JPS6371174A - 純化酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は純化酵素、並びに該酵素の製造方法に関するも
のである。ざらに詳しくは１本発明は。

純化酵素、即ち、デアセトキシセファロスポリンＣ合成
酵素〔、エキスパンダーゼ〕および該酵素を、高い精製
状態で得る方法に関するものである。

従来技術 セファロスポリンＣの生合成の過程で、デアセトキシセ
ファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）合成酵素ハヘニシリンＮ
が、ＦＩ［％（リング・エキスパンション）を経てＤＡ
ＯＣとなる反応を触媒する。

次いで、後者は、ＤＡＯＣヒドロキシラーゼによりデア
セチルセファロスポリンＣ（ＤＡＣ）に転換される。

セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏ
ｓｐｏｒｉａｍ　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　）およびスト
レプトマイセス・クラブリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　）　　からのエキス
ノぐンダーゼ酵素の部分精製が記載されている。クプカ
ら（Ｋｕｐｋａ。

Ｊ−）、　　ＦＥＭＳマイクロバイオロジカル・レタ（
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　）　１６　１〜６
　（１９８３）およびシエイデツガーら（Ｓｈｅｉｄｅ
ｇｇｅｒ、　Ａ、　）　。

ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス（Ｊ、　
Ａｎｔｉｂｉｏｔ、　）　３７　５２２〜５３１　（１
９８４）には、該酵素の、Ｃ，アクレモニウムからの部
分精製について、他方、ジエンセンら（Ｊｅｎｓｅｎ。

Ｓ、　Ｅ、　）　　アンチミクロ・エージエンツ・ケモ
セラ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍ
ｏｔｈｅｒ、　）　２４３０７〜３１２（１９８３）お
よびジエンセンら（Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｓ、　Ｅ、）　％
ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス３８２６
３〜２６５　（１９８５）には、該酵素のＳ、クラブリ
ゲルスからの部分精製Ｅこついでの記載がみられる。部
分的に精製された酵素製剤の使用方法をも含めた、これ
らの研究において、環拡張（ＤＡＯＣの生成）およびヒ
ドロキシル化反応（ＤＡＣの生成）は、原核性のＳ。

クラブリゲルス内では２つの別々の酵素により、また、
真核性のＣ，アクレモニウム内では１つの三機能性エキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼによって触媒されるこ
とが示唆された。

発明の構成 本発明方法によって得られる純化酵素は、エキスパンダ
ーゼ機能およびヒドロキシラーゼ機能の両者を有し、従
って、三機能性酵素である。

第１Ａ図は・、酵素エキスパンダーゼの粗抽出物の弱い
陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーの結果をプ
ロットしたグラフである。

第１Ｂ図は弱い陰イオン交換樹脂から得たエキスパンダ
ーゼ含有溶出液をゲル濾過にかけで得た結果をプロット
したグラフである。

第１Ｃ図は、ゲル濾過の酵素含有押退物をヒドロキシア
パタイトでクロマトグラフィーしで得た結果をプロット
したグラフである。

第１Ｄ図はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの
エキスパンダーゼ含有溶出液をＦＰＬＣクロマトグラフ
ィーにかけて得た結果をプロットしたグラフである。

第２Ａ図はペニシリンＮからデアセトキシセフアロスポ
リンＣへのエキスパンダーゼ転換、並びに後者からデア
セチルセファロスポリンＣへのヒドロキシラーゼ転換の
結果をプロットしたグラフである。

第２Ｂ図はデアセトキシセファロスポリンＣからデアセ
チルセファロスポリンＣへのエキスパンダーゼ転換の結
果をプロットしたグラフである。

第３Ａ図は酵素のエキスパンダーゼ活性を示すＨＰＬＣ
の結果をプロットしたグラフである。

第３Ｂ図は酵素のヒドロキシラーゼ活性を示すＨＰＬＣ
の結果をプロットしたグラフである。

本発明方法によれば、セファロスポリウム・アクレモニ
ウムから得た酵素エキスパンダーゼを、弱い陰イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル押退。

ざらにヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーにか
けることにより精製された状態（純化形）の酵素を得る
ことができ、ざらにこの酵素は１強い陰イオン交換樹脂
クロマトグラフィーにかけて一層精製することもできる
。酵素は純度約９５％で得られ、このものは、酵素の粗
抽出物によって示さ”れる′デアセトキシセファロスポ
リンＣおよびデアセチルセファロスポリンＣ生成に関す
る三機能性を示した。

デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素は、クロマト
グラフィー精製の間、グリセロールまたはスクロース、
エチルアルコールの如きＣ１−０３アルキルの−・価ア
ルコール、ジチオスレイトールの如きスルフヒドリル含
有還元剤およびアスコルベート（ＧＥＤＡ）が存在する
と、効果的に安定化される。

本発明によれば、酵素が安定に維持される条件を導入し
た多段階クロマトグラフィー法によって純化デアセトキ
シセファロスポリンＣ（エキスパンダーゼ）酵素が得ら
れる。

本発明によって得られる純化酵素はゲル押退法に基いて
見積った場合、分子量４３，０００のタンパク質モノマ
ーである。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって求めた最
小分子量は４１，０００である純化エキスパンダーゼの
等重点は６．０±０．５である。

純化酵素の比活性は約０．２Ｕ／＃９〜０．８Ｕ／■で
ある。

エキスパンダーゼのアミノ酸組成を次の表１に示す。

表１　エキスパンダーゼのアミノ酸組成Ａｓｘ　（Ａｓ
ｐ　＋　Ａｓｎ）　　　　　　　　　　３７Ｔｈｒ　　
　　　　　　　　　　　　　　２４Ｓｅｒ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６Ｇｌｘ
（Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ）　　　　　　　　　　３５Ｐｒｏ　
　　　　　　　　　　　　　　　２１ｃｔｙ　　　　　
　　　　　　　　　　　３１Ａｌａ　　　　　　　　　
　　　　　　　３４Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　３２Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
６Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５１１ｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８Ｌｅｕ　　　　　　　　
　　　　　　　　２７Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　１０Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
２０Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　６Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　
　　１７Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　　　　２９
本発明の純化エキスパンダーゼ−ヒドロキシラーゼ酵素
は、以下に示す如く、ペニシリンＮをデアセトキシセフ
ァロスポリンＣに変換し、さらに。

