JPH0267284A

JPH0267284A - ピロロキノリンキノン類の回収・精製方法

Info

Publication number: JPH0267284A
Application number: JP21631788A
Authority: JP
Inventors: Sadaji Uragami; 貞治浦上; Kazuhiro Sugamura; 菅村　和弘; Kazuya Yashima; 八島　一也
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 1988-09-01
Publication date: 1990-03-07
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: JP2692167B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ピロロキノリンキノン類の回収・精製方法に
係わり、さらに詳しくは、ピロロキノリンキノン類溶液
からピロロキノリンキノン類を結晶あるいは沈澱物とし
て析出させ、このピロロキノリンキノン類の結晶あるい
は沈澱物を分離して、回収・精製する方法に関する。

ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記す）は、細菌
にかぎらず、真核生物の九とおよび酵母、さらには哺乳
動物などの！１ｌｉａ中にも存在していることが近年明
かにされた。

また、ざらにＰ　Ｑ　Ｑ、が、植物の花粉の発芽率を増
大させる効果が見出されている（Ｌ、Ｂ、Ｘｉｏｎｇ　
ｅｔａｌ、、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、
第５２巻、第４号、第１０６５頁〜第１０６６頁（１９
８８））。

このように、ＰＱＱは、補酵素として酵素反応または物
質代謝系を活性化する物質であり、たとえば、医薬品な
どとして重要な用途に使用される可能性がある。

［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］従来、
粗製ＰＱＱ水溶液からＰＱＱを分離、精製する方法とし
ては、たとえば、粗製ＰＱＱ水溶液をＤＥＡＥ−５ｅｐ
ｈａｄｅｘ　（ジエチルアミノエチル系陰イオン交換樹
脂−セファデックスバー２５フアルフ９フ社、商品名）
カラムを通過させて、この方うムにＰＱＱを吸着せさた
後、０〜ＩＭ（モル／Ｊ２）ＫＣＩ溶液でＰＱＱを溶出
する方法（Ｍ、　Ａｍｅｙａｍａｅｔ　ａｌ、、Ａｇｒ
ｉｃ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、、第４８巻、第５６１
頁〜５６５頁（１９８４））が知られている。

しかしながら、この方法では、得られたＰＱＱ溶出液は
、多量の無機塩（ＫＣＩなど）を含有しており、ＰＱＱ
ｍ度が低く、かつ、これから得られたＰＱＱはその純度
が低い。

そこで、より純度の高いＰＱＱを結晶あるいは沈澱物と
して得る精製方法の開発が望まれている。

［問題を解決するための手段、作用コ本発明者らは、ＰＱＱをはじめとするＰＱＱ類の精製方
法について研究を重ねた結果、粗製ＰＱＱ類を含む水性
溶媒溶液の塩濃度およびｐＨをそれぞれ０．２Ｍ以上お
よび４以下にすることにより、ＰＱＱ類の結晶あるいは
沈澱が溶液中に析出し、これらを分離することによりＰ
ＱＱ類が、結晶あるいは沈澱物として回収され、さらに
、得られた結晶あるいは沈澱物のＰＱＱ類の純度が向上
することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、粗製のＰＱＱ類を含む水性溶媒溶
液の塩濃度をアルカリ金属として０．２７）ム／、Ｑお
よびｆ）Ｈを４以下に保持することにより、ＰＱＱ類の
結晶または沈澱物を溶液中に析出させ、該ＰＱＱ類の結
晶または沈澱物を分離することを特徴とするＰＱＱ類の
回収・精製方法である。

本発明におけるＰＱＱ類とは、ＰＱＱＳＰＱＱのナトリ
ウム塩およびＰＱＱのカリウム塩なとのＰＱＱ塩類、な
らびにＰＱＱ誘導体を意味する。

ＰＱＱ誘導体の代表例としては、１−メチル−ＰＱＱ、
９−デカルボキシ−ＰＱＱ、７−ジカルボキシ−ＰＱＱ
、７．９−ジブカルボキシ−ＰＱＱおよび５−メチルキ
ノリン−７，８−ジオンなどがある。

