JPH0884593A - Ｌ−セリンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−セリンの製造方法Info
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- JPH0884593A JPH0884593A JP22289194A JP22289194A JPH0884593A JP H0884593 A JPH0884593 A JP H0884593A JP 22289194 A JP22289194 A JP 22289194A JP 22289194 A JP22289194 A JP 22289194A JP H0884593 A JPH0884593 A JP H0884593A
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- enzyme
- solution
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、該固定化酵素を用
いグリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを製造す
る方法。 【効果】 活性が高い状態でＳＨＭＴをイオン交換樹
脂に固定化することができ、これにより不純物が少ない
Ｌ−セリンを製造することができ、酵素の回収も可能と
なった。
ラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、該固定化酵素を用
いグリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを製造す
る方法。 【効果】 活性が高い状態でＳＨＭＴをイオン交換樹
脂に固定化することができ、これにより不純物が少ない
Ｌ−セリンを製造することができ、酵素の回収も可能と
なった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は酵素法によるＬ−セリン
の製造法に関する。詳しくは酵素セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、該
固定化酵素を用いグリシンとホルムアルデヒドからＬ−
セリンを製造する方法に関する。
の製造法に関する。詳しくは酵素セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、該
固定化酵素を用いグリシンとホルムアルデヒドからＬ−
セリンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−セリンは医薬品、化粧品、化学品原
料等に利用される重要なアミノ酸であり、Ｌ−セリンの
合成法として化学合成法、発酵法、酵素法等が知られて
いる。酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
（Ｅ．Ｃ．２．１．２．１、以下「ＳＨＭＴ」と称す
る）はピリドキサルリン酸とテトラヒドロ葉酸を補酵素
とし、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを合
成する反応を触媒し、哺乳動物、鳥類、高等植物、微生
物等に広く存在している。（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，５３ ｐ８３−１１
２（１９８２））また、近年の遺伝子操作により微生物
のＳＨＭＴ生産能を向上させている例もある。（Ｇｅｎ
ｅ，１４ ｐ６３−７２（１９８１）， Ｇｅｎｅ，２
７ ｐ４５−５４（１９８４））
料等に利用される重要なアミノ酸であり、Ｌ−セリンの
合成法として化学合成法、発酵法、酵素法等が知られて
いる。酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
（Ｅ．Ｃ．２．１．２．１、以下「ＳＨＭＴ」と称す
る）はピリドキサルリン酸とテトラヒドロ葉酸を補酵素
とし、グリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを合
成する反応を触媒し、哺乳動物、鳥類、高等植物、微生
物等に広く存在している。（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，５３ ｐ８３−１１
２（１９８２））また、近年の遺伝子操作により微生物
のＳＨＭＴ生産能を向上させている例もある。（Ｇｅｎ
ｅ，１４ ｐ６３−７２（１９８１）， Ｇｅｎｅ，２
７ ｐ４５−５４（１９８４））
【０００３】ＳＨＭＴを利用した酵素法によるＬ−セリ
ンの製造法は既に公知であり、例えば特開昭６２−１９
０９２号公報では工業的に有利に製造するため、基質の
グリシン濃度を高くしてＬ−セリンの蓄積量を向上させ
るとともに収率を高くする方法を開示している。
ンの製造法は既に公知であり、例えば特開昭６２−１９
０９２号公報では工業的に有利に製造するため、基質の
グリシン濃度を高くしてＬ−セリンの蓄積量を向上させ
るとともに収率を高くする方法を開示している。
【０００４】また、特開昭６１−９２９４号公報ではＳ
ＨＭＴ生産能を有する微生物菌体をあらかじめグリシン
と接触させ、菌体の細胞膜の透過性を増大させた後、そ
のまま反応基質としてグリシンを使用し、高収率でしか
も特別な菌体処理剤あるいは処理装置を必要としない製
造法を開示している。
ＨＭＴ生産能を有する微生物菌体をあらかじめグリシン
と接触させ、菌体の細胞膜の透過性を増大させた後、そ
のまま反応基質としてグリシンを使用し、高収率でしか
も特別な菌体処理剤あるいは処理装置を必要としない製
造法を開示している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
にしたがって製造したＬ−セリンは酵素、微生物細胞、
培地の栄養源等と混在しており、高純度の製品を得るた
めに、これら不純物を除去する必要がある。また、これ
ら精製工程を通してＳＨＭＴを酵素活性を保持したまま
回収するのは不可能であり、酵素または微生物は、一度
使用することができるのみである。
にしたがって製造したＬ−セリンは酵素、微生物細胞、
培地の栄養源等と混在しており、高純度の製品を得るた
めに、これら不純物を除去する必要がある。また、これ
ら精製工程を通してＳＨＭＴを酵素活性を保持したまま
回収するのは不可能であり、酵素または微生物は、一度
使用することができるのみである。
【０００６】これらの問題を解決する方法として酵素あ
るいは微生物菌体を固定化し、不純物の流出を抑え、か
つ酵素または微生物菌体を回収、再利用する技術が知ら
れている。固定化方法には大きく担体結合法、架橋法、
そして包括法に分類され、様々な物質が固定化担体に現
在利用されている。
るいは微生物菌体を固定化し、不純物の流出を抑え、か
つ酵素または微生物菌体を回収、再利用する技術が知ら
れている。固定化方法には大きく担体結合法、架橋法、
そして包括法に分類され、様々な物質が固定化担体に現
在利用されている。
【０００７】包括固定化する方法では担体としてカラギ
ーナン、アルギン酸等の天然に存在する物質及びポリア
クリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子物質が知ら
れている。しかしながら、天然物質を使用した場合、酵
素に対し毒性は低いものの物理的強度が小さく、耐久性
に問題がある。また、合成高分子物質を使用した場合、
物理的強度は大きく、耐久性は良いが、架橋剤、重合開
始剤等が毒性を及ぼし活性低下を招きやすい。さらに、
ゲルあるいは膜を介しての反応であるため、基質あるい
は反応生成物の透過速度が影響することがある。
ーナン、アルギン酸等の天然に存在する物質及びポリア
クリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子物質が知ら
れている。しかしながら、天然物質を使用した場合、酵
素に対し毒性は低いものの物理的強度が小さく、耐久性
に問題がある。また、合成高分子物質を使用した場合、
物理的強度は大きく、耐久性は良いが、架橋剤、重合開
始剤等が毒性を及ぼし活性低下を招きやすい。さらに、
ゲルあるいは膜を介しての反応であるため、基質あるい
は反応生成物の透過速度が影響することがある。
【０００８】架橋法においては担体への結合力は大きい
ものの架橋剤による活性が低下するという問題がある。
ものの架橋剤による活性が低下するという問題がある。
【０００９】一方、担体結合法には結合の仕方により共
有結合法、イオン結合法、物理的吸着法に分けられ、幾
つもの担体が知られているが、特にイオン交換樹脂にお
いて固定化操作の簡便さ、及び高い酵素活性の保持率、
さらに樹脂の再利用が可能という利点があり、このこと
から固定化担体として工業的に有利と考えられる。しか
し、イオン交換樹脂への酵素の吸着能は温度、ｐＨ、イ
オン強度によって、変化するため酵素が脱離しやすいと
いう問題がある。特にＳＨＭＴによるＬ−セリンの製造
において基質であるグリシンを高濃度下で行うことは収
率からみて工業的に必須であり、そのような反応条件下
では酵素が脱離する恐れがある。
有結合法、イオン結合法、物理的吸着法に分けられ、幾
つもの担体が知られているが、特にイオン交換樹脂にお
いて固定化操作の簡便さ、及び高い酵素活性の保持率、
さらに樹脂の再利用が可能という利点があり、このこと
から固定化担体として工業的に有利と考えられる。しか
し、イオン交換樹脂への酵素の吸着能は温度、ｐＨ、イ
オン強度によって、変化するため酵素が脱離しやすいと
いう問題がある。特にＳＨＭＴによるＬ−セリンの製造
において基質であるグリシンを高濃度下で行うことは収
率からみて工業的に必須であり、そのような反応条件下
では酵素が脱離する恐れがある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等はこれら課題
を解決するため鋭意検討した結果、特に３級アミンを交
換基に有する弱塩基性陰イオン交換樹脂において、グリ
シン高濃度下、及び反応上好ましいとされる温度、ｐＨ
条件下においてもＳＨＭＴは吸着能を有することを見い
だし本発明を完成した。
を解決するため鋭意検討した結果、特に３級アミンを交
換基に有する弱塩基性陰イオン交換樹脂において、グリ
シン高濃度下、及び反応上好ましいとされる温度、ｐＨ
条件下においてもＳＨＭＴは吸着能を有することを見い
だし本発明を完成した。
【００１１】すなわち本発明は酵素セリンヒドロキシメ
チルトランスフェラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、
該固定化酵素を用いグリシンとホルムアルデヒドからＬ
