JPH04252179A - 酵素の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ザイモモナス・モビリ
ス細菌より得ることができる産業上有用な酵素を、アフ
ィニティークロマトグラフィーを行うことにより工業的
な規模で精製する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、微生物細胞より酵素を採取す
るには、細胞を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー、例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−
又はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース
、吸着クロマトグラフィー、例えばハイドロキシアパタ
イト、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、例えば適
度に架橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミド
ゲルなどを種々組み合わせるという煩雑な工程を経てい
た。そのため、製品としての酵素を得るまでに日数がか
かるだけでなく、クロマトグラフィーの回数が増えるこ
とにより酵素の回収率の低下が生じていた。最近では、
これらカラムクロマトグラフィーの組み合せをできるだ
け少なくするために、目的の酵素を特異的に吸着するよ
うなクロマトグラフィー担体を用いる、いわゆるアフィ
ニティークロマトグラフィーを利用し、それにより比較
的短い日数で酵素を精製する方法も開発されている。

【０００３】例えば、ザイモモナス・モビリス菌よりの
酵素の抽出および精製方法として、特表昭６１−５００
２９９号公報には、部分的に水混和性の有機溶剤、ノニ
オン界面活性剤、およびリゾチームを含有する抽出媒体
を用いて、中性からアルカリ性のｐＨ条件下で、ザイモ
モナス・モビリス菌より酵素を抽出し、ついで得られた
酵素抽出物を、支持マトリックスに結合し、かつ酵素（
グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ）に関して
選択されたタンパク結合染料からなるアフィニティーク
ロマトグラフィー吸着剤と接触させ、前記アフィニティ
ークロマトグラフィー吸着剤によって前記抽出物からグ
ルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼを選択的に単
離し、引き続いて前記アフィニティークロマトグラフィ
ー吸着剤からグルコース−６−リン酸デハイドロゲナー
ゼを回収するために溶出を行い、そして任意に、溶出し
たグルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼを精製す
ることによって、前記グルコース−６−リン酸デハイド
ロゲナーゼを前記酵素抽出物から単離する方法が提案さ
れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の特許公報に記載
の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用に
よりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なくし、
収率よく酵素を精製するという点で優れているが、アフ
ィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価であ
るため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
の目的酵素の吸着能をいかに大きくするかという問題が
あった。

【０００５】本発明は、この様な従来技術の欠点を解消
し、アフィニティークロマトグラフィーにおける酵素の
吸着能を上げ、少しの量のアフィニティークロマトグラ
フィー吸着剤で、できるだけ多量の目的酵素を精製でき
る方法を提供することを目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、ザイモモナ
ス・モビリス菌よりの酵素の抽出に当たって抽出媒体に
加える、部分的に水混和性の有機溶剤、ノニオン界面活
性剤およびリゾチームなどがアフィニティークロマトグ
ラフィー吸着剤への酵素の吸着能を低下させているとい
う事実を見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明
はザイモモナス・モビリス菌を機械的破砕法により破砕
し、得られる酵素抽出液を、タンパク結合染料を支持担
体に結合したアフィニティークロマトグラフィー吸着剤
と接触させて、該タンパク結合染料と特異的に結合する
酵素のみを選択的に吸着させ、次いで吸着した酵素を溶
出させることを特徴とする酵素の精製方法を要旨とする
ものである。

【０００７】本発明に用いられるザイモモナス・モビリ
ス菌としては、例えばＡＴＣＣ３１８２１，３１８２３
，３５０００，３５００１，１０９８８，２９１９１，
２９１９２などが知られているが、これらに限定される
ものではない。また増殖方法は公知の方法、例えばロバ
ート・ケー・スコープス（ＲｏｂｅｒｔＫ．Ｓｃｏｐｅ
ｓ）らの方法〔バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ）第２２８巻，６２
７〜６３４頁（１９８５年）〕を用いることができる。

