CN105566445B - 一种分离纯化还原型谷胱甘肽的方法 - Google Patents

一种分离纯化还原型谷胱甘肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法，包括步骤：1)向谷胱甘肽溶液中加入氧化剂，使其氧化至氧化型谷胱甘肽；2)向溶液中加入酸，调节pH至1.0‑4.0，离心或过滤；3)将步骤2)得到的离心或过滤后的溶液分别经过离子交换树脂、吸附树脂处理，得到氧化型谷胱甘肽洗脱液。4)将步骤3)得到的洗脱液使用还原剂进行还原得到谷胱甘肽溶液，将还原得到的谷胱甘肽溶液用吸附树脂脱盐，之后浓缩、结晶、干燥，得到谷胱甘肽。本发明操作简便、低污染、无需低温和氮气保护，能耗低，反应条件温和，适于工业化生产，得到的固体还原型谷胱甘肽的纯度＞99％。

Description

一种分离纯化还原型谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明涉及药物分离纯化领域，具体而言，涉及一种分离纯化还原型谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一种重要的调节生理功能的药物，在临床上的应用越来越广，已成为医学上重要的具有调节人体免疫功能和辅助抗癌功能的药物之一。GSH的抗氧化性又使它在食品工业中的应用备受人们关注。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的一种含γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物，在蛋白质和DNA的合成、氨基酸的转运、细胞的保护等重要的生物功能中起着直接或间接的作用。它主要分布于动物、植物、微生物细胞中，被广泛应用于临床医学、运动保健、食品加工等很多领域。
谷胱甘肽的相对分子质量为307.33，熔点为189-193℃，其晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5.93。它溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体相对较稳定，而水溶液在空气中易被氧化。两分子还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基氧化缩合为二硫键即可得到氧化型谷胱甘肽(GSSG)。
谷胱甘肽的生产目前主要有酶法和酵母发酵法两种，不管是哪种方法生产的谷胱甘肽，粗提液中均含有很多杂质，如蛋白质、多糖、多肽、氨基酸、盐类等等，而谷胱甘肽在水溶液中的稳定性不好，易氧化和降解，这给分离纯化带来了很大的困难，因此高纯度、高收率、环保低能耗的谷胱甘肽工业化分离比较困难。
目前，有报道的分离纯化谷胱甘肽的方法有以下几种：铜盐法、离子交换法、电渗析法、琼脂糖凝胶过滤法、双水相结合温度诱导相分离法及金属汞亲和层析法，其中有工业前景的是：铜盐法和离子交换法。
1)铜盐法：氧化亚铜能与巯基特异性结合，从而将GSH从水相结合到固相，方便对GSH与大部分杂质的分离。但是铜盐法有很大的局限性。首先，固相的铜盐需要用硫化氢还原以释放GSH，而硫化氢的气味重、有毒，会导致较高的污染；其次，溶液中含有巯基的杂质也较多，铜盐法难以将它们与GSH分离，而其中有些杂质结晶去除困难，这便导致了GSH最终成品的纯度不高，某些杂质超标。
2)离子交换法：离子交换法又分为阳离子交换和阴离子交换两种，目前均有报道，如中国专利申请CN200810233835.6中提供了一种阳离子交换树脂分离纯化方法；中国专利申请CN201210111271.5中提供了一种阴离子交换树脂分离纯化的方法。离子交换法具有操作便捷、低污染的特性，但同样有其缺点。首先，GSH在水溶液中稳定性差，离子交换的过程中容易出现降解和氧化的现象，所以需要在密闭环境同时进行低温和氮气保护才能保持GSH不降解和氧化；其次，离子交换法对某些与GSH性质相似的杂质无法去除，即使结合了吸附树脂也会因为某些杂质与GSH极性差异小而导致难以分开，最终成品的杂质非常容易超标。
因此，工业上仍需要研究和开发更好的分离纯化谷胱甘肽的方法。
发明内容
鉴于现有提取工艺存在的问题，本发明提供了一种从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的新方法，所述方法环保且获得的谷胱甘肽纯度较高。
具体而言，本发明提供的一种从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法包括以下步骤：
1)向谷胱甘肽(GSH)溶液中加入氧化剂，使其氧化至氧化型谷胱甘肽(GSSG)；
2)向溶液中加入酸，调节pH至1.0-4.0，离心或过滤；
3)将步骤2)得到的离心或过滤后的溶液分别经过离子交换树脂、吸附树脂处理，得到GSSG洗脱液；
4)将步骤3)得到的洗脱液使用还原剂进行还原得到GSH溶液，将还原得到的GSH溶液用吸附树脂脱盐，之后浓缩、结晶、干燥，得到GSH。
本发明所述的谷胱甘肽溶液可以使用本领域用于制备谷胱甘肽的常规方法制备得到，包括酵母发酵抽提液(其制备方法参考中国专利申请CN201310644859.1)或酶法转化液(其制备方法参考中国专利申请CN201310538982.5)等。值得注意的是，上述参考文献的全文以合并引用的方式并入本文。
在一个优选的实施方案中，所述步骤1)的氧化剂的加入量为1.5g/L-7g/L，更优选3-5g/L。
进一步优选地，所述步骤1)中的氧化剂为无机氧化剂，优选选自氧气、氯酸钾、溴酸钾、碘酸钾、次氯酸钠、次溴酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾等，更优选氯酸钾或溴酸钾。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤2)中调节pH至2.5-3.5。所述pH的调节使蛋白质变性沉淀。
进一步优选地，所述步骤2)的调节pH所用的酸包括盐酸、硫酸、甲酸、乙酸，更优选盐酸或硫酸。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程为：用0.02-0.05mol/L的弱酸洗涤2-6倍柱体积，优选的弱酸浓度0.03mol/L，优选的洗涤柱体积为5倍，再用1-5％，优选5％的强酸洗脱6-12倍柱体积，优选8倍柱体积。
优选地，所述弱酸为甲酸或乙酸，更优选乙酸；优选地，所述强酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸，更优选硫酸。
所述步骤3)中所述离子交换树脂包括强酸型的阳离子交换树脂、弱酸型的阳离子交换树脂、强碱型的阴离子交换树脂、弱碱型的阴离子交换树脂。
所述强酸型的阳离子交换树脂优选为HD-8，苯乙烯系，粒度范围(mm)：0.315-1.25≥95％，质量全交换容量(mmol/g)：≥4.0；例如，可购自上海华震科技有限公司；
所述弱酸型的阳离子交换树脂优选为D152，苯乙烯系，粒度范围(mm)：0.315-1.25≥90％，质量全交换容量(mmol/g)：≥8.0；例如，可购自上海华震科技有限公司；
所述强碱型的阴离子交换树脂优选为D201，苯乙烯系，粒度范围(mm)：0.315-1.2≥95％，质量全交换容量(mmol/g)：≥3.5；例如，可购自上海华震科技有限公司；
所述弱碱型的阴离子交换树脂优选为WA30，苯乙烯系，离子交换容量(meq/mL)：>1.5，粒度范围(mm)：0.3-1.18≥94％；例如，可购自三菱化学。
进一步优选地，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过吸附树脂的处理过程为：将从离子交换树脂层析柱洗脱的GSSG溶液上柱吸附树脂层析柱，用去离子水洗脱，收集其中GSSG含量＞0.2g/L的部分。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤4)的还原剂是金属粉，优选锌粉或铁粉。在还原的过程中同时滴加一定量的稀酸。
进一步优选地，加入的还原剂的量为GSSG摩尔量的3-5倍，优选3倍，稀酸浓度为0.5-2mol/L，优选1mol/L，稀酸的添加量为还原剂摩尔量的1.5-2倍，优选2倍。
所述稀酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸，优选为盐酸或硫酸。
在另一个优选的实施方案中，所述步骤3)和步骤4)中所述吸附树脂可以采用非极性的吸附树脂SP207(芳香族系衍生型，离子交换容量(meq/mL)：>1.5，粒度范围(mm)：≥0.25mm≥90％，例如可购自三菱化学)、D3520(粒度范围(mm)：0.3-1.25mm≥90％，例如可购自天津波鸿树脂科技有限公司)或AB-8(聚苯乙烯型，粒度范围(mm)：0.3-1.25mm≥90％，例如可购自天津波鸿树脂科技有限公司)。优选为非极性的吸附树脂SP207。
任选地，所述步骤4)中结晶步骤包括加入晶种，边搅拌边滴加低级醇，降温至0-10℃搅拌至晶体完全析出，所述低级醇的体积为结晶母液体积的0.5-1.5倍，优选1倍。
所述低级醇优选为甲醇、乙醇，更优选乙醇。
作为一个优选方案，步骤4)中的结晶步骤中包括加入上述晶种的步骤。
在一个更具体的实施方案中，本发明所述的从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法优选为：
1)向GSH溶液中加入1.5-7g/L的氧化剂，优选3-5g/L，常温搅拌6-15h氧化所述谷胱甘肽溶液中GSH为GSSG；
优选地，所述步骤1)中的氧化剂选自氧气、氯酸钾、溴酸钾、碘酸钾、次氯酸钠、次溴酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾等，更优选氯酸钾或溴酸钾。
2)边搅拌边缓慢加入酸，控制温度小于30℃，调节pH至1.0-4.0，优选2.5-3.5，使蛋白质变性，形成沉淀，离心或过滤；
所述酸优选为盐酸或硫酸。
3)将步骤2)得到的离心或过滤后的溶液上离子交换树脂柱，用0.02-0.05mol/L的弱酸洗涤2-6倍柱体积，优选的弱酸浓度为0.03mol/L，优选的洗涤柱体积为5倍，所述弱酸为甲酸或乙酸，优选乙酸；再用1-5％，优选5％的强酸洗脱6-12倍柱体积，优选8倍柱体积，所述强酸为盐酸或硫酸，优选硫酸；根据洗脱液中GSSG和杂质的含量收取和合并洗脱液。洗脱液上非极性吸附树脂柱，如SP207，用去离子水洗脱，根据洗脱液中GSSG和杂质的含量收取和合并洗脱液，旋转蒸发或纳滤浓缩，得GSSG浓缩液；
优选地，所述离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂HD-8，弱酸型阳离子交换树脂D152，强碱型阴离子交换树脂D201，或弱碱型阴离子交换树脂WA30。
4)向上述GSSG浓缩液中添加GSSG摩尔量3-5倍，优选3倍的锌粉或铁粉，常温搅拌，缓慢滴加0.5-2mol/L，优选1mol/L的稀酸，所述稀酸为盐酸或硫酸。稀酸滴加量为锌粉或铁粉摩尔量的1.5-2倍，优选2倍，反应1-5h，优选1h，还原得到高纯度的GSH溶液，离心或过滤；
将得到的溶液上非极性吸附树脂柱，用去离子水洗脱，所述非极性树脂优选为SP207，根据洗脱液中GSH和杂质的含量收取和合并洗脱液；
将上述GSH合并洗脱液用纳滤或旋转蒸发仪浓缩至GSH浓度200-300g/L，加入少量晶种，边搅拌边滴加低级醇，所述低级醇为甲醇或乙醇，优选乙醇；降温至0-10℃，继续搅拌至晶体完全析出；用0.2-0.45μm膜过滤析出晶体，并用相应的醇淋洗，所得晶体于真空烘干得到还原型谷胱甘肽的固体。
本发明的从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法相对于现有技术，具有以下有益的技术效果：
1、操作简便、低污染；
2、无需低温和氮气保护，能耗低；
3、反应条件温和，适于工业化生产；
4、用本发明方法得到的固体还原型谷胱甘肽的纯度＞99％，各种杂质水平均较低，成品质量符合欧洲药典的要求，可以直接用于后续的制剂生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明，需要说明的是，以下实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
以下是实施例中应用的高效液相检测方法：
高效液相的流动相：
A相：称量磷酸二氢钾6.8g，庚烷磺酸钠2.02g，加去离子水溶解并定容至1000mL，用磷酸调pH至2.8
B相：甲醇
A相/B相＝97/3
色谱柱：C18反相柱，4.6×250mm，5μm
色谱条件：流速1mL/min，柱温25℃，检测器波长210nm
以下实施例1、3-15中酶法所得的GSH转化液根据中国专利申请CN201310538982.5记载的方法获得，实施例2中酵母发酵抽提液根据中国专利申请CN201310644859.1记载的方法获得。
实施例1
取酶法的GSH转化液1L，GSH含量13.1g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.84g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至35mL，加入少量晶种，滴加35mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.5g，收率57.3％，固体的重量纯度99.24％，成品质量符合欧洲药典要求。
实施例2
取酵母发酵抽提液2L，GSH含量11.2g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量9.74g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.05mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸100mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至25mL，加入少量晶种，滴加25mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体6.1g，收率54.5％，固体的重量纯度99.31％，成品质量符合欧洲药典要求。
实施例3
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.1g。加入3g氯酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量9.56g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.05mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸100mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至25mL，加入少量晶种，滴加25mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体5.9g，收率48.8％，固体的重量纯度99.17％。
