JP3015492B2 - グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製法 - Google Patents
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物菌体より得るこ
とができる産業上有用な酵素の１つであるグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを、アフィニティークロマ
トグラフィーを行うことにより、簡単にかつ高純度に精
製する方法に関するものである。
とができる産業上有用な酵素の１つであるグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを、アフィニティークロマ
トグラフィーを行うことにより、簡単にかつ高純度に精
製する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から、微生物菌体より酵素を採取す
るには、菌体を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−又
はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース、
吸着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイ
ト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に
架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲル
等を種々組み合わせるという煩雑な工程をへていた。そ
のため、製品としての酵素を得るまでに日数がかかるだ
けでなく、クロマトグラフィーの回数が増えることによ
り酵素の回収率の低下が生じていた。
るには、菌体を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−又
はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース、
吸着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイ
ト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に
架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲル
等を種々組み合わせるという煩雑な工程をへていた。そ
のため、製品としての酵素を得るまでに日数がかかるだ
けでなく、クロマトグラフィーの回数が増えることによ
り酵素の回収率の低下が生じていた。
【０００３】最近では、これらカラムクロマトグラフィ
ーの組み合せをできるだけ少なくするために、目的の酵
素を特異的に吸着するようなクロマトグラフィー担体を
用いる、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーを
利用し、それにより比較的短い日数で酵素を精製する方
法も開発されている。
ーの組み合せをできるだけ少なくするために、目的の酵
素を特異的に吸着するようなクロマトグラフィー担体を
用いる、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーを
利用し、それにより比較的短い日数で酵素を精製する方
法も開発されている。
【０００４】例えば、特許公表昭６１−５００２９９号
公報には、ザイモモナス・モビリスよりのグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製手段として、タンパ
ク結合染料からなるアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤を利用する方法が提案されている。その中に示さ
れている染料は、商標「プロシオン」で市販されてい
る、プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リアクティブレ
ッド８）、プロシオンタークワーズＭＸ−Ｇ（リアクテ
ィブブルー１４０）、プロシオンブルーＭＸ−Ｒ（リア
クティブブルー４）、プロシオンイエローＭＸ−６Ｇ
（リアクティブイエロー１）、プロシオンイエローＭＸ
−３Ｒ（リアクティブオレンジ８６）、プロシオンイエ
ローＨ−Ａ（リアクティブイエロー３）、プロシオンレ
ッドＭＸ−５Ｂ（リアクティブレッド２）、プロシオン
レッドＭＸ−２Ｂ（リアクティブレッド１）、プロシオ
ンイエローＭＸ−４Ｒ（リアクティブオレンジ１４）、
プロシオンイエローＭＸ−ＧＲ（リアクティブイエロー
７）であり、そのうちでも特にプロシオンスカーレット
ＭＸ−Ｇが最も好ましく、これをセファロースＣＬ−４
Ｂ（商品名）の担体に結合させた吸着剤が、ザイモモナ
ス・モビリス抽出液よりのグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを特異的に、かつ最も大量に吸着し、高収
率で単離精製できることを示している。
公報には、ザイモモナス・モビリスよりのグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製手段として、タンパ
ク結合染料からなるアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤を利用する方法が提案されている。その中に示さ
れている染料は、商標「プロシオン」で市販されてい
る、プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リアクティブレ
ッド８）、プロシオンタークワーズＭＸ−Ｇ（リアクテ
ィブブルー１４０）、プロシオンブルーＭＸ−Ｒ（リア
クティブブルー４）、プロシオンイエローＭＸ−６Ｇ
（リアクティブイエロー１）、プロシオンイエローＭＸ
−３Ｒ（リアクティブオレンジ８６）、プロシオンイエ
ローＨ−Ａ（リアクティブイエロー３）、プロシオンレ
ッドＭＸ−５Ｂ（リアクティブレッド２）、プロシオン
レッドＭＸ−２Ｂ（リアクティブレッド１）、プロシオ
ンイエローＭＸ−４Ｒ（リアクティブオレンジ１４）、
プロシオンイエローＭＸ−ＧＲ（リアクティブイエロー
７）であり、そのうちでも特にプロシオンスカーレット
ＭＸ−Ｇが最も好ましく、これをセファロースＣＬ−４
Ｂ（商品名）の担体に結合させた吸着剤が、ザイモモナ
ス・モビリス抽出液よりのグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを特異的に、かつ最も大量に吸着し、高収
率で単離精製できることを示している。
【０００５】また、ジャーナル・オブ・アプライド・バ
イオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第７巻、１９２〜２０
