JP3080670B2 - 酵素の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ザイモモナス・モビリ
ス細菌より得ることができる産業上有用な酵素を、アフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことにより工業的
な規模で精製する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、微生物細胞より酵素を採取す
るには、細胞を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー、例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−
又はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロー
ス、吸着クロマトグラフィー、例えばハイドロキシアパ
タイト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、例えば
適度に架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミ
ドゲルなどを種々組み合わせるという煩雑な工程を経て
いた。そのため、製品としての酵素を得るまでに日数が
かかるだけでなく、クロマトグラフィーの回数が増える
ことにより酵素の回収率の低下が生じていた。最近で
は、これらカラムクロマトグラフィーの組み合せをでき
るだけ少なくするために、目的の酵素を特異的に吸着す
るようなクロマトグラフィー担体を用いる、いわゆるア
フィニティークロマトグラフィーを利用し、それにより
比較的短い日数で酵素を精製する方法も開発されてい
る。

【０００３】例えば、ザイモモナス・モビリス菌よりの
酵素の抽出および精製方法として、特表昭６１−５００
２９９号公報には、部分的に水混和性の有機溶剤、ノニ
オン界面活性剤、およびリゾチームを含有する抽出媒体
を用いて、中性からアルカリ性のｐＨ条件下で、ザイモ
モナス・モビリス菌より酵素を抽出し、ついで得られた
酵素抽出物を、支持マトリックスに結合し、かつ酵素
（グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ）に関し
て選択されたタンパク結合染料からなるアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤と接触させ、前記アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着剤によって前記抽出物から
グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼを選択的に
単離し、引き続いて前記アフィニティークロマトグラフ
ィー吸着剤からグルコース−６−リン酸デハイドロゲナ
ーゼを回収するために溶出を行い、そして任意に、溶出
したグルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼを精製
することによって、前記グルコース−６−リン酸デハイ
ドロゲナーゼを前記酵素抽出物から単離する方法が提案
されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の特許公報に記載
の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用に
よりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なくし、
収率よく酵素を精製するという点で優れているが、アフ
ィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価であ
るため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
の目的酵素の吸着能をいかに大きくするかという問題が
あった。

【０００５】本発明は、この様な従来技術の欠点を解消
し、アフィニティークロマトグラフィーにおける酵素の
吸着能を上げ、少しの量のアフィニティークロマトグラ
フィー吸着剤で、できるだけ多量の目的酵素を精製でき
る方法を提供することを目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、ザイモモナ
ス・モビリス菌よりの酵素の抽出に当たって抽出媒体に
加える、部分的に水混和性の有機溶剤、ノニオン界面活
性剤およびリゾチームなどがアフィニティークロマトグ
ラフィー吸着剤への酵素の吸着能を低下させているとい
う事実を見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明
はザイモモナス・モビリス菌を機械的破砕法により破砕
し、得られる酵素抽出液を、タンパク結合染料を支持担
体に結合したアフィニティークロマトグラフィー吸着剤
と接触させて、該タンパク結合染料と特異的に結合する
酵素のみを選択的に吸着させ、次いで吸着した酵素を溶
出させることを特徴とする酵素の精製方法を要旨とする
ものである。

【０００７】本発明に用いられるザイモモナス・モビリ
ス菌としては、例えばＡＴＣＣ３１８２１，３１８２
３，３５０００，３５００１，１０９８８，２９１９
１，２９１９２などが知られているが、これらに限定さ
れるものではない。また増殖方法は公知の方法、例えば
ロバート・ケー・スコープス（ＲｏｂｅｒｔＫ．Ｓｃｏ
ｐｅｓ）らの方法〔バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）第２２８巻，６
２７〜６３４頁（１９８５年）〕を用いることができ
る。

【０００８】本発明に用いられるザイモモナス・モビリ
ス菌の機械的破砕法としては、細胞および組織の破砕用
として用いられている機械的破砕法であればいずれでも
よく、例えば高速回転刃による機械的破砕〔スイスキネ
マチカ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）社のポリトロンホモジ
ナイザー，西独ホルムス−ベテル（Ｈｏｒｍｕｔｈ−Ｖ
ｅｔｔｅｒ）社の連続式テフロンホモジナイザー〕、超
音波による破砕〔米国ブランソン（ＢＲＡＮＳＯＮ）社
のソニファイアー超音波細胞破砕装置〕、圧力破砕〔米
国エス・エル・エム−アミンコ（ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣ
Ｏ）社のフレンチプレス細胞破砕機、西独ブランリュー
ベ（Ｂｒａｎ＋Ｌｕｅｂｂｅ）社のブランリューベ連続
式細胞破砕機、シー・エス・シー／バイオックス（ＣＳ
Ｃ／ＢＩＯＸ）社のＸ−プレス細胞破砕機、米国ピー・
エー・アール・アール（ＰＡＲＲ）社のパール細胞破砕
器〕、グラスビーズ衝撃法による破砕〔米国バイオスペ
ック（ＢＩＯＳＰＥＣ）社のビート・ビーター細胞破砕
器、スイスウィリー・エー・バコヘン・マニュファクチ
ャーリング・エンジニアーズ（Ｗｉｌｌｉｙ Ａ．Ｂａ
ｃｈｏｆｅｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｓ）社のダイノーミル細胞破砕装置〕などがあ
げられる。特に、これらの中でも連続大量処理可能なポ
リトロン超高速ホモジナイザー，ブランリューベ連続式
細胞破砕機、ダイノーミル連続細胞破砕装置、超音波連
続式細胞破砕機などが工業用生産レベルの破砕法として
好ましい。ザイモモナス・モビリス菌をこれらの機械的
破砕機にて破砕するに当たっては、ザイモモナス・モビ
リス菌細胞を緩衝液に懸濁させて破砕すればよい。緩衝
液のｐＨは６〜１０、特に７.5〜８.5であることが好ま
しい。緩衝液の種類としては上記ｐＨの範囲で緩衝能を
持つものであればいずれも用いることができるが、工業
用生産を考えた場合には安価なリン酸緩衝液や酢酸緩衝
液であることが好ましい。緩衝液濃度としては１ｍＭ〜
５００ｍＭ、特に５ｍＭ〜１００ｍＭ、さらには２０ｍ
Ｍ〜５０ｍＭであることが好ましい。また、１ｍＭ〜５
０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭのＳＨ保護剤、さ
らに0.５ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭの
マグネシウム塩などを、上記緩衝液に加えることができ
る。ＳＨ保護剤としては、２−メルカプトエタノール、
ジチオスレイトールなどが、マグネシウム塩としては、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが用いられ
る。

【０００９】このように機械的破砕により得たザイモモ
ナス・モビリス菌破砕懸濁液を，ｐＨ５〜７.5、好まし
くは６〜６.5に調整したのち遠心分離あるいは濾過処理
し、破砕片などの水不溶物を除去すればよい。ｐＨが低
いほどアフィニティークロマトグラフィー吸着剤への酵
素の吸着量は増すが、あまり低くなると酵素が失活しや
すくなるため，ｐＨは上記の範囲で調整することが好ま
しい。

【００１０】このようにして得られた酵素抽出溶液を、
アフィニティークロマトグラフィーに供すればよい。こ
のようにして得た酵素抽出溶液と、タンパク結合染料を
支持担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤とを単に混合するか、あるいはカラムに充填した
上記吸着剤に通液することにより酵素を特異的に吸着さ
せることができる。

【００１１】次に、吸着剤に吸着させた酵素を吸着剤よ
り溶離させることが必要である。溶離させるに当たって
は目的酵素の吸着剤への特異的な吸着をなくする溶離液
を用いることができる。好ましい溶離液としては、目的
酵素の基質あるいは基質類似物を含有する緩衝液が用い
られる。また場合によっては、緩衝液のｐＨを変える、
塩類を含んだ緩衝液を用いる、緩衝液の種類を変えるな
どが溶離手段として用いられることもある。

