JPH04304885A - グルコキナーゼの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物菌体より得るこ
とができる産業上有用な酵素の１つであるグルコキナー
ゼを、アフィニティークロマトグラフィーを行うことに
より、簡単にかつ高純度に精製する方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】従来から、微生物菌体より酵素を採取す
るには、菌体を破砕後、塩あるいは界面活性剤を含む溶
液などで抽出し、核酸の除去、硫酸アンモニウムを用い
た塩析による分画などを行った後、種々の担体を用いた
カラムクロマトグラフィーが実施されていた。特にカラ
ムクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグ
ラフィー例えばＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−又
はＴＥＡＥ（トリエチルアミノエチル）−セルロース、
吸着クロマトグラフィー例えばハイドロキシアパタイト
、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー例えば適度に架
橋したデキストランゲル又はポリアクリルアミドゲル等
を種々組み合わせるという煩雑な工程をへていた。その
ため、製品としての酵素を得るまでに日数がかかるだけ
でなく、クロマトグラフィーの回数が増えることにより
酵素の回収率の低下が生じていた。

【０００３】最近では、これらカラムクロマトグラフィ
ーの組み合せをできるだけ少なくするために、目的の酵
素を特異的に吸着するようなクロマトグラフィー担体を
用いる、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーを
利用し、それにより比較的短い日数で酵素を精製する方
法も開発されている。

【０００４】例えば、特許公表昭６１−５００２９９号
公報には、プロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（商品名）
（一般名：リアクティブレッド８）をセファロースＣＬ
−４Ｂ（商品名）に結合させたアフィニティークロマト
グラフィー吸着剤が，ザイモモナス・モビリス抽出液よ
りのグルコキナーゼを特異的に，高収率で単離精製でき
ることを示している。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の特許公表に記載
の方法は、アフィニティークロマトグラフィーの利用に
よりカラムクロマトグラフィーの組み合せを少なくし、
収率よく酵素を精製するという点で優れているが、アフ
ィニティークロマトグラフィー吸着剤が比較的高価であ
るため、該アフィニティークロマトグラフィー吸着剤へ
いかに特異的に、かつ大量の目的酵素を吸着させるかと
いう点に問題があった。

【０００６】本発明は、この様な従来技術の欠点を解消
し、アフィニティークロマトグラフィーにおけるグルコ
キナーゼの特異的吸着能を上げ、少しの量のアフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着剤で、できるだけ多量のグ
ルコキナーゼを精製できる方法を提供することを目的と
するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な問題点を解決するために鋭意検討の結果、アフィニテ
ィークロマトグラフィー吸着担体としてリアクティブイ
エロー７，リアクティブイエロー８１あるいはリアクテ
ィブオレンジ８４からなる吸着担体を用いることによっ
て、上記の目的が達成されることを見いだし本発明に到
達した。

【０００８】すなわち、本発明は微生物菌体から得たグ
ルコキナーゼ含有酵素溶液を、リアクティブイエロー７
、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレンジ
８４からなる群より選択される少なくとも一種の色素を
リガンドとする水不溶性担体に接触させて，グルコキナ
ーゼを該吸着担体に吸着させ、ついで吸着したグルコキ
ナーゼを溶離することを特徴とするグルコキナーゼの精
製法を要旨とするものである。

【０００９】本発明に用いられている微生物菌体として
は、グルコキナーゼ生産能を持つ微生物菌体であればい
かなるものでも利用でき、起源を限定するものではない
が、工業的には保存安定性に優れるグルコキナーゼを大
量に産出するザイモモナス・モビリス又はバチルス・ス
テアロサーモフィルスが好ましい。

【００１０】これらの微生物菌体から得たグルコキナー
ゼ含有酵素溶液としては、例えば菌体を水あるいは緩衝
液に懸濁させ、自己消化法、リゾチーム処理法、凍結溶
解法、ホモジナイザー法、摩砕法あるいは高圧法等で破
砕し、遠心分離して得た上清液を用いればよい。また、
場合によっては除核酸処理して得た溶液を用いてもよい
。

【００１１】本発明で用いられるリアクティブイエロー
７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレン
ジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色素
をリガンドとする水不溶性担体は、リアクティブイエロ
ー７、リアクティブイエロー８１及びリアクティブオレ
ンジ８４からなる群より選択される少なくとも一種の色
素と水不溶性担体とを結合して作製することができる。

【００１２】リアクティブイエロー７、リアクティブイ
エロー８１又はリアクティブオレンジ８４の各色素は、
例えばＩＣＩ社よりそれぞれプロシオンイエローＭＸ−
ＧＲ、プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ又はプロシオンオ
レンジＨ−ＥＲという商標名で市販されているものを用
いることができる。

