CN103923167A - 一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及谷胱甘肽的生产工艺，具体的说一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法。将酿酒酵母菌泥经酸性热水抽提离心，收集上清液调节pH至酸性后经阳离子交换树脂纯化，并以可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液进行洗脱，洗脱组分再经凝胶柱纯化洗脱，洗脱组分即为还原型谷胱甘肽。本发明采用合理的抽提条件，使谷胱甘肽最大程度地从细胞中溶解出来，并使谷胱甘肽在高温条件下的损失达到最低。抽提液与谷胱甘肽溶液在酸性条件下处于水溶液中最稳定的状态，同时可去除部分杂质。在谷胱甘肽的溶液与纯化设备中充入惰性气体，避免谷胱甘肽与空气中的氧接触，防止谷胱甘肽氧化。该方法步骤少，成本低，谷胱甘肽的得率与纯度较高，实现工业化生产。

Description

一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽的生产工艺，具体的说一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法。

背景技术

还原性谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有巯基的三肽化合物，广泛存在于植物和动物的细胞中，是细胞的主要代谢产物。谷胱甘肽具有多种生理活性，如作为抗氧化剂保护酶和其它蛋白质巯基；维持红细胞膜的完整性；解除毒物及抗衰老等方面具有重要的作用。随着研究的不断深入，谷胱甘肽在临床医学、食品添加剂和运动营养学等领域的应用日益正引起人们的关注，市场前景需求量不断加大。

现今，国外已有关于谷胱甘肽分离纯化的工艺，但都处于保密阶段；国内对于还原型谷胱甘肽的分离纯化正处于研究阶段，谷胱甘肽的生产和纯化技术仍有待提高。

GSH的生产方法主要有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。早期大多采用溶剂萃取法和化学合成法生产GSH，目前主要以生物发酵法，特别是酵母发酵法来进行生产。

萃取法主要以富含GSH的动植物组织和酵母为原料，通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、蛋白酶处理，再分离精制而成。苑小林（苑小林,等.鲜酵母中谷胱甘肽(GSH)分离纯化的初步研究[J].药物生物技术,1998,5(2):89-91）曾报道溶剂萃取法具有收率低、成本高、效益差等缺点。

化学合成法生产工艺较为成熟，但魏雪芹（魏雪芹，等.谷胱甘肽的生产及应用研究[J].现代面粉工业,2009,(2):52-54）通过研究发现，化学合成法存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂等缺陷。并且合成后反应液中的化合物复杂，分离困难，还会造成环境污染。

酶法合成GSH是利用生物体内的天然谷胱甘肽合成酶，以L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸为底物，并添加少量三磷酸腺苷等即可合成GSH。酶法具有生产过程简化、生产效率高等优点。但由于微生物细胞中GSH合成酶系的活性普遍较低，而且要有一个廉价的ATP再生方式，所以目前还处于实验室研究阶段（何俊勇.高产谷胱甘肽新菌种的选育及其工艺条件的研究[D].杭州:浙江工业大学,2004）。

生物发酵法具有反应条件温和、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优点，受到科学家们的广泛关注。目前应用发酵法生产的谷胱甘肽，尽管在产量上有了大幅提高，但在分离纯化的工艺仍有待提高。在国家专利（申请号200510002408.3）中选择含有-S-R基团或-S-S-R基团的可以与巯基特异性结合的离子交换树脂法分离纯化谷胱甘肽，够制得获得高纯度的谷胱甘肽。但在层析过程中试用高浓度的酸或碱做洗脱液，谷胱甘肽的损失大。在国家专利（申请号200810233835.6）中，选择阳离子树脂、吸附树脂、乙醇结晶等方法获得高纯度的谷胱甘肽。但该工艺缺少在工艺过程中对谷胱甘肽的保护，并且在阳离子树脂吸附过程中，含有一价阳离子的洗脱液会在后续工艺中大量残留，影响谷胱甘肽纯度。

目前，谷胱甘肽的生产纯化工艺中存在成本高、收率低、纯度低、环境污染等问题。提高收率与纯度，降低工艺成本，减少对环境的污染是实现谷胱甘肽工业生产的重心所在。

发明内容

本发明目的在于一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，将酿酒酵母菌泥经酸性热水抽提离心，收集上清液调节pH至酸性后经阳离子交换树脂纯化，并以可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液进行洗脱，洗脱组分再经凝胶柱纯化洗脱，洗脱组分即为还原型谷胱甘肽。

具体为：

1）将酿酒酵母菌泥加入水中并调节pH至酸性，再经加热浸提将菌液放置于沸水浴中浸提后置于冰浴冷却至室温，待用；

2）将上述冷却后浸提液离心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液中通入惰性气体；

3）将上述上清液采用阳离子交换树脂上进行吸附，并以可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液洗脱，收集富含谷胱甘肽的收集液，收集液减压蒸干固体，待用；

