CN1232496A - 制备生物反应器的方法 - Google Patents
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Abstract
用于纯化酶,特别是酰基转移酶的方法,其特征在于用表面活性剂,特别是阳离子表面活性剂选择性聚集和沉淀杂质酶,特别是脱乙酰基酶;用于通过处理由结合酶至载体且任选再加上以交联剂交联而制备的固定化酶再生固定化酶载体,特别是那些由合成吸附剂或离子交换树脂所制成载体的方法;用于再生上述为多孔载体的方法;和用于再生其中的酶为头孢菌素(酰基转移酶的上述载体的方法。通过上面纯化酶的方法,可选择性地去除对靶酶是不必要的但又通过常规分离技术不能去除的杂质酶。因此,这些酶对于制备高度纯酶样本是有用的。与常规方法相比,用于再生固定化酶载体的上述方法使很有效地从此载体特别是多孔的载体中经蛋白酶消化而去除该酶成为可能。因此,这些载体可反复使用,这使这些方法无论对环境还是对费用角度均是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及制备生物反应器的方法。更具体地,本发明涉及用表面活性剂纯化酶的方法和用蛋白酶再生固定化酶载体的方法。
背景领域
生物反应器为在人工容器中复制生化反应的系统技术,并且由该术语所指的内涵已逐渐扩展。然而,正如这里所使用的,生物反应器意为其中的酶本身用作催化剂的反应器。为了这个目的,该酶为了作为催化剂的经济使用应该以某种方式加以固定。因此,固定化酶在生物反应器中起主导作用。决定固定化酶优越性的一个重要因素是所用酶的纯度。
根据目的酶和杂质蛋白的特性,通过适当结合通常已知的各种蛋白分离技术从生物样品或细胞培养上清中纯化酶蛋白。目前,主导的分离技术包括,例如,利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀法等;利用分量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、聚丙烯酰胺电泳等;利用电荷的方法,如离子交换层析等;利用亲和特异性的方法如亲和层析等;利用疏水性差异的方法如反相高效液相色谱等;和利用等电点差异的方法如等电点电泳等。
然而,在实践中没有几种情况可从目的酶中完全去除杂质蛋白。这可能归结于目的酶与杂质蛋白在常规蛋白分离方法所用的各种理化特性中缺乏明显的差异。例如,通过如透析、硫酸铵分级分离、阴离子交换层析等(未审查的日本专利公开号5-84078)步骤反复分离作为起始原料的粗细胞提取液可将源自假单胞杆菌属的头孢菌素C酰基转移酶〔将头孢菌素C和戊二酰基7-氨基头孢菌酸(GL7-ACA)转化成7-氨基头孢菌酸(7-ACA)的酶;之后简称为CC酰基转移酶〕纯化至约95%的纯度。然而,通过常规的方法不能够去除污染物脱乙酰基酶因为其在阴离子交换树脂柱中几乎显示出与CC酰基转移酶相同的行为。脱乙酰基酶使7-ACA脱乙酰基从而产生脱乙酰基7-ACA,导致7-ACA较低的产量。因此,存在一种能够分离和去除该无需蛋白的新的酶纯化方法的强烈需求。
决定固定化酶优越性的另一因素为固定化酶载体的寿命。一般来说,酶对加热、强酸、强碱、有机溶剂等趋于不稳定,并且甚至在适于酶反应的条件下容易丧失活性。固定化酶随着其反复使用显示出逐渐降低的酶活性,因而降低目的物质的生产效率。降解的固定化酶一般被丢弃,但当离子交换树脂用作载体时,从环境和经济上考虑,此载体的循环使用是必要的。
用于再生固定化酶载体的常规方法包括使用强酸或强碱从而从载体中释放和去除酶,然而,通过此方法不可能将酶从载体中完全去除,从而导致当反复再生载体和固定化酶时此固定化酶活性的剧烈下降。特别是当载体具有细小孔时,该酶凝集于细小孔中,由于再生和再固定而导致适当的降解。