【００１３】本発明に用いられる水不溶性担体としては
、例えばセルロース、デキストラン、アガロース、デン
プン等の多糖類の誘導体、ポリアミド類、ポリエステル
類、ポリウレタン類等の有機合成ポリマー、ガラスビー
ズ、ハイドロキシアパタイト等の無機物の誘導体等があ
げられる。特に、これらの中でも、セルロース、デキス
トラン、アガロース等の多糖類の誘導体が好ましく、ア
ガロースの誘導体として、ファルマシア社よりセファロ
ースの商標名で市販されているものがより好ましい。

【００１４】前記した水不溶性担体にリアクティブイエ
ロー７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティ
ブオレンジ８４を結合させるには、例えば、あらかじめ
水不溶性担体を水に懸濁させておき、これに水不溶性担
体の約１〜２Ｗ／Ｗ　％に当たるリアクティブ染料を加
え、さらに塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムを加え
て室温付近で数時間から数十時間反応させるという周知
の方法により行うことができる〔トニー・アトキンソン
（Ｔｏｎｙ　　Ａｔｋｉｎｓｏｎ）らの方法、バイオケ
ミカル・ソサイエティ・トランスアクションズ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ　　Ｔｒａｎｓａ
ｃｔｉｏｎｓ）第９巻、２９０〜２９２頁（１９８１年
）〕。

【００１５】前記のようにして得たグルコキナーゼ含有
酵素溶液と、リアクティブイエロー７、リアクティブイ
エロー８１あるいはリアクティブオレンジ８４をリガン
ドとする水不溶性担体とを単に混合するか、あるいはカ
ラムに充填した上記吸着担体に通液することによりグル
コキナーゼを吸着担体に特異的に吸着させることができ
る。この際、溶液のｐＨが低いほど吸着担体へのグルコ
キナーゼの吸着量は増すが、あまりｐＨを低くするとグ
ルコキナーゼが失活しやすくなるため、ｐＨ５〜６．５
特に６から６．５の範囲に調整することが好ましい。

【００１６】次に、吸着担体に吸着させたグルコキナー
ゼを溶離させることが必要である。そのためには、まず
グルコキナーゼが吸着した担体を、上記緩衝液で洗浄し
異種蛋白質を充分除いておくことが望ましく、その後、
例えば以下に述べる溶離液を用いてグルコキナーゼを溶
離することで、高純度のグルコキナーゼを得ることがで
きる。

【００１７】溶離液としては、例えばアデノシントリリ
ン酸のような基質類を含有する緩衝液も用いられるが、
緩衝液のｐＨを７〜８にするだけで特異的にグルコキナ
ーゼが溶離する。

【００１８】

【実施例】次に、本発明を実施例と比較例によって具体
的に説明する。なお、グルコキナーゼの酵素活性は、１
０ｍＭ−グルコース、１ｍＭ−アデノシントリリン酸、
１ｍＭ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、５ｍ
Ｍ−塩化マグネシウム及び２単位／ｍＬのグルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む２０ｍＭ−イミダゾ
ールと２０ｍＭ−リン酸カルシウムからなる緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）にグルコキナーゼを加えた時の３４０ｎｍの
吸光度の単位時間当たりの増加量の測定より求めたもの
であり、１分当たり１μモルのニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドの還元型を生ぜしめる酵素活性を１単位
とした。

【００１９】また、酵素タンパク量は、クマシーブリリ
ヤントブルーとの結合により生ずる色調変化を６２０ｎ
ｍで測定することにより求めた。

【００２０】実施例１、比較例１ ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ２９１９１株の湿菌体
１００ｇを、２ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）５００ｍＬに懸濁し、ダイノーミル
細胞破砕装置を用いて細胞を破砕し、酢酸を加えてｐＨ
６に調整した後、遠心分離により不溶物を除去し、酵素
抽出溶液５６０ｍＬを得た。

【００２１】また、別に０．４ｇのリアクティブイエロ
ー８１（プロシオンイエローＨ−Ｅ３Ｇ，ＩＣＩ社製）
を２５ｍＬの水に溶解し、これと２５ｇのセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を７５ｍＬの水に懸濁
した液とを混合し、さらに４Ｍの塩化ナトリウム１５ｍ
Ｌ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム０．１７５ｍＬを加え
、２５℃で５０時間インキュベーションすることにより
、リアクティブイエロー８１をリガンドとするアフィニ
ティークロマトグラフィー吸着剤を作製した。

【００２２】これを充填した内径２ｃｍ、高さ８ｃｍの
カラム（２５ｍＬ容）に先に得た酵素抽出溶液を通じ、
グルコキナーゼが吸着剤当り何単位まで吸着するかを調
べた。５６０ｍＬの酵素抽出溶液のうちカラムへの通液
量が４２０ｍＬになったところから、それ以上のグルコ
キナーゼは吸着されずに素通ってきた。即ち、４２０ｍ
Ｌ中に存在していた１５，０００単位のグルコキナーゼ
が２５ｍＬの吸着剤を充填したカラムに吸着したことと
なり、グルコキナーゼの吸着容量としては６００単位／
ｍＬ−吸着剤となる。

【００２３】ついで、通液を２ｍＭの塩化マグネシウム
と１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭ
のリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）を６０ｍＬ通じ非吸
着のタンパクを完全に除き、引き続き上記緩衝液のｐＨ
を７．２に変えてグルコキナーゼを溶出させた。

【００２４】回収されたグルコキナーゼは１４，１００
単位で，吸着したグルコキナーゼよりの回収率は９４％
であった。このようにして得たグルコキナーゼの比活性
値は１０５単位／ｍｇであった。

【００２５】比較のため、アフィニティークロマトグラ
フィー吸着剤として、特許公表昭６１−５００２９９号
公報に示されたプロシオンスカーレットＭＸ−Ｇ（リア
クティブレッド８）結合セファロースＣＬ−４Ｂを用い
、上記と同様の実験を行った。

【００２６】５６０ｍＬの酵素抽出溶液のうちカラムへ
の通液量が１０２ｍＬになったところでグルコキナーゼ
は素通ってきたため、グルコキナーゼの吸着量としては
１４５単位／ｍＬ−吸着剤であった。また吸着剤からの
溶出によって回収されたグルコキナーゼは３，３５０単
位、回収率は９２％、比活性値は１００単位／ｍｇであ
った。

【００２７】実施例２、３、比較例２、３実施例１のリ
アクティブイエロー８１に代えて、リアクティブイエロ
ー７（プロシオンイエローＭＸ−ＧＲ、ＩＣＩ社製）（
実施例２）、リアクティブオレンジ８４（プロシオンオ
レンジＨ−ＥＲ、ＩＣＩ社製）（実施例３）、リアクテ
ィブレッド５（プロシオンレッドＭＸ−Ｇ、ＩＣＩ社製
）（比較例２）あるいはリアクティブレッド２（プロシ
オンレッドＭＸ−５Ｂ、ＩＣＩ社製）（比較例３）を使
用する以外は、実施例１と同様の実験を行った。それら
の結果を実施例１及び比較例１の結果とともに表１にま
とめて示した。

【００２８】

【表１】

【００２９】表１から明らかなように、リアクティブイ
エロー８１（実施例１）、リアクティブイエロー７（実
施例２）あるいはリアクティブオレンジ８４（実施例３
）を水不溶性担体に結合したアフィニティークロマトグ
ラフィー吸着剤は、これまでのタンパク結合染料及び他
の比較例の染料からなる他のアフィニティークロマトグ
ラフィー吸着剤に比べ、驚くほどグルコキナーゼ吸着能
に優れた新規の吸着剤であることがわかる。

【００３０】実施例４ バチルス・ステアロサーモフィルスＮＣＡ１５０３株の
湿菌体１２５ｇを、１ｍＭの塩化マグネシウムと１０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２５ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）６２５ｍＬに懸濁し、超
音波破砕機を用いて破砕後、ｐＨを６．５に調整し、遠
心分離により不溶物を除去した。このようにして得られ
た７００ｍＬの酵素抽出溶液を、実施例１で作製したリ
アクティブイエロー８１をセファロースＣＬ−４Ｂに結
合させたアフィニティークロマトグラフィー吸着剤を充
填した１０ｍＬ容のカラムに通じたところ、通液量２４
０ｍＬまでグルコキナーゼは素通ってこなかった。即ち
、バチルス・ステアロサーモフィルスのグルコキナーゼ
の吸着容量は５１０単位／ｍＬ−吸着剤であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、リアクティブイエロー
７、リアクティブイエロー８１あるいはリアクティブオ
レンジ８４を水不溶性担体に結合したアフィニティーク
ロマトグラフィー吸着剤を用いることにより、従来のア
フィニティークロマトグラフィー吸着剤と比べグルコキ
ナーゼの吸着能を飛躍的に上げることができ、カラムク
ロマトグラフィーをコンパクトにすることが可能となる
。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　微生物菌体から得たグルコキナーゼ含
   有酵素溶液を、リアクティブイエロー７，リアクティブ
   イエロー８１及びリアクティブオレンジ８４からなる群
   より選択される少なくとも一種の色素をリガンドとする
   水不溶性担体に接触させて、グルコキナーゼを該吸着担
   体に吸着させ、ついで吸着したグルコキナーゼを溶離す
   ることを特徴とするグルコキナーゼの精製法。
2. 【請求項２】　　微生物菌体がザイモモナス・モビリス
   、又はバチルス・ステアロサーモフィルスである請求項
   １記載の精製法。