JPH0556952B2 - - Google Patents
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- JPH0556952B2 JPH0556952B2 JP26338185A JP26338185A JPH0556952B2 JP H0556952 B2 JPH0556952 B2 JP H0556952B2 JP 26338185 A JP26338185 A JP 26338185A JP 26338185 A JP26338185 A JP 26338185A JP H0556952 B2 JPH0556952 B2 JP H0556952B2
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、医薬及び試薬として有用な、コンド
ロイチン硫酸分解酵素である純コンドロイチナー
ゼの製造法、更に詳しくは、コンドロイチナーゼ
の部分精製液、特にコンドロイチナーゼＡ、Ｂ又
はＣタイプの部分精製液を、亜鉛固定化担体を分
離剤（リガンド）とするアフイニテイークロマト
グラフイーに供して完全精製を行ない、純コンド
ロイチナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
ロイチン硫酸分解酵素である純コンドロイチナー
ゼの製造法、更に詳しくは、コンドロイチナーゼ
の部分精製液、特にコンドロイチナーゼＡ、Ｂ又
はＣタイプの部分精製液を、亜鉛固定化担体を分
離剤（リガンド）とするアフイニテイークロマト
グラフイーに供して完全精製を行ない、純コンド
ロイチナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
従来、一般的なコンドロイチナーゼの精製法と
しては、微生物菌体を超音波又はフレンチプレス
等により破壊し、得られる菌体抽出液を硫安沈澱
及びストレプトマイシン処理後、DEAEセルロー
スカラムクロマトグラフイー又はフオスホセルロ
ースカラムクロマトグラフイー等で分画し、しか
る後ゲル濾過により分離精製する方法が知られて
いる。
しては、微生物菌体を超音波又はフレンチプレス
等により破壊し、得られる菌体抽出液を硫安沈澱
及びストレプトマイシン処理後、DEAEセルロー
スカラムクロマトグラフイー又はフオスホセルロ
ースカラムクロマトグラフイー等で分画し、しか
る後ゲル濾過により分離精製する方法が知られて
いる。
また、アフイニテイークロマトグラフイーによ
るコンドロイチナーゼ部分精製液からのコンドロ
イチナーゼの精製法としては、ヘパリンをリガン
ドとする方法（特開昭54−107586号公報参照）及
びコンドロイチンをリガンドとする方法（特開昭
54−107587号公報参照）が知られている。
るコンドロイチナーゼ部分精製液からのコンドロ
イチナーゼの精製法としては、ヘパリンをリガン
ドとする方法（特開昭54−107586号公報参照）及
びコンドロイチンをリガンドとする方法（特開昭
54−107587号公報参照）が知られている。
しかしながら、上記の精製法においては、硫安
処理或いはストレプトマイシン処理等の処理が必
要であり、操作が複雑で、収率良く純コンドロイ
チナーゼを得られない等の問題があつた。
処理或いはストレプトマイシン処理等の処理が必
要であり、操作が複雑で、収率良く純コンドロイ
チナーゼを得られない等の問題があつた。
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意
検討した結果、コンドロイチナーゼの部分精製液
を精製するに際し、亜鉛固定化担体を分離剤とす
るアフイニテイークロマトグラフイーを用い、コ
ンドロイチナーゼを上記亜鉛固定化担体に吸着さ
せた後、吸着されたコンドロイチナーゼをコンド
ロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出させる
と、硫安処理或いはストレプトマイシン処理等の
処理を省略でき、従来法に比べ、操作が簡易で、
より収率良く純コンドロイチナーゼを製造できる
ことを知見した。
検討した結果、コンドロイチナーゼの部分精製液
を精製するに際し、亜鉛固定化担体を分離剤とす
るアフイニテイークロマトグラフイーを用い、コ
ンドロイチナーゼを上記亜鉛固定化担体に吸着さ
せた後、吸着されたコンドロイチナーゼをコンド
ロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出させる
と、硫安処理或いはストレプトマイシン処理等の
処理を省略でき、従来法に比べ、操作が簡易で、
より収率良く純コンドロイチナーゼを製造できる
ことを知見した。
本発明は、上記の知見に基づきなされたもの
で、コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際
し、該コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛
固定化担体を分離剤とするアフイニテイークロマ
トグラフイーに付すことを特徴とする純コンドロ
イチナーゼの製造法を提供することによつて、上
記の問題点を解決したものである。
で、コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際
し、該コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛
固定化担体を分離剤とするアフイニテイークロマ
トグラフイーに付すことを特徴とする純コンドロ
イチナーゼの製造法を提供することによつて、上
記の問題点を解決したものである。
以下、本発明の純コンドロイチナーゼの製造法
をその好ましい実施態様に基づき詳述する。
をその好ましい実施態様に基づき詳述する。
本発明の製造法は、予め通常の方法で部分精製
したコンドロイチナーゼの部分精製液を精製する
もので、この部分精製液は、その部分精製法には
特に制限されないが、その好ましい一例として
は、コンドロイチナーゼ産生菌体を破壊した後得
られる抽出液を、DEAEセルロースカラムに通
し、その未吸着画分をヒドロキシルアパタイトカ
ラムに付し、適当なリン酸バツフアーを用いて溶
出させたコンドロイチナーゼ含有液が挙げられ
る。又、上記のコンドロイチナーゼ産生菌体とし
ては、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸を添
加した培地を用いて培養されたプロテウス属、フ
ラボバクテリウム属、アエロモナス属、又はバク
テロイデス属の菌体が好ましい。
したコンドロイチナーゼの部分精製液を精製する
もので、この部分精製液は、その部分精製法には
特に制限されないが、その好ましい一例として
は、コンドロイチナーゼ産生菌体を破壊した後得
られる抽出液を、DEAEセルロースカラムに通
し、その未吸着画分をヒドロキシルアパタイトカ
ラムに付し、適当なリン酸バツフアーを用いて溶
出させたコンドロイチナーゼ含有液が挙げられ
る。又、上記のコンドロイチナーゼ産生菌体とし
ては、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸を添
加した培地を用いて培養されたプロテウス属、フ
ラボバクテリウム属、アエロモナス属、又はバク
テロイデス属の菌体が好ましい。
また、本発明の製造法において、マフイニテイ
ーカラムクロマトグラフイーの分離剤（リガン
ド）として用いられる亜鉛固定化担体としては、
タンニン、イミノジアセテートアガロース
（Sigma Chemical社製）等が挙げられる。又、
マフイニテイーカラムクロマトグラフイーの調製
は、上記担体をカラムに充填し、これを緩衝液、
例えば10ｍＭのTris・HCl等の緩衡液で充分平衡
化した後、斯る緩衝液と同様の緩衡液に溶解させ
た亜鉛化合物の溶液、例えば1MのZnCl2溶液を
カラムに導通することによつて行うのが好まし
い。
ーカラムクロマトグラフイーの分離剤（リガン
ド）として用いられる亜鉛固定化担体としては、
タンニン、イミノジアセテートアガロース
（Sigma Chemical社製）等が挙げられる。又、
マフイニテイーカラムクロマトグラフイーの調製
は、上記担体をカラムに充填し、これを緩衝液、
例えば10ｍＭのTris・HCl等の緩衡液で充分平衡
化した後、斯る緩衝液と同様の緩衡液に溶解させ
た亜鉛化合物の溶液、例えば1MのZnCl2溶液を
カラムに導通することによつて行うのが好まし
い。
而して、本発明の製造法の実施に際しては、先
ず、上記コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜
鉛固定化担体を分離剤とするマフイニテイーカラ
ムクロマトグラフイーに付し、亜鉛と酵素との高
い親和性を利用してコンドロイチナーゼを斯る亜
鉛固定化担体に吸着させる。
ず、上記コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜
鉛固定化担体を分離剤とするマフイニテイーカラ
ムクロマトグラフイーに付し、亜鉛と酵素との高
い親和性を利用してコンドロイチナーゼを斯る亜
鉛固定化担体に吸着させる。
次いで、亜鉛固定化担体に吸着されたコンドロ
イチナーゼをコンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを
用いて溶出させる。この溶出は、0.5〜１％コン
ドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ又はコ
ンドロイチン硫酸Ｃを含む５〜100ｍＭのTris・
HCl等の緩衝液をカラムに通して行うのが好まし
い。尚、溶出に先立つては、カラムを５〜100ｍ
ＭのTris・HCl等の緩衝液で洗浄しておくのが好
ましい。
イチナーゼをコンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを
用いて溶出させる。この溶出は、0.5〜１％コン
ドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ又はコ
ンドロイチン硫酸Ｃを含む５〜100ｍＭのTris・
HCl等の緩衝液をカラムに通して行うのが好まし
い。尚、溶出に先立つては、カラムを５〜100ｍ
ＭのTris・HCl等の緩衝液で洗浄しておくのが好
ましい。
しかる後、溶出液中のコンドロイチン硫酸とコ
ンドロイチナーゼＡ、Ｂ又はＣとを分画するた
め、斯る溶出液（酵素液）をSephadx Ｇ−200カ
ラムクロマトグラフイー等のカラムクロマトグラ
フイーに付し、得られた活性画分を集めることに
より、高純度のコンドロイチナーゼを得ることが
できる。
ンドロイチナーゼＡ、Ｂ又はＣとを分画するた
め、斯る溶出液（酵素液）をSephadx Ｇ−200カ
ラムクロマトグラフイー等のカラムクロマトグラ
フイーに付し、得られた活性画分を集めることに
より、高純度のコンドロイチナーゼを得ることが
できる。
上述のように、本発明の純コンドロイチナーゼ
の製造法は、コンドロイチナーゼの強力な阻害剤
である亜鉛を固定化した担体に、亜鉛との親和性
を利用してコンドロイチナーゼを吸着させ、その
後、亜鉛固定化担体に吸着されたコンドロイチナ
ーゼを、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用い
て溶出させることにより、高純度コンドロイチナ
ーゼを得るものである。
の製造法は、コンドロイチナーゼの強力な阻害剤
である亜鉛を固定化した担体に、亜鉛との親和性
を利用してコンドロイチナーゼを吸着させ、その
後、亜鉛固定化担体に吸着されたコンドロイチナ
ーゼを、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用い
て溶出させることにより、高純度コンドロイチナ
ーゼを得るものである。
次に、実施例を挙げ、本発明の純コンドロイチ
ナーゼの製造法を更に具体的に説明する。
ナーゼの製造法を更に具体的に説明する。
プロテウスブルガリスNCTC4636を栄養培地
（１％ペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食塩、
0.1％グルコース、PH7.2）にて30℃で一晩培養し
た。得られた湿菌体50ｇを、10の誘導培地
（0.7％リン酸２カリウム、0.3％リン酸１カリウ
ム、0.01％硫酸マグネシウム、0.1％硫酸アンモ
ニウム、0.1mg／mlニコチン酸、0.3％コンドロイ
チン硫酸Ｃ、PH7.0）にて30℃で12時間通気培養
した後、遠心分離して菌体を集め、0.85％食塩水
で洗浄した。その後、この洗浄菌体90ｇを50mlの
10ｍＭリン酸バツフアー（KPB）PH7.0に懸濁
後、Dyno−Millを用いて０℃で３分菌体破砕処
理を行つた。この菌体破砕液を遠心分離し、その
上澄液（粗酵素液）を得た。
（１％ペプトン、0.5％酵母エキス、0.5％食塩、
0.1％グルコース、PH7.2）にて30℃で一晩培養し
た。得られた湿菌体50ｇを、10の誘導培地
（0.7％リン酸２カリウム、0.3％リン酸１カリウ
ム、0.01％硫酸マグネシウム、0.1％硫酸アンモ
ニウム、0.1mg／mlニコチン酸、0.3％コンドロイ
チン硫酸Ｃ、PH7.0）にて30℃で12時間通気培養
した後、遠心分離して菌体を集め、0.85％食塩水
で洗浄した。その後、この洗浄菌体90ｇを50mlの
10ｍＭリン酸バツフアー（KPB）PH7.0に懸濁
後、Dyno−Millを用いて０℃で３分菌体破砕処
理を行つた。この菌体破砕液を遠心分離し、その
上澄液（粗酵素液）を得た。
次いで、上記粗酵素液を、10ｍMKPB（PH7.0）
で平衡化したDEAEセルロースカラム（５×56
cm）に通し、未吸着画分をとり、更に同バツフア
ーで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムク
ロマトグラフイー（２×15cm）に付し、10ｍＭ−
0.5MのKPBで溶出した。0.3M付近で溶出したコ
ンドロイチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を集め、これを
濃縮後、大過剰の10ｍＭのTris・HCl（PH7.0）に
対して透析し、コンドロイチナーゼの部分精製液
を得た。
で平衡化したDEAEセルロースカラム（５×56
cm）に通し、未吸着画分をとり、更に同バツフア
ーで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムク
ロマトグラフイー（２×15cm）に付し、10ｍＭ−
0.5MのKPBで溶出した。0.3M付近で溶出したコ
ンドロイチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を集め、これを
濃縮後、大過剰の10ｍＭのTris・HCl（PH7.0）に
対して透析し、コンドロイチナーゼの部分精製液
を得た。
一方、亜鉛固定化カラム（アフイニテイークロ
マトグラフイー）には、例えば10mlの固定化タン
ニンやイミノジアセテートアガロース（Sigma
Chemical社製）を充填し、10ｍＭのTris・HCl
緩衡液（PH7.0）で充分平衡化した。次いで10ｍ
ＭのTris・HCl緩衡液（PH7.0）に溶解させた1M
のZnCl2溶液50mlをカラムに導通することによつ
て調整した。
マトグラフイー）には、例えば10mlの固定化タン
ニンやイミノジアセテートアガロース（Sigma
Chemical社製）を充填し、10ｍＭのTris・HCl
緩衡液（PH7.0）で充分平衡化した。次いで10ｍ
ＭのTris・HCl緩衡液（PH7.0）に溶解させた1M
のZnCl2溶液50mlをカラムに導通することによつ
て調整した。
しかる後、上述の如く調整されたカラムに、上
記透析液（コンドロイチナーゼの部分精製液）を
導通し、該カラムを５倍量の10ｍＭのTris・HCl
（PH7.0）で洗つた後、0.5％コンドロイチン硫酸
Ｃを含む10ｍＭのTris・HCl（PH7.0）でカラムか
らコンドロイチナーゼABCを溶出した。そして、
コンドロイチン硫酸Ｃを除くために、セフアデツ
クスＧ−200カラムクロマトグラフイー（1.6×50
cm）で、溶出したコンドロイチナーゼABCを処
理したところ、電気泳動的に均一な高純度のコン
ドロイチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を容易に得ること
が出来た。
記透析液（コンドロイチナーゼの部分精製液）を
導通し、該カラムを５倍量の10ｍＭのTris・HCl
（PH7.0）で洗つた後、0.5％コンドロイチン硫酸
Ｃを含む10ｍＭのTris・HCl（PH7.0）でカラムか
らコンドロイチナーゼABCを溶出した。そして、
コンドロイチン硫酸Ｃを除くために、セフアデツ
クスＧ−200カラムクロマトグラフイー（1.6×50
cm）で、溶出したコンドロイチナーゼABCを処
理したところ、電気泳動的に均一な高純度のコン
ドロイチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を容易に得ること
が出来た。
叙上の如く、本発明の純コンドロイチナーゼの
製造法は、コンドロイチナーゼの部分精製液の精
製に際し、該部分精製液を、亜鉛固定化担体を分
離剤とするアフイニテイークロマトグラフイーに
付すもので、本発明の製造法によれば、従来法に
必要とされていた硫安処理或いはストレプトマイ
シン処理等の処理を省略でき、従来法に比べて、
操作が簡易で、より収率良く純コンドロイチナー
ゼを製造できると云う卓越した効果が奏せられ
る。
製造法は、コンドロイチナーゼの部分精製液の精
製に際し、該部分精製液を、亜鉛固定化担体を分
離剤とするアフイニテイークロマトグラフイーに
付すもので、本発明の製造法によれば、従来法に
必要とされていた硫安処理或いはストレプトマイ
シン処理等の処理を省略でき、従来法に比べて、
操作が簡易で、より収率良く純コンドロイチナー
ゼを製造できると云う卓越した効果が奏せられ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際
し、該コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛
固定化担体を分離剤とするアフイニテイークロマ
トグラフイーに付すことを特徴とする純コンドロ
イチナーゼの製造法。 ２ コンドロイチナーゼの部分精製液が、コンド
ロイチナーゼ産生菌体を破壊した後、得られる抽
出液を、DEAEセルロースカラムに通し、更にヒ
ドロキシルアパタイトカラム処理を用いて分画さ
れたコンドロイチナーゼ含有液である、特許請求
の範囲第１項記載の純コンドロイチナーゼの製造
法。 ３ コンドロイチナーゼ産生菌体が、プロテウス
属、フラボバクテリウム属、アエロモナス属、又
はバクテロイデス属の菌体である、特許請求の範
囲第２項記載の純コンドロイチナーゼの製造法。 ４ コンドロイチナーゼ生産菌体が、コンドロイ
チン硫酸又はヒアルロン酸を添加した培地を用い
て培養されたものである、特許請求の範囲第２項
記載の純コンドロイチナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26338185A JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26338185A JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62122588A JPS62122588A (ja) | 1987-06-03 |
| JPH0556952B2 true JPH0556952B2 (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=17388698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26338185A Granted JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62122588A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
| WO1995029256A1 (en) * | 1994-04-22 | 1995-11-02 | American Cyanamid Company | Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof |
| US5888798A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase I and chondroitinase II producing mutants of P. vulgaris |
| AR082319A1 (es) | 2010-07-22 | 2012-11-28 | Biomarin Pharm Inc | Produccion de una n-acetilgalactosamina-6-sulfatasa humana activa altamente fosforilada y sus usos |
-
1985
- 1985-11-22 JP JP26338185A patent/JPS62122588A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62122588A (ja) | 1987-06-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |