CN101921810B - 一种从木糖母液制备木糖醇与l-阿拉伯糖混合晶体的方法 - Google Patents

Abstract

一种从木糖母液制备木糖醇与L-阿拉伯糖混合晶体的方法本发明涉及生物技术领域制备稀有糖醇的方法。描述了一种采用生物方法从木糖母液中净化出木糖醇与L-阿拉伯糖混合晶体的方法。采用不能以L-阿拉伯糖为唯一碳源的酵母(Candida sp)X828 CGMCC No.3691接种到木糖母液培养基中进行发酵，消耗木糖母液里面的葡萄糖以及半乳糖，同时将木糖还原为木糖醇，得到含木糖醇以及L-阿拉伯糖的发酵液，发酵液经浓缩-脱盐-再浓缩-结晶，得到木糖醇和L-阿拉伯糖的混合结晶。本发明可增加木糖母液的附加值，木糖醇和L-阿拉伯糖的混合晶体可以直接用于制备同时含L-阿拉伯糖以及木糖醇的产品。

Description

一种从木糖母液制备木糖醇与L-阿拉伯糖混合晶体的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域制备稀有糖醇的方法。一种采用酵母(Candidasp)X828 CGMCC No.3691发酵的方法来净化木糖母液，消耗木糖母液里面除L-阿拉伯糖以及木糖以外的其它糖类，并将木糖转化为木糖醇同时富集L-阿拉伯糖的方法。

背景技术

蔗渣和玉米芯酸水解液经过中和、脱色、离子交换以及浓缩等净化工艺后得到富含木糖的糖膏，梯度降温结晶分离木糖后留下的茶褐色粘稠液体即为木糖母液。平均每结晶分离一吨的木糖即得到一吨的木糖母液。木糖母液含有丰富的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及D-半乳糖，其含量依木糖母液来源以及批次不同而异。其中木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖以及D-半乳糖的含量分别在40％-50％、15％-25％、10-20％以及7％-15％左右，其中，L-阿拉伯糖以及木糖仍具有很大的回收利用价值。但由于其高糖浓度使其粘度很大，而且其成分较为复杂，除了含有上述单糖外，还含有大量的色素以及胶体(应用化工，2009年第38卷第1期，8-10页)，无法再通过现行结晶技术分离其中的木糖。2009年我国产生约4万吨的木糖母液，大多作为低价的原料处理，比如作为制备焦糖色素的原料(中国食品添加剂，2002年第5期，54-56页；中国调味品，2007年第2期，54-59页)，大大降低了企业的利润。因此，国内外学者就如何充分利用木糖母液提高其附加值做了一定的研究。

王普等利用一种酵母来脱除木糖母液中的葡萄糖来回收木糖(食品科学，2002年第23卷第7期，73-76页)，以此来提高木糖母液的附加值。筛选的酵母能够将木糖母液中的葡萄糖消耗完全，以此来提高木糖的纯度，然后进一步净化提高木糖的纯度，再采用真空浓缩结晶的方法将木糖结晶出来。但由于木糖母液里面除了含有35-45％的木糖外，还含有15-20％的L-阿拉伯糖。仅仅脱除母液中的葡萄糖难以将木糖高效的分离，而且附加值更高的L-阿拉伯糖没有得到分离，对提高木糖母液的附加值不明显。

赵光辉等采用单柱装置组成一个简单的移动模拟床来分离木糖母液(应用化工，2005年第43卷第3期，182-183页)，将其中的各种单糖进行分离，虽然在技术上可行，但在实际操作使用时程序复杂，分离效果不理想，柱子再生时产生大量的污水，得率也较低，而且设备的运行成本高。

中国发明专利CN200710014175描述了一种采用顺序式模拟移动床提纯木糖母液的方法，该方法采用一系列的层析柱来逐步将木糖母液中的木糖、阿拉伯糖等单糖分离，分离得到的木糖还要经过化学加氢的方法才能转变为具有木糖醇。存在设备投入相对较大、使用成本较高、产生的污水也较多、使用程序也很复杂以及分离效果不理想的缺点。而采用生物分离的方法在净化木糖母液的同时，还能将木糖同时还原成为木糖醇，省去了化学加氢的过程。

中国发明专利CN200910087819描述了一种利用木糖母液生产木糖醇和L-阿拉伯糖的方法，先利用微生物(酵母、细菌、放线菌或霉菌)消耗葡萄糖并将其中的木糖转化为木糖醇，得到含有木糖醇与L-阿拉伯糖的发酵液，然后通过分离技术首先将木糖醇结晶出来，再通过移动模拟床技术将L-阿拉伯糖分离出来，分别单独得到木糖醇以及L-阿拉伯糖。该发明需要采用的方法比较复杂，需要经过2次以上的浓缩、结晶等步骤，而且还需要使用模拟移动分离，在生产实际操作中比较复杂，设备投入也很大。

由于L-阿拉伯糖在2008年即被我国相关部门批准作为一种新资源食品，可以在食品中添加使用，包括用于制备口香糖、月饼等食品，而木糖醇在我国早已广泛使用在食品行业。L-阿拉伯糖具有防止肥胖的显著功效，而木糖醇具有防止龋齿的显著功效，因此将木糖醇与L-阿拉伯糖在发酵液中同时结晶，晶体添加到食品中即能起到防止肥胖又能防止龋齿的双重功效。因此，本发明描述一种采用生物净化木糖母液的方法，从木糖母液中经过一种酵母发酵同时得到含有木糖醇以及L-阿拉伯糖的发酵液，然后通过洁净技术得到木糖醇与L-阿拉伯糖的混合晶体，该混合晶体即可以作为食品添加剂添加到相关食品中。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种无污染、生产成本低，适合工业规模化生产的以木糖母液为原料得到L-阿拉伯糖与木糖醇混合晶体的方法。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

(1)将木糖母液稀释3倍到10倍，并加入氮源和无机盐，充分溶解，得到发酵培养基，然后在105℃灭菌10分钟；所述的氮源与稀释后的木糖母液质量体积百分比为0.2％-4％(w/v)，所述的无机盐与稀释后的木糖母液的质量体积百分比为0.01％-2％(w/v)；

(2)制备假丝酵母X828一级种子液：将保存在试管斜面上的假丝酵母X828细胞接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在28-35℃下进行培养，按照200-300rpm的搅拌速度，培养12-24小时；

(3)制备假丝酵母X828二级种子液：将一级种子液5ml全部加入到含100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，培养条件同步骤(2)；

(4)将步骤(3)制备的假丝酵母X828二级种子液接种到步骤(1)制备的灭菌发酵培养基中，搅拌下进行发酵培养。发酵在5升的发酵罐中进行，装料4升。所述假丝酵母X828二级种子液的接种量按照体积比为10％(v/v)，发酵温度为25℃-35℃，发酵时间为36-120小时，发酵搅拌电机转速在100转-600转；

(5)发酵结束后去除假丝酵母X828得到澄清发酵液，澄清的发酵液依次用活性炭脱色、用离子交换树脂进行脱盐、浓缩处理，得到澄清无色的发酵液；

(6)将步骤(5)得到的假丝酵母X828重新加入到除菌的发酵培养基中，并降低该发酵培养基中氮源的含量，不加无机盐，在温度为25℃-35℃下发酵，发酵时间为36-120小时，发酵搅拌电机转速在100转-600转；发酵结束后，假丝酵母X828又可以重新反复利用。

(7)将步骤(5)与(6)过滤所得的发酵液浓缩，使L-阿拉伯糖与木糖醇的总浓度达到70％以上，总的纯度达到85％以上，电导率低于200μS，透光率大于95％，得到富含L-阿拉伯糖与木糖醇的净化液，然后结晶，得到含木糖醇以及L-阿拉伯糖的混合白色粉末晶体。

