JPH08501218A - 固定化グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下における，グリコール酸の酸化によるグリオキシル酸の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリオキシル酸と化学的付加物を形成することができるアミン緩衝液の存在下で、水溶液中で、グリコール酸と酸素、並びに不溶性の担体上に固定化されもしくは共固定化されたグリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼを反応させることによる、グリオキシル酸の製造方法が示される。反応はｐＨ７から１０で、好適には８から９．５で、グリコール酸の初期濃度は２００から２５００ｍＭで、グリコール酸に対するアミンの初期のモル比は１．０から３．０の範囲内にあるアミンの濃度で、固定化カタラーゼの濃度は５０から１００，０００ＩＵ／ｍＬで、好適には３５０から１４，０００ＩＵ／ｍＬで、酸素の圧力は５０気圧までで、好適には１５気圧までで、固定化グリコラートオキシダーゼの濃度は約０．０１から１０ＩＵ／ｍＬで、好適には約０．１から４ＩＵ／ｍＬで、そして温度は０℃から４０℃で、好適には５℃から１５℃で実施される。好適な不溶性の固定化担体はEupergit C-250L及びEupergit C（オキシランアクリルビーズ）である。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下における、グリコール 酸の酸化によるグリオキシル酸の製造発明の背景 １．発明の分野： 本発明は、グリコール酸の酵素触媒酸化による、グリオキシル酸の製造の改良 された方法に関する。より具体的には、本発明は、触媒としての、一種類の不溶 性の担体上に固定化されたグリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの使用に関 する。 ２．関連技術分野の説明： 葉の多い緑色植物及び哺乳類の細胞中に一般的に認められる酵素の一種である グリコラートオキシダーゼは、過酸化水素を同時に製造しながら、グリコール酸 のグリオキシル酸への酸化の触媒作用をもたらす。N.E.Tolbert 等はJ.Biol.Che m .,Vol.181,905-914(1949)において、中間的にグリオキシル酸を生成することに よる、グリコール酸のギ酸及びＣＯ₂への酸化の触媒作用をもたらす、タバコの 葉から抽出された酵素につき最初に報告した。エチレンジアミンのようなある種 の化合物の添加は前記中間体のグリオキシル酸の更なる酸化を抑制した。前記酸 化はｐＨが約８で、具体的には約３−４０ｍＭ（ミリモル）の濃度のグリコール 酸を使用して実施された。このグリコラートの酸化に最適なｐＨは８．９である と報告された。シュウ酸（１００ｍＭ）はグリコラートオキシダーゼの触媒作用 を阻害すると報告された。同様にK.E.Richardson 及びN.E.TolbertはJ.Biol.Chem.,Vol.236,1280-1284(1961)において、グリコー ル酸のグリコラートオキシダーゼ触媒による酸化において、トリス（ヒドロキシ メチル）アミノメタン含有の緩衝液はシュウ酸の生成を阻害することを示した。 C.O.Clagett、N.E.Tolbert及びR.H.BurrisはJ.Biol.Chem.,Vol.178,977-987(1949 )においてグリコール酸のグリコラートオキシダーゼ触媒による、酸素による酸 化に対して最適なｐＨは約７．８−８．６であり、そして最適な温度は３５℃− ４０℃であると報告した。I.Zelitch及びS.OchoaはJ.Biol.Chem.,Vol.201,707-7 18(1953)において、そしてJ.C.Robinson等はJ.Biol.Chem.,Vol.237,2001-2009(1 962)において、ホウレンソウのグリコラートオキシダーゼにより触媒作用を受け るグリコール酸の酸化における、ギ酸及びＣＯ₂の生成は、Ｈ₂Ｏ₂とグリオキシ ル酸との非酵素的な反応によりもたらされると報告した。彼らはＨ₂Ｏ₂の分解に 触媒作用をもたらす酵素の一種のカタラーゼを添加すると、ギ酸及びＣＯ₂の生 成を抑制することによってグリオキシル酸の収率を著しく改善する事を認めた。 ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加も又グリコラートオキシダーゼの安 定性を著しく増加させることも認められた。 N.A.Frigerio及びH.A.HarburyはJ.Biol.Chem.,Vol.231,135-157(1958)におい て、ホウレンソウから単離したグリコール酸オキシダーゼの製法及び性状につき 報告した。前記の精製酵素は溶液中では非常に不安定であることが発見された； この不安定性は、この酵素の活性部位に対するフラビンモノヌクレオチド（ＦＭ Ｎ）の比較的弱い結合、並びに、酵素学的に活性な前記酵素の四量体及び／又は 八量体が、非可逆的に凝集しそして沈澱する酵素学的に不活性な単量体及び二量 体に解離することが 原因とされた。前記酵素の溶液へのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加 はその安定性を著しく増加させ、そして高いタンパク質濃度又は高いイオン強度 がその酵素を八量体もしくは四量体として保持した。 グリコール酸オキシダーゼの触媒作用によるグリコール酸の酸化については他 に幾多の参考文献がある，例えば： 前記酵素の単離（通常、アッセイ法を含む）： I.ZelitchによるMethods of Enzymology.Vol.1,Academic Press,New York,195 5.p.528-532におけるホウレンソウ及びタバコの葉からの酵素。 M.Nishimura等によるArch.Biochem.Biophys.,Vol.222,397-402(1983)における カボチャの子葉からの酵素。 H.Asker及びD.Daviesによる、Biochim.Biophys.Acta,Vol.761,103-108(1983) におけるラットの肝臓からの酵素。 M.J.Emes及びK.H.Erismannによる、Int.J.Biochem.,Vol.16,1373-1378(1984) におけるレムナミノールＬ(Lemna Minor L)からの酵素。 前記酵素の構造： E.Cederlund等、Eur.J.Biochem.,Vol.173,523-530(1988)。 Y.Lindquist及びC.Branden、J.Biol.Chem.Vol.264,3624-3628(1989)。発明の要約 本発明は、一種類の不溶性の担体上に固定化されたグリコラートオキシダーゼ （(S)-2-ヒドロキシ酸オキシダーゼ、ＥＣ1.1.3.15）及びカタラーゼ(ＥＣ1.11. 1.6)から成る一種類の触媒の存在下で、グリコール酸（ＨＯＣＨ₂ＣＯＯＨ）（ ２００から約２５００ｍＭ）と酸素を水溶液（ｐＨ７から１０）中で反応させる 、グリオキシル酸（ＯＣＨＣＯＯＨ） の製造方法に関する。最適な条件下ではグリコール酸の高率の転化により非常に 高収率でグリオキシル酸が得られ、そして前記固定化酵素触媒は回収され再利用 することができる。発明の詳細な記述 本発明はグリコール酸（ヒドロキシ酢酸）からのグリオキシル酸の製造のため の、一種類の固定化酵素触媒の製造及び使用につき記載する。グリコール酸と酸 素の、酵素による触媒反応は何年も以前から知られていたが、グリオキシル酸へ の高い選択性（¢９９％）はこれまで得られておらず、又グリコール酸の酸化は ０．２０Ｍから２．５Ｍの濃度では実施されていない。以前の、共通して譲渡さ れた出願で、１９８９年１０月１６日出願の米国特許第０７／４２２，０１１号 明細書の「グリコール酸からのグリオキシル酸の製造」には、酸素、アミン緩衝 液、及び可溶性酵素のグリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下での、 グリコール酸のグリオキシル酸への酵素による転化方法について記載されている 。この方法は、カタラーゼ（副生成物の過酸化水素を分解するため）及び生成さ れるグリオキシル酸と化学付加物を形成することができるアミン緩衝液（それ以 上の酸化を制限する）の両者を使用することの予想外の相乗効果を示し、そして その方法はそのような目的で、引用することにより本明細書の内容とされる。カ タラーゼもしくはアミン緩衝液の別個の添加によっては、両者の併存時に認めら れた高い選択性は認められず、そして得られたグリオキシル酸のほとんど定量的 な収率は、カタラーゼ又はアミン緩衝液の単独の使用の単純な加算効果から期待 される量以上のものであった。本発明は、この方法に固定化された酵素触媒が提 供される点において、前記の方法の改良法と見なされる。 以前に報告された、触媒としての可溶性酵素の使用は幾つかの問題を提出する ：すなわち再利用のための触媒の回収の実施が容易ではなく、触媒の安定性が固 定化酵素により得られるもの程良好でなく、そして可溶性酵素は酸素の反応混合 物への散布（酸素の溶解率及びそれにより反応速度を増加するために必要）に対 して安定でない。今日、二種類の酵素；すなわち、グリコラートオキシダーゼ（ 例えば、ホウレンソウもしくはビートの葉から、単離又は市販源から得られる） 及びカタラーゼ（例えば、アスペルギルス・ニガー[Aspergillus niger]、アス ペルギルス・ニジュランス[Aspergillus nidulans]、サッカロマイセス・セレビ シエ[Saccharomyces cerevisae](Bayker's yeast社)、あるいは牛の肝臓、単離 又は市販源から得られる）を、一種類の固体の担体（例えば、市販のオキシラン アクリルビーズ）上に同時に固定化することを含む、触媒の製造方法が開発され た。前記の方法において、この固定化酵素触媒の使用により幾つかの利点が提唱 される：すなわち １）この固定化酵素は反応終結時に再利用のために反応混合物から容易に回収 されるが、一方可溶性酵素は回収が非常に困難で活性を喪失する； ２）この固定化触媒は、反応終結時又は水性緩衝液中に長期間保存後に回復さ れる酵素活性についてと同様に、可溶性酵素に対して得られる触媒代謝回転数に ついても、可溶性酵素よりも安定であり；そして ３）最も重要なことであるが、この固定化触媒は、酸素の溶解速度及び反応速 度を増加させるために、反応混合物中に酸素を散布する反応条件に対して安定で あり、一方同様の反応条件下で、可溶性グリコラートオキシダーゼは急速に分解 する。 ある特定の酵素に対して、その固定化が成功することを期待して一つの固定化 法を選択することはできない。更に、１種類を越える酵素の共固定化の成功の期 待は一層予知が困難である。一般的に当業者にとって、ある１種類の酵素の有効 な固定化は、多種多様の方法のスクリーニング、及び試行錯誤により得られた最 適な結果により発見されねばならないことが認められている。グリコラートオキ シダーゼの場合には、固定化の試みについての報告はない。酵素の固定化は下記 を含む多種多様の方法を用いて実施することができる：すなわち（１）共有結合 、物理的吸着、静電気結合、又は親和力結合による、酵素の、キャリア(carrier )もしくは担体(support)への結合、（２）二官能性のもしくは多官能性の試薬と の架橋、（３）ゲルマトリックス、ポリマー、エマルション、もしくはある種の 形態の膜中への取り込み、及び（４）これらの方法のいずれかとの組み合わせで ある。酵素固定化の多くのこれらの方法の詳細な説明、及び固定化の方法の選択 に影響を与える幾多の因子は、Methodsin Enzymology,K.Mosbach(ed.),Academic Press,New Yorkの下記の巻にまとめられている:すなわちVol.44(1976)、Vol.135 (1987)、Vol.136(1987)、Vol.137(1988)、及びそれらの参考文献である。 グリコラートオキシダーゼの固定化の多種多様の方法が試験され、そしてこれ らの幾つかの方法の最適な結果を実施例中に記載する。オキシランアクリルビー ズ(Eupergit C)への共有結合、臭化シアン活性化アガロース、及びトリエチレン テトラミン(PAN-500)と架橋したポリ（アクリルアミド−co-N-アクリルオキシス クシンイミド）ゲルへの、このタンパク質の共有結合は、樹脂のXAD-8及びフェ ニルアガロースへの物理的吸着と同様に、活性な固定化酵素を生成した。このタ ンパク質とグルタルアルデ ヒド、ジメチルアジピミダート、ジメチルスベリミダート、もしくは1,4-ブタン ジオールジグリシジルエーテルとの架橋結合の試みと同様に、種々の担体へのイ オン結合は不成功であった。活性な固定化グリコラートオキシダーゼの異なった 形態のうち、オキシランアクリルビーズ−酵素のみがグリコール酸の酸化に対す る触媒として有用であった。物理的に吸着された酵素はｐＨ９．０で０．７５Ｍ のグリコール酸及び０．７９Ｍのエチレンジアミンを含有する反応混合物中で、 担体から早急に脱離し、一方臭化シアン活性化アガロースはエチレンジアミンと 反応して共有結合した酵素を反応混合物中に再度放出した。PAN-500ゲルに結合 した酵素の比活性は余りにも低いので反応における実際的な触媒としては有用で なかった。 オキシランアクリルビーズのEupergit C及びEupergit C-250L(Rohm Pharma社 ）上へのグリコラートオキシダーゼの固定化は、その反応条件に対して安定で、 そしてこの使用目的に有用な十分に高い比活性（酵素活性単位／触媒１グラム） を有する触媒をもたらした。カタラーゼも又オキシランアクリルビーズ上に固定 化され、そして二種の別個の触媒を一緒に使用するか、あるいは両方の酵素を同 じ担体上に共固定化してからこの単一の触媒を反応混合物中に添加した（後者の 方法が好適である）。 前記固定化酵素触媒を使用することにより、可溶性酵素の多くの欠点が排除さ れた。水性緩衝液中での固定化グリコラートオキシダーゼの安定性は可溶性酵素 よりもずっと大きい（硫酸アンモニウム沈澱酵素の安定性に近い）。共固定化触 媒の回収及び再利用は、その反応混合物から触媒を単に濾取し、そしてそれを新 規の反応混合物に再利用することにより容易に実施することができる；この方法 で固定化グリコラートオキ シダーゼに対する代謝回転数（すなわち、酵素の不活性化前の触媒分子１モル当 たりの、生成物分子に転化される基質分子の数）は１０⁷（モル/モル）の高い値 が得られた。最後に、酵素触媒の性状を変化させずに反応混合物中に酸素を吹き 込むことが可能なために反応速度を少なくとも１０倍増加させ、そしてこの速度 増加は本方法の製造経費を著しく軽減する。 反応中に使用される固定化グリコラートオキシダーゼは有効な濃度で、通常は 約０．００１から約１０．０ＩＵ／ｍＬ、好適には約０．１から約４ＩＵ／ｍＬ の濃度で存在しなければならない。ＩＵ（国際単位）とは１分間に１マイクロモ ルの基質の変換の触媒作用をする酵素の量と定義される。この酵素のアッセイ法 はI.Zelitch及びS.OchoaによるJ.Biol.Chem.,Vol.201,707-718(1953)に認められ る。この方法は又、回収又は再利用されたグリコラートオキシダーゼの活性のア ッセイにも使用される。 反応溶液のｐＨは７と１０の間、好適には８．０と９．５の間になければなら ない。酵素活性はｐＨにより変化するので、ｐＨは緩衝液により保持することが できる。反応のｐＨは反応が進行するに従って僅かに減少するので、酵素活性が 最大であるｐＨ領域の最高端の近く、約９．０−９．５で反応を開始し、そして 反応の経過中に低下させることは多くの場合有用である。１９８９年１０月１６ 日出願の米国特許出願第０７／４２２，０１１号明細書に以前に記載されたよう に、生成物の選択性を最大にするために、グリオキシル酸と複合体を生成するこ とができる（化学的もしくは酵素による酸化に対してより安定なイミンを生成す ることにより）アミン緩衝液が、カタラーゼと共に使用される。エチレンジアミ ン、あるいはそれほど好適ではないが、トリス（ヒドロキ シメチル）メチルアミン（以後ＴＲＩＳと称する）、ピペラジン、又はグリシル グリシンはグリオキシル酸の収率を改善した。これらのアミン類はアミン／グリ コール酸のモル比（出発量）が１．０から３．０で、好適には１．０５から１． ３３で使用される。