CN106220708B - 一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：将GSCu沉淀和水一并加入至反应容器中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入酸进行酸化，再加入硫化物，搅拌反应，进行离心或过滤处理，去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；浓缩结晶，制得谷胱甘肽晶体纯品；所述硫化物选自以下任一种或多种的组合：硫化铵，硫化钠，硫化钾。上述方法通过有效地选取原料，合理地控制配比及反应条件，避免了硫化氢的使用，从而减少了环境污染，提高了生产操作的便利性，所制得的谷胱甘肽产品质量稳定，因此，十分适合于大规模工业化生产。综上所述，本发明所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法具有良好的应用前景与市场潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种谷胱甘肽的分离纯化方法，尤其涉及一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽(Glutathione, GSH)，全称γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酰甘氨酸，是由 L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的含巯基的生物活性三肽，是生物体内重要的非蛋白巯基化合物之一。
GSH在生物体内具有多种作用，参与体内多种代谢，特别是对维持体内氧化还原平衡起着重要作用。基于其较强的电子供体能力，GSH能保护DNA、蛋白质等生物分子免受自由基等的氧化损伤。GSH有解毒作用，能与进入机体的重金属离子、一氧化碳、杀虫剂、除草剂等结合并最终排出体外，还可以在一系列酶的催化下与一些亲电试剂结合生成硫醇尿酸排出体外，从而保护细胞。GSH参与体内的氨基酸吸收及转运、三羧酸循环及糖代谢。此外，GSH与生物免疫密切相关，具有增强机体免疫力的功效。
由于GSH的特性及在细胞里的作用，它在食品、医药、运动及美容行业均有应用。随着我国医疗保健、食品加工业的发展，GSH的需求越来越大。
目前GSH工业生产主要通过发酵法合成。发酵液经粗提后获得的GSH溶液通常含有许多杂质，如蛋白质、无机盐、多糖、氨基酸等。目前有离子交换法、有机汞亲和层析、双水相法、铜盐法等方法从发酵粗提液中获取GSH的方法。离子交换法、有机汞亲和层析、双水相法等方法由于操作复杂、成本高、三废高等缺点，仅限于研究，未见工业化报道。目前工业中应用最广的为铜盐法。
铜盐法提取GSH具有操作简单、成本低、三废低等特点。此方法最先见于文献HOPKINS（Hopkins F G. On glutathione: a reinvestigation[J]. Journal ofBiological Chemistry, 1929, 84(1): 269-320）采用，后期美国专利（US2,376,186及US2,702,799）又对其方法进行了改进。但此类方法在形成GSH铜盐沉淀后，均采用硫化氢将GSH铜盐置换成GSH。硫化氢属于有毒气体，对其使用方法有严格限制，其储存及运输都存在危险，不利于大规模工业化生产。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷与不足，为了获得一种适于工业化生产的分离纯化谷胱甘肽的方法，发明人拟提出一种用金属硫化物替代硫化氢的铜盐提取分离法，旨在简化生产操作并有效解决环境污染问题，从而利于工业化生产。
本发明的第一方面，提供了一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
将GSCu沉淀和水一并加入至反应容器中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入酸进行酸化，再加入硫化物，搅拌反应，进行离心或过滤处理，去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；浓缩结晶，制得谷胱甘肽晶体纯品；
其中，所述硫化物选自以下任一种或多种的组合：硫化铵，硫化钠，硫化钾。其中，各种硫化物的纯度优选大于95%。
在上述方法中，发明人意外地发现硫化铵、硫化钠、硫化钾或其混合物的使用，可以高效地置换出谷胱甘肽，从而有效地替代了现有技术中所使用的硫化氢。此外，在上述方法中，发明人通过实验发现，加入适量水后，使得GSCu沉淀在水中的浓度处于100~500g/L的范围内时，后续的置换效果更好。
值得说明的是，上述GSCu沉淀是通过新鲜制备的氧化亚铜溶液与谷胱甘肽水溶液反应制得的，并且，其为白色络合物。
优选地，在上述方法中，所述水与所述GSCu沉淀的质量比为2~5:1。
优选地，在上述方法中，所述酸为浓酸或稀酸，选自以下任一种或多种的组合：硫酸、盐酸、磷酸。
进一步优选地，在上述方法中，所述酸中的H+浓度达到0.05-1mol/L。
优选地，在上述方法中，所述硫化物中的硫原子与GSCu沉淀的质量比为0.002~0.02：1。
进一步优选地，在上述方法中，所述搅拌反应的温度为15~30℃且反应时间为1~3小时。
进一步优选地，在上述方法中，所述浓缩结晶包括以下步骤：
S1：将所述谷胱甘肽母液在-0.07Mpa~0 Mpa压力下且在50~60℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；S2：采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品；S3：真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品。
更进一步优选地，S2包括：向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55~65℃的50~60%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65~75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。
更进一步优选地，S3包括：在-0.05 Mpa~0 Mpa的压力下于55~60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品。
本发明所提供的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，与现有技术相比，具有以下优势：通过有效地选取原料，合理地控制配比及反应条件，避免了硫化氢的使用，从而在一定程度上减少了环境污染，同时提高了生产操作的便利性，所制得的谷胱甘肽产品质量稳定，因此，十分适合于大规模工业化生产。综上所述，本发明所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法具有良好的应用前景与市场潜力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。
本发明提供了一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
将GSCu沉淀和水一并加入至反应容器中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入酸进行酸化，再加入硫化物，搅拌反应，进行离心或过滤处理，去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；浓缩结晶，制得谷胱甘肽晶体纯品；
其中，所述硫化物选自以下任一种或多种的组合：硫化铵，硫化钠，硫化钾。
在一个优选实施例中，所述水与所述GSCu沉淀的质量比为2~5:1。
在一个优选实施例中，所述酸为浓酸或稀酸，选自以下任一种或多种的组合：硫酸、盐酸、磷酸。
在一个进一步优选的实施例中，所述酸中的H+浓度达到0.05-1mol/L。
在一个优选实施例中，所述硫化物中的硫原子与GSCu沉淀的质量比为0.002~0.02：1。
在一个进一步优选的实施例中，所述搅拌反应的温度为15~30℃且反应时间为1~3小时。
在一个进一步优选的实施例中，所述浓缩结晶包括以下步骤：
S1：将所述谷胱甘肽母液在-0.07Mpa~0 Mpa压力下且在50~60℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；S2：采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品；S3：真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品。
在一个更进一步优选的实施例中，S2包括：向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55~65℃的50~60%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65~75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。
在一个更进一步优选的实施例中，S3包括：在-0.05 Mpa~0 Mpa的压力下于55~60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品。
下述从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的实施例均按照本发明所提供的技术方案实施，其中所使用的原料或试剂如无特别说明均能从公开商业途径获得，所述步骤如无特别说明则均为常规处理操作。
实施例 1
将320g GSCu沉淀和700ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入36%浓盐酸22ml进行酸化，再加入20%硫化铵溶液32ml，在20-25℃下搅拌反应1.5小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.05Mpa压力下且在50℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至60℃的50%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.05 Mpa的压力下于60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得46g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为98.3%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.10%、H 5.57%、O 31.26%。
实施例 2