【０００８】本発明に用いられるザイモモナス・モビリ
ス菌の機械的破砕法としては、細胞および組織の破砕用
として用いられている機械的破砕法であればいずれでも
よく、例えば高速回転刃による機械的破砕〔スイスキネ
マチカ（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ）社のポリトロンホモジ
ナイザー，西独ホルムス−ベテル（Ｈｏｒｍｕｔｈ−Ｖ
ｅｔｔｅｒ）社の連続式テフロンホモジナイザー〕、超
音波による破砕〔米国ブランソン（ＢＲＡＮＳＯＮ）社
のソニファイアー超音波細胞破砕装置〕、圧力破砕〔米
国エス・エル・エム−アミンコ（ＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ
）社のフレンチプレス細胞破砕機、西独ブランリューベ
（Ｂｒａｎ＋Ｌｕｅｂｂｅ）社のブランリューベ連続式
細胞破砕機、シー・エス・シー／バイオックス（ＣＳＣ
／ＢＩＯＸ）社のＸ−プレス細胞破砕機、米国ピー・エ
ー・アール・アール（ＰＡＲＲ）社のパール細胞破砕器
〕、グラスビーズ衝撃法による破砕〔米国バイオスペッ
ク（ＢＩＯＳＰＥＣ）社のビート・ビーター細胞破砕器
、スイスウィリー・エー・バコヘン・マニュファクチャ
ーリング・エンジニアーズ（Ｗｉｌｌｉｙ　　Ａ．Ｂａ
ｃｈｏｆｅｎ　　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　　Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｓ）社のダイノーミル細胞破砕装置〕など
があげられる。特に、これらの中でも連続大量処理可能
なポリトロン超高速ホモジナイザー，ブランリューベ連
続式細胞破砕機、ダイノーミル連続細胞破砕装置、超音
波連続式細胞破砕機などが工業用生産レベルの破砕法と
して好ましい。ザイモモナス・モビリス菌をこれらの機
械的破砕機にて破砕するに当たっては、ザイモモナス・
モビリス菌細胞を緩衝液に懸濁させて破砕すればよい。 緩衝液のｐＨは６〜１０、特に７．５〜８．５であるこ
とが好ましい。緩衝液の種類としては上記ｐＨの範囲で
緩衝能を持つものであればいずれも用いることができる
が、工業用生産を考えた場合には安価なリン酸緩衝液や
酢酸緩衝液であることが好ましい。緩衝液濃度としては
１ｍＭ〜５００ｍＭ、特に５ｍＭ〜１００ｍＭ、さらに
は２０ｍＭ〜５０ｍＭであることが好ましい。また、１
ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭのＳＨ保
護剤、さらに０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ
〜５ｍＭのマグネシウム塩などを、上記緩衝液に加える
ことができる。ＳＨ保護剤としては、２−メルカプトエ
タノール、ジチオスレイトールなどが、マグネシウム塩
としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが
用いられる。

【０００９】このように機械的破砕により得たザイモモ
ナス・モビリス菌破砕懸濁液を，ｐＨ５〜７．５、好ま
しくは６〜６．５に調整したのち遠心分離あるいは濾過
処理し、破砕片などの水不溶物を除去すればよい。ｐＨ
が低いほどアフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
の酵素の吸着量は増すが、あまり低くなると酵素が失活
しやすくなるため，ｐＨは上記の範囲で調整することが
好ましい。

【００１０】このようにして得られた酵素抽出溶液を、
アフィニティークロマトグラフィーに供すればよい。こ
のようにして得た酵素抽出溶液と、タンパク結合染料を
支持担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー
吸着剤とを単に混合するか、あるいはカラムに充填した
上記吸着剤に通液することにより酵素を特異的に吸着さ
せることができる。

【００１１】次に、吸着剤に吸着させた酵素を吸着剤よ
り溶離させることが必要である。溶離させるに当たって
は目的酵素の吸着剤への特異的な吸着をなくする溶離液
を用いることができる。好ましい溶離液としては、目的
酵素の基質あるいは基質類似物を含有する緩衝液が用い
られる。また場合によっては、緩衝液のｐＨを変える、
塩類を含んだ緩衝液を用いる、緩衝液の種類を変えるな
どが溶離手段として用いられることもある。

