験
を行った。それらの結果を実施例１及び比較例１の結果
とともに表１にまとめて示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】表１から明らかなように、リアクティブイ
エロー８１（実施例１）、リアクティブイエロー７（実
施例２）あるいはリアクティブオレンジ８４（実施例
３）を水不溶性担体に結合したアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤は、これまでのタンパク結合染料及び
他の比較例の染料からなる他のアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤に比べ、驚くほどグルコキナーゼ吸着
能に優れた新規の吸着剤であることがわかる。
エロー８１（実施例１）、リアクティブイエロー７（実
施例２）あるいはリアクティブオレンジ８４（実施例
３）を水不溶性担体に結合したアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤は、これまでのタンパク結合染料及び
他の比較例の染料からなる他のアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤に比べ、驚くほどグルコキナーゼ吸着
能に優れた新規の吸着剤であることがわかる。
【００３０】実施例４ バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡ１５０３株の
湿菌体１２５ｇを、１ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）６２５ｍＬに懸濁し、超
音波破砕機を用いて破砕後、ｐＨを６．５に調整し、遠
心分離により不溶物を除去した。このようにして得られ
た７００ｍＬの酵素抽出溶液を、実施例１で作製したリ
アクティブイエロー８１をセファロースＣＬ−４Ｂに結
合させたアフィニティークロマトグラフィー吸着剤を充
填した１０ｍＬ容のカラムに通じたところ、通液量２４
０ｍＬまでグルコキナーゼは素通ってこなかった。即
ち、バチルス・ステアロサーモフィルスのグルコキナー
ゼの吸着容量は５１０単位／ｍＬ−吸着剤であった。
湿菌体１２５ｇを、１ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）６２５ｍＬに懸濁し、超
音波破砕機を用いて破砕後、ｐＨを６．５に調整し、遠
心分離により不溶物を除去した。このようにして得られ
た７００ｍＬの酵素抽出溶液を、実施例１で作製したリ
アクティブイエロー８１をセファロースＣＬ−４Ｂに結
合させたアフィニティークロマトグラフィー吸着剤を充
填した１０ｍＬ容のカラムに通じたところ、通液量２４
０ｍＬまでグルコキナーゼは素通ってこなかった。即
ち、バチルス・ステアロサーモフィルスのグルコキナー
ゼの吸着容量は５１０単位／ｍＬ−吸着剤であった。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、リアクティブイエロー
７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティブオ
レンジ８４を水不溶性担体に結合したアフィニティーク
ロマトグラフィー吸着剤を用いることにより、従来のア
フィニティークロマトグラフィー吸着剤と比べグルコキ
ナーゼの吸着能を飛躍的に上げることができ、カラムク
ロマトグラフィーをコンパクトにすることが可能とな
る。
７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティブオ
レンジ８４を水不溶性担体に結合したアフィニティーク
ロマトグラフィー吸着剤を用いることにより、従来のア
フィニティークロマトグラフィー吸着剤と比べグルコキ
ナーゼの吸着能を飛躍的に上げることができ、カラムク
ロマトグラフィーをコンパクトにすることが可能とな
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 ザイモモナス属又はバチルス属に属する
微生物菌体から得たグルコキナーゼ含有酵素溶液を、リ
アクティブイエロー７、リアクティブイエロー８１及び
リアクティブオレンジ８４からなる群より選択される少
なくとも一種の色素をリガンドとする水不溶性担体に接
触させて、グルコキナーゼを該吸着担体に吸着させ、つ
いで吸着したグルコキナーゼを溶離することを特徴とす
るグルコキナーゼの精製法。 - 【請求項２】 微生物菌体がザイモモナス・モビリス、
又はバチルス・ステアロサーモフィルスである請求項１
記載の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3092854A JP3071857B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコキナーゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3092854A JP3071857B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコキナーゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304885A JPH04304885A (ja) | 1992-10-28 |
| JP3071857B2 true JP3071857B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=14066017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3092854A Expired - Fee Related JP3071857B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコキナーゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3071857B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3092854A patent/JP3071857B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04304885A (ja) | 1992-10-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |