JPS62122588A - 純コンドロイチナ−ゼの製造法 - Google Patents
純コンドロイチナ−ゼの製造法Info
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- JPS62122588A JPS62122588A JP26338185A JP26338185A JPS62122588A JP S62122588 A JPS62122588 A JP S62122588A JP 26338185 A JP26338185 A JP 26338185A JP 26338185 A JP26338185 A JP 26338185A JP S62122588 A JPS62122588 A JP S62122588A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、医薬及び試薬として有用な、コントロイチン
硫酸分解酵素である純コンドロイチナーゼの製造法、更
に詳しくは、コンドロイチナーゼの部分車ｎ製液、特に
コンドロイチナーゼＡ、Ｂ又はＣタイプの部分精製液を
、亜鉛固定化担体を分離剤（リガンド）とするアフィニ
ティークロマトグラフィーに供して完全精製を行ない、
純コンドロイチナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
硫酸分解酵素である純コンドロイチナーゼの製造法、更
に詳しくは、コンドロイチナーゼの部分車ｎ製液、特に
コンドロイチナーゼＡ、Ｂ又はＣタイプの部分精製液を
、亜鉛固定化担体を分離剤（リガンド）とするアフィニ
ティークロマトグラフィーに供して完全精製を行ない、
純コンドロイチナーゼを製造する方法に関するものであ
る。
従来、一般的なコンドロイチナーゼの精製法としては、
微生物菌体を超音波又はフレンチプレス等により破壊し
、得られる菌体抽出液を硫安比の及びストレプトマイシ
ン処理後、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィ
ー又はフォスホセルロースカラムクロマトグラフィー等
で分画し、しかる後ゲル濾過により分離精製する方法が
知られている。
微生物菌体を超音波又はフレンチプレス等により破壊し
、得られる菌体抽出液を硫安比の及びストレプトマイシ
ン処理後、ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィ
ー又はフォスホセルロースカラムクロマトグラフィー等
で分画し、しかる後ゲル濾過により分離精製する方法が
知られている。
また、アフィニティークロマトグラフィーによるコンド
ロイチナーゼ部分精製液からのコンドロイチナーゼのｌ
７ｆｉＪ法としては、ヘパリンをリガンドとする方法（
特開昭５４−１０７５８６号公報参照）及びコントロイ
チンをリガンドとする方法（特開昭５４−１０７５８７
号公報参照）が知られている。
ロイチナーゼ部分精製液からのコンドロイチナーゼのｌ
７ｆｉＪ法としては、ヘパリンをリガンドとする方法（
特開昭５４−１０７５８６号公報参照）及びコントロイ
チンをリガンドとする方法（特開昭５４−１０７５８７
号公報参照）が知られている。
しかしながら、上記の精製法においては、硫安処理或い
はストレプトマイノン処理等の処理が必要であり、操作
が複雑で、収率良く純コンドロイチナーゼを得られない
等の問題があった。
はストレプトマイノン処理等の処理が必要であり、操作
が複雑で、収率良く純コンドロイチナーゼを得られない
等の問題があった。
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討した
結果、コンドロイチナーゼの部分精製液を精製するに際
し、亜鉛固定化担体を分離剤とするアフィニティークロ
マトグラフィーを用い、コンドロイチナーゼを上記亜鉛
固定化担体に吸着させた後、吸着されたコンドロイチナ
ーゼをコントロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出さ
せると、硫安処理或いはストレプトマイシン処理等の処
理を省略でき、従来法に比べ、操作が簡易で、より収率
良く純コンドロイチナーゼを製造できることを知見した
。
結果、コンドロイチナーゼの部分精製液を精製するに際
し、亜鉛固定化担体を分離剤とするアフィニティークロ
マトグラフィーを用い、コンドロイチナーゼを上記亜鉛
固定化担体に吸着させた後、吸着されたコンドロイチナ
ーゼをコントロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出さ
せると、硫安処理或いはストレプトマイシン処理等の処
理を省略でき、従来法に比べ、操作が簡易で、より収率
良く純コンドロイチナーゼを製造できることを知見した
。
本発明は、上記の知見に基づきなされたもので、コンド
ロイチナーゼの部分精製液の精製に際し、該コンドロイ
チナーゼの部分精製液を、亜鉛固定化担体を分離剤とす
るアフィニティークロマトグラフィーに付すことを特徴