−セリンを製造する方法を提供するものである。
チルトランスフェラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、
該固定化酵素を用いグリシンとホルムアルデヒドからＬ
−セリンを製造する方法を提供するものである。
【００１２】本発明において用いられるＳＨＭＴはＳＨ
ＭＴ生産能を有する微生物由来のものであれば良く制限
はないが、特に大腸菌が望ましい。例としては、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ
Ｔ−１０３５０（微工研菌第７４３７号）、エシェリヒ
ア・コリＭＴ−１０３５１（微工研菌第７４３８号）を
挙げることができる。
ＭＴ生産能を有する微生物由来のものであれば良く制限
はないが、特に大腸菌が望ましい。例としては、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ
Ｔ−１０３５０（微工研菌第７４３７号）、エシェリヒ
ア・コリＭＴ−１０３５１（微工研菌第７４３８号）を
挙げることができる。
【００１３】微生物菌体からＳＨＭＴを抽出する方法
は、機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧
処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活
性剤処理等の方法が使用できるが、特開昭６１−９２９
４号公報に開示されているようにＳＨＭＴの反応基質で
あるグリシンによる処理法が特別な処理剤、処理装置を
必要としないため特に好ましい。
は、機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧
処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活
性剤処理等の方法が使用できるが、特開昭６１−９２９
４号公報に開示されているようにＳＨＭＴの反応基質で
あるグリシンによる処理法が特別な処理剤、処理装置を
必要としないため特に好ましい。
【００１４】また固定化には上記方法により微生物菌体
を処理した液、特にグリシン処理した液をそのまま使用
するのが工業的にみて好ましいが、硫安沈澱やアセトン
沈澱、カラムクロマトグラフィー等により精製を重ねた
ものを用いても何等差し支えない。
を処理した液、特にグリシン処理した液をそのまま使用
するのが工業的にみて好ましいが、硫安沈澱やアセトン
沈澱、カラムクロマトグラフィー等により精製を重ねた
ものを用いても何等差し支えない。
【００１５】本発明において用いられるイオン交換樹脂
は、ＳＨＭＴが吸着しうれば限定はされないが、高濃度
のグリシン存在下で反応する際の樹脂からの酵素脱離の
防止、及びＳＨＭＴ生産菌体とグリシンをあらかじめ接
触させＳＨＭＴを抽出させた処理液を用い固定化する際
には、特に交換基に３級アミンをもつ弱塩基性陰イオン
交換樹脂が望ましい。そのような交換基としては、例え
ばジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）やジメチルアミ
ノメチル基等が挙げられる。
は、ＳＨＭＴが吸着しうれば限定はされないが、高濃度
のグリシン存在下で反応する際の樹脂からの酵素脱離の
防止、及びＳＨＭＴ生産菌体とグリシンをあらかじめ接
触させＳＨＭＴを抽出させた処理液を用い固定化する際
には、特に交換基に３級アミンをもつ弱塩基性陰イオン
交換樹脂が望ましい。そのような交換基としては、例え
ばジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）やジメチルアミ
ノメチル基等が挙げられる。
【００１６】本発明におけるグリシンとホルムアルデヒ
ドとの反応は、固定化した酵素の存在下、ｐＨ６〜９、
温度２０〜６０℃で行うのが望ましい。反応基質である
グリシンの使用濃度には制限はなく通常は１〜４０％の
範囲で行われる。また、もう一方の基質であるホルムア
ルデヒドは酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ
なければならず、通常０．０１〜１０％程度の濃度に制
御する必要がある。
ドとの反応は、固定化した酵素の存在下、ｐＨ６〜９、
温度２０〜６０℃で行うのが望ましい。反応基質である
グリシンの使用濃度には制限はなく通常は１〜４０％の
範囲で行われる。また、もう一方の基質であるホルムア
ルデヒドは酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ
なければならず、通常０．０１〜１０％程度の濃度に制
御する必要がある。
【００１７】反応方法についても反応槽に反応液と共に
固定化した樹脂を仕込み、撹拌下で行ってもよいし、固
定化した樹脂をカラムに詰め反応液を通液してもよい。
固定化した樹脂を仕込み、撹拌下で行ってもよいし、固
定化した樹脂をカラムに詰め反応液を通液してもよい。
【００１８】このようにして製造したＬ−セリンを単離
するには、濃縮、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着
処理などの常法が適用できる。
するには、濃縮、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着
処理などの常法が適用できる。