4）将上述减压蒸干固体溶于水中并充入惰性气体，而后经凝胶柱纯化洗脱，洗脱组分真空浓缩，浓缩液经醇重结晶，结晶液减压蒸干，获得白色粉末状谷胱甘肽纯品固体。

将酿酒酵母的发酵液以滤膜压滤方式获得菌泥，即酿酒酵母菌泥；按质量比1:4的比例将菌泥与去离子水混合，并用无机酸调节pH至1.0-3.0，而后加热至85-95℃于沸水浴中浸提，浸提后采用冰浴冷却至室温。

所述压滤的滤膜孔径为0.22μm-10.0μm；无机酸为硫酸，硝酸或盐酸。

将上述冷却后的浸提液于5000r/min的条件下离心10min，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液采用无机酸调节pH至1.0-3.0，而后以0.1-0.5mL/s充气速度将惰性气体通入其中。

所述无机酸为硫酸，硝酸或盐酸。

所述可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液为氯化铵、碳酸氢铵、氨水或盐酸。

所述步骤3）和步骤4）减压蒸干的条件，真空度为-0.79Mpa--0.04Mpa加热温度为50-60℃。

所述阳离子交换树脂柱为：（大孔树脂D001×7强酸型阳离子交换树脂）

本发明所提供的还原型谷胱甘肽生产方法，与现有技术相比，具有以下优点：

1.在谷胱甘肽的贮存和分离的过程中，始终保持溶液处于酸性状态，谷胱甘肽在酸性条件下以阳离子形式存在，性质最为稳定，不易氧化。

2.在谷胱甘肽的分离过程中充惰性气体隔绝空气，避免谷胱甘肽被环境中的氧氧化。

3.在阳离子交换树脂纯化过程中，以可挥发性铵盐、可分解性铵盐和可挥发性无机酸做洗脱液。在之后的真空干燥中，洗脱液可完全除去，避免了洗脱液对谷胱甘肽纯度的干扰。

4.本发明采用合理的抽提条件，使谷胱甘肽最大程度地从细胞中溶解出来，并使谷胱甘肽在高温条件下的损失达到最低。抽提液与谷胱甘肽溶液在酸性条件下处于水溶液中最稳定的状态，同时可去除部分杂质。在谷胱甘肽的溶液与纯化设备中充入惰性气体，避免谷胱甘肽与空气中的氧接触，防止谷胱甘肽氧化。采用可挥发的铵盐和挥发性无机酸做阳离子树脂的洗脱液，可排除洗脱液中盐性成分对谷胱甘肽纯度的影响。利用阳离子树脂与葡聚糖凝胶纯化谷胱甘肽，可直接结晶。该方法步骤少，成本低，谷胱甘肽的得率与纯度较高，可实现工业化生产。

具体实施方式

从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

（1）压滤发酵液：发酵液下罐后，以滤膜压滤方式获得菌泥，得酿酒酵母y菌泥；谷胱甘肽的发酵水平至少应达到15mg/g。

（2）酸性热水抽提：称量菌泥质量，按适当比例加入去离子水，无机酸调节至酸性，加热浸提将菌液放置于沸水浴中浸提后一段时间后立即置于冰浴冷却至室温；抽提液的加热温度为85-95℃。

（3）收集提取液：离心提取液，除酵母残渣，得富含谷胱甘肽的提取液。

（4）调节提取液pH：以无机酸调节提取液pH至酸性，此时谷胱甘肽在水溶液中最稳定，不易氧化。

（5）惰性气体保护：向提取液和层析柱树脂水层以上空间中通入惰性气体；所述的惰性气体为氮气或氦气，惰性气体充入量不少于十个原容器体积，充气速度不大于0.5mL/s。

（6）阳离子交换树脂纯化：将提取液在酸性的条件下在阳离子交换树脂上进行吸附，可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液洗脱，得到富含谷胱甘肽的溶液。

（7）真空干燥：将阳离子交换树脂过程收集的洗脱液减压蒸干，得白色粉末状固体。

（8）惰性气体保护：将得到的白色固体溶于去离子水一定浓度的溶液，并向溶液中通入惰性气体。所述的惰性气体为氮气或氦气，惰性气体充入量不少于十个原容器体积，充气速度不大于0.5mL/s。

（9）Sephadex G-10纯化：溶液在凝胶上进行吸附，以去离子水洗脱，得富含谷胱甘肽的溶液。

（10）真空浓缩：将经分子筛层析的洗脱液减压蒸干浓缩，使谷胱甘肽的浓度大于200mg/mL。

（11）结晶：在谷胱甘肽溶液中加入乙醇至终浓度70％以上，无机酸调整至酸性，4℃冰箱结晶。

（12）真空干燥：将上述结晶液减压蒸干，获得白色粉末状谷胱甘肽纯品固体。

实施例1

取10L发酵罐培养的发酵液6L，在0.22μm的滤膜下压滤，得酿酒酵母y235菌泥（该菌购自美国红星酵母产品公司y-30，原菌号：As2.501），获得的菌泥用0.02mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，并以5000r/min条件下离心10min，反复三次，得到干净的菌泥。