发明内容
因此,提供用于选择性分离和去除对目的酶不必要并且不能通过常规分离技术去除的杂质酶的方法从而使高纯度目的酶的制备成为可能是本发明的一个目的。本发明的另一目的是提供能够有效从载体去除酶再生固定化酶载体的方法。
本发明者进行了深入的研究试图达到上述目的并且具有利用由表面活性剂所致蛋白选择性聚集和沉淀的观念。因此,他们用由脱乙酰基酶污染的CC酰基转移酶溶液系统从各方面加以研究。结果显示添加表面活性剂,特别是阳离子表面活性剂导致脱乙酰基酶的选择性聚集和沉淀,并且用该作用,本发明者成功制备出具有高纯度和高7-ACA制备效率的标准CC酰基转移酶产物。
通过使蛋白酶作用于由吸附CC酰基转移酶至离子交换树脂载体并以戊二醛交联CC酰基转移酶而获得的固定化酶,本发明者也成功有效地去除CC酰基转移酶。此外,他们发现,在用上述酶和交联剂的固定化酶情形中,酸性蛋白酶的使用对去除酶特别有效,这导致了本发明的完成。
因此,本发明提供了纯化酶的方法,包括用表面活性剂导致杂质酶选择性聚集和沉淀。本发明也提供上述用于纯化酶,特别是酰基转移酶的方法,其中的表面活性剂为阳离子表面活性剂。本发明也提供用于纯化上述酰基转移酶的方法,其中的酰基转移酶为头孢菌素C酰基转移酶并且杂质酶为脱乙酰基酶。本发明进一步提供了用于纯化上述酶的方法,其中的表面活性剂为甲基型或苄基型阳离子表面活性剂,特别是氯化烷基(棕榈基)二甲苄基铵,此外,本发明提供用于纯化上述酰基转移酶的方法,其中的阳离子表面活性剂以0.1-0.6%的浓度使用。
此外,本发明还提供了用于再生固定化酶载体的方法,包括将蛋白酶对固定化酶作用从而从该载体中去除酶,所述的固定化酶通过将此酶与载体,如合成的吸附剂和离子交换树脂结合,并且在结合后用交联剂任选地交联酶而制备。特别地,本发明提供了用于再生上述载体的方法,其中所述的载体具有细小的孔。此外,本发明提供了用于再生上述载体的方法,其中的酶为CC酰基转移酶。此外,本发明提供了用于再生上述载体的方法,其中所述的蛋白酶为酸性蛋白酶。
附图简述
图1显示了再生和重新固定后再生条件对固定化CC酰基转移酶活性的影响。
发明详述
只要其较其它杂质酶对至少一种表面活性剂显示出更低的聚集和较少的沉淀,适用于本发明纯化方法的酶没有任何特别的限制。优选地,在其中不到95%杂质酶聚集和沉淀的条件下不到70%的酶保持于溶液中。优选酶的实例包括酰基转移酶,特别是CC酰基转移酶。
本发明纯化方法待去除的杂质酶应该具有较目的酶对至少一种表面活性剂更易聚集和沉淀的特性。例如,当目的酶为酰基转移酶时,杂质酶的实例有脱乙酰基酶等。可以含有多种杂质酶。当每种杂质酶通过不同种表面活性剂聚集和沉淀时,首先加入一种表面活性剂以导致第一种杂质酶聚集和沉淀,接着通过离心或过滤去除沉淀物,并且然后,加入不同的表面活性剂以导致另一种杂质酶的聚集和沉淀。
本发明中待用的表面活性剂没有特别的限制并且可根据目的酶和杂质酶的特性选自阳离子、阴离子和非离子型表面活性剂。例如,当去除污染酰基转移酶溶液的脱乙酰基酶时,优选使用阳离子表面活性剂,更优选使用甲基型或苄基型阳离子表面活性剂,特别是甲基和苄基型阳离子表面活性剂〔如,氯化烷基(棕榈)二甲苄基铵等〕。
表面活性剂可以随表面活性剂的种类以及目的酶和杂质酶的组合而变化的浓度使用。所需的浓度为使95%或更多杂质酶聚集和沉淀并且使70%或更多目的酶保留于溶液中的浓度,例如,当目的酶为酰基转移酶并且杂质酶为脱乙酰基酶时,此表面活性剂加入至0.1-0.6%的浓度。
只要其可用于通过典型载体结合方法对酶固定化,可应用于本发明载体再生方法中的载体没有特别的限制。其实例包括天然吸附剂如活性炭、酸性粘土、高岭石、硅藻土、氧化铝、皂土、硅胶、氧化钛、壳多糖、鞣质等;合成的吸附剂如其中导入有疏水残基(如,丙基、丁基、己基、苯基等)的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺凝胶等;具有离子交换基的多糖凝胶;离子交换树脂等。合成吸附剂和离子交换树脂是优选的。载体的种类可根据待固定的酶特性等而改变。
当载体具有细小孔(本发明的细小孔意指具有100nm或更小直径的孔)时本发明的载体再生方法特别有效。例如,当酶通过载体结合方法和交联方法的组合而固定于载体上时,用强酸或强碱的常规方法未能溶解由形成交联而固定的酶。然后此酶凝集于细小的孔中以导致载体的显著降解。相反,本发明用蛋白酶的降解方法提供从载体中有效去除固定酶,因为该固定酶由于蛋白酶的作用而降解,导致该酶的重新溶解。
只要其可通过物理吸附、离子键合等与载体结合而不丧失其活性,待固定于载体上的酶没有特别的限制,并且可以使用源自微生物、植物和动物的多种酶。工业化酶包括酰基转移酶、酰化氨基酸水解酶、转化酶、腈水合酶、糖异构酶等。
酶可通过常规的载体结合方法(其中的酶与不溶于水载体结合的固定方法,包括本发明中通过物理吸附的结合方法)固定至载体上。特别地,根据需要,通过离子亲键、疏水亲键或物理吸附将酶与载体结合。例如,当离子交换树脂用作载体时,将平衡的树脂包装于柱中并将含有酶的适当缓冲液流经柱(400-100单位/mL柱),因而使该酶与树脂结合。
当仅仅载体结合不足以阻止酶泄漏时,将与该载体结合后的酶以交联剂交联并且固定。交联剂的实例包括戊二醛、1,6-己二异氰酸酯等。通过洗上述方法获得的固定化酶并且将溶解于适当缓冲液中的交联剂经柱循环大约0.5-2小时而进行交联反应。交联剂中未反应的官能团需要以失活剂如甘油经该柱循环约0.5-1小时而加以失活。
固定化酶载体可按如下再生。将通过上述固定方法制备的固定化酶反复用于已知的酶反应直至其丧失一半的酶活性,并且将含有3-50单位/mL酸性蛋白酶(或碱性蛋白酶)的溶液(pH 3-5或pH 9-11)以大约5-15倍的柱床体积并以5-20柱床/小时的流速(之后表示为SV5-20)流经含有所述固定化酶的柱床约1到5小时。再生反应温度为20-60℃,优选30-50℃。
酶可以与第一次固定相同的方式重新固定至再生的固定载体上。
实施例
通过仅用于例举的实例本发明详细解释如下并且并不以任何方式限制本发明。实施例1 通过不同的表面活性剂脱乙酰基酶从CC酰基转移酶溶液中的分离和去除(1)CC酰基转移酶制备菌的培养和粗提取液的纯化
将突变的CC酰基转移酶N-176制备菌大肠杆菌JM 109(PCCN176-2)FERM BP-3047根据实施例3中公开的未审查的日本专利公开No.5-84078的方法培养并通过离心收获细胞,以匀浆器破碎获得的细胞沉淀并用水提取可溶的蛋白组分,接着离心去除废物,继而获得粗提取液。(2)通过表面活性剂对污染脱乙酰基酶的去除
将聚乙烯亚胺加入到上述(1)中获得的粗提取液中以使核酸沉淀,接着离心以回收上清液。将此上清液应用至以磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的DEAE柱,以水洗并用0.2M-NaCl洗脱(通过此步骤,选择性回收另一种杂质酶,β-内酰胺酶并将其从非吸附馏份中去除)。向此获得的洗脱液中加入阳离子表面活性剂:氯化烷基(棕榈)二甲苄基铵〔商品名:Cation F2-50;由NOF公司生产(以下同)〕,氯化烷基〔棕榈〕三甲基铵(商品名:Cation FB)或氯化十二烷基三甲基铵〔商品名:Cation BB〕,阴离子表面活性剂:烷基甘氨酸〔商品名:Nissan Anon LG〕或非离子型表面活性剂:聚氧化乙烯辛基苯醚(商品名:Nonion HS-210)或聚氧化乙烯山梨聚糖油酸单酯(商品名:Nonion OT-221)至0.1、0.3和0.5%的终浓度,并将混合物于室温静置16小时。