CN112321675B - 一种谷胱甘肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离纯化领域，具体涉及一种谷胱甘肽的纯化方法。本发明从谷胱甘肽发酵菌体悬浮液中纯化还原型谷胱甘肽的方法，将酿酒酵母菌泥经稀释、破碎、离心，收集水相，在碱性条件下将谷胱甘肽和氯甲基聚苯乙烯树脂反应，将树脂过滤洗涤后，脱除树脂，收集谷胱甘肽，最后经过乙醇重结晶，即得精制的谷胱甘肽。本发明采用合适的氯甲基聚苯乙烯树脂的用量，即保证了谷胱甘肽的回收率，又避免了过多用量导致的产品中杂质过多的情况。同时，本发明的提纯方法对谷胱甘肽发酵菌体悬浮液不需要做特殊要求，只要所述悬浮液可以达到本发明所要求的GSH含量即可，使用范围广泛。
Description
技术领域
本发明涉及分离纯化领域，具体涉及一种谷胱甘肽的纯化方法。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是一种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。谷胱甘肽在体内以两种形态存在，即还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione，简称GSSG)。通常人们所指的谷胱甘肽是还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，两分子谷胱甘肽的活泼巯基氧化脱氢后以二硫键相连得到的二聚体，即是氧化型谷胱甘肽。其中只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽需经还原后才能发挥生理功能。
谷胱甘肽是一种白色晶体，相对分子质量为307.33，熔点是192～195℃(分解)，等电点为5.93。比旋光度[α]D20为+17.60°(C＝0.05，H2O)，易溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰氨，不溶于乙醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中易被氧化，谷胱甘肽在高水分活度下不易保存，只有将水分活度控制在0.3以下才能长期稳定保存。
中国专利(申请号200810233834.1)“一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法”中，提供了一种谷胱甘肽的提取方法：在3000rpm下离心发酵液10-15min，获得酵母细胞沉淀，加入6-10倍的去离子水，在沸水中抽提，使用磁性纳米材料吸附谷胱甘肽，用电场沉降分离后，0.1-0.6mol/L的酸解析，解析液经过电渗处理，再减压浓缩，冷冻干燥，提取收率达到70.3％，纯度98.5％。
中国专利201210111271.5“从含有还原型谷胱甘肽的发酵抽提液中分离纯化还原型谷胱甘肽的方法”中，发酵抽提液用凝胶型强碱树脂纯化，解析后再上含卤素的非极性树脂，解析后，浓缩，加入晶种，低级醇或丙酮，搅拌下结晶，过滤，干燥，重量纯度达到99.73％(折干)。
以上对于谷胱甘肽提纯工艺的探讨，有微波破碎细胞后抽提，沸水抽提，树脂、磁性纳米材料吸附处理后，冻干、结晶干燥得到成品，对结晶的讨论滴加乙醇，加晶种、控制搅拌速度的传统结晶方法，使产品纯度和收率提高。.
发明内容
为了解决谷胱甘肽纯化工艺复杂，纯化过程中容易产生氧化型谷胱甘肽的的问题。
本发明的目的是提供一种工艺简单，可以避免氧化性谷胱甘肽产生的谷胱甘肽纯化方法。
本发明提供了一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取谷胱甘肽发酵菌体悬浮液，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取，提取后离心，收集水相。
步骤2)在搅拌条件下向步骤1)的水相中加入氯甲基聚苯乙烯树脂和碱进行反应；反应完成后，过滤，水洗，醇洗，抽干，得连接有谷胱甘肽的树脂；
步骤3)将步骤2)得到的连接有谷胱甘肽的树脂均匀分散在溶剂中，加入三氟乙酸和三乙基硅烷进行反应，反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
步骤4)将步骤3)的谷胱甘肽粗品使用乙醇重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼，干燥即得谷胱甘肽纯品。
进一步地，所述步骤1)中，所述谷胱甘肽菌体悬浮液中GSH含量≥6mmol/L。
进一步地，所述以GSH的摩尔量为1eq，所述步骤2)中，氯甲基聚苯乙烯树脂以活性基团的含量计，用量为0.9-1.1eq，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾中的至少一种，用量为1.5-2.0eq。
进一步地，所述步骤2)中，所述氯甲基聚苯乙烯树脂的基团载量为1.2-1.5mmol/g。
进一步地，所述步骤2)中，所述碱为氢氧化钠和碳酸钾中的至少一种。
进一步地，所述步骤2)中，所述反应温度为-5-0℃，所述反应时间为4-6h，所述水洗是水洗至流出液pH＝7-8。
进一步地，所述步骤3)中，所述溶剂为乙醇、甲醇和四氢呋喃中的至少一种和水的混合溶剂，溶剂用量GSH的摩尔量比为6-8L/mol，所述三氟乙酸的用量以体积计，为溶剂用量的1/5-1/3；所述三乙基硅烷的用量为10-15eq；所述反应的温度为20-30℃，反应时间为8-16h，反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