１頁（１９８５年）には、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスよりのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
の精製に、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（リアクティ
ブブルー２からなるアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤）を利用したことが示されている。
イオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第７巻、１９２〜２０
１頁（１９８５年）には、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスよりのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
の精製に、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ（リアクティ
ブブルー２からなるアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤）を利用したことが示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記の特許公報及びジ
ャーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリーに記
載の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用
によりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なく
し、収率よく酵素を精製するという点で優れているが、
アフィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価
であるため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着
剤へいかに特異的に，かつ大量の目的酵素を吸着させる
かという点に問題があった。
ャーナル・オブ・アプライド・バイオケミストリーに記
載の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用
によりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なく
し、収率よく酵素を精製するという点で優れているが、
アフィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価
であるため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着
剤へいかに特異的に，かつ大量の目的酵素を吸着させる
かという点に問題があった。
【０００７】本発明は、この様な従来技術の欠点を解消
し、アフィニティークロマトグラフィーにおけるグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの特異的吸着能を上
げ、少しの量のアフィニティークロマトグラフィー吸着
剤で、できるだけ多量のグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを精製できる方法を提供することを目的とす
るものである。
し、アフィニティークロマトグラフィーにおけるグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの特異的吸着能を上
げ、少しの量のアフィニティークロマトグラフィー吸着
剤で、できるだけ多量のグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを精製できる方法を提供することを目的とす
るものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着担体としてリアクティブレ
ッド５あるいはリアクティブイエロー８１からなる吸着
担体を用いることによって、上記の目的が達成されるこ
とを見いだし本発明に到達した。
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着担体としてリアクティブレ
ッド５あるいはリアクティブイエロー８１からなる吸着
担体を用いることによって、上記の目的が達成されるこ
とを見いだし本発明に到達した。
【０００９】すなわち、本発明は微生物菌体から得たグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液
を、リアクティブレッド５及びリアクティブイエロー８
１からなる群より選択される少なくとも一種の色素をリ
ガンドとする水不溶性担体に接触させて，グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを該吸着担体に吸着させ、
ついで吸着したグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを溶離することを特徴とするグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの精製法を要旨とするものである。
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液
を、リアクティブレッド５及びリアクティブイエロー８
１からなる群より選択される少なくとも一種の色素をリ
ガンドとする水不溶性担体に接触させて，グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを該吸着担体に吸着させ、
ついで吸着したグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを溶離することを特徴とするグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの精製法を要旨とするものである。
【００１０】本発明に用いられている微生物菌体として
は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ生産能を
持つ微生物菌体であればいかなるものでも利用でき、起
源を限定するものではないが、工業的には保存安定性に
優れるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを大量
に産出するザイモモナス・モビリス又はバチルス・ステ
アロサーモフィルスが好ましい。
は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ生産能を
持つ微生物菌体であればいかなるものでも利用でき、起
源を限定するものではないが、工業的には保存安定性に
優れるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを大量