とする純コンドロイチナーゼの製造法を提供することに
よって、上記の問題点を解決したものである。
ロイチナーゼの部分精製液の精製に際し、該コンドロイ
チナーゼの部分精製液を、亜鉛固定化担体を分離剤とす
るアフィニティークロマトグラフィーに付すことを特徴
とする純コンドロイチナーゼの製造法を提供することに
よって、上記の問題点を解決したものである。
以下、本発明の純コンドロイチナーゼの製造法をその好
ましい実施態様に基づき詳述する。
ましい実施態様に基づき詳述する。
本発明の製造法は、予め通常の方法で部分精製したコン
ドロイチナーゼの部分精製液を精製するもので、この部
分精製液は、その部分精製法には特に制限されないが、
その好ましい一例としては、コンドロイチナーゼ産生菌
体を破壊した後得られる抽出液を、ＤＥＡＥセルロース
カラムに通し、その未吸着画分をヒドロキシルアパタイ
トカラムに付し、適当なリン酸バッファーを用いて溶出
させたコンドロイチナーゼ含有液が挙げられる。又、上
記のコンドロイチナーゼ産生菌体としては、コントロイ
チン硫酸又はヒアルロン酸を添加した培地を用いて培養
されたプロテウス属、フラボバクテリウム冗、アエロモ
ナス属、又はバクテロイデス屈の菌体が好ましい。
ドロイチナーゼの部分精製液を精製するもので、この部
分精製液は、その部分精製法には特に制限されないが、
その好ましい一例としては、コンドロイチナーゼ産生菌
体を破壊した後得られる抽出液を、ＤＥＡＥセルロース
カラムに通し、その未吸着画分をヒドロキシルアパタイ
トカラムに付し、適当なリン酸バッファーを用いて溶出
させたコンドロイチナーゼ含有液が挙げられる。又、上
記のコンドロイチナーゼ産生菌体としては、コントロイ
チン硫酸又はヒアルロン酸を添加した培地を用いて培養
されたプロテウス属、フラボバクテリウム冗、アエロモ
ナス属、又はバクテロイデス屈の菌体が好ましい。
また、本発明の製造法において、マフィニティー力ラム
クロマトグラフィーの分離剤（リガンド）として用いら
れる亜鉛固定化担体としては、タンニン、イミノジアセ
テートアガロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ１社製）
等が挙げられる。又、マフィニティー力ラムクロマトグ
ラフィーの調製は、上記担体をカラムに充填し、これを
緩衝液、例えば１０ｍＭのＴｒｉｓ・ｌｌＣｌ等の緩衝
液で充分平衡化した後、断る緩衝液と同様の緩衝液に溶
解させた亜鉛化合物の／８液、例えばＩＭのＺｎＣｌ、
溶液をカラムに導通することによって行うのが好ましい
。
クロマトグラフィーの分離剤（リガンド）として用いら
れる亜鉛固定化担体としては、タンニン、イミノジアセ
テートアガロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ１社製）
等が挙げられる。又、マフィニティー力ラムクロマトグ
ラフィーの調製は、上記担体をカラムに充填し、これを
緩衝液、例えば１０ｍＭのＴｒｉｓ・ｌｌＣｌ等の緩衝
液で充分平衡化した後、断る緩衝液と同様の緩衝液に溶
解させた亜鉛化合物の／８液、例えばＩＭのＺｎＣｌ、
溶液をカラムに導通することによって行うのが好ましい
。
而して、本発明の製造法の実施に際しては、先ず、上記
コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛固定化担体を
分離剤とするマフィニティー力ラムクロマトグラフィー
に付し、亜鉛と酵素との高い親和性を利用してコンドロ
イチナーゼを斯る亜鉛固定化担体に吸着させる。
コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛固定化担体を
分離剤とするマフィニティー力ラムクロマトグラフィー
に付し、亜鉛と酵素との高い親和性を利用してコンドロ
イチナーゼを斯る亜鉛固定化担体に吸着させる。
次いで、亜鉛固定化担体に吸着されたコンドロイチナー
ゼをコントロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出させ
る。この溶出は、０．５〜１％コントロイチン硫酸Ａ、
コントロイチン硫酸Ｂ又はコントロイチン硫酸Ｃを含む
５〜１００１のＴｒｉｓ・ＨＣＩ等のｒｉ街液をカラム
に通して行うのが好ましい。尚、溶出に先立っては、カ
ラムを５〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ等の緩衝液で
洗浄しておくのが好ましい。
ゼをコントロイチン硫酸Ａ、Ｂ又はＣを用いて溶出させ
る。この溶出は、０．５〜１％コントロイチン硫酸Ａ、
コントロイチン硫酸Ｂ又はコントロイチン硫酸Ｃを含む
５〜１００１のＴｒｉｓ・ＨＣＩ等のｒｉ街液をカラム
に通して行うのが好ましい。尚、溶出に先立っては、カ
ラムを５〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ等の緩衝液で
洗浄しておくのが好ましい。
しかる（麦、溶出液中のコントロイチン硫酸とコンドロ