後者をデアセチルセファロスポリンＣに変換する。

Ｏ２Ｈ ペニシリンＮのＤＡＯＣへの変換およびＤＡＯＣのＤＡ
Ｃへの変換の両方に、純化酵素は第１鉄イオン（Ｆｅ）
、α−ケトグルタル酸および酸素を要求する。この酵素
によって示されるエキスパンダーゼ活性に対するヒドロ
キシラーゼ活性の比率は０．１５±０．０４である。

ざらにこの酵素は、ある種の刺激に対する反応によって
特徴づけられる。純化酵素の両機能（エキスパンダーゼ
およびヒドロキシラーゼ）は、インキュベーション混合
物中にジチオスレイトール。

アスコルベートおよびＡＴＰが存在することで刺激され
る。酵素のエキスパンダーゼ作用およびヒドロキシラー
ゼ作用はジチオスレイトールおよびアスコルベートによ
り可逆的に再活性化される。

酵素の両機能は、亜鉛イオンの存在および５，５′−ジ
チオビス−２−二トロ安息香酸の存在によって阻害され
る。これら、２種の物質はスルフヒドリル基の結合剤（
バインダー〕であることが分っでおり、従って、活性型
酵素は１またはそれ以上の遊離のスルフヒドリル基（水
硫基）を有すると思われる。

本発明によって得られる純化酵素を、臭化シアン開裂お
よびトリプシン開裂の後、逆相クロマトグラフィーにか
けてアミノ酸配列を決定したところ、以下のペプチドフ
ラグメントを含有していることがわかった。両分解法に
より、以下の１３アミノ酸からな６るフラグメントが得
られた。

Ａｌａ−ＶａＩ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ下記の１２，８および７アミノ酸フラグメントはトリ
プシン消化の後、逆相ＨＰＬＣにかけで得られた。

Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−ＡｒｇＡｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ａｒｇまた、本発明は精製度の高いエキスパ
ンダーゼを製造する方法を提供するものである。本発明
方法の重要な点は、多段階クロマトグラフィーの工程の
間、酵素に安定性を付与することにある。工程の間の安
定性は、β−メルカプトエタノール、ジチオエリスレイ
トール、またはジチオスレイトール（ＤＤＴ）の如きス
ルフヒドリル含有還元剤。

およびアスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸
カリウム（いずれも濃度約１ｍＭ〜約２０ｍＭで用いる
）、約５％〜約１５％のメチルアルコールｔた１９ｆル
アルコールの類ＩＣ１−Ｃ３−価アルコール、並びに約
５％〜約１５％のグリセロールまたはスクロースの存在
下で精製を行うことにより、達成される。工程中の酵素
の安定性を最大にする好ましい安定化の混合物は、エチ
ルアルコール約１０容ｔ％、グリセロール約１０容量％
、ＤＴＴ約１０ｍＭ、およびアスコルビン酸ナトリウム
約１０ｍＭを含有する。本明細書中では。

便宜上、安定化混合物をＧＥＤＡと呼ぶこととする。Ｇ
ＥＤＡは、還元状態の酵素、即ち、遊離のスルフヒドリ
ル基を存在させると共に、酵素に。

その活性を最良にするのに好ましい状態である疎水性の
環境を与えるよう機能すると思われる。反応には調製し
たばかりのＧＥＤＡを用いることが好ましい。ＧＥＤＡ
は、後述する様に、りん酸バッファーまたはトリス−Ｈ
Ｃｊ　バッファー（ｐＨ７，５）等のバッファーに入れ
で使用する。本明細書で用いられるｒＧＥＤＡＪバッフ
ァーなる語句は、その様なバッファー中のＧＥＤＡを意
味している。

本発明の精・製法では、ＧＥＤＡ詔よびｐＨ７〜８のバ
ッファーの存在下で調製、維持され、プロテアーゼ阻害
剤で処理されたエキスパンダーゼ酵素の粗細胞抽出物（
エキス）を、まず、予めバッファー中ＧＥＤＡで平衡化
された弱い陰イオン交換樹脂でクロマトグラフする。Ｇ
　Ｅ　Ｄ　Ａ！衝液に入れた塩化カリウムまたは塩化ナ
トリウムあるいはトリス−ＨＣｊ　　で樹脂から酵素を
溶離し１次いで、Ｈ，Ｐ　Ｌ　Ｏアッセイによって確認
した主要な活性のピークをゲル押退する。次に、ゲル押
退した酵素をＧＥＤＡとりん酸カリウムのグラジェント
の混合物を用い、ヒドロキシルアパタイト（りん酸カル
シウム水和物）によりクロマトグラフする。

この３段階工程で得られる酵素をドデシル硫酸すトリク
ふ一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）によって測定すると、純度は約８０Ｘ〜約８５Ｘで
ある。

酵素を、下記の如くにしてざらに精製することができる
。採取した溶出液を所望によりセリンプロテアーゼ阻害
剤で処理し、強い陰イオン交換樹脂による。高速タンパ
ク質液体クロマトグラフィーにかけ、この場合も、溶離
剤としでＧＥＤＡと塩化カリウムまたはトリス−ＨＣｌ
　グラジェントを用いて溶離する。この様にしで得られ
る酵素の純度は約９５％である。

酵素活！１：（それは、酵素の純度を反映している）は
、本明細書中、活性単位（Ｕ）で表わす。エキスパンダ
ーゼ活性１単位は、１分間に、ペニシリンＮから１μモ
ルのＤＡＯＣ＋ＤＡＣを生成させるのに必要な酵素の量
と定義する。ヒドロキシラーゼ活性１単位は、１分間に
ＤＡＯＣから１μＭのＤＡＣを生成させるのｆこ必要な
酵素の量と定義する。

本発明方法は３段階工程で表わすことができる。

第１段階に用いられるエキスパンダーゼの粗細胞エキス
は、ｐＨ７〜８の７５ソファ−１好ましくは約５０ｍＭ
トリス−ＨＣ／バッファー（ｐＨ７，５）中、ＧＥＤＡ
の存在下でセファロスポレウム・アクレモニウムの新鮮
な細胞浮遊液を音波処理することにより得られる。この
音波処理の間、細胞から遊離された酵素を保護するため
に、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ
）またはジインプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ
）の如きセリンプロテアーゼ阻害剤を加える。音波処理
の後、細胞浮遊液を遠心して細胞片と他の不溶物を除去
し、上清に酵素を得る。本明細書では。

この上清を「粗細胞抽出物（エキス）」と称する。

本発明工程の第１段階は１弱い陰イオン交換樹脂をＧＥ
ＤＡバッファーで平衡化し、酵素の粗細胞エキスを適用
することからなる。１５ｍＭ）リス−Ｈ（：１（ｐＨ７
，５）、あるいはりん酸ナトリウムまたはりん酸カリウ
ムバッファー中にＧＥＤＡを入れたＧＥＤＡバッファー
で樹脂を洗浄する。

洗浄した樹脂から、ＧＥＤＡバッファー中約５０ｍＭ〜
約６００ｍＭ塩化カリウムのリニアー（線状）グラジェ
ント、あるいはＧＥＤＡ中約１５ｍＭ〜約５００ｍＭの
トリス−ＨＣｌの線状グラジェントで酵素を溶離する。

複数の両分を採取し、後述の如くにしてその各々をＨＰ
　Ｌ　Ｃで分析する。

酵素は、４０Ｍ　〜６０Ｍ　ＫＣＩまたは８０ｍＭ〜１
００ｍＭトリスＨＣｊで溶離する間に、エキスパンダー
ゼ活性の１本の主ピークと２本の小ピークとして溶離さ
れる。第１段階における弱い陰イオン交換樹脂精製の結
果を第１Ａ図に示す。

本発明方法に用い得る弱い陰イオン交換樹脂には、ジエ
チルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥセルロース、ワ
ットマン、インコーポレ、−テッド）等の市販品から入
手可能なセルロース誘導体樹脂、あるいはジエチルアミ
ノエチルトリスアクリル共重合体（ＤＥＡＥ−トリスア
クリル、ＬＳ。

ＬＫＢインスツルメンツ、インコーホレーテッド）等の
Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アクリルア
ミドの共重合体の如きアクリル共重合体樹脂等の樹脂が
含まれる。

陰イオン交換クロマトグラフィーによる主ピークを含む
両分をプールする。次いで１本発明工程の第２段階とし
で、プールした両分をゲル濾過する。

ゲルを大量に用いることを避けるために、プールした画
分の容積を１例えば、限外押退によりタンパク質約５・
Ｏ’９　／　ｍｆｆ１程度に減することが好ましく、Ｎ
。

第１段階で得た。プールした両分またはその濃縮物を加
える前にＧＥＤＡバッファーでゲルを平衡化しでおく。

酵素をゲルからＧＥＤＡバッファーで洗い出し、ＨＰＬ
Ｃ分析のためｆこ複数の両分を採取する。第２段階のゲ
ル濾過の結果を第１Ｂ図に示す。本発明工程の第２段階
ｉこ用いるには。

市販されている多くの、交差結合した多糖類型のゲルが
適する。例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　
）の如き交差結合したデキストラン。

セファロース（５ｅｐｈａ　Ｉ　１ｏｓｅ　）の如き交
差結合したアガロース、セファクリル（５ｅｐｈａｃｒ
ｙｌ　）　　の如き共有結合的に結合したアクリルデキ
ストラン（ファルマシア、インコーポレーテツドから入
手可）を用いることができる。

比活性が少くとも約０．３Ｕ／ηであるゲル濾過の両分
を一緒にし１本発明工程の第３段階としで。

例えばヒドロキシルアパタイトの如きりん酸カルシウム
水和物でクロマトグラフする。使用に先立ち、ヒドロキ
シルアパタイトを、２０ｍＭりん酸カリウム中のＧＥＤ
Ａバッファーで平衡化する。

３０．４０．６０．８０および１００ｍＭりん酸カリウ
ムの段階的グラジェントまたはりん酸カリウム約２０ｍ
Ｍ〜約１００ｍＭの線状グラジェントで酵素を溶離する
。再度、分析のためＥこ複数の画分を採取する。酵素は
、数個の小ピークを伴なった１本の主ピークとして溶離
される。主ピークは、比活性的０．５００Ｕ／η以上の
両分を含む。

これらの画分け、プールするか、あるいは個々に用いる
ことができ、所望により、採取後またはプールした後、
ＰＭＳＦの如きセリンプロテアーゼ阻害剤で処理する。

通常、ＰＭＳＦを、濃度約０゜２５ｍＭまで加える。

本工程の粗抽出物の調製およびクロマトグラフィ一工程
は約り℃〜約１０℃、好ましくは約４℃で都合良く行わ
れる。

本工程の第３段階で得られる酵素の純度は、ペニシリン
ＮをデアセトキシセファロスポリンＣおよびデアセチル
セファロスポリンＣに効率良く変換するのに十・分であ
る。

本発明工程の第３段階による精製の結果を第１Ｃ図に示
す。第３段階を終えた後の酵素の純度は通常、約８０％
〜約８５％である。

本工程の粗細胞エキスから第３工程までの酵素の精製の
進行度を表２に示す。

表２　エキスパンダーゼ−ヒドロキシラーゼ精製 粗細胞エキス１２．５００　４８５　　１００　０．０
３９　　１．０（第１段階） 所望により、強い陰イオン交換樹脂によりクロマトグラ
フして純度的９５％まで、＃素をさらに精製する。最高
純度の酵素を得るためには、比活性が最も高い（通常、
約０．８Ｕ／ηまたはそれ以上）、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーにおける主ピークから得た両分
を高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ｌ
こより、強い陰イオン交換樹脂でクロマトグラフする。

好ましい樹脂は、高分子陰イオン交換樹脂であるモノ（
Ｍｏｎｏ）Ｑ（ファルマシア、インコーホレーテッド）
である。まず、樹脂をＧＥＤＡバッファーで平衡化し、
次に、酵素を含んだ、第３段階から得たフラクションを
樹脂に加える。酵素を、０〜０．４ＭＫＣ！・またはＮ
ａＣ１のグラディエンド。

あるいはトリス−ＨＣ／グラジェントで溶離する。

複数の両分を採取し１分析する。

第１Ｄ図はＥＰＬＣによって得られた活性およびタンパ
ク質の溶離像を示す図である。

本工程の第１段階を、粗抽出物を弱い陰イオン交換樹脂
で予備精製することにより変更しでもよい。例えば、酵
素をＧＥＤＡの存在下、約５０ｍＭのトリス−ＨＣｊバ
ッファーで樹脂から洗い流すこと番こより、混入してい
るタンパク質を除去することができる。この濃度では、
酵素は樹脂に保持されず通過する。しかしながら汚染性
のタンパク質は保持され、約１．６倍の精製が行われる
。次いで、上記の如くにして酵素含有洗液を弱い陰イオ
ン交換樹脂でクロマトグラフする。

本工程の第３段階を経で精製した後、所望により、ＤＥ
ＡＥセファロース（ファルマシア、インコーポレーテツ
ド）の如き交差結合し、たアガロース等の、交差結合し
た多糖類型の樹脂によるクロマトグラフィーにかけ、第
４段階を行うことができる。第３段階におけるクロマト
グラフィーで得た高活性画分を合して樹脂に加えること
が好ましい。樹脂をＧＥＤＡバッファーで予備処理しで
おき、ＧＥＤＡバッファー中、０．０５Ｍ〜０．６Ｍの
ＫＣＩまたはＮａＣ１による線状グラジェントで酵素を
溶離する。分析のために、複数の両分を集める。

本発明工程によれば、比活性的０．２Ｕ／ＩＩｙ１〜約
０．８Ｕ／”Ｓ’の純化エキスパンダーゼが得られる。

本工程の一例を示すと、上記の如くにして新鮮な細胞６
００ｇから調製した酵素の粗抽出物を。

ＧＥＤＡバッファーで予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（２，５Ｘ４１ＣＩＫ）でクロマトグラフす
る。樹脂を、最初％０．０５ＭＫＣｌの存在下、ＧＥＤ
Ａバッファーで洗浄する。

ＧＥＤＡバッファー中０．０４Ｍ〜０．６Ｍ塩化カリウ
ムを含有する線状グラジェントで酵素を溶離する。流速
２５ｍＱ１時で多数の１０−画分を採取し、各々を後述
の如くにしてＨＰＬＣ分析にかける。エキスパンダーゼ
は、０．０４Ｍ〜０．０６Ｍ塩化カリウムの間に、１本
の主ピークと２本の小ピークとして溶離する（ＨＰＬＣ
分析）。全エキスパンダーゼ活性の約８５％が主ピーク
中に存在している。

比活性的０．０８８　Ｕ／＃１９以上の主ピークの両分
をプールし、限外押退により濃縮する。濃縮物を。

予めＧＥＤＡバッファーで平衡化しでおいたセファクリ
ルＳ−２００（ファルマシア、インコーポレーテツド、
ビスカッタウェイ、ＮＪ）でクロマトグラフする。ＧＥ
ＤＡバッファーでエキスパンダーゼ活性を溶離し、流速
約４ｏｍｆｆｉ／時で約１０ｍＱの両分を多数採取し、
比活性が少くとも約０．３３　Ｕ／／１１５１である両
分を一緒にする。

プールした画分を、使用に先立つて、２０ｍＭりん酸カ
リウムの存在下０ＥＤＡバツフアーで平衡化しておいた
ヒドロキシルアパタイトでクロマトグラフする。濃度約
３０１４０Ｊ６０．８０および１００ｍＭのりん酸カリ
ウムを含んだＧＥＤＡバッファーの段階的グラジェント
によってエキスパンダーゼを溶離する。流速的１５ｍＱ
／時で約５ｍｆｆ１の両分を多数採取する。各画分を分
析すると、エキスパンダーゼは１本の主ピークと数本の
小ピークとして溶離している。約０．５５８　Ｕ／ＩＩ
９以上の活性を含み、主ピークを形成する両分は全活性
の約８０％を含有している。

両分を濃度約０．２５ｍＭのフェニルメチルスルホニル
フルオライド等のプロテアーゼ阻害剤で処理する。

粗エキスパンダーゼ製品は様々なセファロスポリンＣ産
生微生物から得られる。粗細胞エキスの調製には、セフ
ァロスポリンＣの高い生産能を有するものを用いること
が好ましい。好適な酵素供給源としで挙げられるものＥ
こは、セファロスポリウム・アクレモニウム（クリソゲ
ナム）ＡＴＣＣ１１５５０、Ｃ，アクレモニウム（クリ
ソゲナム）ＡＴＣＣ３６２２５＃よび高い力価のものを
産生ずるＣ、アクレモニウム（クリソゲナム）ＡＴＣＣ
４８２７７がある。セファロスポリン類の産生菌として
知られでいるストレプトマイセス・クラブリゲルスの株
も粗酵素の供給源である。

純化酵素（、第３段階）のエキスパンダーゼおよびヒド
ロキシラーゼ活性の適切なパラメーターを表３に示す。

表３　適切な触媒のパラメーター 活　　　性 エキスパ　　ヒドロキ 反応のパラメーター　　　　　２ターセ　　　ッラーセ
至適　ｐＨ７，５〜７４３　７．３ 至適温度（１：）　　　　　２６〜３４３６〜３８最小
飽和 （Ｆｅ”］　（μＭ）　　　　　　　　５０　　　５０
以下の刺激によって得られる 最大の再活性化１ ＤＴＴ（１，０ｍＭ）　　　　　　　　Ｏ〜５０．　　
０〜０．２３アスコルベート（０，２５ｍＭ　）　　　
Ｏ〜９０　　　０〜０．８１ＡＴＰ　（０，０５ｍＭ）
　　　　　　３８〜５２　０．５７〜０．６１１：初期
値：最終の活性、ＵｘｌＯ−３純化酵素の三機能性によ
り、６０分間の反応の間１こペニシリンＮはＤＯＡＣと
ＤＡＣの両者に変換された。ＤＡＯＣ＋ＤＡＣ／ペニシ
リンＮの化学量論的な比率は１：１に維持された。

同様に、純化酵素による６０分間のヒドロキシラーゼ触
媒反応でＤＡＯＣは定９量的にＤＡＣに、１：１の比率
で変換された。この化学量論的な作用を図式化して第２
図に示す。

デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素の不安定さの
故に、これまで、この酵素は精製された状態で得られな
かった。上記の如く１本発明は。

精製工程の間−酵素を安定化するために、各クロマトグ
ラフィ一段階にＧＥＤＡを用いることからなるこの酵素
の精製方法を提供するものである。

ＧＥＤＡを用い、第３段階を経で得られる純化酵素は、
それ以上精製を行わなくとも、４℃で４日間保存した場
合、その活性の約９６％を保持し、４℃で７日間保存し
た場合、その活性の約８７％を保持している。本発明方
法で得られた純化酵素は、後の使用のために、ＧＥＤＡ
／（ソファ−中、−７０℃で保存することが好ましい。

また１本発明は、エキスパンダーゼ酵素を安定化する方
法であって、ｐＨ約７〜約８の間で、酵素の水性溶液ま
たは懸濁液を、グリセロールまたはスクロース、０１〜
Ｃ３−価アルコール、スルフヒドリル基含有還元剤右よ
びアスコルベートと混合することからなる方法（ここに
、スクロースは濃度５〜１５重量％に混合され、グリセ
ロールおよびｃｌ−Ｃ３アルコールはそれぞれ濃度約５
〜１５容量％に混合され、さらに、スルフヒドリｌし基
含有還元剤およびアスコルベートは、それぞれ、終濃度
約１ｍＭ〜２０ｍＭに混合されるものとし。

混合物の温度は約−７０℃〜約５℃の間に維持されるも
のとする）を提供するものである。

酵素の水性溶液または懸濁液は粗細胞エキス、あるいは
本発明方法で得られる部分的に精製された酵素または純
化酵素であってよい。また、酵素の粗細胞エキスをフェ
ニルメチルスルホニルフルオライドまたはジイソプロピ
ルフルオロホスフェートの如きセリンプロテアーゼ阻害
剤で処理することが好ましい。

本発明方法に用いられるアスコルベートは、アスコルビ
ン酸の塩、例えばナトリウム塩やカリウム塩を指す。

安定化混合物中に用いるには、スクロースよりもグリセ
ロールの方が好ましく、好ましい一価アルコールはエチ
ルアルコールでアル。いｆれも。

約１０容量％の濃度で用いるのが最適である。ジチオス
レイトールは好適なスルフヒドリル含有還元剤である。

ジチオスレイトールおよびアスコルベートの各々は、濃
度約１０ｍＭづつ安定化混合物中に存在さ・せるのが好
ましい。

安定化された酵素混合物のｐＨは、約７〜約８の間であ
ることが好ましく、特に、ｐＨ７，５であることが好ま
しい。望ましいｐＨ或は、トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
５）　　等の適当なバッファーＳこより維持され得る。

酵素安定化法の有効性は粗細胞エキスにおいで得られた
安定性≦こよって示されている。典型的な酵素の粗細胞
エキスは、濃度２ｍＭのＰＭＳＦ　。

１０％エタノール、１０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ
および１ｍＭアスコルベートを含有せしめた５０ｍＭ）
リス−ＨＣ／バッファー中（ｐＨ７，５）では、４℃で
７日間保存した後、その活性を１００％保持しでいた。

また、本発明は、酵素エキスパンダーゼの安定な組成物
であって、ｐＨ約７〜約８の酵素水溶液。

終濃度約５％〜約１５Ｘのグリセロールまたはスクロー
ス、終濃度約５％〜約１５％のＣ１−Ｃ３−価アルコー
ル並びに、それぞれ終濃度約１ｍＭ〜約２０ｍＭのスル
フヒドリル含有還元剤およびアスコルベートからなる組
成物を提供するものである。

組成物は、ジチオスレイトールおよびアスコルベートを
、それぞれ、終濃度約１０ｍＭで含有していることが好
ましい。

組成物は冷時、好ましくは０℃〜５℃で形成するとよい
。酵素溶液に各成分を個別に、任意の順序で加える。別
法としで、予め安定化剤を混合しておき、この混合物を
所望の濃度まで酵素に加えでもよい。

スクロースよりもグリセロールの方が好ましく。

好ａ　ｆ！　−価アルコールはエチルアルコールである
。

本発明方法で得られる純化酵素は、セファロスポリン核
７−アミノ−デアセトキシセファロスポリンＣ（７−Ａ
ＤＣＡ）の中間体であるデアセトキシセファロスポリン
Ｃの調製に有用である。７−ＡＤＣＡを既知の方法でア
シル化し、セファレキシンの如き３−メチルセファロス
ポリン抗生物質を得ることができる。ＤＡＣも同じく、
３−アシルオキシセファロスポリン抗生物質の製造に有
用である。純化形の酵素は、ペニシリンから抗生物質活
性を有するセファロスポリンへの変換に関する研究と同
様、クローニングを目的とする酵素のアミノ酸配列の決
定に特に有用である。

以下に示す方法および実施例により１本発明をさらに詳
しく説明する。

酵素の純度および工程の間１こおける精製程度は。

クロマトグラフィー法で得た両分のエキスパンダーゼ活
性およびヒドロキシラーゼ活性を高速液体クロマトグラ
フィーにより決定すると共に、クロマトグラフィー法で
得た両分のタンパク質バンドを５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分析することで決定される。エキスパンダーゼで触媒
される反応は、０．２８ｍＭペニシリンＮｓ０．６０ｍ
Ｍα−ケトゲルタレ−）　（Ｃ１ＫＧ）、ｏ、ｏ　６ｍ
Ｍ硫酸第工鉄。

０．６７ｍＭアスコルベー）、１．００ｍＭジチオスレ
イトール、０．０５ｍＭＡＴＰおよび５０ｍＭ）’Ｊス
ーＨＣ／（ｐＨ７，５）１ｍＱ中の酵素０．０００３〜
０．００３単位を用い、３０１：で１５分間行われる。

ヒドロキシラーゼで触媒される反応は、同じ媒質中、ペ
ニシリンＮの代りＥこ０．０５ｍＭ濃度のデアセトキシ
セファロスポリンｃを用いｒ３６℃で行われる。

１−のエチルアルコールを加えることによって酵素反応
を中断した。４，０００Ｘｇで５分間遠心して沈殿を分
離し、ｉ素反応の生成物を含んだ上清を下記の如くにし
でＨＰＬＣで分析した。酵素が明らかに二機能性である
ことから、ペニシリンＮからのＤＡＯＣおよびＤＡＣ両
者の生成を監視することによりエキスパンダーゼ活性を
決定した。

ヒドロキシラーゼ活性は、ＤＡＯＣからのＤＡＣの生成
を監視することで決定された。

上澄液の一部（２０〜１００μりをとり、外部基準を用
い、ＨＰＬＣでＤＡＯＣおよびＤＡＣに関しで分析した
。

以下の成分からなるＨＰＬＣシステムが好ましい。７２
１型システム制御装置（コントローラー）、７３０型デ
ーター変換装置（モジュル）。

５１０ＥＦ型、ポンプ、７１０Ｂ型ウオーターズ・イン
テリジェント・サンプル・プロセッサー（Ｗａｔｅｒｓ
　Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｏｃｅ
ｓｓｅｒ）およびラムダ−マックス・４８１型ＬＣスペ
クトロフオトメーター（Ｌａｍｄａ　−Ｍａｘ　Ｍｏｄ
ｅｌ　４８１ＬＣｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
　）　　（ウォーターズーアソシエーション（Ｗａｔｅ
ｒｓ　Ａｓ５ｏｃ、　）　ｓ　ミルホールド、ＭＡ）。

ＤＡＣおよびＤＡＯＣを、迅速にμボンダパック（Ｂｏ
ｎｄａｐａｋ　）　−ＮＨ４カラム（０，８Ｘ　１０ｃ
ｔ）　（ウォーターズ・アソシエーション）ｌこ圧縮充
填し、移動相としで２Ｘ酢酸−０〜４％メチルアルコー
ル−６〜７９ｃアセトニトリル−８７〜９２９（水、ｐ
Ｈ’３．８を用い、流速１．５〜２．０ｍ９１分で分離
させ％２６０　ｎｍで検出（セファロスポリン発色団）
することが好ましい。この分析は、エキスパンダーゼお
よびヒドロキシラーゼの両者による触媒反応の重複分析
においで。

偏差２％で再現性を有するものである。

これら２種の活性に関する代表的なＨＰＬＣ分析の結果
を第３図に示す。エキスパンダーゼ分析のためには、共
溶出されるので、ＤＡＣに関する定量値（ＤＡＯＣの定
量値に加えて）を、ペニシリンＮに関しで修正する。

弱い陰イオン交換クロマトグラフィー（第２段階）で得
た活性なエキスパンダーゼの分子量は。

予め、１ｍＭＤＴＴおよび１ｍＭアスコルベートの存在
下、５０ｍＭトリス−ＨＣ／、ｐＨ７，５で平衡化した
バイオゲＩＬ／　（Ｂｌｏ−Ｇｅ１　）　Ａ　０．５　
ｍカラム（１，６Ｘ１００Ｃ１１）を用いてゲル濾過す
ることにより算出された。系のカリブレーションは、酵
母のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＭＷ−８０，０００
）、ウシ血清アルブミン（ＭＷ−６６゜０００）、卯ア
ルブミン（ＭＷ−４５，０００）、炭酸脱水酵素（ＭＷ
３１，０００）およびリボヌクレアーゼ（ＭＷ−１３，
７００）を用いて行われた。

ＦＰＬＣでさらに精製した酵素の最小分子量を。

タンパク質の分子量標準を用い、ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって求めた。

純化酵素の等電点は、アンダーマンら（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ、　Ｎ、　Ｇ、　）　ｓアナライザー・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　８５　　
、３３１〜３４０（１９７８）およびアンダーマンら（
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　、　Ｎ、　Ｌ、　）アナライザー・
バイオケミストリー８５，３４１〜３５４（１９７８）
の記載の如くにしで決定された。

電気泳動は、４％アクリルアミドゲル中％　５％（ｐＨ
３，５〜１０）両性電解質（ファルマシア・インコーホ
レーテッド供給）を用いで行われた。

銀染色でタンパク質を観察した。

純化酵素のアミノ酸組成は、強い陰イオン交換樹脂の溶
出液をＭｏｎｏＱ　　上、ＦＰＬＣにかけで決定した。

溶出液を６ＮＨＣｌ中、１１０℃で２４．４８．７２　
および９６時間加水分解した。

ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）アミノ酸アナライザー
（６３００型）にかけ、コンピューターによる積分シス
テムを用いてアミノ酸を分析した。スレオニンおよびセ
リンを、加水分解０度として外挿した。システィンは、
ジメチルスルホキシド処理後、システィン酸としで計算
された。トリプトファンは、チオグリコール酸による加
水分解によって求められた。

酵素のタンパク質含有量はウシ血清アルブミンのフラク
ション■を標準に用い、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ、　Ｍ、　Ｍ−）、アナリテイカ／Ｌｌ　・バイ
オケミストリー、７２，２４８〜２５４（１９７６）の
方法に従って決定された。

実施例１　セファロスポリン産生生物の増殖セファロス
ポリンＣ生産性の高い、セファロスボレウム・アクレモ
ニウムをクイーナーら（Ｑｕｅｅｎｅｒ、　Ｓ、　Ｗ、
　）　（１９８４）の記載による複合液体培地を入れた
５０ｍｊ！のエーレンマイヤー・フラスコ中で９６時間
増殖させた。セファロスポリンＣの発酵：硫黄代謝の生
化学的および調節的観点（、ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ａｓｐｅｃｔｓｏｆ　
５ｕｌｆｕｒ　ｍｅｔａ　ｂｏｌｉｓｍ　）　１４１〜
１７０頁。

Ｅ、　Ｊ、ヴアン、・ダーム（Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ　）
　（編）、工業的抗生物質の生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ　）、マルセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅ
ｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　）インコーホレーテッド、ニューヨ
ーク。

２０、ＯＯＯＸｇで１０分間遠心し、１．０Ｍ塩化カリ
ウムの存在下、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌバッファーで洗
浄し、さらに、塩化カリウムの非存在下、該バッファー
で再び洗浄することにより細胞を収穫した。

酵素の精製 エキスパンダーゼの精製は、約り℃〜約４℃の温度で行
われた。使用に先立ち、全てのバッファーを完全に脱気
した。

新鮮な細胞（湿重量６００ｇ）を１０％グリセロール、
ＩＯＸエタノール、１０ｍＭジチオスレイトールおよび
１０ｍＭアスコルベートの存在下。

総容量が１１となるよう、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ７，５）に再懸濁した。懸濁した細胞を温
度４℃またはそれ以下で音波処理することにより破壊し
た。音波処理の間、フェニルメチルスルホニルフルオラ
イドを何度も加え、終濃度を２ｍＭとした。ＤＮａｓｅ
および硫酸マグネシウムを加えで、それぞれの濃度を１
μｇ／ｒｄ　　および２ｍＭとした。音波処理した懸濁
液を４０．ＯＯＯＸｇで３０分間遠心し、上清を分離し
て酵素の粗エキスを得た。粗エキスを分析し、総タンパ
ク質含量１２，５００η、比活性０．０３９Ｕ／岬、総
活性４８５Ｕを得た。

粗エキスを、予めＧＥＤＡバッファーで平衡化しでおい
たＤＥＡＥ−トリスアクリルＬＳカラム（５ａｍ　Ｘ　
３００　ｔｘ　）に充填した。５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ
バッファーでは、エキスパンダーゼはカラムに保持され
ないが、混在するタンパク質が保持されることによって
ｒ液中の酵素の精製度は約１．６倍■こなった（総タン
パク質＝　６，２００．Ｕ、Ｍｌ＝０．０６３、総活性
＝３９３Ｕ）。

このｒ液を、予めＧＥＤＡバッファーで平衡化してお一
４Ｊ）たＤＥＡＥセルロースカラム＜　２．５　Ｘ４１
０〕に充填した。カラムを、０．０５Ｍ塩化カリウムの
存在下、・カラム容量の４倍のＧＥＤＡバッファーで洗
浄した。洗浄後、ＧＥＤＡバッファー中ＫＣ７０，０５
Ｍ〜０．６０Ｍの線状グラジェント（総容量８００ｍｆ
ｆ１）を該カラムに適用した。流速２５ｍｔＺ時で１０
ｍＱづつの両分を採取した。酵素は１本の主ピークと２
本の小ピークとしで、　ＫＣＩ　　０゜０４Ｍ〜０．０
６Ｍの間で溶出した。全活性の約７５％が主ピークに存
在しでいた。比活性が０．０８８Ｕ／岬以上を示す主ピ
ークに由来する両分をプールし、ＰＭ３０メンプランを
備えたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ　）　　限外濾過によつ
て９．５　ｍＱに濃縮し。

得られた濃縮物を、予めＧＥＤＡバッファーで平衡化し
たセファクリルＳ−２００カラム（５ｏｘ　Ｘ８５Ｃ１
ｌ）に充填した。流速４０ｍＱ１時で１０ｍｆｆ１の両
分を採取した。比活性が少くとも０．３３Ｕ／ηである
画分を一緒にし、予め２０ｍＭりん酸カリウムの存在下
ＧＥＤＡバッファーで平衡化させたヒドロキシルアパタ
イトカラム（１，６ｃｍＸ、９５ｏａ）に充填した。カ
ラムを２カラム容量の同バッファーで洗浄した。りん酸
カリウムを３０．４０．６０．８０および１００ｍＭ含
んだＧＥＤＡバッファー１００ｍｆｆ１の段階的グラジ
ェントでカラムから酵素を溶離した。流速１５ｍｆｆ１
／時で５ｍＱづつの両分を採取した。酵素は、１本の主
ピークと１本の小ピークとじて溶離した。主ピークは全
活性の約８０％を含有していた。酵素を含有する各フラ
クションｉこフェニルメチルスルホニルフルオライドを
０．２５ｍＭとなるように加えた。最高の比活性（０，
８２７Ｕ／η）を有する主ピーク由来の両分を下記の如
く、ＭｏｎｏＱを用い、高速タンパク液体クロマトグラ
フィー（ＦＰＬＣ）、ファルマシア・インコーポレーテ
ッド、ビスカッタウェイ。

ＮＪにより、さらに精製した。

比活性が最も高い主ピークの画分の一部（５，６Ｍ９）
を、予めＧＥＤＡバッファーで平衡化させたＭｏｎｏ　
　Ｑ　カラム（０，５ｃｍ　Ｘ　５　ｃｘ　）に充填し
た。

ＧＥＤＡバッファー中の０〜０．４ＭＫＣｌ線状グラジ
ェント（総量−３２ｍ１りで酵素を溶離した。

流速３０ｄ／時で１−の画分を集めた。ＭｏｎｏＱＥＰ
ＬＣからの、活性とタンパク質の溶離像を第４図に示す
。

ヒドロキシルアパタイトクロマトゲフィーから得た比活
性０．５５８　Ｕ／ＩＩ９以上の他の画分を一緒ニＬ、
予めＧＥＤＡバッファーで平衡化させたＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラム（１，６０ＩＸ９５０ｍ）に充填した。

このカラムを、　０．０５Ｍ　Ｋ（、／の存在下、カラ
ムの２容量のバッファーで洗浄した。

ＧＥＤＡバッファー中、０．０５Ｍ〜０．６０　Ｍ　Ｋ
ＣＩの線状グラジェント・（総量＝４００ｍＱ）で酵素
を溶離した。流速１５ｍＱ／時で５ｍｆｌの両分を集め
た。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ−Ｄはそれぞれ、酵素エキスパンダーゼの精製
工程の各段階における精製状態を示すグラフであって、
Ａは酵素の粗抽田物のＤＥＡＥ−トリスアクリルクロマ
トグラフィーによる精製、ＢはＡで得た溶出液のセファ
クリルＳ−２００ゲルによるゲル押通、ＣはＢで得た炉
液のヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによる
精！！、ＤはＣで得た溶出液のＭｏｎｏ　Ｑ　　による
ＦＰＬＣ精製の結果を表わす。第２図は第３段階で得た
純化ｊＬｔのエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ活性
（Ａ）およびヒドロキシラーゼ活性（Ｂ）が化学量論的
なものであることを示すグラフであって。 −・はペニシリンＮ、ｃ−ｏはＤＡＯＣ，ｏ−ｏはＤＡ
Ｃを表わす。第３図はＨＰＬＣによる。酵素のエキスパ
ンダーゼ活性（Ａ）およびヒドロキシラーゼ活性の分析
結果を示すクロマトグラムである。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンノずニー 代理人弁理士青山　葆（外１名） ＦＩＧ、２ 反応時開（分） 層斥」１７　（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、等電点が約６．０±０．５、ゲルろ過による分子量
   測定値が４３，０００、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動により測定した最小分子量
   が４１，０００、アミノ酸組成が以下の表： ￥アミノ酸残基￥　　　　　￥残基数／４１，０００ダ
   ルトン￥　Ａｓｘ（Ａｓｐ＋Ａｓｎ）　　３７ 　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　２４ 　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　２６ 　Ｇｌｘ（Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ）　　３５ 　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　２１ 　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　３１ 　Ａｌａ　　　　　　　　　　　３４ 　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　３２ 　Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　６ 　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　５ 　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　８ 　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　２７ 　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　１０ 　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　２０ 　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　６ 　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　１７ 　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　２９　 　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　３ 　計　　　　　　　　　　　３７１ で示されるタンパク質モノマーであつて、比活性が約０
   ．２Ｕ／ｍｇ〜約０．８Ｕ／ｍｇであり、ヒドロキシラ
   ーゼ活性とエキスパンダーゼ活性を有し、ヒドロキシラ
   ーゼ活性のエキスパンダーゼ活性に対する割合が約０．
   １５±０．０４であり、式：【遺伝子配列があります】
   ；および 【遺伝子配列があります】 で示されるペプチドフラグメントを含有している純化さ
   れた形の酵素デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素
   。 ２、純化酵素デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素
   の製造方法であつて、 １）ｐＨ約７〜８に緩衝化されたプロテアーゼインヒビ
   ターおよびＧＥＤＡを含有している該酵素の細胞不含の
   水性粗抽出物を弱い陰イオン交換樹脂と接触させ、塩化
   カリウムまたは塩化ナトリウムのグラジエントあるいは
   トリス−ＨＣｌのグラジエントであつて、ＧＥＤＡを含
   有するグラジエントで溶離し、 ２）第１段階の酵素含有溶出液を交差結合した多糖類ゲ
   ルでゲルろ過し、該ゲルをＧＥＤＡで洗浄し、 ３）第２段階の酵素含有ろ液をヒドロキシルアパタイト
   と接触させ、ＧＥＤＡ含有りん酸カリウムのグラジエン
   トで酵素を溶離することからなる段階を含む方法 〔ここに、ＧＥＤＡは、濃度約５％〜１５％のグリセロ
   ールまたはスクロース、濃度約５％〜約１５％のＣ＿１
   〜Ｃ＿３アルキルの一価アルコール、濃度約１ｍＭ〜約
   ２０ｍＭのスルフヒドリル含有還元剤、および濃度約１
   ｍＭ〜約２０ｍＭのアスコルベートである〕。 ３、さらに、第３段階の酵素含有溶出液を強い陰イオン
   交換樹脂と接触させ、ＧＥＤＡを含有するトリス−ＨＣ
   ｌのグラジエントまたは塩化カリウムあるいは塩化ナト
   リウムのグラジエントで酵素を溶離する段階を含む第２
   項記載の方法。 ４、第１段階の弱い陰イオン交換樹脂、第２段階のゲル
   、および第３階段のヒドロキシアパタイトが該酵素との
   接触に先立つてＧＥＤＡで平衡化されている第２項記載
   の方法。 ５、粗酵素抽出物がトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡
   化されている第２項記載の方法。 ６、グリセロールまたは糖の濃度が約１０％、Ｃ＿１−
   Ｃ＿３アルキルの一価アルコールの濃度が約１０％、そ
   してスルフヒドリル含有還元剤およびアスコルベートの
   濃度がそれぞれ約１０ｍＭである第２項または第３項記
   載の方法。 ７、グリセロール、エチルアルコール、ジチオスレイト
   ールおよびアスコルベートが存在している第２、第３ま
   たは第６項記載の方法。 ８、第１段階において、０．０４Ｍ〜０．６Ｍの塩化カ
   リウムまたは塩化ナトリウムのリニア−グラジエントで
   酵素を溶離する第２項記載の方法。 ９、第１段階におけるグラジエントが０．０１５Ｍ〜０
   ．５Ｍトリス−ＨＣｌである第２項記載の方法。 １０、第１段階において、弱い陰イオン交換樹脂がジエ
   チルアミノエチルセルロースまたはジエチルアミノエチ
   ルポリアクリル樹脂である第２項記載の方法。 １１、第３段階において、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭの
   りん酸カリウムグラジエントで酵素を溶離する第２項記
   載の方法。 １２、酵素デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素の
   安定化法であつて、ｐＨ約７〜約８において、該酵素水
   溶液をグリセロールまたはスクロース、Ｃ＿１−Ｃ＿３
   アルキルの一価アルコール、スルフヒドリル含有還元剤
   およびアスコルベートと混合することからなる方法 ここに、グリセロールまたはスクロースおよび一価アル
   コールはそれぞれ濃度約５％〜１５％に混合し、還元剤
   およびアスコルベートはそれぞれ濃度約１ｍＭ〜約２０
   ｍＭに混合し、混合物の温度は約−７０℃〜約５℃の間
   に維持することを特徴とする方法。 １３、Ｃ＿１−Ｃ＿３アルキルの一価アルコールがエチ
   ルアルコールであり、スルフヒドリル含有還元剤がジチ
   オスレイトールである第１２項記載の方法。 １４、ジチオスレイトールおよびアスコルベートを濃度
   約１０％のグリセロールまたはエチルアルコールと、そ
   れぞれ濃度約１０ｍＭに混合する第１２項記載の方法。 １５、酵素デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素の
   安定化された組成物であつて、ｐＨ約７〜約８の酵素水
   溶液と、濃度約５％〜約１５％のグリセロールまたはス
   クロース、濃度約５％〜約１５％のＣ＿１−Ｃ＿３アル
   キルの一価アルコール、それぞれ、濃度約１ｍＭ〜約２
   ０ｍＭのスルフヒドリル含有還元剤およびアスコルベー
   トとを含有する組成物。 １６、グリセロール、エチルアルコールおよびジチオス
   レイトールを含有する第１５項記載の組成物。 １７、ジチオスレイトールおよびアスコルベートの濃度
   がそれぞれ約１０ｍＭであり、グリセロールおよびエチ
   ルアルコールがそれぞれ濃度約１０％で存在している第
   １６項記載の組成物。