【００１２】本発明に用いられるタンパク結合染料を支
持担体に結合したアフィニティークロマトグラフィー吸
着剤としては、目的の酵素と特異的に結合する染料を水
不溶性支持担体に結合したものである。用いられる水不
溶性支持担体としては、例えばセルロース、デキストラ
ン、アガロース、デンプンなどの多糖類の誘導体、ポリ
アミド類、ポリエステル類、ポリウレタン類などの有機
合成ポリマー、ガラスビーズ、ハイドロキシアパタイト
などの無機物の誘導体などがあげられる。特に、これら
の中でも、セルロース、デキストラン、アガロースなど
の多糖類の誘導体が好ましい。一方、タンパク結合染料
としては、目的の酵素と特異的に結合する染料であれば
、例えば酸性染料、媒染染料、直接染料、反応染料いず
れのものからも選ぶことができる。これらの中でも反応
基としてクロロトリアジン基を有する反応染料、例えば
チバ（Ｃｉｂａ）社のチバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ）
（商標名）染料あるいはアイ・シー・アイ（ＩＣＩ）社
のプロシオン（Ｐｒｏｃｉｏｎ）（商標名）染料が好ま
しい。これらの染料を水不溶性支持担体に結合させるに
は、例えばトニー・アトキンソン（Ｔｏｎｙ　　Ａｔｋ
ｉｎｓｏｎ）らの方法〔バイオケミカル・ソサイエティ
・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｓｏｃｉｅｔｙ　　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ）第９巻
，２９０〜２９２頁（１９８１年）〕を用いることがで
きる。

【００１３】本発明に適用できる酵素は、染料と結合す
る酵素であればどのような酵素でもよい。例えば、アル
コールデハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、グ
ルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．１
．１．４９）、グルコース−フルクトースオキシドレダ
クターゼ（ＥＣ１．１．９９．−）、グリセロアルデハ
イド−３−リン酸−デハイドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．
１．１２）、グルコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２）、
フルクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４）、ピルビン酸
キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、ホスホグリセレー
トキナーゼ（ＥＣ２．７．２．３）、６−ホスホグルコ
ノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．３１）、ピルビン酸
デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１）、エノラー
ゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、６−ホスホグルコネート
デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１２）、２−ケト−
３−デオキシ−６−リン酸−グルコネートアルドラーゼ
（ＥＣ４．１．２．１４）、ホスホグリセレートムター
ゼ（ＥＣ５．４．２．１）などがあげられる。

【００１４】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１，比較例１ ザイモモナス・モビリス菌の湿菌体５００ｇを，２ｍＭ
の塩化マグネシウムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノ
ールを含む２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）
２．５ｌ　に懸濁し、ダイノーミル細胞破砕装置を用い
て細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ６に調整した後、遠
心分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を得た。こ
の酵素抽出溶液を，プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（
ＩＣＩ社）をアトキンソンらの方法〔バイオケミカル・
ソサイエティ・トランスアクションズ，第９巻，２９０
〜２９２頁（１９８１年）〕に従ってセファロースＣＬ
−４Ｂ（ファルマシア社）に結合させて作成したアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤を充填した内径４．
４ｃｍ，高さ１２ｃｍのカラムに通じ、グルコキナーゼ
が吸着剤当り何単位まで吸着するかを調べた。３ｌ　の
酵素抽出溶液のうちカラムへの通液量が７５０ｍｌ　に
なったところから、それ以上のグルコキナーゼは吸着さ
れずに素通ってきた。そこで、通液を２ｍＭの塩化マグ
ネシウムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む
２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）に変え、５
００ｍｌ　通じ非吸着のタンパクを完全に除き、引き続
き上記緩衝液でｐＨ７に調整した緩衝液に変えてグルコ
キナーゼを溶出させた。回収されたグルコキナーゼは２
４，８００単位であった。

【００１５】比較のため、ザイモモナス・モビリス菌の
湿菌体５００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、１％（Ｖ／Ｖ）のブタ
ノール、０．１％（Ｖ／Ｖ）のノニデット（商品名）Ｐ
−４０および０．２ｇのリゾチームを含む２５ｍＭのリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）２．５ｌ　に懸濁し、３
０℃で３時間インキュベートし、酢酸を加えてｐＨを６
に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素抽
出溶液を得た。この酵素抽出溶液を上記と同様にアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤に接触させ、グルコ
キナーゼの吸着量を調べた。カラムへの通液量が４００
ｍｌ　以上で、もはやグルコキナーゼは吸着されなかっ
た。また、吸着したグルコキナーゼの溶出も上記と同様
に行ったところ、回収されたグルコキナーゼは１４，２
００単位であった。