实施例4
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量11.7g。加入3g次氯酸钠，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量9.37g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.05mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸100mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至25mL，加入少量晶种，滴加25mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体5.9g，收率50.3％，固体的重量纯度99.21％。
实施例5
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.4g。加入3g重铬酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量10.52g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至25mL，加入少量晶种，滴加25mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体6.6g，收率49.5％，固体的重量纯度99.05％。
实施例6
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.7g。加入5g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量9.95g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.05mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸100mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体6.2g，收率45.3％，固体的重量纯度99.15％。
实施例7
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.8g。加入3g溴酸钾，常温搅拌6h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.62g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至35mL，加入少量晶种，滴加35mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.5g，收率58.6％，固体的重量纯度99.23％。
实施例8
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.4g。加入3g溴酸钾，常温搅拌6h后，用硫酸调pH至2.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.62g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至35mL，加入少量晶种，滴加35mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.5g，收率56.0％，固体的重量纯度99.37％。
实施例9
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.5g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱弱酸型阳离子交换树脂D152，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量10.47g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体6.4g，收率51.2％，固体的重量纯度99.14％。
实施例10
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.1g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强碱型阳离子交换树脂D201，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量10.77g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体6.9g，收率52.7％，固体的重量纯度99.07％。
实施例11
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.2g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱弱碱型阳离子交换树脂WA30，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量8.98g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.05mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸100mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至20mL，加入少量晶种，滴加20mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体5.5g，收率45.1％，固体的重量纯度99.21％。
实施例12
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.6g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，0.45μm膜过滤。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.25g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液0.45μm膜过滤。将膜过滤得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.1g，收率56.3％，固体的重量纯度99.05％。
实施例13
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量12.7g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.65g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的铁粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.2g，收率56.7％，固体的重量纯度99.20％。