进一步地，所述步骤3)中，所述溶剂为水。
进一步地，所述步骤3)中，所述滤饼用水洗涤中，水的用量和GSH的摩尔量比为7-10L/mol，洗涤次数为1-3次。
进一步地，所述步骤4)中，所述乙醇的用量和GSH的摩尔量比为1.5-2.5L/mol，所述洗涤为用乙醇洗涤1-3次。
本文中所涉及的术语“eq”为“equivalent”的缩写，即本领域技术人员所知的“当量”，在本发明未进行特殊说明的情况下，“eq”在本文中所指的“当量”为摩尔数为基础的“当量”。
本发明的优势在于：
1.本发明提供的提纯方法，步骤1)破碎后直接煮沸提取，在提取的同时使蛋白质在沸水中变性沉淀，通过离心，收集水相，去除大部分蛋白大分子和不溶性杂质以及和水不互溶的有机质；步骤2)中直接在提取液中将目标谷胱甘肽上的-SH和树脂反应，经过过滤洗涤去除可溶性蛋白小分子和水溶性杂质，同时防止在此纯化过程中谷胱甘肽氧化二聚得到GSSH副产物；最后通过步骤3)的脱附和步骤4)简单的重结晶方法，即可得到较高纯度的谷胱甘肽。本发明提供的方法操作简单，同时避免了纯化过程中的谷胱甘肽氧化二聚反应。
2.本发明采用合适的氯甲基聚苯乙烯树脂的用量，即保证了谷胱甘肽的回收率，又避免了过多用量导致的产品中杂质过多的情况。
3.由本方法的特征可以看出，本发明的提纯方法对谷胱甘肽发酵菌体悬浮液不需要做特殊要求，只要所述悬浮液可以达到本发明所要求的GSH含量即可，使用范围广泛。
具体实施方式
本发明的目的在于从谷胱甘肽发酵菌体悬浮液中提纯谷胱甘肽，谷胱甘肽发酵菌体悬浮液可以是现有技术中常规发酵所得，不对其做特殊限定，只要所述悬浮液可以达到本发明所要求的GSH含量即可。
本发明所使用的各种物质，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
本发明提及的“基团载量”，单位mmol/g，表示每1g树脂上包含的活性基团的摩尔量。
实施例1
一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取菌体250g/L，GSH含量8mmol/L的谷胱甘肽发酵菌体悬浮液4L，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取30min，提取后离心，收集水相。
步骤2)将水相降温至-5-0℃，在搅拌条件下加入氯甲基聚苯乙烯树脂(20g，基团载量：1.5mmol/g，0.94eq)，和碳酸钾(64mmol，2eq)，-5-0℃下反应4h；过滤，水洗至流出液pH＝7.5，醇洗，抽干，得连接有谷胱甘肽的树脂；
步骤3)将步骤2)得到的连接有谷胱甘肽的树脂均匀分散在水(200mL)中，加入三氟乙酸(40mL)和三乙基硅烷(320mmol，10eq)，在25℃反应8h。反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤2次，每次240mL，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
步骤4)将步骤3)的谷胱甘肽粗品使用95％的乙醇(80mL)重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼两次，每次40mL，干燥即得谷胱甘肽纯品(29.2mmol)，LC-MS检测纯度为99.3％。
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实施例2
一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取菌体250g/L，GSH含量6mmol/L的谷胱甘肽发酵菌体悬浮液4L，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取30min，提取后离心，收集水相。
步骤2)将水相降温至-5-0℃，在搅拌条件下加入氯甲基聚苯乙烯树脂(21g，基团载量：1.2mmol/g，1.05eq)，和氢氧化钠(36mmol，1.5eq)，-5-0℃下反应6h；过滤，水洗至流出液pH＝7.5，醇洗，抽干，得连接有谷胱甘肽的树脂；
步骤3)将步骤2)得到的连接有谷胱甘肽的树脂均匀分散在水(180mL)中，加入三氟乙酸(60mL)和三乙基硅烷(360mmol，15eq)，在25℃反应12h。反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤2次，每次240mL，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
步骤4)将步骤3)的谷胱甘肽粗品使用95％的乙醇(48mL)重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼两次，每次40mL，干燥即得谷胱甘肽纯品(21.9mmol)，LC-MS检测纯度为98.8％。
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对比例1-和实施例1的不同之处在于提取后直接用乙醇重结晶
一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取菌体250g/L，GSH含量8mmol/L的谷胱甘肽发酵菌体悬浮液4L，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取30min，提取后离心，收集水相。
步骤2)将步骤1)得到的水相经减压移除溶剂，残渣使用95％的乙醇(80mL)重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼两次，每次40mL，干燥即得谷胱甘肽(30.5mmol)，LC-MS检测纯度为36.2％。杂质主要为水溶性蛋白小分子和无机盐。在此对比例中，虽然可以得到较高的谷胱甘肽回收率，但是进一步纯化难度大，无法达到生产以及科研要求。
对比例2-和实施例1的不同在于氯甲基聚苯乙烯树脂用量
一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取菌体250g/L，GSH含量8mmol/L的谷胱甘肽发酵菌体悬浮液4L，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取30min，提取后离心，收集水相。
步骤2)将水相降温至-5-0℃，在搅拌条件下加入氯甲基聚苯乙烯树脂(30g，基团载量：1.5mmol/g，1.4eq)，和碳酸钾(64mmol，2eq)，-5-0℃下反应4h；过滤，水洗至流出液pH＝7.5，醇洗，抽干，得连接有谷胱甘肽的树脂；
步骤3)将步骤2)得到的连接有谷胱甘肽的树脂均匀分散在水(200mL)中，加入三氟乙酸(40mL)和三乙基硅烷(320mmol，10eq)，在25℃反应12h。反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤2次，每次240mL，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
步骤4)将步骤3)的谷胱甘肽粗品使用95％的乙醇(80mL)重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼两次，每次40mL，干燥即得谷胱甘肽纯品(29.4mmol)，LC-MS检测纯度为86.7％。鉴定杂质为含亲核性基团的蛋白小分子。在此对比例中，由于氯甲基基苯乙烯树脂用量过多，导致多余的活性基团和蛋白小分子反应，引入过多蛋白小分子杂质，导致通过简单地重结晶无法将多余蛋白小分子杂质去除，是产品纯度较低。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种谷胱甘肽的纯化方法，包括以下步骤：
步骤1)取谷胱甘肽发酵菌体悬浮液，加入等体积蒸馏水稀释，经破碎后，直接煮沸提取，提取后离心，收集水相；
步骤2)在搅拌条件下向步骤1)的水相中加入氯甲基聚苯乙烯树脂和碱进行反应；反应完成后，过滤，水洗，醇洗，抽干，得连接有谷胱甘肽的树脂；
步骤3)将步骤2)得到的连接有谷胱甘肽的树脂均匀分散在溶剂中，加入三氟乙酸和三乙基硅烷进行反应，反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品；
步骤4)将步骤3)的谷胱甘肽粗品使用乙醇重结晶，过滤，使用乙醇洗涤滤饼，干燥即得谷胱甘肽纯品。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述谷胱甘肽菌体悬浮液中GSH含量≥6mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述反应以GSH的摩尔量为1eq，所述步骤2)中，氯甲基聚苯乙烯树脂以活性基团的含量计，用量为0.9-1.1eq，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾中的至少一种，用量为1.5-2.0eq。
4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述氯甲基聚苯乙烯树脂的基团载量为1.2-1.5mmol/g。
5.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述碱为氢氧化钠和碳酸钾中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述反应温度为-5-0℃，所述反应时间为4-6h，所述水洗是水洗至流出液pH＝7-8。
7.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述溶剂为乙醇、甲醇和四氢呋喃中的至少一种和水的混合溶剂，溶剂用量GSH的摩尔量比为6-8L/mol，所述三氟乙酸的用量以体积计，为溶剂用量的1/5-1/3；所述三乙基硅烷的用量为10-15eq；所述反应的温度为20-30℃，反应时间为8-16h，反应完成后，过滤，滤饼用水洗涤，合并滤液，减压除去溶剂，得到谷胱甘肽粗品。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述溶剂为水。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述滤饼用水洗涤中，水的用量和GSH的摩尔量比为7-10L/mol，洗涤次数为1-3次。
10.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述乙醇的用量和GSH的摩尔量比为1.5-2.5L/mol，所述洗涤为用乙醇洗涤1-3次。
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