称量菌泥质量为64.2g，按质量比1:4加入去离子水，以硫酸调节提取液pH2.0，将提取液放置于95℃水浴中浸提10min后，立即置于冰浴冷却至室温。以5000r/min离心提取液10min，去除酵母残渣，得富含谷胱甘肽的提取液250mL，紫外吸收法测量提取液中GSH的含量为0.92g。以H₂SO₄调节提取液pH至3.0，0.5mL/s的速度向提取液中通入氮气，同时向装好的层析柱树脂水层以上空间及各容器中充入氮气。将提取液在pH3.0的条件下吸附于大孔树脂D001×7，以0.1mol/L的150mL氨水洗脱。收集洗脱液，将溶液在真空，60℃条件下真空干燥，得到白色粉末状固体。将得到的白色固体溶于5mL去离子水，向溶液及各容器中充入氮气。将溶液在Sephadex G-10凝胶上进行吸附，去离子水洗脱，得到富含谷胱甘肽的溶液32.5mL。将所得溶液于60℃条件下真空干燥，使谷胱甘肽的浓度大于200mg/mL。在谷胱甘肽溶液中加入乙醇，乙醇加入体积占谷胱甘肽溶液总体积的70％，调pH3.0，4℃环境结晶。于60℃条件下真空干燥，得白色粉末状固体0.68g，紫外吸收法测定谷胱甘肽的质量为0.67g。GSH的最终收率为73.1％，纯度98.1％。

实施例2

取10L发酵罐培养的发酵液6L，在0.22μm的滤膜下压滤，得酿酒酵母y235菌泥，获得的菌泥以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，并于5000r/min条件下离心10min，反复三次，得到干净的菌泥。称量菌泥质量65.4g，热水抽提后得富含谷胱甘肽的提取液260mL，紫外吸收法测量提取液中GSH的含量为0.93g。而后按上述实施例中记载不在氮气的保护下进行操作，得白色粉末状固体0.62g，紫外吸收法测定谷胱甘肽的质量为0.61g。GSH的最终收率为65.4％，纯度96.8％。

实施例3

取10L发酵罐培养的发酵液6L，按上述实施例的方式获得菌泥。称量菌泥质量62.5g，热水抽提后得富含谷胱甘肽的提取液250mL，紫外吸收法测量提取液中GSH的含量为0.89g。以大孔树脂D001×7阳离子交换树脂对富含谷胱甘肽进行纯化，0.1mol/L盐酸做洗脱液。而后按上述实施例中记载在氮气的保护下进行操作，得白色粉末状固体0.51g，紫外吸收法测定谷胱甘肽的质量为0.50g。GSH的最终收率为56.3％，纯度97.7％。

Claims (8)

1.一种从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：将酿酒酵母菌泥经酸性热水抽提离心，收集上清液调节pH至酸性后经阳离子交换树脂纯化，并以可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液进行洗脱，洗脱组分再经凝胶柱纯化洗脱，洗脱组分即为还原型谷胱甘肽。

2.按权利要求1所述的从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于具体为：

1）将酿酒酵母菌泥加入水中并调节pH至酸性，再经加热浸提将菌液放置于沸水浴中浸提后置于冰浴冷却至室温，待用；

2）将上述冷却后浸提液离心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液中通入惰性气体；

3）将上述上清液采用阳离子交换树脂上进行吸附，并以可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液洗脱，收集富含谷胱甘肽的收集液，收集液减压蒸干固体，待用；

4）将上述减压蒸干固体溶于水中并充入惰性气体，而后经凝胶柱纯化洗脱，洗脱组分真空浓缩，浓缩液经醇重结晶，结晶液减压蒸干，获得白色粉末状谷胱甘肽纯品固体。

3.按权利要求1或2从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：将酿酒酵母的发酵液以滤膜压滤方式获得菌泥，即酿酒酵母菌泥；按质量比1:4的比例将菌泥与去离子水混合，并用无机酸调节pH至1.0-3.0，而后加热至85-95℃于沸水浴中浸提，浸提后采用冰浴冷却至室温。

4.按权利要求3从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述压滤的滤膜孔径为0.22μm-10.0μm；无机酸为硫酸，硝酸或盐酸。

5.按权利要求1或2从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：将上述冷却后浸提液离心，收集富含谷胱甘肽的上清液，上清液采用无机酸调节pH至1.0-3.0，而后以01.-0.5mL/s充气速度将惰性气体通入其中。

6.按权利要求5从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述无机酸为硫酸，硝酸或盐酸。

7.按权利要求1或2从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述可挥发性铵盐或可挥发性无机酸溶液为氯化铵、碳酸氢铵、氨水或盐酸。

8.按权利要求2从酵母菌体中纯化还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于：所述步骤3）和步骤4）减压蒸干的条件，真空度为-0.79Mpa—-0.04Mpa加热温度为50-60℃。