将400g GSCu沉淀和1200ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入18%盐酸60ml进行酸化，再加入14g硫化钠，在20-25℃下搅拌反应2小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在0Mpa压力下且在60℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至65℃的55%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度70%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.04 Mpa的压力下于60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得60g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为98.7%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.09%、H 5.59%、O 31.23%。
实施例 3
将380g GSCu沉淀和1100ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入98%浓硫酸10ml进行酸化，再加入19g硫化钾，在25-30℃下搅拌反应2小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.06Mpa压力下且在50℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55℃的50%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.05 Mpa的压力下于55℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得53g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为99.4%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.06%、H 5.54%、O 31.26%。
实施例 4
将450g GSCu沉淀和1500ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入20%浓硫酸65ml进行酸化，再加入20%硫化铵溶液13ml和硫化钠10g，在25-30℃下搅拌反应2小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.07Mpa压力下且在55℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至60℃的60%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度70%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.01 Mpa的压力下于60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得64g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为99.1%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.09%、H 5.55%、O 31.27%。
实施例 5
将270g GSCu沉淀和900ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入20%硫酸35ml进行酸化，再加入20%硫化铵溶液10ml和硫化钾7g，在25-30℃下搅拌反应2小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.02Mpa压力下且在55℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至65℃的50%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.05 Mpa的压力下于55℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得30g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为98.8%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.07%、H 5.59%、O 31.23%。
实施例 6
将350g GSCu沉淀和1000 ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入85%浓磷酸8ml进行酸化，再加入硫化钠9g和硫化钾7g，在15-20℃下搅拌反应2.5小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.03Mpa压力下且在60℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55℃的50%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.02 Mpa的压力下于60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得39g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为98.5%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.05%、H 5.56%、O 31.27%。
实施例 7
将410g GSCu沉淀和1600ml水一并加入至反应釜中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入35%磷酸40ml进行酸化，再加入20%硫化铵溶液8ml以及硫化钠4g和硫化钾6g，在15-20℃下搅拌反应2.5小时，离心去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；将所述谷胱甘肽母液在-0.07Mpa压力下且在50℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55℃的60%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2~4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度70%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；在-0.05 Mpa的压力下于55℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，最终制得52g谷胱甘肽晶体纯品；经高效液相(HPLC)检测，谷胱甘肽晶体纯品的纯度为98.5%。
所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下：理论值：C 39.08%、H 5.58%、O 31.24%；测量值：C 39.06%、H 5.57%、O 31.26%。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行 的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (7)
1.一种从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将GSCu沉淀和水一并加入至反应容器中，形成悬浮液，充分搅拌，然后加入酸进行酸化，再加入硫化物，搅拌反应，进行离心或过滤处理，去除生成的Cu2S沉淀，制得谷胱甘肽母液；浓缩结晶，制得谷胱甘肽晶体纯品；
其中，所述硫化物选自以下任一种或多种的组合：硫化铵，硫化钠，硫化钾；
所述浓缩结晶包括以下步骤：
S1：将所述谷胱甘肽母液在-0.07Mpa～0Mpa压力下且在50～60℃下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；
S2：采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品；
S3：真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品；
其中，S2包括：
向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55～65℃的50～60％的乙醇溶液，接着使用盐酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2～4，缓慢搅拌，充分析晶，抽滤，用浓度65～75％的乙醇溶液洗涤2～4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。
2.根据权利要求1所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述水与所述GSCu沉淀的质量比为2～5:1。
3.根据权利要求1所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述酸为浓酸或稀酸，选自以下任一种或多种的组合：硫酸、盐酸、磷酸。
4.根据权利要求3所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述酸中的H+浓度达到0.05-1mol/L。
5.根据权利要求1所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述硫化物中的硫原子与GSCu沉淀的质量比为0.002～0.02：1。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述搅拌反应的温度为15～30℃且反应时间为1～3小时。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的从GSCu沉淀中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于，S3包括：在-0.05Mpa～0Mpa的压力下于55～60℃真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品。
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Denomination of invention: A Method for Extracting and Separating Glutathione from GSCu Precipitation Granted publication date: 20200410 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Shanghai Yangtze River Delta Integrated Demonstration Zone Sub branch Pledgor: SHANGHAI QINGPING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2024310000191 |
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