に産出するザイモモナス・モビリス又はバチルス・ステ
アロサーモフィルスが好ましい。
【００１１】これらの微生物菌体から得たグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液としては、例
えば菌体を水あるいは緩衝液に懸濁させ、自己消化法、
リゾチーム処理法、凍結溶解法、ホモジナイザー法、摩
砕法あるいは高圧法等で破砕し，遠心分離して得た上清
液を用いればよい。また，場合によっては除核酸処理し
て得た溶液を用いてもよい。
６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液としては、例
えば菌体を水あるいは緩衝液に懸濁させ、自己消化法、
リゾチーム処理法、凍結溶解法、ホモジナイザー法、摩
砕法あるいは高圧法等で破砕し，遠心分離して得た上清
液を用いればよい。また，場合によっては除核酸処理し
て得た溶液を用いてもよい。
【００１２】本発明で用いられるリアクティブレッド５
及びリアクティブイエロー８１からなる群より選択され
る少なくとも一種の色素をリガンドとする水不溶性担体
は、リアクティブレッド５及びリアクティブイエロー８
１からなる群より選択される少なくとも一種の色素と水
不溶性担体とを結合して作製することができる。
及びリアクティブイエロー８１からなる群より選択され
る少なくとも一種の色素をリガンドとする水不溶性担体
は、リアクティブレッド５及びリアクティブイエロー８
１からなる群より選択される少なくとも一種の色素と水
不溶性担体とを結合して作製することができる。
【００１３】リアクティブレッド５又はリアクティブイ
エロー８１の各色素は、例えばＩＣＩ社よりそれぞれプ
ロシオンレッドＭＸ−Ｇ又はプロシオンイエローＨ−Ｅ
３Ｇという商標名で市販されているものを用いることが
できる。
エロー８１の各色素は、例えばＩＣＩ社よりそれぞれプ
ロシオンレッドＭＸ−Ｇ又はプロシオンイエローＨ−Ｅ
３Ｇという商標名で市販されているものを用いることが
できる。
【００１４】本発明に用いられる水不溶性担体として
は、例えばセルロース、デキストラン、アガロース、デ
ンプン等の多糖類の誘導体、ポリアミド類、ポリエステ
ル類、ポリウレタン類等の有機合成ポリマー、ガラスビ
ーズ、ハイドロキシアパタイト等の無機物の誘導体等が
あげられる。特に、これらの中でも、セルロース、デキ
ストラン、アガロース等の多糖類の誘導体が好ましく、
アガロースの誘導体として、ファルマシア社よりセファ
ロースの商標名で市販されているものがより好ましい。
は、例えばセルロース、デキストラン、アガロース、デ
ンプン等の多糖類の誘導体、ポリアミド類、ポリエステ
ル類、ポリウレタン類等の有機合成ポリマー、ガラスビ
ーズ、ハイドロキシアパタイト等の無機物の誘導体等が
あげられる。特に、これらの中でも、セルロース、デキ
ストラン、アガロース等の多糖類の誘導体が好ましく、
アガロースの誘導体として、ファルマシア社よりセファ
ロースの商標名で市販されているものがより好ましい。
【００１５】前記した水不溶性担体にリアクティブレッ
ド５あるいはリアクティブイエロー８１を結合させるに
は、例えば、あらかじめ水不溶性担体を水に懸濁させて
おき、これに水不溶性担体の約１〜２W/W ％に当たるリ
アクティブ染料を加え、さらに塩化ナトリウム及び水酸
化ナトリウムを加えて室温付近で数時間から数十時間反
応させるという周知の方法により行うことができる〔ト
ニー・アトキンソン（Ｔｏｎｙ Ａｔｋｉｎｓｏｎ）ら
の方法、バイオケミカル・ソサイエティ・トランスアク
ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ
Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ）第９巻、２９０〜２９２頁
（１９８１年）〕。
ド５あるいはリアクティブイエロー８１を結合させるに
は、例えば、あらかじめ水不溶性担体を水に懸濁させて
おき、これに水不溶性担体の約１〜２W/W ％に当たるリ
アクティブ染料を加え、さらに塩化ナトリウム及び水酸
化ナトリウムを加えて室温付近で数時間から数十時間反
応させるという周知の方法により行うことができる〔ト
ニー・アトキンソン（Ｔｏｎｙ Ａｔｋｉｎｓｏｎ）ら
の方法、バイオケミカル・ソサイエティ・トランスアク
ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ
Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ）第９巻、２９０〜２９２頁
（１９８１年）〕。
【００１６】前記のようにして得たグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液と、リアクティブレ
ッド５あるいはリアクティブイエロー８１をリガンドと
する水不溶性担体とを単に混合するか、あるいはカラム
に充填した上記吸着担体に通液することによりグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを吸着担体に特異的に
吸着させることができる。この際、溶液のｐＨが低いほ
ど吸着担体へのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼの吸着量は増すが、あまりｐＨを低くするとグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼが失活しやすくなるた
め、ｐＨ５〜７．５特に６から６．５の範囲に調整する
ことが好ましい。
ン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液と、リアクティブレ
ッド５あるいはリアクティブイエロー８１をリガンドと
する水不溶性担体とを単に混合するか、あるいはカラム
に充填した上記吸着担体に通液することによりグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを吸着担体に特異的に
吸着させることができる。この際、溶液のｐＨが低いほ
ど吸着担体へのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼの吸着量は増すが、あまりｐＨを低くするとグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼが失活しやすくなるた
め、ｐＨ５〜７．５特に６から６．５の範囲に調整する
ことが好ましい。
【００１７】次に、吸着担体に吸着させたグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶離させることが必要で
ある。そのためには、まずグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼが吸着した担体を、緩衝液で洗浄し異種蛋
白質を充分除いておくことが望ましく、その緩衝液のｐ