イチナーゼＡ、Ｂ又はＣとを分画するため、斯る溶出ｔ
Ｌ（酵素ｌ＆）を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラ
ムクロマトグラフイー等のカラムクロマトグラフィ−に
付し、得られた活性画分を集めることにより、高純度の
コンドロイチナーゼを得ることができる。
イチナーゼＡ、Ｂ又はＣとを分画するため、斯る溶出ｔ
Ｌ（酵素ｌ＆）を５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラ
ムクロマトグラフイー等のカラムクロマトグラフィ−に
付し、得られた活性画分を集めることにより、高純度の
コンドロイチナーゼを得ることができる。
上述のように、本発明の純コンドロイチナーゼの製造法
は、コンドロイチナーゼの強力な阻害剤である亜鉛を固
定化した担体に、亜鉛との親和性を利用してコンドロイ
チナーゼを吸着させ、その後、亜鉛固定化担体に吸着さ
れたコンドロイチナーゼを、コントロイチン硫酸Ａ、
Ｂ又はＣを用いて溶出させることにより、高純度コン
トロイチン硫酸を得るものである。
は、コンドロイチナーゼの強力な阻害剤である亜鉛を固
定化した担体に、亜鉛との親和性を利用してコンドロイ
チナーゼを吸着させ、その後、亜鉛固定化担体に吸着さ
れたコンドロイチナーゼを、コントロイチン硫酸Ａ、
Ｂ又はＣを用いて溶出させることにより、高純度コン
トロイチン硫酸を得るものである。
次に、実施例を挙げ、本発明の純コンドロイチナーゼの
製造法を更に具体的に説明する。
製造法を更に具体的に説明する。
プロテウスブルガリスＮＣＴＣ４６３６を栄養培地（１
％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％食塩、０．
１％グルコース、ｐＨ７，２）にて３０℃で一晩培養し
た。得られた湿菌体５０ｇを、１０！の誘導培地（０，
７％リン酸２カリウム、０．３％リン酸１カリウム、０
．０１％硫酸マグネシウム、０゜１％硫酸アンモニウム
、０．１■／ｍｌニコチン酸、０．３％コントロイチン
硫酸Ｃ，ｐ）１７．０）にて３０“Ｃで１２時間通気培
養した後、遠心分離して菌体を集め、０．８５％食塩水
で洗浄した。その後、この洗浄菌体９０ｇを５０ｍ１の
１０ｍＭリン酸バッフｙ−（ＫＰＢ）ｐＨ７，０に２．
４後、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌを用いて０℃で３分画体破砕
処理を行った。この菌体破砕液を遠心分離し、その上澄
液（粗酵素液）を得た。
％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％食塩、０．
１％グルコース、ｐＨ７，２）にて３０℃で一晩培養し
た。得られた湿菌体５０ｇを、１０！の誘導培地（０，
７％リン酸２カリウム、０．３％リン酸１カリウム、０
．０１％硫酸マグネシウム、０゜１％硫酸アンモニウム
、０．１■／ｍｌニコチン酸、０．３％コントロイチン
硫酸Ｃ，ｐ）１７．０）にて３０“Ｃで１２時間通気培
養した後、遠心分離して菌体を集め、０．８５％食塩水
で洗浄した。その後、この洗浄菌体９０ｇを５０ｍ１の
１０ｍＭリン酸バッフｙ−（ＫＰＢ）ｐＨ７，０に２．
４後、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌを用いて０℃で３分画体破砕
処理を行った。この菌体破砕液を遠心分離し、その上澄
液（粗酵素液）を得た。
次いで、上記粗酵素液を、１０ｍＭＫ Ｐ Ｂ （ｐＨ
７゜０）で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（５×
５６ｃｍ）に通し、未吸着画分をとり、更に同バッファ
ーで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムクロマト
グラフィー（２Ｘ１５ｃｍ）に付し、１０ｍＭ０．５門
のＫＰＢで溶出した。０．３門付近で溶出したコンドロ
イチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を集め、これを濃縮後、大過
剰の１０ｍＭのＴｒｉｓ・１（Ｃ１（ｐＨ７，０）に対
して透析し、コンドロイチナーゼの部分精製液を得た。
７゜０）で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（５×
５６ｃｍ）に通し、未吸着画分をとり、更に同バッファ
ーで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムクロマト
グラフィー（２Ｘ１５ｃｍ）に付し、１０ｍＭ０．５門
のＫＰＢで溶出した。０．３門付近で溶出したコンドロ
イチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を集め、これを濃縮後、大過
剰の１０ｍＭのＴｒｉｓ・１（Ｃ１（ｐＨ７，０）に対
して透析し、コンドロイチナーゼの部分精製液を得た。
一方、亜鉛固定化カラム（アフィニティークロマトグラ
フィー）には、例えば１０１）の固定化タンニンやイミ
ノジアセテートアガロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
１社製）を充填し、１）０１ＩＩのＴｒｉｓ ・ＨＣＩ
ｍ南液（ｐＨ７，０＞で充分平衡化した。次いで１０
ｍＭのＴｒｉｓ ・Ｉ（ＣＩ １）！衡／＆（ｐＨ７，
０）に溶解させたＩＭのＺｎＣｊ□ｆ６液５０ｍ１をカ
ラムに導通することによってｔ周整した。
フィー）には、例えば１０１）の固定化タンニンやイミ
ノジアセテートアガロース（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
１社製）を充填し、１）０１ＩＩのＴｒｉｓ ・ＨＣＩ
ｍ南液（ｐＨ７，０＞で充分平衡化した。次いで１０
ｍＭのＴｒｉｓ ・Ｉ（ＣＩ １）！衡／＆（ｐＨ７，
０）に溶解させたＩＭのＺｎＣｊ□ｆ６液５０ｍ１をカ
ラムに導通することによってｔ周整した。
しかる後、上述の如く調整されたカラムに、上記遇析液
（コンドロイチナーゼの部分精製液）を導通し、該カラ
ムを５倍量の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０
）で洗った後、０．５％コントロイチン硫酸Ｃを含むｌ
ｏｍＭのＴｒｉｓ ・ＩＩｃＩ （ｐＨ７，０）でカ
ラムからコンドロイチナーゼＡＢＣを溶出した。そして
、コントロイチン硫酸Ｃを除くために、セファデックス
Ｇ−２００カラムクロマトグラフイー＜１．６ Ｘ ５
０ｃｍ）で、ｌ８出したコンドロイチナーゼＡＢＣを処
理したところ、電気泳動的に均一な高純度のコンドロイ
チナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を容易に得ることが出来た。
（コンドロイチナーゼの部分精製液）を導通し、該カラ
ムを５倍量の１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０
）で洗った後、０．５％コントロイチン硫酸Ｃを含むｌ
ｏｍＭのＴｒｉｓ ・ＩＩｃＩ （ｐＨ７，０）でカ
ラムからコンドロイチナーゼＡＢＣを溶出した。そして
、コントロイチン硫酸Ｃを除くために、セファデックス
Ｇ−２００カラムクロマトグラフイー＜１．６ Ｘ ５
０ｃｍ）で、ｌ８出したコンドロイチナーゼＡＢＣを処
理したところ、電気泳動的に均一な高純度のコンドロイ
チナーゼＡ、Ｂ、Ｃ画分を容易に得ることが出来た。
叙上の如く、本発明の純コンドロイチナーゼの製造法は
、コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際し、該部
分精製液を、亜鉛固定化担体を分離剤とするアフィニテ
ィークロマトグラフィーに付すもので、本発明の製造法
によれば、従来法に必要とされていた硫安処理或いはス
トレプトマイシン処理等の処理を省略でき、従来法に比
べて、操作が簡易で、より収率良く純コンドロイチナー
ゼを製造できると云う卓越した効果が奏せられる。
、コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際し、該部
分精製液を、亜鉛固定化担体を分離剤とするアフィニテ
ィークロマトグラフィーに付すもので、本発明の製造法
によれば、従来法に必要とされていた硫安処理或いはス
トレプトマイシン処理等の処理を省略でき、従来法に比
べて、操作が簡易で、より収率良く純コンドロイチナー
ゼを製造できると云う卓越した効果が奏せられる。
Claims (4)
- （１）コンドロイチナーゼの部分精製液の精製に際し、
該コンドロイチナーゼの部分精製液を、亜鉛固定化担体
を分離剤とするアフィニティークロマトグラフィーに付
すことを特徴とする純コンドロイチナーゼの製造法。 - （２）コンドロイチナーゼの部分精製液が、コンドロイ
チナーゼ産生菌体を破壊した後、得られる抽出液を、Ｄ
ＥＡＥセルロースカラムに通し、更にヒドロキシルアパ
タイトカラム処理を用いて分画されたコンドロイチナー
ゼ含有液である、特許請求の範囲第（１）項記載の純コ
ンドロイチナーゼの製造法。 - （３）コンドロイチナーゼ産生菌体が、プロテウス属、
フラボバクテリウム属、アエロモナス属、又はバクテロ
イデス属の菌体である、特許請求の範囲第（２）項記載
の純コンドロイチナーゼの製造法。 - （４）コンドロイチナーゼ生産菌体が、コントロイチン
硫酸又はヒアルロン酸を添加した培地を用いて培養され
たものである、特許請求の範囲第（２）項記載の純コン
ドロイチナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26338185A JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26338185A JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62122588A true JPS62122588A (ja) | 1987-06-03 |