本发明采取的技术方案中，步骤(1)所述的木糖母液是生产木糖后留下的含高浓度糖的粘稠液体，生产原料是玉米芯或者甘蔗渣或其他富含木聚糖的生物质，木糖母液中总糖浓度为40-90％，或者折光度为40-90，木糖母液含有的木糖占总糖的30-70％，L-阿拉伯糖占总糖的5-30％，葡萄糖占总糖的5-20％，半乳糖占总糖的0.2-10％，以及少量的其它未知糖分。

本发明的技术方案中所述的脱色是采用活性炭或者大孔树脂吸附脱色或者二者结合使用，将活性炭按照质量百分比为0.3-3％的比率加入到木糖母液或发酵上清液中，在50℃-98℃下缓慢搅拌，脱色30分钟到3小时；或者用活性炭脱色后再将脱色液通过大孔树脂吸附进一步脱色。

本发明的技术方案中，所述的脱盐所用的离子交换树脂是强酸性或弱酸性阳离子交换树脂与强碱性或弱碱性阴离子交换树脂；分别选自强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂001×7、大孔强酸性苯乙烯阳离子交换树脂D001、大孔弱酸性丙烯酸阳离子交换树脂D113与强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂201×7、大孔强碱性苯乙烯阴离子交换树脂D201、大孔弱碱苯乙烯系阴离子交换树脂D301；优选为001×7阳离子交换树脂与201×7阴离子交换树脂。

本发明的技术方案中步骤(1)所用的发酵所需氮源选自酵母膏、酵母粉、玉米浆、玉米浆干粉、大豆饼粉、棉籽粉，硫酸铵、尿素中的至少一种；优选酵母粉或玉米浆干粉。所述的无机盐选自无水硫酸镁、七水硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化锰、硫酸亚铁中的至少一种；优选无水硫酸镁和磷酸氢二钾。

所述步骤(5)的发酵结束后，使酵母菌沉降或者通过滤布过滤，分离出酵母菌，再将此酵母菌加入到新的除菌的发酵培养基中重复使用，该酵母菌能够重复利用6次以上，而且活性没有明显改变。

本发明的技术方案中所述的灭菌处理采用高温灭菌或过滤除菌。

所述步骤(7)中的结晶方法为：在步骤(7)所述的富含L-阿拉伯糖与木糖醇的净化液中(温度在70℃-80℃)加入无水乙醇以及种晶，缓慢结晶12-72小时，无水乙醇与浓缩液的体积比为4-8.5∶1。离心干燥，得到L-阿拉伯糖与木糖醇的混合白色粉末。

本发明的有益效果是：本发明选用一种特异性的假丝酵母X828将木糖母液中的木糖转变为木糖醇，消耗葡萄糖以及其它杂糖，不利用L-阿拉伯糖，净化后得到富含L-阿拉伯糖以及木糖醇的溶液，同时将L-阿拉伯糖与木糖醇结晶。由于L-阿拉伯糖与木糖醇均属于食品添加剂，而且二者功能具有互补性，不需再将二者单独分开，因此可以同时添加到相关食品中，比如同时添加到口香糖中。本发明完全不需要采用其它专利中所采用的碱水解、酸水解或者酶解的方法，而是直接将一种酵母菌接种到稀释后的木糖母液中，经发酵，即能完成其它专利必须采用柱层析才能完成的任务，大大减低了生产成本。采用本发明提供的方法，能源消耗少，对环境无污染，能够变废为宝，能够经济有效地解决目前困扰木糖生产厂家的木糖母液处理的问题。

本发明所用的假丝酵母X828(CGMCC NO.3691)的菌株于2006年12月在云南丽江老君山原始森林的土壤分离得到。分离方法为：取土壤少许用无菌水充分混匀，静置60分钟，将上清涂布到含20％葡萄糖的YPD固体平板上(每升含：200克葡萄糖，10克酵母粉，5克蛋白胨，15克琼脂)，在32℃培养至长出单菌落，将酵母样形态的单菌落逐一单独分出，再将得到的单菌落逐一进行发酵木糖母液试验，最后发现一株酵母能将母液中的木糖转变为木糖醇，而L-阿拉伯糖仍然残留很多，再将该酵母涂布接种在含有40％(体积百分比)的木糖母液的固体培养基上进行驯化，使其能够适应高浓度木糖母液，得到能够在40％(体积百分比)浓度的木糖母液中生长良好的酵母菌株X828，该菌株保存在中国普通微生物保藏管理中心。