Ｈは６〜９、特に７〜８であることが好ましい。このよ
うにして洗浄した後、例えば以下に述べる溶離液を用い
てグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶離する
ことで、高純度のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼを得ることができる。
６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶離させることが必要で
ある。そのためには、まずグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼが吸着した担体を、緩衝液で洗浄し異種蛋
白質を充分除いておくことが望ましく、その緩衝液のｐ
Ｈは６〜９、特に７〜８であることが好ましい。このよ
うにして洗浄した後、例えば以下に述べる溶離液を用い
てグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶離する
ことで、高純度のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼを得ることができる。
【００１８】溶離液としては、例えば０．２ｍＭ〜１０
ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１ｍＭのニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）あるいはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含有
する緩衝液が用いられる。この緩衝液のｐＨは６〜９、
特に７〜８であることが好ましい。
ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１ｍＭのニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）あるいはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を含有
する緩衝液が用いられる。この緩衝液のｐＨは６〜９、
特に７〜８であることが好ましい。
【００１９】
【実施例】次に、本発明を実施例と比較例によって具体
的に説明する。なお、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの酵素活性は、１ｍＭ−グルコース−６−リン
酸、１ｍＭ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
２ｍＭ−硫酸マグネシウム及び３０ｍＭ−ＫＣl を含む
３０ｍＭ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）にグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを加えた時の３４０ｎｍの
吸光度の単位時間当たりの増加量の測定より求めたもの
であり、１分当たり１μモルのニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの還元型を生ぜしめる酵素活性を１単位
とした。
的に説明する。なお、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼの酵素活性は、１ｍＭ−グルコース−６−リン
酸、１ｍＭ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、
２ｍＭ−硫酸マグネシウム及び３０ｍＭ−ＫＣl を含む
３０ｍＭ−トリス緩衝液（ｐＨ８．０）にグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを加えた時の３４０ｎｍの
吸光度の単位時間当たりの増加量の測定より求めたもの
であり、１分当たり１μモルのニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの還元型を生ぜしめる酵素活性を１単位
とした。
【００２０】また、酵素タンパク量は、クマシーブリリ
ヤントブルーとの結合により生ずる色調変化を６２０ｎ
ｍで測定することにより求めた。
ヤントブルーとの結合により生ずる色調変化を６２０ｎ
ｍで測定することにより求めた。
【００２１】実施例１、比較例１ ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ２９１９１株の湿菌体
３００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）１．５Ｌに懸濁し、ダイノーミル細
胞破砕装置を用いて細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ６
に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素抽
出溶液１．６Ｌを得た。
３００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）１．５Ｌに懸濁し、ダイノーミル細
胞破砕装置を用いて細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ６
に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素抽
出溶液１．６Ｌを得た。
【００２２】また、別に０．４ｇのリアクティブイエロ
ー８１（プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ，ＩＣＩ社製）
を２５ｍＬの水に溶解し、これと２５ｇのセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を７５ｍＬの水に懸濁
した液とを混合し、さらに４Ｍの塩化ナトリウム１５ｍ
Ｌ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム０．１７５ｍＬを加
え、２５℃で５０時間インキュベーションすることによ
り、リアクティブイエロー８１をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤を作製した。
ー８１（プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ，ＩＣＩ社製）
を２５ｍＬの水に溶解し、これと２５ｇのセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を７５ｍＬの水に懸濁
した液とを混合し、さらに４Ｍの塩化ナトリウム１５ｍ
Ｌ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム０．１７５ｍＬを加
え、２５℃で５０時間インキュベーションすることによ
り、リアクティブイエロー８１をリガンドとするアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤を作製した。
【００２３】これを充填した内径２ｃｍ、高さ８ｃｍの
カラム（２５ｍＬ容）に通じ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼが吸着剤当り何単位まで吸着するかを
調べた。１．６Ｌの酵素抽出溶液のうちカラムへの通液
量が１２００ｍＬになったところから、それ以上のグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは吸着されずに素
通ってきた。即ち、１２００ｍＬ中に存在していた８
７，０００単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼが２５ｍＬの吸着剤を充填したカラムに吸着したこ
ととなり，グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの
吸着容量としては３４８０単位／ｍＬ−吸着剤となる。
カラム（２５ｍＬ容）に通じ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼが吸着剤当り何単位まで吸着するかを
調べた。１．６Ｌの酵素抽出溶液のうちカラムへの通液
量が１２００ｍＬになったところから、それ以上のグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは吸着されずに素
通ってきた。即ち、１２００ｍＬ中に存在していた８
７，０００単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼが２５ｍＬの吸着剤を充填したカラムに吸着したこ
ととなり，グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの
吸着容量としては３４８０単位／ｍＬ−吸着剤となる。
【００２４】ついで、通液を２ｍＭの塩化マグネシウム
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）に変え、６０ｍＬ通
じ非吸着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝液
に０．５ｍＭのＮＡＤＰを加えた緩衝液に変えてグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶出させた。
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）に変え、６０ｍＬ通
じ非吸着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝液
に０．５ｍＭのＮＡＤＰを加えた緩衝液に変えてグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶出させた。
【００２５】回収されたグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼは８１，０００単位で、吸着したグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりの回収率は９３％で
あった。このようにして得たグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの比活性値は３５０単位／ｍｇであっ
た。
ロゲナーゼは８１，０００単位で、吸着したグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりの回収率は９３％で
あった。このようにして得たグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの比活性値は３５０単位／ｍｇであっ
た。
【００２６】比較のため、アフィニティークロマトグラ
フィー吸着剤として、特許公表昭６１−５００２９９号
公報でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの吸着
能が最も高かったプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リ
アクティブレッド８）結合セファロースＣＬ−４Ｂを用
い、上記と同様の実験を行った。
フィー吸着剤として、特許公表昭６１−５００２９９号
公報でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの吸着
能が最も高かったプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リ
アクティブレッド８）結合セファロースＣＬ−４Ｂを用
い、上記と同様の実験を行った。
【００２７】１．６Ｌの酵素抽出溶液のうちカラムへの
通液量が１４２ｍＬになったところでグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼは素通ってきたため、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの吸着量としては４１
０単位／ｍＬ−吸着剤であった。また吸着剤からの溶出
によって回収されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼは９，４５０単位，回収率は９２％，比活性値は
３２０単位／ｍｇであった。
通液量が１４２ｍＬになったところでグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼは素通ってきたため、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの吸着量としては４１
０単位／ｍＬ−吸着剤であった。また吸着剤からの溶出
によって回収されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼは９，４５０単位，回収率は９２％，比活性値は
３２０単位／ｍｇであった。
【００２８】実施例２、比較例２、３、４ 実施例１のリアクティブイエロー８１に代えて、リアク
ティブレッド５（プロシオンレッドＭＸ−Ｇ、ＩＣＩ社
製）（実施例２）、リアクティブイエロー７（プロシオ
ンイエローＭＸ−ＧＲ、ＩＣＩ社製）（比較例２）、リ
アクティブオレンジ８４（プロシオンオレンジＨ−Ｅ
Ｒ、ＩＣＩ社製）（比較例３）あるいはリアクティブレ
ッド２（プロシオンレッドＭＸ−５Ｂ、ＩＣＩ社製）
（比較例４）を使用する以外は、実施例１と同様の実験
を行った。それらの結果を実施例１及び比較例１の結果
とともに表１にまとめて示した。
ティブレッド５（プロシオンレッドＭＸ−Ｇ、ＩＣＩ社
製）（実施例２）、リアクティブイエロー７（プロシオ
ンイエローＭＸ−ＧＲ、ＩＣＩ社製）（比較例２）、リ
アクティブオレンジ８４（プロシオンオレンジＨ−Ｅ
Ｒ、ＩＣＩ社製）（比較例３）あるいはリアクティブレ
ッド２（プロシオンレッドＭＸ−５Ｂ、ＩＣＩ社製）