粗製ＰＱＱ類としては、その製法などには特に制限はな
いが、通常、実用上は、ＰＱＱ類を生産する微生物を培
養して得られる。

すなわち、たとえばメチロバチルスグリコゲネス、メチ
ロバクテリウムエクストロクエンス、メチロバクテリウ
ムオルガノフィラム、メチロバクテリウムロブイウム、
メチロバクテリウムメソフィリカム、メチロバクテリウ
ムラジオトレランス、ハイホミクロビウムブルガレ、ハ
イホミクロビウムメチロボラム、アンシロバクターアキ
ュアティカス、キサントバクターオートトロフィカス、
キサントバクタ−フラバム、アセトバクターメタツリカ
ス、バラコッカスディニトロフィカンス、チオバチルス
ノベルス、オリゴモナスメタノリカ、メチロファーガマ
リーナおよびメチロファーガサラシカなどの、メタノー
ルを責化し、ＰＱＱ類を生産する微生物をメタノールを
炭素源とする培地中で培養して得られた培養液から、た
とえば、濾過および遠心分離などの固液分離手段によっ
て菌体な除いて得られた培養上澄液、この培養上澄液を
ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘ　（ファルマシア製）、５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０（ファルマシア製）ハイポー
ラスポリマーＨＰ（三菱化成工業（株）製）などを使用
したカラムで処理して得られた溶出液、このような培養
上澄液および溶出液のそれぞれから得られたＰＱＱ類の
粗製物ならびに有機合成によって得られたＰＱＱ類の粗
製物などの粗製ＰＱＱ類から高純度のＰＱＱが本発明の
方法によって回収・分離される。就中、培養上澄液から
得られた溶出液、この溶出液から得られたＰＱＱ類の粗
製物が、実用上、好ましい。

本発明の粗製ＰＱＱ類を含む水性溶媒溶液（以下、ＰＱ
Ｑ類溶液と記すこともある）とは、前記のような粗！！
ＰＱＱ類と水性溶媒との混合液である。なお、この混合
液に不溶な物質を、濾過および遠心分離などの固液分離
手段によって、除去することが好ましいが、不溶性物質
を含有する混合液をそのまま使用することを妨げない。

このときの水性溶媒とは水または、水と、たとえばメタ
ノール、エタノールおよびアセトンのような水溶性の大
きい有機溶媒との混合物である。

水と有機溶媒との比には特に制限はないが、通常は水１
容量部に対し、有機溶媒１０容量部以下とされる。

ＰＱＱ類溶液のＰＱＱ類の濃度には、特に制限はないが
、ＰＱＱ類の濃度が低いとＰＱＱ類の回収率が低くなる
ことから２０ｍｇ／　ｊ２以上が好ましく、特に１００
ｍｇ／　Ｊ２以上が好ましい。

ＰＱＱ類溶液に添加する塩としては、特に制限はないが
、実用上、無機塩類が好適に使用され、例えば、塩化ナ
トリウムあるいは塩化カリウムなどの無機中性塩類が好
ましいが、重炭酸ナトリウムおよび酸性リン酸カルシウ
ムなどの無機酸性塩を使用することもある。なお、この
塩濃度によ＝は、粗製ＰＱＱ類に含有されている塩も含
まれる。

これらの塩濃度は、塩を含有しているＰＱＱ類溶液中の
濃度として表示され、アルカリ金属として０．２７’）
ム／Ａ以上であればよく、特に０．４７）ム／ｌ以上が
好ましい。塩濃度の上限としては、ＰＱＱ類を析出させ
て回収するため、ＰＱＱ類の結晶および沈澱を析出させ
る際の温度における塩の飽和濃度未満とする必要がある
。

ＰＱＱ類溶液のｐＨを４以下とするために、塩酸および
硫酸など酸類ならびに前記の無機酸性塩などの酸性物質
が添加されるが、これらの中では酸類が好ましく塩酸が
特に好ましい。ＰＱＱ類溶液のｐＨは、４以下とされる
が、ＰＱＱ類の回収率およびＰＱＱ類の純度を高めるた
めには、ｐＨ２〜３．５とすることが特に好ましい。

なお、塩の添加および酸の添加の順序は、ＰＱＱ類の回
収率およびＰＱＱ類の純鵬二大きく影響４以下とされた
ＰＱＱ類溶液は、そのまま放置することによってＰＱＱ
類の結晶および沈澱が析出するが、比較的低温度で放置
すればより短い時間でＰＱＱ類の結晶あるいは沈澱物が
より多量に析出する。ＰＱＱの回収率を向上させるには
、１０℃以下、好ましくは３〜７℃で５時間以上放置す
ることが好ましい。