该菌株为卵圆形或长椭圆形，出芽生殖，菌落圆形，边缘不整齐，菌落表面以及边缘有肉眼可见绒毛样丝状凸起，菌落奶黄色，表面干燥并有突出与凹陷的沟纹；能在含有葡萄糖，半乳糖、木糖，山梨醇，甘露醇作为唯一碳源的基本培养基上良好生长。但很少利用木糖醇，不能利用L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇。

该菌株的名称：假丝酵母(Candida sp.)X828，保藏号：CGMCC NO.3691，保藏单位：中国普通微生物保藏中心，保藏日期是2010年3月25日。

本发明所用菌株的培养方法如下：

(1)发酵培养基的制备：

每升发酵培养基含：木糖母液(来源于木糖厂)100ml-300ml、酵母粉(OXOID公司)5-10克、2-4克磷酸氢二钾与2克无水硫酸镁。将上述成分混合后用净化水定容到1升，在108℃蒸汽灭菌10分钟即制得无菌的发酵培养基。

(2)接种、培养

酵母一级种子的培养：将保存在试管斜面上的酵母细胞接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在28-37℃下进行培养，按照100-300rpm搅拌速度，培养12-24小时。试管斜面培养基的组成为(g/l)：麦芽汁10克、葡萄糖5克、琼脂粉15克。

酵母二级种子的培养：将一级种子5ml全部加入到含100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，培养条件同一级种子的培养条件。

再将二级种子液的接种量按照体积比为10％加入到5升发酵罐中进行发酵培养。

附图说明

图1实施例1中假丝酵母X828在含稀释4倍的木糖母液的发酵液中发酵72小时后，经过滤除菌后的HPLC图谱，图中保留时间为10.332分钟的峰为L-阿拉伯糖，17.598分钟的为L-阿拉伯糖醇的峰，24.198分钟的为木糖醇的峰，它们的含量分别为19.3％，8.5％以及65.0％，三者总的含量之和为92.8％。

图2实施例1中假丝酵母X828发酵液过滤除菌净化结晶后的混合物的HPLC图谱，图中保留时间为11.032分钟的峰为L-阿拉伯糖，25.065分钟的为木糖醇的峰，它们的含量分别为55％，45％，三者总的含量之和为90％。

图3假丝酵母X828在含稀释8倍的木糖母液的发酵液中发酵48小时后，经过滤除菌净化后的HPLC图谱，图中保留时间为10.040分钟为L-阿拉伯糖的峰，17.598分钟为L-阿拉伯糖醇的峰，26.632分钟为木糖醇的峰。它们的含量分别为43.5％，5.6％以及31.1％，三者中的含量之和为79.2％。含量之和明显低于木糖母液稀释4倍的含量之和。

图4假丝酵母X828细胞在含稀释5倍的木糖母液水溶液中静息细胞转化48小时后的HPLC分析图谱，图中保留时间为11.282，18.607以及25.22分钟分别为L-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖醇与木糖醇的峰，在L-阿拉伯糖前面的峰(约10.22分钟)为乙醇的峰。L-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖醇以及木糖醇的含量分别为21.2％、9.5％以及58.6％，含量之和为89.3％。

图5假丝酵母X828细胞在含稀释5倍的木糖母液水溶液中第二次静息细胞转化48小时后的HPLC分析图谱，图中保留时间为11.532，19.132以及26.264分钟分别为L-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖醇与木糖醇的峰，在L-阿拉伯糖前面的峰(约10.42分钟)为乙醇的峰。转化液中木糖醇、L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇的含量分别为：52.2％、23.4％以及10.4％，

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

量取1000毫升木糖母液，测定折光度为67.4。该母液为用玉米芯水解液制备木糖后残留的无法再结晶的深褐色粘稠液体，木糖的含量为45％(质量体积百分比)，L-阿拉伯糖的含量为15％(质量体积百分比)，葡萄糖的含量为12％(质量体积百分比)，其余的其它未知杂糖。加入粉末性活性炭(国药)20克，在80℃脱色90分钟，旋转搅拌，90rpm。然后采用滤布过滤得到淡褐色的粘稠液体，测定折光度为62.2，减少的5.2折光度为活性炭吸附损失掉，得率为92.2％。将脱色的母液用纯净水稀释4倍，测定折光率为15.1，电导率为82.4μS/cm。加入质量百分比为1.5％的酵母粉，质量百分比为1％的磷酸二氢钾以及0.1％的硫酸镁，充分溶解，测定电导率为1.7mS/cm，电导率的大幅升高是由于加入的酵母粉引起的。将配好的发酵液装入5升的发酵罐中，过滤除菌。将保存在试管斜面的上的假丝酵母(Candida ssp.)X828接种到含5ml发酵培养基的50ml的试管中，在32℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养24小时得到一级种子液；将一级种子液5ml全部加入到含100ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在32℃下进行培养，按照300rpm的搅拌速度，培养12小时得到二级种子液；将二级种子液100ml全部加入到含400ml发酵培养基的2000ml的摇瓶中，在32℃下进行培养，按照200rpm的搅拌速度，培养24小时得到三级种子液；再将此三级种子液按照10％(V/V)接种到发酵罐中进行发酵，在32℃，300rpm条件下发酵72小时。离心分离酵母菌体，得到淡黄色的发酵液。将此发酵液进行HPLC分析，除了含有L-阿拉伯糖以及木糖醇外，还含有少量的L-阿拉伯糖醇。发酵液的HPLC分析结果如图1所示。再进行离子交换处理：依次通过001×7型阳离子交换柱，201×7型阴离子交换柱以及001×7型阳离子交换柱，滤液通过交换柱的流速为每分钟200毫升。在线检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于50μS/cm时停止离子交换。将脱盐后的发酵液通过旋转蒸发浓缩到折光度85以上，缓慢加入L-阿拉伯糖种晶与木糖醇种晶，加入量分别为浓缩的发酵液中L-阿拉伯糖与木糖醇含量的5％，然后加入3倍体积的无水乙醇使木糖醇以及L-阿拉伯糖失去分子表面结合水，并在65℃温度下进行助晶10小时，轻轻搅拌，再缓慢降温至20℃直至充分结晶，离心得到白色晶体，再用无水乙醇洗涤二次，然后干燥去除乙醇，得到136克干燥的L-阿拉伯糖与木糖醇混合晶体。经HPLC分析，此混合晶体中L-阿拉伯糖与木糖醇的含量分别为55％与45％，结晶后木糖醇的含量较结晶前有所降低，而L-阿拉伯糖的含量有所提高，原因可能是L-阿拉伯糖较木糖醇容易结晶。混合结晶物的HPLC图谱如图2所示。由图2可见，结晶混合物中不含L-阿拉伯糖醇，可能的原因是没有加入种晶以及本身含量较低达不到饱和临界点，使L-阿拉伯糖醇无法结晶。

实施例2

量取500毫升木糖母液，该木糖母液同实施例1。用纯净水稀释8倍，测定折光率为8.5，电导率为76.5。加入质量百分比为1.5％的酵母粉，充分溶解，测定电导率为1.6mS/cm，电导率的大幅升高是由于加入的酵母粉引起的。将配好的发酵液装入5升的发酵罐中，过滤除菌。假丝酵母(Candida ssp.)X828种子的培养同实施例1。再将此种子液按照20％(V/V)接种到发酵罐中进行发酵，在32℃，300rpm条件下发酵48小时。离心分离酵母菌体，得到茶褐色的发酵液。旋转浓缩到体积为2升，加入粉末性活性炭(国药)20克，在80℃脱色90分钟，旋转搅拌，90rpm。然后采用滤布过滤除去活性炭得到淡褐色的粘稠液体，测定折光度为15.2。进行HPLC分析，除了含有L-阿拉伯糖以及木糖醇外，还含有少量的L-阿拉伯糖醇。脱色液的HPLC分析结果如图3所示。再进行离子交换处理：依次通过001×7型阳离子交换柱，201×7型阴离子交换柱以及001×7型阳离子交换柱，滤液通过交换柱的流速为每分钟200毫升。在线检测流出液的电导率，当流出液的电导率低于50μs/cm时停止离子交换。结晶过程同实施例1。得到的混合晶体为46克。500ml母液中含有175克木糖以及35克L-阿拉伯糖，理论上可以得到175克木糖醇以及37克的L-阿拉伯糖。但酵母在发酵转化过程中，在母液浓度较为低的情况下会消耗较多的木糖以及L-阿拉伯糖用于代谢合成，并且消耗木糖的速率要比L-阿拉伯糖要快。发酵结束后，理论上木糖醇的含量要大于L-阿拉伯糖的含量，但从图3可以看出，木糖醇的含量要比L-阿拉伯糖的含量要少，原因是酵母X828消耗了大量的木糖以及木糖醇。因此得到混合晶体量要少于实施例1中的量的一半。

实施例3

将实施例1得到的酵母细胞部分悬浮在用纯净水稀释5倍的木糖母液中，装在2升的摇瓶中，装料400毫升，充分混匀，木糖母液同实施例1。混匀后测定细胞在OD600的光密度，测定值为108。细胞在32℃，220rpm条件下进行转化木糖母液。转化期间每隔6小时取样一次进行HPLC分析其中的糖醇含量。转化到48小时时，木糖基本转变为木糖醇，而L-阿拉伯糖约有15％转化为L-阿拉伯糖醇。转化液中木糖醇、L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇的含量分别为：58.6％、21.2％以及9.5％。转化48小时时的HPLC图谱如图4所示。转化液的脱色、脱盐以及结晶步骤同实施例1。从400ml转化液中得到14.2克的混合白色粉末结晶，含有L-阿拉伯糖以及木糖醇。

实施例4

将实施例3得到的转化液离心得到酵母细胞，将该酵母细胞重新悬浮在用纯净水稀释5倍的木糖母液中，装在2升的摇瓶中，装料400毫升，充分混匀，木糖母液同实施例1，进行细胞的第二次转化木糖母液。转化条件同实施例3。转化期间每隔6小时取样一次进行HPLC分析其中的糖醇含量。转化到48小时时，木糖基本转变为木糖醇，而L-阿拉伯糖约有15％转化为L-阿拉伯糖醇。转化液中木糖醇、L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇的含量分别为：52.2％、23.4％以及10.4％，转化48小时时的HPLC图谱如图5所示。转化液的脱色、脱盐以及结晶步骤同实施例1。从400ml转化液中得到13.2克的混合白色粉末结晶，含有L-阿拉伯糖以及木糖醇。转化效果基本与实施例3的效果一致。

实施例5

将实施例3、4得到的L-阿拉伯糖以及木糖醇混合粉末结晶，作为甜味剂按照5％以上比例添加到纯净水或自来水中，搅拌2-3分钟至晶体完全溶解，即可。

Claims (2)

1.一种基于假丝酵母(candida sp.)X828从木糖母液制备木糖醇与L-阿拉伯糖混合晶体的方法，其中所述的假丝酵母X828已经于2010年3月25日保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC NO.3691，其特征在于利用假丝酵母X828去除木糖母液中葡萄糖以及半乳糖，达到分离木糖醇以及L-阿拉伯糖的目的。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的木糖母液包括蔗渣或玉米芯来源的木糖母液。

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