【００１９】また、固定化した樹脂の回収は通常の濾過
等により行える。そして、樹脂の活性が低下してきた場
合は樹脂を再生し、再び固定化することができる。
等により行える。そして、樹脂の活性が低下してきた場
合は樹脂を再生し、再び固定化することができる。
【００２０】
【実施例】次に実施例及び比較例により本発明を具体的
に説明する。 実施例１ グルコース ４．０ｇ／ｌ、クエン酸 ２．０ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．２ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １
０ｇ／ｌ、ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ０．２ｇ／
ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｌ（ｐＨ７．０）の組成か
らなる培地１０００ｍｌを５００ｍｌ容振とうフラスコ
１０本に分注し、滅菌後、あらかじめブイヨンスラント
上で３７℃、２０時間生育させたエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０３５
０を１白金耳ずつ接種した。３７℃で１５時間振とう培
養した。培養液より遠心分離により菌体を集め、湿菌体
を得た。次に１８ｇのグリシンを蒸留水６３ｇに溶解し
てｐＨ７．５に調整した溶液に、先ほどの湿菌体１０ｇ
を接触させ４０℃で１６時間振とうし酵素の抽出（グリ
シン処理）を行った。さらにこの抽出液（グリシン処理
液）１００ｇにアセトンを最終濃度２０％になるよう添
加し０℃で２時間撹拌した。遠心後上清を取り再びアセ
トンを最終濃度５０％になるよう添加し０℃、２時間撹
拌後遠心し、沈澱を集めた。この沈澱１０ｇを５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）２５ｍｌに溶解
後、同緩衝液で透析しＳＨＭＴ酵素液とした。この酵素
液を蒸留水で１０倍に希釈後、該液３．０ｇに対し、１
Ｎ ＮａＯＨで再生、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）で平衡化した交換基に３級アミンを持つＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ａ−２５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）１．０ｇを加え４℃で１５時間緩や
かに撹拌し吸着させた。その後樹脂を５ｍＭリン酸緩衝
液で５回洗浄し、反応に使用した。反応は１００ｍｌ容
三角フラスコに固定化した樹脂０．３３ｇ（１００％固
定化したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当量）に反応
液（０．４Ｍグリシン、２ｍＭテトラヒドロ葉酸（ＴＨ
Ｆ）、６．３ｍＭホルムアルデヒド、０．０４ｍＭピリ
ドキサルリン酸、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３））１２ｍｌ加え、５０℃で１０分振とうした。
１０分後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより
分析したところ５．５ｍｇのＬ−セリンが生成した。よ
って、固定化していない酵素系（比較例１）に対し、６
８．８％の活性を保持していた。
に説明する。 実施例１ グルコース ４．０ｇ／ｌ、クエン酸 ２．０ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．２ｇ／ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １
０ｇ／ｌ、ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ０．２ｇ／
ｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｌ（ｐＨ７．０）の組成か
らなる培地１０００ｍｌを５００ｍｌ容振とうフラスコ
１０本に分注し、滅菌後、あらかじめブイヨンスラント
上で３７℃、２０時間生育させたエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０３５
０を１白金耳ずつ接種した。３７℃で１５時間振とう培
養した。培養液より遠心分離により菌体を集め、湿菌体
を得た。次に１８ｇのグリシンを蒸留水６３ｇに溶解し
てｐＨ７．５に調整した溶液に、先ほどの湿菌体１０ｇ
を接触させ４０℃で１６時間振とうし酵素の抽出（グリ
シン処理）を行った。さらにこの抽出液（グリシン処理
液）１００ｇにアセトンを最終濃度２０％になるよう添
加し０℃で２時間撹拌した。遠心後上清を取り再びアセ
トンを最終濃度５０％になるよう添加し０℃、２時間撹
拌後遠心し、沈澱を集めた。この沈澱１０ｇを５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）２５ｍｌに溶解
後、同緩衝液で透析しＳＨＭＴ酵素液とした。この酵素
液を蒸留水で１０倍に希釈後、該液３．０ｇに対し、１
Ｎ ＮａＯＨで再生、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）で平衡化した交換基に３級アミンを持つＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ａ−２５（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）１．０ｇを加え４℃で１５時間緩や
かに撹拌し吸着させた。その後樹脂を５ｍＭリン酸緩衝
液で５回洗浄し、反応に使用した。反応は１００ｍｌ容
三角フラスコに固定化した樹脂０．３３ｇ（１００％固
定化したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当量）に反応
液（０．４Ｍグリシン、２ｍＭテトラヒドロ葉酸（ＴＨ
Ｆ）、６．３ｍＭホルムアルデヒド、０．０４ｍＭピリ
ドキサルリン酸、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３））１２ｍｌ加え、５０℃で１０分振とうした。
１０分後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより
分析したところ５．５ｍｇのＬ−セリンが生成した。よ
って、固定化していない酵素系（比較例１）に対し、６
８．８％の活性を保持していた。
【００２１】比較例１ 実施例１で調整したＳＨＭＴ酵素液０．１ｇをそのまま
反応に使用した。反応も実施例１と同様に行った。１０
分後、生成したＬ−セリンは８．０ｍｇであった。
反応に使用した。反応も実施例１と同様に行った。１０
分後、生成したＬ−セリンは８．０ｍｇであった。
【００２２】比較例２ ４．０％к−カラギーナン溶液１．５ｇに実施例１で調
整したＳＨＭＴ酵素液１．５ｇを４５℃保温下で加え、
２％ＫＣｌ溶液中で固定化した。固定化したゲルを約１
×１×１ｍｍに切断後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．３）で５回洗浄した。このゲル０．２ｇ（１
００％固定化したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当
量）を用い実施例１と同様に反応を行った。１０分後、
生成したＬ−セリンは０．７ｍｇであった。固定化して
いない酵素系に対する活性保持率は８．８％であった。
整したＳＨＭＴ酵素液１．５ｇを４５℃保温下で加え、
２％ＫＣｌ溶液中で固定化した。固定化したゲルを約１
×１×１ｍｍに切断後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７．３）で５回洗浄した。このゲル０．２ｇ（１
００％固定化したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当
量）を用い実施例１と同様に反応を行った。１０分後、
生成したＬ−セリンは０．７ｍｇであった。固定化して
いない酵素系に対する活性保持率は８．８％であった。
【００２３】比較例３ ポリエチレングリコール（平均分子量２０００）１モル
と、グリセリンを開始剤とするエチレンオキシド・プロ
ピレンオキシド共重合体（平均分子量６０００）１モル
との混合ポリエーテルポリオールに、トリレンジイソシ
アネート５モルを８０℃、１時間反応させ得たポリウレ
タンプレポリマー１．５ｇと実施例１で調整したＳＨＭ
Ｔ酵素液１．５ｇを氷浴中で混合し発泡体中に固定化し
た。この発泡体を約１×１×１ｍｍに切断後、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で５回洗浄した。
このゲル０．２ｇ（１００％固定化したとしてＳＨＭＴ
酵素液０．１ｇ相当量）を用い実施例１と同様に反応を
行った。１０分後、生成したＬ−セリンは０．８ｍｇで
あった。固定化していない酵素系に対する活性保持率は
１０．０％であった。
と、グリセリンを開始剤とするエチレンオキシド・プロ
ピレンオキシド共重合体（平均分子量６０００）１モル
との混合ポリエーテルポリオールに、トリレンジイソシ
アネート５モルを８０℃、１時間反応させ得たポリウレ
タンプレポリマー１．５ｇと実施例１で調整したＳＨＭ
Ｔ酵素液１．５ｇを氷浴中で混合し発泡体中に固定化し
た。この発泡体を約１×１×１ｍｍに切断後、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で５回洗浄した。
このゲル０．２ｇ（１００％固定化したとしてＳＨＭＴ
酵素液０．１ｇ相当量）を用い実施例１と同様に反応を
行った。１０分後、生成したＬ−セリンは０．８ｍｇで
あった。固定化していない酵素系に対する活性保持率は
１０．０％であった。
【００２４】比較例４ ２％グルタルアルデヒド、５０ｍＭリン酸カリウム溶液
（ｐＨ７．３）７ｍｌに実施例１で調整したＳＨＭＴ酵
素液１．０ｇを加え、４℃で６時間緩やかに撹拌し、固
定化を行った。その後遠心分離により沈澱を集め５０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄した。同緩衝液を加
え懸濁し１．０ｇとした後、０．１ｇ（１００％固定化
したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当量）を用い実施
例１と同様に反応を行った。１０分後、Ｌ−セリンは生
成されていなかった。
（ｐＨ７．３）７ｍｌに実施例１で調整したＳＨＭＴ酵
素液１．０ｇを加え、４℃で６時間緩やかに撹拌し、固
定化を行った。その後遠心分離により沈澱を集め５０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄した。同緩衝液を加
え懸濁し１．０ｇとした後、０．１ｇ（１００％固定化
したとしてＳＨＭＴ酵素液０．１ｇ相当量）を用い実施
例１と同様に反応を行った。１０分後、Ｌ−セリンは生
成されていなかった。
【００２５】実施例２ 実施例１と同様にして固定化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ（登録商標）Ａ−２５樹脂１．０ｇを２５％グリ
シン、５０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．８）１０
ｍｌに加え、５０℃、５時間振とうした。濾過、および
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄後、樹脂０．
３３ｇを用い実施例１と同様に反応を行った。１０分
後、生成したＬ−セリンは２．８ｍｇであった。
ｄｅｘ（登録商標）Ａ−２５樹脂１．０ｇを２５％グリ
シン、５０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．８）１０
ｍｌに加え、５０℃、５時間振とうした。濾過、および
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄後、樹脂０．
３３ｇを用い実施例１と同様に反応を行った。１０分
後、生成したＬ−セリンは２．８ｍｇであった。
【００２６】実施例３及び比較例５ 交換基に３級アミンを持つ弱塩基性陰イオン交換樹脂Ｄ
ＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０（三菱化成工業社製）
を用い実施例１と同様な方法でＳＨＭＴ酵素液の固定化
を行った。固定化した樹脂１．０ｇを実施例２と同様に
２５％グリシン、５０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ
６．８）１０ｍｌに加え、５０℃、５時間振とうした。
濾過、および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄
後、樹脂０．３３ｇを用い実施例１と同様に反応を行っ
た。１０分後、生成したＬ−セリンは１．９ｍｇであっ
た。交換基に２級アミンを持つ弱塩基性陰イオン交換樹
脂ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ２１（三菱化成工業社
製），交換基が４級アンモニウム型である強塩基性陰イ
オン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９００
（オルガノ社）について全く同様に行い反応した結果Ｌ
−セリンは生成されず、ＳＨＭＴの固定化は確認されな
かった。反応結果を表１に示す。
ＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０（三菱化成工業社製）
を用い実施例１と同様な方法でＳＨＭＴ酵素液の固定化
を行った。固定化した樹脂１．０ｇを実施例２と同様に
２５％グリシン、５０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ
６．８）１０ｍｌに加え、５０℃、５時間振とうした。
濾過、および５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で５回洗浄
後、樹脂０．３３ｇを用い実施例１と同様に反応を行っ
た。１０分後、生成したＬ−セリンは１．９ｍｇであっ
た。交換基に２級アミンを持つ弱塩基性陰イオン交換樹
脂ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ２１（三菱化成工業社
製），交換基が４級アンモニウム型である強塩基性陰イ
オン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ９００
（オルガノ社）について全く同様に行い反応した結果Ｌ
−セリンは生成されず、ＳＨＭＴの固定化は確認されな
かった。反応結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例４ 実施例１に従い調整したグリシン処理液５．０ｇに１Ｎ
ＮａＯＨで再生、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３）で平衡化した交換基に３級アミンを持つ弱塩基
性陰イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０
樹脂１．０ｇを加え室温で、５時間緩やかに振とうし
た。その後樹脂を５ｍＭリン酸緩衝液で５回洗浄し、反
応に使用した。反応は樹脂０．３３ｇを用い実施例１と
同様に行った。１０分後、生成したＬ−セリンは２．９
ｍｇであった。
ＮａＯＨで再生、５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．３）で平衡化した交換基に３級アミンを持つ弱塩基
性陰イオン交換樹脂ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＷＡ３０
樹脂１．０ｇを加え室温で、５時間緩やかに振とうし
た。その後樹脂を５ｍＭリン酸緩衝液で５回洗浄し、反
応に使用した。反応は樹脂０．３３ｇを用い実施例１と
同様に行った。１０分後、生成したＬ−セリンは２．９
ｍｇであった。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、活性が高い状態でＳＨＭ
Ｔをイオン交換樹脂に固定化することができた。これに
より不純物が少ないＬ−セリンを製造することができ、
酵素の回収も可能である。しかも３級アミンを交換基に
持つ弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いることにより、特
開昭６１−９２９４号公報に開示されたＳＨＭＴ生産能
を有する微生物菌体と高濃度のグリシンを接触させ抽出
したＳＨＭＴ酵素液から直接固定化酵素を調製すること
ができる。これにより、固定化するための特別な菌体処
理工程や酵素精製工程も不要である。また、特開昭６２
−１９０９２号公報に開示された高濃度グリシン存在下
での反応も可能で高収率でＬ−セリンを製造することが
できる。このように本発明の工業的意義は大きい。
Ｔをイオン交換樹脂に固定化することができた。これに
より不純物が少ないＬ−セリンを製造することができ、
酵素の回収も可能である。しかも３級アミンを交換基に
持つ弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いることにより、特
開昭６１−９２９４号公報に開示されたＳＨＭＴ生産能
を有する微生物菌体と高濃度のグリシンを接触させ抽出
したＳＨＭＴ酵素液から直接固定化酵素を調製すること
ができる。これにより、固定化するための特別な菌体処
理工程や酵素精製工程も不要である。また、特開昭６２
−１９０９２号公報に開示された高濃度グリシン存在下
での反応も可能で高収率でＬ−セリンを製造することが
できる。このように本発明の工業的意義は大きい。
Claims (3)
- 【請求項１】 酵素セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼをイオン交換樹脂に固定化し、該固定化酵素を
用いグリシンとホルムアルデヒドからＬ−セリンを製造
する方法。 - 【請求項２】 酵素セリンヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼが大腸菌由来である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 イオン交換樹脂が３級アミンを交換基に
持つ弱塩基性陰イオン交換樹脂である請求項１記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22289194A JP3167546B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | Ｌ−セリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22289194A JP3167546B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | Ｌ−セリンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0884593A true JPH0884593A (ja) | 1996-04-02 |
| JP3167546B2 JP3167546B2 (ja) | 2001-05-21 |
Family
ID=16789491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22289194A Expired - Lifetime JP3167546B2 (ja) | 1994-09-19 | 1994-09-19 | Ｌ−セリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3167546B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172145A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-19 | 量子高科(中国)生物股份有限公司 | 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4831642B1 (ja) * | 2011-05-25 | 2011-12-07 | 株式会社コバード | どら焼き用耳締め処理装置並びにどら焼き製造装置及び方法 |
-
1994
- 1994-09-19 JP JP22289194A patent/JP3167546B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111172145A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-19 | 量子高科(中国)生物股份有限公司 | 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3167546B2 (ja) | 2001-05-21 |
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