【００１６】以上のように、ダイノーミルのような機械
的破砕法により破砕する方が、有機溶媒や界面活性剤を
用いる破砕法に比べ、驚くほどアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤への酵素の吸着量は多いことが判る。

【００１７】実施例２，比較例２ ザイモモナス・モビリス菌の湿菌体５００ｇを、２ｍＭ
の塩化マグネシウムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノ
ールを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）
２．５ｌ　に懸濁し、フレンチプレス細菌破砕機を用い
て破砕し、酢酸を加えてｐＨを６．５に調整した後、遠
心分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液を得た。こ
の酵素抽出溶液をプロシオンレッドＭＸ−５Ｂ（ＩＣＩ
社）をセファロースＣＬ−４Ｂに結合したアフィニティ
ークロマトグラフィー吸着剤に接触させグルコース−６
−リン酸デハイドロゲナーゼが吸着当り何単位まで吸着
するかを調べた。１９５ｍｌ　の酵素抽出溶液の通液で
、グルコース−６−リン酸デハイドロゲナーゼは素通り
しはじめた。カラムへ吸着したグルコース−６−リン酸
デハイドロゲナーゼの溶出は、２ｍＭの塩化マグネシウ
ムと１０ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ
のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を
含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で
行ったところ、１２，４００単位のグルコース−６−リ
ン酸デハイドロゲナーゼが回収された。

【００１８】比較のため、ザイモモナス・モビリス菌の
湿菌体５００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール、１％（Ｖ／Ｖ）のブタ
ノール、０．１％（Ｖ／Ｖ）のノニデットＰ−４０およ
び０．２ｇのリゾチームを含む２０ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）２．５ｌ　に懸濁し、３０℃で３時
間インキュベートし、酢酸を加えてｐＨを６．５に調整
した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素抽出溶液
を得た。この酵素抽出溶液を上記と同様にアフィニティ
ークロマトグラフィー吸着剤に接触させ、グルコース−
６−リン酸デハイドロゲナーゼの吸着量を調べた。カラ
ムへの通液量が８５ｍｌ　以上で、もはやグルコース−
６−リン酸デハイドロゲナーゼは吸着されなかった。ま
た、吸着したグルコース−６−リン酸デハイドロゲナー
ゼの溶出も上記と同様に行ったところ、回収されたグル
コース−６−リン酸デハイドロゲナーゼは５，９００単
位であった。

【００１９】実施例３，比較例３ 実施例１のプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇをプロシオ
ンイエローＭＸ−Ｇに変え、対象酵素のグルコキナーゼ
をフルクトキテーゼとし、さらにアフィニティークロマ
トグラフィー吸着剤に吸着された酵素の溶出緩衝液を３
ｍＭのアデノシントリリン酸（ＡＴＰ）を含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）に変える以外は，実
施例１と同様に行った。酵素抽出溶液の１１９０ｍｌ　
まで通液でき、溶出により回収されたフルクトキナーゼ
は２２，０００単位であった。

【００２０】比較のため、比較例１と同様にザイモモナ
ス・モビリス菌を破砕した後、実施例３と同様にアフィ
ニティークロマトグラフィー吸着剤への酵素の吸着量を
求めた。酵素抽出溶液の９６０ｍｌ　まで通液ができ、
溶出により回収されたフルクトキナーゼは１７，２００
単位であった。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、目的の酵素と特異的に
結合する染料を支持担体に結合したアフィニティークロ
マトグラフィー吸着剤を用いて、短い日数で収率よく酵
素を精製するに当たって、ザイモモナス・モビリス菌体
内の酵素を機械的破砕法により抽出することにより、引
き続き行うアフィニティークロマトグラフィーへの酵素
の吸着能を上げることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍ
   ｏｎａｓ　　ｍｏｂｉｌｉｓ）細菌細胞を機械的破砕法
   により破砕し、得られる酵素抽出液を、タンパク結合染
   料を支持担体に結合したアフィニティークロマトグラフ
   ィー吸着剤と接触させて、該タンパク結合染料と特異的
   に結合する酵素のみを選択的に吸着させ、次いで吸着し
   た酵素を溶出させることを特徴とする酵素の精製方法。