测定添加该表面活性剂前后每种样品中CC酰基转移酶和脱乙酰基酶的活性并且测定其变化。通过定量测定以GL7-ACA为底物而产生的7-ACA和去乙酰7-ACA而计算酶的活性。结果显示于表1中。Cation F2-50在0.1-0.3%浓度时显示出90%或更多的CC酰基转移酶残余活性并且污染的脱乙酰基酶活性降至不超过5%。在0.5%的浓度时,脱乙酰基酶几乎被完全去除。其它2种阳离子表面活性剂在0.5%的浓度时也显示出选择性去除脱乙酰基酶。当使用阴离子或非离子型表面活性剂时,在此测定浓度范围中不能够完全去除脱乙酰基酶,但脱乙酰基酶的活性降至一半或更少而几乎没有降低CC酰基转移酶的活性。
表1
通过添加不同的表面活性剂对去除污染的脱乙酰基酶的影响
表面活性剂(商品名) | 残余活性1)(CC酰基转移酶/脱乙酰基酶) | |||
添加浓度(%)0 0.1 0.3 0.5 | ||||
Cation F 2-50 | 100/100 | 95/5 | 92/1 | 70/0 |
Cation FB | 100/100 | 100/55 | 100/40 | 80/1 |
Cation BB | 100/100 | 100/55 | 100/45 | 85/5 |
Nissan Anon LG | 100/100 | 100/60 | 100/50 | 95/30 |
Nonion HS-210 | 100/100 | 100/50 | 100/50 | 100/45 |
Nonion OT-221 | 100/100 | 100/50 | 100/50 | 100/45 |
1)残余活性以基于添加表面活性剂之前(添加浓度0%)的酶活性为100的相对活性表示的。实施例2 通过蛋白酶对交联的CC酰基转移酶沉淀物的溶解
向10mM含有67单位/mL CC酰基转移酶N176的Tris HCl缓冲液(pH8.0,5mL)(如何获得该酶公开于未审查的日本专利公开No.5-84078)中加入含有2%戊二醛的1 50mM Tris HCl缓冲液(pH8.7,5mL)中并将混合物搅拌1小时以造成反应,继而交联产物得以沉淀。通过离心去除上清液并且回收沉淀物。向此沉淀物中加入3mL 2N-NaOH、0.1N-NaOH、0.1N-NaOH+碱性蛋白酶〔Bioprase AL-15(30单位);Nagase生化有限公司生产〕,2N-HCl、0.1N-HCl或0.1N-HCl+酸性蛋白酶〔Denapsin(30单位);由Nagase生化有限公司生产〕并将沉淀物于40℃浸入其中2小时。结果,单独加入NaOH或HCl没有导致沉淀物的改变,但加入HCl+酸性蛋白酶导致沉淀物的完全溶解并获得了清亮的溶液。虽然添加NaOH+碱性蛋白酶也导致该沉淀物几乎完全的溶解,但溶液浑浊并且没有获得完全的溶解。从上面的结果,显示通过交联处理而固定的CC酰基转移酶通过使用蛋白酶,特别是酸性蛋白酶而有效地再溶解。实施例3 通过蛋白酶对固定的CC酰基转移酶载体的再生(1)固定化载体的制备
将一种新的苯乙烯-二乙烯苯高度多孔的强碱离子交换树脂〔80mL,HPA 25(具有直径10-100nm的细小孔);由三菱化学公司生产〕浸入1N-NaOH∶甲醇=1∶1中一天并且包装于柱(350mm×15cm)中。然后,以SV3将3-倍体积的2N-HCl流经该柱并且以5-倍体积的水(SV3)洗柱,之后以SV3将5-倍体积的0.1N-HCl流经此柱并且以水以SV3洗柱直至该柱的流出液pH变为4或更高。(2)CC酰基转移酶的固定
将上述(1)中制备的HPA 25(80mL)包装于柱中并且用10mM含有CC酰基转移酶N176(67单位/mL)的Tris HCl缓冲液(pH8.0,240mL)以SV3流经此柱。以240mL水(SV3)洗柱后,将60mM含有2%戊二醛的磷酸缓冲液(pH8.0,300mL)以SV20循环1小时同时调整pH至7.5。交联后,以400mL水(SV3)洗柱。然后,将60mM含有0.2M甘氨酸的磷酸缓冲液(pH8.0,300mL)以SV10循环1小时以失活未反应的醛基。用水(400mL或更多)以SV5洗柱以得到82mL固定于HPA25上的酰基转移酶。(3)通过固定的CC酰基转移酶制备7-ACA
将固定于HPA25(20mL)且在上述(2)中制备的CC酰基转移酶装于具有夹套(jacket)的柱中,并且以大约70mL/分钟的循环流速于20℃将6.0mg/mL戊二酰基7-氨基头孢菌酸(GL7-ACA)溶液(100mL)循环1小时同时以NaOH调pH至7.75,继而获得7-ACA。反应后,用水冲出柱中的反应混合物并回收7-ACA。将上述反应重复100次(连续分批反应)作为一个循环。(4)固定化载体的再生
用2N-NaOH、0.1N-NaOH+Bioprase(3000ppm,10单位/mL)或0.1N-HCl+Denapsin(3000ppm,10单位/mL)作为再生剂,每个循环再生HPA25。将再生剂(载体体积的10-倍)于40℃ SV约20循环5小时。
再生反应后,重复上述步骤(1)-(4)2到4次,并且测定再固定(2)后CC酰基转移酶的活性。比较其活性的改变。
结果显示于图1中。当2N-NaOH用作再生剂时,固定化CC酰基转移酶的活性每轮循环几乎降低一半,而用0.1N-HCl和Denapsin(酸性蛋白酶)甚至在3轮循环后仍没有导致酶活性的下降。当使用0.1N-NaOH和Bioprase(碱性蛋白酶)时,与单独使用NaOH相比,每轮循环后CC酰基转移酶的活性下降较小的幅度,并且甚至经4轮循环后仍表现出不到原初活性的50%。
本发明的酶纯化方法特征在于通过表面活性剂利用蛋白的选择性聚集和沉淀分离和去除不能够用常规纯化方法去除且对目的酶是不必要的杂质酶。因此,根据本发明,可制备较常规产物具有更高纯度的标准酶产物。此外,基于蛋白酶对酶的作用而用于再生本发明固定化酶载体的方法可极其有效地从载体去除酶,从而长期连续的循环使用此载体得以实现。因此,本发明大大地有利于生物反应器生产成本的降低并防止与载体废物处理有关的环境破坏。
本申请是基于在日本提交的申请Nos.212383/1996和212387/1996,在此掺入其内容仅供参考。在此掺入的所有公开参考与其中具体描述的每个单个公开相同的内容。
Claims (12)
1.纯化酶的方法,其特征在于用表面活性剂选择性地聚集和沉淀杂质酶。
2.权利要求1的方法,其中的表面活性剂为阳离子性的。
3.纯化酰基转移酶的方法,其特征在于用阳离子表面活性剂选择性聚集和沉淀杂质酶。
4.权利要求3的酰基转移酶纯化方法,其中的酰基转移酶为头孢菌素C酰基转移酶,并且杂质酶为脱乙酰基酶。
5.权利要求3或4的酰基转移酶纯化方法,其中的阳离子表面活性剂为甲基型或苄基型。
6.权利要求3的酰基转移酶纯化方法,其中的阳离子表面活性剂为氯化烷基(棕榈)二甲基苄基铵。
7.权利要求3到6任一权利要求的酰基转移酶纯化方法,其中的阳离子型表面活性剂以0.1-0.6%的浓度使用。
8.用于再生固定化酶载体的方法,包括使蛋白酶作用于固定化的酶从而从该载体上去除酶,所述的固定化酶通过将该酶与载体结合并且任选在结合后使用交联剂交联该酶而制备。
9.权利要求8的方法,其中的载体为合成的吸附剂或离子交换树脂。
10.权利要求8或9的方法,其中的载体具有细小的孔。
11.权利要求8到10中任一权利要求的方法,其中的酶为头孢菌素C酰基转移酶。
12.权利要求8到11中任一权利要求的方法,其中的蛋白酶为酸性蛋白酶。
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