| JPH0556952B2 JPH0556952B2 (ja) | 1993-08-20 |
Family
ID=17388698
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26338185A Granted JPS62122588A (ja) | 1985-11-22 | 1985-11-22 | 純コンドロイチナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62122588A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
| EP0756636A1 (en) * | 1994-04-22 | 1997-02-05 | American Cyanamid Company | Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof |
| US5888798A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase I and chondroitinase II producing mutants of P. vulgaris |
| US9567572B2 (en) | 2010-07-22 | 2017-02-14 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Manufacture of active highly phosphorylated human N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and uses thereof |
-
1985
- 1985-11-22 JP JP26338185A patent/JPS62122588A/ja active Granted
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
| EP0756636A1 (en) * | 1994-04-22 | 1997-02-05 | American Cyanamid Company | Chondroitinases i and ii, methods of preparation, and use thereof |
| EP0756636A4 (en) * | 1994-04-22 | 1997-12-17 | American Cyanamid Co | CHONDROITINASES I AND II, PROCESSES FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE |
| US5716617A (en) * | 1994-04-22 | 1998-02-10 | American Cyanamid Company | Compositions of proteus vulgaris chondroitinase I and chondroitinase II |
| US5741692A (en) * | 1994-04-22 | 1998-04-21 | American Cyanamid Company | Protein vulgaris chondroitinase II |
| US5855883A (en) * | 1994-04-22 | 1999-01-05 | American Cyanamid Company | Method of disinsertion of vitreous body from neural retina of the eye with Proteus vulgaris chondroitinases I and II |
| US5888798A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | American Cyanamid Company | Chondroitinase I and chondroitinase II producing mutants of P. vulgaris |
| US9567572B2 (en) | 2010-07-22 | 2017-02-14 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Manufacture of active highly phosphorylated human N-acetylgalactosamine-6-sulfatase and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0556952B2 (ja) | 1993-08-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |