KR880004086A - 정제 효소 및 정제 효소의 제조방법 - Google Patents

정제 효소 및 정제 효소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

정제 효소 및 정제 효소의 제조방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1A도는 효소 엑스판다체(expandase)의 조 추출물을 약한 음이온 교환수지상에서 크로마토그라피한 것에 관한 도.
제1B도는 약한 음이온 교환수지로부터 수득한 엑스판다제 함유 용출물을 겔 여과한 것에 관한 도.
제1C도는 수산화인회석(hydroxyapatite) 상에서 효소 함유 겔 여과물을 크로마토그라피한 것에 관한 도.
제1D도는 수산화인회석 크로마토그라피의 엑스판다제 함유 용출물을 FPLC 크로마토그라피한 것에 관한 도.
제2A도는 페니실린 N을 탈아세톡시 세팔로스포린 C로의 엑스판다제 전환 및 탈아세톡시 세팔로스포린 C를 탈아세틸세팔로스포린 로의 가수분해 효소 전환에 관한 도.
제2B도는 탈아세톡시세팔로스포린 C를 탈아세틸세팔로스포린 C로의 엑스판다제 전환에 관한 도.
제3A도는 효소의 엑스판다제 활성의 HPLC에 관한 도.
제 3B도는 효소의 가수분해 효소 활성의 HPLC에 관한 도.

Claims (17)

  1. 등전점이 약 6.0±0.5이고 : 겔여과로 측정한 분자량이 43.000이며 : 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 측정한 최소 분자량이 41,000이고 : 아미노산 조성은 하기와 같으며, 고유활성이 약 0.2μ/mg 내지 약 0.8μ/mg이고 : 가수분해 효소 활성 대 엑스판다제 활성의 비가 약 0.15±0.014인 엑스 판다제 및 가수분해 효소 활성을 나타내며 : 다음과 같은 펩타이드 단편을 함유하는 정제된 형태의 효소 탈아세톡시세팔로스포린 C 합성효소 :
    펩타이트 단편
    Ala-Val-Leu-Asn-Ser-Val-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Gly-Glu ; Gly-Phe-Glu-Asp-Val-Trp-Glu-Asp-Tyr-Phe-Asp-Arg : Val-Ala-Glu-Glu-Glu-Pro-Leu-Arg ; 및 Ala-Val-Thr-Leu-Ala-Asp-Arg.
  2. 1) 단백질 분해 효소 억제제를 함유하고, GEDA를 함유하며, 약 7내지 8의 pH로 완충된, 세포가 없는 효소의 수성 조 추출물을 약한 음이온 교환 수지와 접촉시키고, 효소를 염화 칼륨 또는 염화 나트륨의 구배 또는 트리스 -Hcl의 구배(언급한 구배는 GEDA를 함유한다)로 용출시키고 2) 제1단계의 효소 함유 용출액을 가교결합된 폴리사카라이드 겔상에서 여과하여 상기 겔을 GEDA로 세척하고 3) 제2단계의 효소 함유 여액을 하이드록실아파타이트와 접촉시키고, 효소를 GEDA를 함유하는 인산 칼륨의 구배로 용출시킴을(여기에서 GEDA는 약5% 내지 15% 농도의 글리세롤 또는 슈크로즈, 약 5% 내지 약 15% 농도의 C1내지 C3알킬 1가 알콜, 약 1mM 내지 약 20mM 농도의 설프하이드릴 함유 환원제 및 약 1mM 내지 약 20mM 농도의 아스코르베이트이다) 특징으로하여 정제된 효소 탈아세톡시 세팔로스포린 C 합성효소를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제3단계의 효소 함유 용출액을 강한 음이온 교환수지와 접촉시키고, 효소를 염화 칼륨 또는 염화 나트륨의 구배 또는 GEDA를 함유하는 트리스-Hcl의 구배롤 용출시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 제1단계의 약한 음이온 교환수지, 제2단계의 겔 및 제3단계의 하이드록시아파타이트를 상기 효소와 접촉시키기 전에 GEDA로 평형화 시키는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 조 효소 추출물을 pH 7.5로 트리스-Hcl을 사용하여 완충시키는 방법.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 글리세롤 또는 당의 농도가 약 10%이며, C1-C3알킬 1가 알콜의 농도가 약 10%이고 설프하이드릴 함유 환원제 및 아스코르베이트의 농도가 각각 약 10mM인 방법.
  7. 제2항, 3항 또는 6항에 있어서, 글리세롤, 에틸알콜, 디티오트레이톨 및 아스코르베이트가 존재하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 제1단계에서 효소를 0.04M 내지 0.6M의 염화 칼륨 또는 염화 나트륨 선형구배로 용출시키는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 제1단계에서 구배가 0.015M 내지 0.5M의 트리스-Hcl인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 제1단계에서 약한 음이온 교환수지가 디에틸아미노에틸 세룰로즈 또는 디에틸아미노 에틸 폴리아크릴 수지인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 제3단계에서 효소를 약 20mM 내지 약 110mM 인산 칼륨의 선형구배로 용출시키는 방법.
  12. 효소의 수용액을 pH 약 7 내지 pH 약 8에서 글리세롤 또는 슈크로즈, C1-C3알킬 1가 알콜, 설프하이드릴 함유 환원제 및 아스코르로베이트와 혼합시키되, 글리세롤 똔느 슈크로즈 및 1가 알콜은 각각 약 5% 내지 약 15%의 농도로 한합시키고 환원제 및 아스코르베이트는 각각 약 1mM 내지 약 20mM의 농도로 혼합시키며, 혼합물의 온도를 약 -70℃ 내지 약 5℃로 유지시킴을 특징으로 하여, 효소 탈아세톡시세팔로스포린 C 합성효소를 안정화시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, C1-C3알킬 1가 알콜이 에틸알콜이며, 설프하이드릴 함유 환원제가 디티오트레이톨인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 디티오트레이톨 및 아스코르베이트를 약 10% 농도의 글리세롤 및 에틸 알콜과 약 10mM의 농도로 혼합시키는 방법.
  15. 약 7 내지 약 8의 pH의 효소 수용액, 약 5% 내지 약 15% 농도의 글리세롤 또는 슈크로즈, 약 5% 내지 약 15% 농도의 C1-C3알킬 1가 알콜 및 각각 약 1mM 내지 약 20mM 농도의 설프하이드릴 함유 환원제 및 아스코르베이트를 함유하는 탈아세톡시세팔로스포린 C 합성효소의 안정화 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 글리세롤, 에틸 알콜 및 디티오트레이톨을 함유하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 디티오트레이톨 및 아스코르베이트 각각의 농도가 약 10mM이고 글리세콜 및 에틸 알콜의 농도가 각각 약 10%인 조성물.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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