このようにしてＰＱＱ類の結晶または沈澱物が析出する
が、析出したＰＱＱ類の結晶または沈澱物は、遠心分離
、濾過およびデカント処理などにより、高い回収率で高
純度のＰＱＱ類を得ることが出来る。

得られたＰＱＱ類は、風乾あるいは乾燥されＰＱＱ類の
粉体として得られる。このようにして得られたＰＱＱ類
の粉体の純度は高いが、回収されたＰＱＱ類は、必要に
応じて、カラム処理あるいは再結晶などによりさらに精
製される。

［実施例コ以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例　１ハイホミクロビウムメチロボラムＤＳＭ　１８６９（Ｕ
ｒａｋａｍｉ　　ａｎｄ　　にｏｍａｇａｔａ、Ｊ、Ｇ
ｅｎ、Ａｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

、第３３巻、第５２１頁〜第５４２頁、（１９８７））
を培養して得られた培養液を遠心分離して、菌体を除去
し、ＰＱＱを含有する培養上澄液を得た。（ＰＱＱ濃度
３００μｇ／ｍ　ｌ　）。

２ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｆ１７．０）で予め平
衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５
（ファルマシア製）カラム（充ｔａｆｆｉ　４Ｘ２０ｃ
ｍ）に、この培養上澄液７，１２を通過させてＰＱＱを
吸着させた。

ついで、このカラムからＰＱＱを０．７Ｍ　ＮａＣｌ水
溶液で溶出させ、ＰＱＱを６３０μｇ／ｍｌ含有する液
を３ρ得た。

この溶液のＰＱＱ純度は、高速液体クロマトのＵＶ吸収
（２６０ｎｍ）で測定した結果、８０％であった。

なお、ＰＱＱは、この溶液中ではＰＱＱ争２Ｎａ塩とし
て存在している。このＰＱＱ溶液１．５ρにＨＣＩを添
加し、溶液のｐｌ（を３．０とし、５℃で２０時間放置
した処、ＰＱＱ・２Ｎａの結晶が析出した。

この液を１２０００Ｘ　９で２０分間遠心分離し、ＰＱ
Ｑ・２Ｎａ結晶を分離した。

このＰＱＱ・２Ｎａ全量と、純水１ρとを混合し、さら
にこの液のＰＨが６になるようにＮａ０ｔｌを添加し、
ＰＱＱφ２Ｎａを完全に溶解した。このＰＱＱの溶液を
高速液体クロマトで分析したところ、この溶液（７）Ｐ
ＱＱＩ度は８５０　μｇ／ｍ　ｌ　テア１１）、ＰＱＱ
純度は、高速液体クロマトのＵＶ吸収（２６０ｎｍ）で
９７％であった。

なお、回収率は、約９０％であった。

実施例　２実施例１のＤＥＡＥ−５ｅｐｈｄｅｘ　Ａ−２５カラム
の溶出液３βのうちの残部、１．５Ｊ２　（０，７Ｍ　
ＮａＣｌ、高速液体クロマトのＵＶ吸収（２６０ｎｍ）
でＰＱＱ純度は８０％、ＰＱＱ含量６３０μｇ／ｍ　Ｉ
　）を以下の実験に用いた。

予め純水で平衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１
０（ファルマシア製）カラム（充填量ｔｑｘｔ００ｃｍ
）に、前記のＰＱＱ含有液１．５ｊ２を通過させてＰＱ
Ｑを吸着させた。ついで、このカラムからＰＱＱを純水
で溶出させ、ＰＱＱ画分をＩＡ得た。　このＰＱＱ溶液
のＮａＣｌｎ度は０．４Ｍ、　Ｐ　Ｑ　Ｑｆｉ度は、８
７０７４　ｇ／ｍ１、高速液体クロマトのＵＶ吸収（２
６０ｎｍ）によるＰＱＱの純度は、９４％であった。

このＰＱＱ溶液にＮａＣｌを添加し、ＮａＣＩ　６度を
０．６Ｍとした。さらにＨＣＩを添加し、このＰＱＱ溶
液のｐＨを３．０とし、５℃で２０時間放置した処、Ｐ
ＱＱ・２Ｎａの結晶が析出した。