（比較例４）を使用する以外は、実施例１と同様の実験
を行った。それらの結果を実施例１及び比較例１の結果
とともに表１にまとめて示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】表１から明らかなように、リアクティブイ
エロー８１（実施例１）あるいはリアクティブレッド５
（実施例２）を水不溶性担体に結合したアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤は、これまでのタンパク結合
染料及び他の比較例の染料からなる他のアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤に比べ、驚くほどグルコキナ
ーゼ吸着能に優れた新規の吸着剤であることがわかる。
エロー８１（実施例１）あるいはリアクティブレッド５
（実施例２）を水不溶性担体に結合したアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤は、これまでのタンパク結合
染料及び他の比較例の染料からなる他のアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤に比べ、驚くほどグルコキナ
ーゼ吸着能に優れた新規の吸着剤であることがわかる。
【００３１】実施例３ バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡ１５０３株の
湿菌体５００ｇを、１ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２．０Ｌに懸濁し、フレ
ンチプレス破砕機を用いて破砕後、ｐＨを６．５に調整
し、遠心分離により不溶物を除去した。このようにして
得られた２．３Ｌの酵素抽出溶液を、実施例１で作製し
たリアクティブイエロー８１をセファロースＣＬ−４Ｂ
に結合させたアフィニティークロマトグラフィー吸着剤
を充填した１０ｍＬ容のカラムに通じたところ、通液量
２，０２０ｍＬまでグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼは素通ってこなかった。即ち、バチルス・ステア
ロサーモフィルスのグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼの吸着容量は１，４００単位／ｍＬ−吸着剤であ
った。
湿菌体５００ｇを、１ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２．０Ｌに懸濁し、フレ
ンチプレス破砕機を用いて破砕後、ｐＨを６．５に調整
し、遠心分離により不溶物を除去した。このようにして
得られた２．３Ｌの酵素抽出溶液を、実施例１で作製し
たリアクティブイエロー８１をセファロースＣＬ−４Ｂ
に結合させたアフィニティークロマトグラフィー吸着剤
を充填した１０ｍＬ容のカラムに通じたところ、通液量
２，０２０ｍＬまでグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼは素通ってこなかった。即ち、バチルス・ステア
ロサーモフィルスのグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼの吸着容量は１，４００単位／ｍＬ−吸着剤であ
った。
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、リアクティブレッド５
あるいはリアクティブイエロー８１を水不溶性担体に結
合したアフィニティークロマトグラフィー吸着剤を用い
ることにより、従来のアフィニティークロマトグラフィ
ー吸着剤と比べグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼの吸着能を飛躍的に上げることができ、カラムクロマ
トグラフィーをコンパクトにすることが可能となる。
あるいはリアクティブイエロー８１を水不溶性担体に結
合したアフィニティークロマトグラフィー吸着剤を用い
ることにより、従来のアフィニティークロマトグラフィ
ー吸着剤と比べグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼの吸着能を飛躍的に上げることができ、カラムクロマ
トグラフィーをコンパクトにすることが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 微生物菌体から得たグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ含有酵素溶液を、リアクティブレ
ッド５及びリアクティブイエロー８１からなる群より選
択される少なくとも一種の色素をリガンドとする水不溶
性担体に接触させて、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼを該吸着担体に吸着させ、ついで吸着したグル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを溶離することを
特徴とするグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの
精製法。 - 【請求項２】 微生物菌体がザイモモナス・モビリス，
又はバチルス・ステアロサーモフィルスである請求項１
記載の精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3092855A JP3015492B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3092855A JP3015492B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304884A JPH04304884A (ja) | 1992-10-28 |
| JP3015492B2 true JP3015492B2 (ja) | 2000-03-06 |
Family
ID=14066047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3092855A Expired - Fee Related JP3015492B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3015492B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3092855A patent/JP3015492B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04304884A (ja) | 1992-10-28 |
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Legal Events
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