【００１２】本発明に用いられるタンパク結合染料を支
持担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー吸
着剤としては、目的の酵素と特異的に結合する染料を水
不溶性支持担体に結合したものである。用いられる水不
溶性支持担体としては、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロース、デンプンなどの多糖類の誘導体、ポリ
アミド類、ポリエステル類、ポリウレタン類などの有機
合成ポリマー、ガラスビーズ、ハイドロキシアパタイト
などの無機物の誘導体などがあげられる。特に、これら
の中でも、セルロース、デキストラン、アガロースなど
の多糖類の誘導体が好ましい。一方、タンパク結合染料
としては、目的の酵素と特異的に結合する染料であれ
ば、例えば酸性染料、媒染染料、直接染料、反応染料い
ずれのものからも選ぶことができる。これらの中でも反
応基としてクロロトリアジン基を有する反応染料、例え
ばチバ（Ｃｉｂａ）社のチバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏ
ｎ）（商標名）染料あるいはアイ・シー・アイ（ＩＣ
Ｉ）社のプロシオン（Ｐｒｏｃｉｏｎ）（商標名）染料
が好ましい。これらの染料を水不溶性支持担体に結合さ
せるには、例えばトニー・アトキンソン（Ｔｏｎｙ Ａ
ｔｋｉｎｓｏｎ）らの方法〔バイオケミカル・ソサイエ
ティ・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ）第９
巻，２９０〜２９２頁（１９８１年）〕を用いることが
できる。

【００１３】本発明に適用できる酵素は、染料と結合す
る酵素であればどのような酵素でもよい。例えば、アル
コールデハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、グ
ルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．
１．１．４９）、グルコース−フルクトースオキシドレ
ダクターゼ（ＥＣ１．１．９９．−）、グリセロアルデ
ハイド−３−リン酸−デハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．
２．１．１２）、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．
２）、フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）、ピル
ビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、ホスホグリ
セレートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．３）、６−ホスホ
グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．３１）、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）、エ
ノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、６−ホスホグルコ
ネートデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２）、２−
ケト−３−デオキシ−６−リン酸−グルコネートアルド
ラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）、ホスホグリセレート
ムターゼ（ＥＣ５．４．２．１）などがあげられる。

【００１４】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１，比較例１ ザイモモナス・モビリス菌の湿菌体５００ｇを，２ｍＭ
の塩化マグネシウムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノ
ールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）
２．５l に懸濁し、ダイノーミル細胞破砕装置を用いて
細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ６に調整した後、遠心
分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を得た。この
酵素抽出溶液を，プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（Ｉ
ＣＩ社）をアトキンソンらの方法〔バイオケミカル・ソ
サイエティ・トランスアクションズ，第９巻，２９０〜
２９２頁（１９８１年）〕に従ってセファロースＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社）に結合させて作成したアフィニ
ティークロマトグラフィー吸着剤を充填した内径４.4ｃ
ｍ，高さ１２ｃｍのカラムに通じ、グルコキナーゼが吸
着剤当り何単位まで吸着するかを調べた。３l の酵素抽
出溶液のうちカラムへの通液量が７５０ｍl になったと
ころから、それ以上のグルコキナーゼは吸着されずに素
通ってきた。そこで、通液を２ｍＭの塩化マグネシウム
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）に変え、５００ｍl
通じ非吸着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝
液でｐＨ７に調整した緩衝液に変えてグルコキナーゼを
溶出させた。回収されたグルコキナーゼは２４，８００
単位であった。

【００１５】比較のため、ザイモモナス・モビリス菌の
湿菌体５００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、１％（Ｖ／Ｖ）のブタ
ノール、0.１％（Ｖ／Ｖ）のノニデット（商品名）Ｐ−
４０および0.２ｇのリゾチームを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８）２.5l に懸濁し、３０℃で３
時間インキュベートし、酢酸を加えてｐＨを６に調整し
た後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を
得た。この酵素抽出溶液を上記と同様にアフィニティー
クロマトグラフィー吸着剤に接触させ、グルコキナーゼ
の吸着量を調べた。カラムへの通液量が４００ｍl 以上
で、もはやグルコキナーゼは吸着されなかった。また、
吸着したグルコキナーゼの溶出も上記と同様に行ったと
ころ、回収されたグルコキナーゼは１４，２００単位で
あった。

【００１６】以上のように、ダイノーミルのような機械
的破砕法により破砕する方が、有機溶媒や界面活性剤を
用いる破砕法に比べ、驚くほどアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤への酵素の吸着量は多いことが判る。

【００１７】実施例２，比較例２ ザイモモナス・モビリス菌の湿菌体５００ｇを、２ｍＭ
の塩化マグネシウムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノ
ールを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）
２.5l に懸濁し、フレンチプレス細菌破砕機を用いて破
砕し、酢酸を加えてｐＨを６.5に調整した後、遠心分離
により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を得た。この酵素
抽出溶液をプロシオンレッドＭＸ−５Ｂ（ＩＣＩ社）を
セファロースＣＬ−４Ｂに結合したアフィニティークロ
マトグラフィー吸着剤に接触させグルコース−６−リン
酸デハイドロゲナーゼが吸着当り何単位まで吸着するか
を調べた。１９５ｍl の酵素抽出溶液の通液で、グルコ
ース−６−リン酸デハイドロゲナーゼは素通りしはじめ
た。カラムへ吸着したグルコース−６−リン酸デハイド
ロゲナーゼの溶出は、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０
ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭのニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を含む２０
ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.5）で行ったとこ
ろ、１２，４００単位のグルコース−６−リン酸デハイ
ドロゲナーゼが回収された。

【００１８】比較のため、ザイモモナス・モビリス菌の
湿菌体５００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、１％（Ｖ／Ｖ）のブタ
ノール、0.１％（Ｖ／Ｖ）のノニデットＰ−４０および
0.２ｇのリゾチームを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ８）２.5l に懸濁し、３０℃で３時間インキ
ュベートし、酢酸を加えてｐＨを６.5に調整した後、遠
心分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を得た。こ
の酵素抽出溶液を上記と同様にアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤に接触させ、グルコース−６−リン酸
デハイドロゲナーゼの吸着量を調べた。カラムへの通液
量が８５ｍl 以上で、もはやグルコース−６−リン酸デ
ハイドロゲナーゼは吸着されなかった。また、吸着した
グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼの溶出も上
記と同様に行ったところ、回収されたグルコース−６−
リン酸デハイドロゲナーゼは５，９００単位であった。

【００１９】実施例３，比較例３ 実施例１のプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇをプロシオ
ンイエローＭＸ−Ｇに変え、対象酵素のグルコキナーゼ
をフルクトキテーゼとし、さらにアフィニティークロマ
トグラフィー吸着剤に吸着された酵素の溶出緩衝液を３
ｍＭのアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）を含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）に変える以外は，実
施例１と同様に行った。酵素抽出溶液の１１９０ｍl ま
で通液でき、溶出により回収されたフルクトキナーゼは
２２，０００単位であった。

【００２０】比較のため、比較例１と同様にザイモモナ
ス・モビリス菌を破砕した後、実施例３と同様にアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤への酵素の吸着量を
求めた。酵素抽出溶液の９６０ｍl まで通液ができ、溶
出により回収されたフルクトキナーゼは１７，２００単
位であった。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、目的の酵素と特異的に
結合する染料を支持担体に結合したアフィニティークロ
マトグラフィー吸着剤を用いて、短い日数で収率よく酵
素を精製するに当たって、ザイモモナス・モビリス菌体
内の酵素を機械的破砕法により抽出することにより、引
き続き行うアフィニティークロマトグラフィーへの酵素
の吸着能を上げることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 13/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏ
   ｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）細菌細胞を機械的破砕法によ
   り破砕し、得られる酵素抽出液を、タンパク結合染料を
   支持担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー
   吸着剤と接触させて、該タンパク結合染料と特異的に結
   合する酵素のみを選択的に吸着させ、次いで吸着した酵
   素を溶出させることを特徴とする酵素の精製方法。