この液を１２０００Ｘ　９で２０分間遠心分離し、ＰＱ
Ｑ・２Ｎａ結晶を分離した。このＰＱＱ・２Ｎａ全量と
、純水１ｊ２とを混合して、この液のｐＨが５になるよ
うにＮａ０）１を添加し、ＰＱＱ・２Ｎａを完全に溶解
した。このＰＱＱの溶液を高速液体クロマトグラフィー
で分析したところ、この溶液のＰＱＱ澗度は８００μ８
７ｍ１であり、ＰＱＱの純度は、高速液体クロマトのＵ
Ｖ吸収（２６０ｎｍ）で９９．５％であった。なお、回
収率は約９２％であった。

実施例　３純度約８０剋％の粗ＰＱＱを純水とぶ合して得られたＰ
ＱＱを０．９３ｍｇ／ｍｌ含有するＰＱＱ溶？１（ｐＨ
５，５）を、三等分し、それぞれにＮａＣ１を添加して
ＮａＣＩ　ｖＡ度をそれぞれ０．３Ｍおよび１．０Ｍと
した。さらにこれらの溶液をそれぞれ６等分し、このそ
れぞれにＭＣＩを添加し、ｐ）１を２．０，２．５，３
．０，３．５，４．０および５．０とし、５℃で２０時
間放置し、ＰＱＱを析出させた。

それぞれの液を１２０００Ｘ　ｇで２０分間遠心分離し
、ＰＱＱ結晶を回収して乾燥し、その重量を測定して回
収率を求めた。なお、このようにして得られたＰＱＱの
純度はいずれも９６〜９９ｗｔ％であった。

その結果を第１表に示す。

第１表、ＰＱＱの回収率（％）ＮａＣＩｆｉ度を０．２Ｍ、０．５Ｍ、１．ＯＭ、１．
５Ｍおよび２．０Ｍとし、５℃で２０時間放置し、ＰＱ
Ｑ結晶を析出させた。

それぞれの液を１２０００Ｘ　９で２０分間遠心分離し
、ＰＱＱ結晶を回収して乾燥し、その重量を測定して回
収率を求めた。なお、このようにして得られたＰＱＱの
純度はいずれも９６〜９９剋％であった。

その結果を第２表に示す。

第２表、ＰＱＱの回収率（％）実施例　４純度的８２ｗｔ％の粗ＰＱＱを純水と混合して得られた
ＰＱＱを１．３ｍｇ／ｍｌ含有するＰＱＱ溶液（ｐ）１
５．５）を三等分して、これにＨＣＩを添加し、それぞ
れのｐＨを３および４とした。さらにこれらの溶液をそ
れぞれ５等分し、それぞれにＮａＣＩを添加し、実施例
　５純度約８０ｗｔ％の１ＪＩＰＱＱを５０ｖｏ　１％メタ
ノール水溶液と混合して得られたＰＱＱを０　、４ｍｇ
／ｍ　Ｉ含有するＰＱＱ溶液（ｐ）Ｉ　５．５）を二等
分し、それぞれにＮａＣｌを添加してＮａＣ１６度をそ
れぞれ１．０Ｍおよび２．０Ｍとした。さらにこれらの
溶ｉ夜をそれぞれ６等分し、これらに希塩酸を添加し、
ｐＨを２．０，２．５゜３．０，３．５，４．０および
５．０とし、５℃で２０時間放置し、ＰＱＱ結晶を析出
させた。それぞれの液を１２０００Ｘ９で２０分間遠心
分離し、ＰＱＱ結晶を回収して乾燥し、重量を測定して
回収率を求めた。なお、このようにして得られたＰＱＱ
の純度は、いずれも９６〜９９ｗｔ％であった。

その結果を第３表に示す。

（以下余白）第３表。

ＰＱＱの回収率（％）［発明の効果］本発明により、高純度のＰＱＱ類を結晶あるいは沈澱物
として回収することが可能となり、工業的に極めて大き
な利点がある。

Claims

【特許請求の範囲】

粗製のピロロキノリンキノン類を含む水性溶媒溶液の塩
濃度をアルカリ金属として０．２アトム／ｌおよびｐＨ
を４以下でそれぞれ保持することにより、ピロロキノリ
ンキノン類の結晶または沈澱物を溶液中に析出させ、該
ピロロキノリンキノン類の結晶または沈澱物を分離する
ことを特徴とするピロロキノリンキノン類の回収・精製
方法。