实施例14
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.0g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用硫酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量11.27g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的铁粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的盐酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至30mL，加入少量晶种，滴加30mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.1g，收率54.6％，固体的重量纯度99.51％。
实施例15
取酶法所得的GSH转化液1L，GSH含量13.3g。加入3g溴酸钾，常温搅拌15h后，用盐酸调pH至3.5，离心。上柱强酸型阳离子交换树脂HD-8，用0.03mol/L的乙酸洗涤5倍柱体积，再用5％的硫酸洗脱，收集GSSG浓度高于0.2g/L的洗脱液。上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSSG浓度大于0.2g/L的洗脱液，其中GSSG含量12.11g。纳滤浓缩至500mL，向浓缩液中加入0.06mol的锌粉，通风常温搅拌，滴加1mol/L的硫酸120mL，反应1h，反应液离心。将离心得到的溶液上柱非极性吸附树脂SP207，用去离子水洗脱，收集GSH浓度高于0.2g/L的洗脱液。旋转蒸发浓缩至35mL，加入少量晶种，滴加35mL乙醇，降温至0-10℃搅拌结晶，过滤、干燥得到GSH固体7.7g，收率57.9％，固体的重量纯度99.14％。

Claims (26)

1.一种从含有谷胱甘肽的溶液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法，所述方法包括以下步骤：
1)向谷胱甘肽溶液中加入氧化剂，使其氧化至氧化型谷胱甘肽；
2)向溶液中加入酸，调节pH至1.0-4.0，离心或过滤；
3)将步骤2)得到的离心或过滤后的溶液分别经过离子交换树脂、吸附树脂处理，得到氧化型谷胱甘肽洗脱液；
4)将步骤3)得到的洗脱液使用还原剂进行还原得到谷胱甘肽溶液，将还原得到的谷胱甘肽溶液用吸附树脂脱盐，之后浓缩、结晶、干燥，得到还原型谷胱甘肽；
所述步骤1)中的氧化剂为无机氧化剂，所述无机氧化剂选自氧气、氯酸钾、溴酸钾、碘酸钾、次氯酸钠、次溴酸钠、高锰酸钾、重铬酸钾；
所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程为：用0.02-0.05mol/L的弱酸洗涤2-6倍柱体积，再用1-5％的强酸洗脱6-12倍柱体积；
所述步骤4)中，加入的还原剂的量为氧化型谷胱甘肽摩尔量的3-5倍，所述步骤4)的还原剂是金属粉；
所述步骤3)和步骤4)中所述吸附树脂为非极性的吸附树脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的氧化剂为无机氧化剂，所述无机氧化剂为氯酸钾或溴酸钾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程中所用弱酸的浓度为0.03mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程中用弱酸洗涤5倍柱体积。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程中用5％的强酸洗脱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，将步骤2)得到的溶液经过离子交换树脂的处理过程中用强酸洗脱8倍柱体积。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，加入的还原剂的量为氧化型谷胱甘肽摩尔量的3倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的还原剂为锌粉或铁粉。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)和步骤4)中的吸附树脂为SP207、D3520或AB-8。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的氧化剂的加入量为1.5g/L-7g/L。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的氧化剂的加入量为3-5g/L。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中调节pH至2.5-3.5。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的调节pH所用的酸为盐酸、硫酸、甲酸或乙酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的调节pH所用的酸为盐酸或硫酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱酸为甲酸或乙酸，所述强酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述弱酸为乙酸。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述强酸为硫酸。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述离子交换树脂包括强酸型的阳离子交换树脂、弱酸型的阳离子交换树脂、强碱型的阴离子交换树脂、弱碱型的阴离子交换树脂。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中强酸型的阳离子交换树脂为HD-8。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中弱酸型的阳离子交换树脂为D152。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中强碱型的阴离子交换树脂为D201。
22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中弱碱型的阴离子交换树脂为WA30。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在还原的过程中同时滴加稀酸，稀酸浓度为0.5-2mol/L，稀酸的添加量为还原剂摩尔量的1.5-2倍，所述稀酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述稀酸浓度为1mol/L。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述稀酸的添加量为还原剂摩尔量的2倍。
26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述稀酸为盐酸或硫酸。
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