この範囲内で正確な値に調整して希望のｐＨを得ることがで きる。グリコール酸に対するアミンの高い比率で使用される、非常に塩基性の強 いアミンについては、例えば塩酸又は硫酸のような酸を添加すること等により、 ｐＨを調節することが必要であろう。ＴＲＩＳのようなそれほど塩基性の強くな いアミンの場合には、希望のｐＨを維持するために塩基を添加することが必要か も知れない。 固定化カタラーゼの濃度は５０から１００，０００ＩＵ／ｍＬ，好適には、３ ５０から１４，０００ＩＵ／ｍＬでなければならない。それらの酵素は、その反 応に添加する触媒の量を抑制するために共固定化し、そしてカタラーゼとグリコ ラートオキシダーゼの濃度を、カタラーゼ：グリコラートオキシダーゼの比率（ それぞれＩＵで測定された）が少なくとも約２５０：１となるような前述の範囲 内に調整することが好適である。フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、０． ０から２．０ｍＭの濃度で、好適には０．０１から０．２ｍＭの濃度で使用され る、任意の添加成分である。 反応速度は、酸素が水性溶媒に溶解することができる速度により、少なくとも 部分的に制御される。酸素は大気中の酸素として反応に添加することができるが 、比較的純粋な形態の酸素を使用し、そして高圧を使用することが好適である。 酸素圧の上限は知られていないが、５０気圧までの酸素圧は使用可能であり、そ して１５気圧の上限が好適である。 酸素の高い溶解速度（及びそれにより、高い反応速度）を維持するために、反応 混合物中に酸素を散布する（吹き込む）ことが必要である。酸素は１分間に、反 応混合物の体積当たり０．０５から５容量（容量／容量・分）の、好適には０． ２と２容量／容量・分の間の酸素量（大気圧下で測定）の速度で反応混合物中に 吹き込まれる。更に、かきまぜのような便利な撹拌の形態が有用である。 反応温度は、それが反応速度及び酵素類の安定性に影響を与えるので重要な可 変因子である。０℃から４０℃の反応温度を使用することができるが、好適な反 応温度範囲は５℃から１５℃である。好適な温度範囲で処理すると、反応の終結 時に回収される酵素活性が最大となる。 反応を終結し、酵素触媒を濾過又は遠心分離により除去する際、アミン緩衝液 はイオン交換樹脂の使用により除去すると最も便利ある。適切な酸性の陽イオン 交換樹脂には「AMBERLITE」CG120又は「AMBERLITE」IR120(Rohm&Haas 社)、及び「DOWE X」50(Dow Chemical 社)が含まれる。次いでそのアミンは回収され、そして更に その樹脂を強塩基で処理することにより再利用することが出来る。 生成物のグリオキシル酸は、イオン交換樹脂中に、そして医薬品工業における 酸触媒として(Ullmanns社)使用されると共に、バニリン及びエチルバニリンの製 造において有用である。それは通常５０％（重量パーセント）水溶液として販売 されている。本出願明細書におけるグリオキシル酸への言及は、特にグリオキシ ル酸が、ｐＨが約２．３より大きい溶液中に存在する際にはグリオキシラートの 陰イオンをも意味する可能性があることも又理解して頂きたい。ホウレンソウの葉から抽出したグリコラートオキシダーゼの精製 ホウレンソウから抽出したグリコラートオキシダーゼは硫酸アンモニウムによ る選択的分別、及びそれに続くＤＥＡＥセルロースを使用する、抽出物のバッチ 吸着を使用して精製した。後者の方法によりグリコラートオキシダーゼを除く、 実質的にすべての植物タンパク質の吸着がもたらされた。精製のすべての段階は 、特記されない場合は４℃で実施した。２５℃で、新鮮なホウレンソウ２ブッシ ェル（１６ｋｇ）を、０．５インチの網目スクリーンのついたフィッツミル粉砕 機 (Fitz Mill grinder)を用いて微細片に截断した。生成するパルプの流体部分 (約６Ｌ)を４枚のチーズクロスでしぼることにより単離した；代替法として、ジ ュース絞り器 (Vitantonio社)を使用することができる。前記流体部分にジチオ トレイトール５．６ｇ（最終濃度５ｍＭ）を添加し、次いで２０％酢酸を５−２ ０ｍＬ添加することによりｐＨを５．２に調整した。１０分間温置後、ＧＳ−３ ローター (Sorvall社)を用いて４℃で２５分間１３，０００ｇで生成混合物を遠 心分離した。そのペレット部分は廃棄し、そして６Ｎの水酸化カリウム１５−２ ０ｍＬを用いて上澄み液のｐＨを７．５−８．０に調整した (Zelitch,I.,Ochoa ,S.,J.Biol.Chem.,Vol.201,707(1953);Frigerio,N.A.,Harbury,H.A.,J.Biol.Che m .,Vol.231,135(1958))。次いで、１００，０００ＭＷの膜カセットを備えたペ リコン (Pelicon)(Millipore社)限外濾過器を用いて、上澄み液（約５．５Ｌ） を５倍に濃縮した；濃厚液の最終容量はおよそ１．１Ｌであった。次いで１０分 間に渡りゆっくりとその濃厚液に固体硫酸アンモニウム（１５４ｇ）を添加した 。すべての硫酸アンモニウムを溶解した後、生成する沈澱物を１３，０００ｇで ２５分間遠心分離することにより除去した。そのペレット部分を廃棄し、そして 硫酸アンモニウム７７ｇを 上澄み液（約１．１Ｌ）に添加し、次いで前述のように遠心分離した。生成した タンパク質ペレットを回収し、上澄み液を廃棄した (Zelitch(1953);Frigerio(1 958))。 前記タンパク質のペレットを２０ｍＭのビシン(bicine)緩衝液（ｐＨ８．０） 約２００ｍＬに溶解した。スペクトロポル(Spectropor)２透析管（１２，０００ −１４，０００ＭＷＣＯ）を用いて、２ｍＭのＦＭＮ含有の２０ｍＭビシン緩衝 液（ｐＨ８．０）４Ｌに対して、前記タンパク質を１６時間透析した。伝導度メ ーターを用いて、新鮮なビシン緩衝液の伝導度と比較して前記タンパク質溶液の 伝導度を測定し、そしてもしその読み取り値が同じでない場合はそのタンパク質 溶液を更に４時間透析し、次いで前と同様にテストした。透析したタンパク質溶 液（約２５０ｍｌ）はマグネチック撹拌棒もしくは頭上撹拌機を用いてビーカー 内で撹拌し、次いで前以て膨潤させたＤＥＡＥセルロース ((Sigma社)２５ｇ (K err,M.W.,Groves,D.,Phytochemistry,Vol.14,359-362(1975))を添加しそして生 成した混合物を１０分間温置した。樹脂へのタンパク質の結合は、ブラッドフォ ード(Bradford)アッセイ(Bio-Rad社)を用いて、溶液のタンパク質濃度の減少を 追跡することにより監視した。上澄み液のタンパク質濃度が痕跡レベル（０．２ ｍｇ／ｍＬ）に減少した時に、直径１３ｃｍのブックナー(Buchner)漏斗(Cole-P armer社)中の１１ｃｍのホワットマン(Whatman)＃１濾板を通した真空濾過によ り、非結合タンパク質を混合物から回収した。酵素の回収を最大にするために、 樹脂ケークを２０ｍＭのビシン緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬで洗浄した。前 記タンパク質溶液にフラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ、Sigma社)を２ｍＭの最 終濃度になるまで添加し、次いで５Ｎの水酸化カリウムを滴 加してｐＨを８．０に保ちながら、その酵素溶液（約４００ｍＬ）に固体硫酸ア ンモニウム２４０ｇを、撹拌しつつ１５分に渡り徐々に添加した。生成した沈澱 グリコラートオキシダーゼは必要な時まで４℃の暗所に保存した。新鮮なパン酵母 (Bakers Yeast)から抽出したカタラーゼの精製 すべての精製段階は４℃で実施された。新鮮なパン酵母(１ｌｂ．，Universal Food-Red Star社)を、フェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ、Sigma 社)１ｍＭ含有の２０ｍＭトリス (Tris)緩衝液（ｐＨ７．５）４５０ｍＬ中に懸 濁させた。前記酵母懸濁液の２００ｍＬを、ガラスの小粒(直径０．５ｍｍ−Bio spec Products社)２００ｍＬを含有する４００ｍＬ容量のビーズビーター (Bead Beater)ブレンダーに移し、そして５分間の継続的な混合の後に、その溶解物を 受容器（氷上）に移した。残りの酵母懸濁液を同様に処理した。 ＧＳ−３ローター (Sorvall社)中で１３，０００ｇで４５分−１時間、４℃で その抽出物を遠心分離することにより細胞片を除去した。上澄み液（４００ｍＬ ）を収集し、その溶液に固体硫酸アンモニウム９０．４ｇを溶解して４０％飽和 液にし、次いで氷上で１０分間温置後、その懸濁液をＧＳＡローター (Sorvall 社)中で１３，０００ｇで２５分間４℃で遠心分離した。ペレットは廃棄し、次 いで上澄み液（４００ｍＬ）に固体硫酸アンモニウム４８ｇを添加して最終的な ６０％飽和液をもたらした (Seah,T.C.M.,Kaplan,J,G.J.Biol.Chem.Vol.218,No. 8,2880(1973))。この混合液を前述のように温置、遠心分離し、そして生成した タンパク質ペレットを２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）の最少量に溶解した。 スペクトロポール (Spectropor)２透析管を用いて、前記タンパク質溶 液を２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）で透析し；透析緩衝液を１６時間後に廃 棄し、補充した。透析は更に４時間継続し、次いで透析タンパク質（１００ｍＬ ）を回収した。 前記透析タンパク質の一部の５０ｍＬを、Ｑセファロース(Sepharose) 速流イ オン交換樹脂(Pharmacia社)１００ｍＬを充填した輻流クロマトグラフィーカラ ム(Sepragen社)に充填し、そして非結合タンパク質を２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ ７．５）で１０ｍＬ／分で溶出した。タンパク質の溶出は、チャート記録計（Ｌ ＫＢ社）に接続した２８０ｎｍのフィルター（ＬＫＢ社）を備えたフローセルを 用いて監視した；ＬＫＢの画分回収器を用いて１０−１５ｍＬのカラム画分を回 収した。すべての非結合タンパク質をカラムから溶出したら、２０ｍＭのＴＲＩ Ｓ（ｐＨ７．５）に溶解した０−５００ｍＭからのＮａＣｌ４００ｍＬの直線勾 配(linear gradient)を１０ｍＬ／分で開始し、そして画分は２４０ｎｍで過酸 化物の消失を監視することによりカタラーゼ活性のアッセイを実施した。カタラ ーゼ活性を有する画分を収集し、そして硫酸アンモニウムを添加して最終濃度を ８０％飽和度にした。生成した沈澱カタラーゼを４℃で保存した。 この精製法は又アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus Nidulans)及びア スペルギルス・ニガー(Aspergillus Niger)から抽出されるカタラーゼの精製に も使用された。オキシランアクリルビーズ上に固定されたグリコラートオキシダーゼ及びカタラ ーゼの酵素アッセイ法 オキシランアクリルビーズ上に固定されたグリコラートオキシダーゼは、マグ ネチック撹拌棒の入った３ｍＬ入り石英セル中に、処理ビーズ 約５−１０ｍｇを正確に秤量することによりアッセイし、次いで２，６−ジクロ ロフェノールインドフェノール０．１２ｍＭ及びＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．３） ８０ｍＭ含有溶液２．０ｍＬを添加した。前記セルをゴムの膜で蓋をし、そして 窒素を５分間吹き込むことにより溶液の酸素を抜いた。次いで前記セルにシリン ジにより１．０Ｍグリコール酸／１．０ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．３）４０ｍＬを 添加し、そして６０５ｎｍ（ｅ＝２２，０００）で、時間による吸着の変化を測 定しながらその混合物を撹拌した。 カタラーゼ活性はマグネチック撹拌棒が入った３ｍＬ用石英セルに処理ビーズ 約２−５ｍｇを正確に秤量し、次いで蒸留水２．０ｍＬ、及び５０ｍＭのリン酸 緩衝液（ｐＨ７．０）中５９ｍＭの過酸化水素含有溶液１．０ｍＬを添加しそし て２４０ｎｍ（ｅ＝３９．４）で時間に対する吸収の変化を測定することにより アッセイした。固定化グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの活性はそれぞ れ典型的には６ＩＵ／ビーズ１グラム及び６０００ＩＵ／ビーズ１グラムであっ た。グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸のＨＰＬＣ分析 分析用サンプルは、反応混合物０．１００ｍＬを０．１ＮのＨ₂ＳＯ₄を０．３ ００ｍＬと混合し、次いで生成した溶液をミリポアウルトラフリー(Millipore U ltrafree)ＭＣ濾過器（１０，０００ｍｗカットオフ）により濾過することによ り用意した。グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸及びギ酸の分析は、溶媒 としてＨ₂ＳＯ₄（０．０１Ｎ）及び１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン 酸（０．１ｍＭ）の水溶液を１．０ｍＬ／分で使用することにより、４０℃でBi o-Rad Aminex HPX-87Hのカラム(３００×７．８ｍｍ）を使用して高速液体クロ マトグラ フィー（ＨＰＬＣ）により実施した。その機器は５１０型のポンプ、７１２ＷＩ ＳＰ自動試料採取器の付いたWaters840HPLCシステム、並びに、それに続き４９ ０ＥのＵＶ検出器及び４１０示差屈折計であった。ＵＶ分析は２１０ｎｍで実施 した。シュウ酸、グリオキシル酸、グリコール酸、ギ酸、及びプロピオン酸（内 標準）の保持時間はそれぞれ４．２９分、６．０９分、７．７７分、８．７９分 、及び１１．４１分であった。実施例１ 種々の担体に対するグリコラートオキシダーゼの固定化 ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、シリカゲル上のポリ（エチルエンイミン ）、シリカゲル上のベンジル化ポリ（エチルエンイミン）、ビオレックス (Bio- Rex)７０、ＣＨセファローズ(Sepharose)４Ｂ、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−８、フェ ニルアガローズ(Phenyl Agarose)、ユーペルギット(Eupergit)Ｃ−２５０Ｌ、及 びユーペルギット(Eupergit)Ｃ−３０Ｎはすべて市販源から得られた。Pollack, A.等によりJ.Am.Chem.Soc.,1980,102,6324-6336に記載された方法に従い、トリ エチレンテトラミンと架橋したＰＡＮ−５００（ポリ（アクリルアミド−ｃｏ− Ｎ−アクリルオキシスクシンイミド））ゲルを用意しそしてグリコラートオキシ ダーゼを固定化するのに使用した。タンパク質を物理的吸着により結合する担体 については、その担体を適宜ｐＨ５−１０の水性緩衝液で洗浄し、次いで５℃も しくは２５℃で前以て決められた期間その担体を酵素の緩衝液に浸け、次いでそ の担体を新鮮な緩衝液で３−４回洗浄して未吸着の酵素を除去し、そしてその担 体のグリコラートオキシダーゼ活性を測定することにより固定化を実施した。グ ルタルアルデヒドととも に使用される担体については、酵素の添加の前に担体を５％のグルタルアルデヒ ド水溶液で処理したことを除いて前述で概説した方法を繰り返した。Eupergit上 へのグリコラートオキシダーゼの固定化の詳細な方法は実施例２に示す。下表に 挙げる固定化グリコラートオキシダーゼの収率は、固定化の条件を各担体にとっ て最適化することにより得られ、そして各方法の経過中に添加された酵素活性の 総量を基にしている。 実施例２ グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼのユーペルギット(Eupergit)Ｃへの共 固定化 １２５ｍＬ用三角フラスコ中にオキシランアクリルビーズ(Eupergit C)１０．０ｇを秤量した。次いでそのフラスコに５０ｍＭのビシン緩衝液（ｐＨ ８．０）及び０．０２ｍＭのフラビンモノヌクレオチドを含有する溶液約７５ｍ Ｌを添加し、そして次いでオキシランアクリルビーズをフラスコの内容物を渦状 に撹拌しながら緩衝液中に懸濁させた。ビーズがフラスコの底部に落ち着いた後 、沈んだビーズを動かさないように除去することができる、できるだけ多くの上 澄み液とともに、混合物の上部に浮いている微細物質をピペットで除去した。こ の洗浄方法を２回目も繰り返した。 ３２７ＩＵのグリコラートオキシダーゼ活性を含む(新鮮なホウレンソウの葉 から抽出された)硫酸アンモニウムにより沈殿させたグリコラートオキシダーゼ 混合物１００ｍＬを２０分間１２，０００ｒｐｍで（４℃で、Sorvall GSAロー ター）遠心分離した。上澄み液を廃棄し、ペレットを５０ｍＭのビシン（ｐＨ８ ．０）、０．０２ｍＭのフラビンモノヌクレオチド緩衝液５０ｍＬに溶解した。 硫酸アンモニウムにより沈殿させたアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger ) カタラーゼ(Sigma C-3515)１００ｍｇ（７１５，０００ＩＵ）を含有する混合 物１０ｍＬを１０分間１５，０００ｒｐｍで(Sorvall SS-34ローター)遠心分離 した。上澄み液を廃棄しそしてそのペレットをグリコラートオキシダーゼを含有 する緩衝液に溶解した。次いでこの酵素溶液を、洗浄したオキシランアクリルビ ーズを含有するフラスコに添加し、そして更に緩衝液を添加することにより最終 容量を１２５ｍＬに調整した。生成した混合物は２５０ｍＬ用ポリプロピレンの びんに移し、そのびんは蓋をして１５℃で１６時間４−５ｒｐｍでびんローラー 上に置いた。次いでその混合物をガラス層保持体を入れたクロマトグラフィーカ ラムに注入し、排水 させ、そしてその固定化酵素をビシン／ＦＭＮ緩衝液３０ｍＬで３回洗浄し、こ の同じ緩衝液中に５℃で保存した。この共固定化酵素触媒はグリコラートオキシ ダーゼ活性７．２ＩＵ／Eupergit C1グラム及びカタラーゼ活性５６８０ＩＵ／E upergit C1グラムを有した。実施例３ 可溶性グリコラートオキシダーゼ及び固定化グリコラートオキシダーゼの相対的 な安定性 オキシランアクリルビーズ (Eupergit C)上に固定化されたグリコラートオキ シダーゼに対する、固定化されていない(可溶性)グリコラートオキシダーゼの安 定性は、２．０ｍＭのフラビンモノムクレオチドを含有する緩衝液（ｐＨ８．０ ）中で４℃で両者の形態の酵素を保存し、次いで時間に対する酵素活性を監視す ることにより測定した。更に、３．２Ｍの硫酸アンモニウム、２．０ｍＭのフラ ビンモノムクレオチド中に沈殿し、そして同様な条件下で保存された酵素の安定 性をも監視した。酵素回収率 １日 ２日 ３カ月 ６カ月 可溶性 ５０％ ０ ０ ０ 固定化 ９２％ ９５％ ５０％ ５０％ 沈殿 １００％ １００％ ９５％ ８５％実施例４ 酸素散布時の共固定化酵素の反応 ２０ｍｍのポリエチレン層保持体を入れた２．５ｃｍのＩＤ×２０ｃｍのガラ スカラム中にグリコール酸（０．２５Ｍ）、エチレンジアミン（０．３３Ｍ）、 プロピオン酸（０．０７５Ｍ、ＨＰＬＣ内標準）、 及びフラビンモノムクレオチド（０．２ｍＭ）を含有する溶液１０ｍＬを注入し た。カラム及びその内容物を１５℃に冷却し、次いで２．５ＩＵのホウレンソウ のグリコラートオキシダーゼ及び２７，０００ＩＵのアスペルギルス・ニガー(A spergilus niger) のカタラーゼ(Eupergit Cに共固定化）をその溶液に添加した 。次いで、酸素を多孔性層保持体を通過させそして１０ｍＬ／分の速度で反応混 合物中に泡状に通過させた。その反応は、定期的に反応混合物のアリコート１０ ０ｍＬを採取し、そのアリコートを０．１Ｎ硫酸３００ｍＬと混合して反応を終 結させ、アリコートを濾過し、そしてＨＰＬＣにより分析することにより監視し た。５．５時間後のグリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ９８ ％、２％、及び０％であり、グリコール酸は完全な転化を示した。グリコラート オキシダーゼ及びカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値の９５％及び６５％ であった。比較例１ 酸素散布時の可溶性酵素の反応 同量の、可溶性の、非固定化グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼを反応 混合物に添加したことを除いて、実施例４に記載の反応を繰り返した。４時間後 のグリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ４３％、０％、及び０ ％であり、グリコール酸の転化率は４６％であった。グリコラートオキシダーゼ 及びカタラーゼの最終的活性はそれぞれそれらの初期値の２％及び８２％であり 、そしてより長時間後でもこれ以上の反応は認められなかった。実施例５ 酸素散布時の別個に固定化された酵素の反応 グリコール酸（０．７５Ｍ）、エチレンジアミン（０．８６Ｍ）、プロピオン 酸（０．０７５ＭＮ ＨＰＬＣ内標準）、フラビンモノヌクレオチド（０．２ｍ Ｍ）、Eupergit C上に固定化したホウレンソウのグリコラートオキシダーゼ２． ５ＩＵ及びEupergit C上に固定化されたアスペルギルス・ニガー(Aspergillus n iger )のカタラーゼ１４，０００ＩＵ（２種類の酵素は同じ担体に共固定化され ていない）を含有する溶液１０ｍＬを用いて実施例４の反応を繰り返した。２０ 時間後のグリオキシル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ９９％、０．２ ％、及び０．５％であり、グリコール酸の転化率は１００％であった。グリコラ ートオキシダーゼ及びカタラーゼの最終的活性はそれぞれ初期値の７２％及び６ ６％であった。実施例６ 固定層を使用する共固定化酵素の反応器 コンテスエアリフトバイオリアクター(Kontes Airlift Bioreactor)の中に０ ．７５Ｍのグリコール酸、０．８６Ｍのエチレンジアミン、０．０７５Ｍのプロ ピオン酸（ＨＰＬＣ内標準）、及び０．０１ｍＭのフラビンモノヌクレオチド（ ｐＨ９．０）含有の溶液４００ｍＬを注入した。湿った酸素の気泡をバイオリア クター中の溶液に通過させ、そして蠕動ポンプを使用してその酸素添加溶液を、 バイオリアクターから、Eupergit Cのオキシランアクリルビーズ上に共固定化さ れたホウレンソウのグリコラートオキシダーゼ（１３．９ＩＵ）及びアスペルギ ルス・ニガー (Aspergillus niger)のカタラーゼ（５６，０００ＩＵ）を含有す る、被覆された１ｃｍＩＤ×３０ｃｍのクロマトグラフィーカラム（２１ｍＬの 固定層容量）を通して再循環させた。バイオリアクター及 び被覆されたクロマトグラフィーカラムの内容物は、１０℃の冷蔵浴／循環器セ ットを用いてリアクター及びカラムのジャケットに５０：５０エチレングリコー ル／水を再循環させることにより１５℃に維持した。３７７時間後のグリオキシ ル酸、シュウ酸、及びギ酸の収率はそれぞれ９３％、０％、及び０．３％であり 、グリコール酸は９４％の転化率を示した。グリコラートオキシダーゼ及びカタ ラーゼの最終的活性はそれらの初期値の４８％及び６９％であった。実施例７ 撹拌オートクレーブ反応器中で共固定化グリコラートオキシダーゼ／カタラーゼ を用いたグリコール酸の酸化 ３００ｍＬ用ＥＺＥシール(Seal)の撹拌オートクレーブ(Autoclave Engineers 社)に、グリコール酸（０．７５Ｍ）、エチレンジアミン（０．８６Ｍ、ｐＨ９ ．０）、プロピオン酸（０．０７５Ｍ、ＨＰＬＣ内標準）、及びフラビンモノヌ クレオチド（０．０１ｍＭ）を含有する溶液１００ｍＬを充填し、そしてその溶 液を１５℃に冷却した。次いでそのオートクレーブに約２８ｇのEupergit Cに共 固定化された８９ＩＵのホウレンソウのグリコラートオキシダーゼ及び７２，６ ００ＩＵのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のカタラーゼを添加し た。生成混合物を、１００ｍＬ／分でその混合物中に酸素の気泡を通気しながら 、７０ｐｓｉｇ（４８３ｋＰａ）の酸素下で１５℃で５００ｒｐｍで撹拌した。 反応は、定期的に反応混合物の１００ｕＬのアリコートを採取して、そのアリコ ートを０．１Ｎの硫酸３００ｍＬと混合して反応を終結させ、そのアリコートを 濾過しそしてＨＰＬＣにより分析することにより監視した。３時間後のグリオキ シル酸、シュウ酸、及びギ酸の収 率はそれぞれ１００％、０％及び０％であり、グリコール酸は完全な転化率を示 した。グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの最終的活性はそれらの初期値 の１００％及び１００％であった。実施例８ 撹拌オートクレーブ反応器中での共固定化グリコラートオキシダーゼ／カタラー ゼの回収及び再利用 固定化酵素触媒は、反応混合物を、２０ｍｍのポリエチレン層保持体を入れた ２．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍのガラスカラムを通して濾過することにより、実施例 ７に記載の反応から回収した。その触媒に吸着された残りの流体は、カラムに窒 素を短時間通すことにより除去し、次いでその触媒はグリコール酸（０．７５Ｍ ）、エチレンジアミン（０．８６Ｍ）、プロピオン酸（０．０７５Ｍ、ＨＰＬＣ 内標準）、及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含有する新鮮な１ ５℃の溶液１００ｍＬ中に再度懸濁させた。３００ｍＬ用オートクレーブ反応器 に再度この反応混合物を充填し、そしてこの反応を繰り返した。この触媒回収法 は１０回連続したバッチ反応で実施し、そしてその反応時間、グリコラートオキ シダーゼ（Ｇ．Ｏ．）及びカタラーゼ活性の回復率、並びにグリオキシル酸の収 率は下表に示す。 実施例９ 撹拌オートクレーブ反応器中でのグリコール酸の、酵素による、酸素散布による 酸化の反応速度 ３００ｍＬ用ＥＺＥ−シール (Seal)撹拌オートクレーブ(Autoclave Engineer s社)にグリコール酸(０．７５Ｍ)、エチレンジアミン（０．８６Ｍ、ｐＨ９．０ ）、プロピオン酸（０．０７５Ｍ、ＨＰＬＣ内標準）、及びフラビンモノヌクレ オチド（０．０１ｍＭ）含有溶液１００ｍＬを充填し、そしてその溶液を１５℃ に冷却した。次いでそのオートクレーブに約１５ｇのEupergit Cに共固定化され た４１ＩＵのホウレンソウのグリコラートオキシダーゼ及び４２，８００ＩＵの アスペルギルス・ニガー(Aspergilus niger)のカタラーゼを添加した。生成混合 物を、混合物中に酸素の気泡を５０ｍＬ／分で通気しながら、３５、７０、１０ ５、又は１４０ｐｓｉｇ（２４２，４８３，７２４又は９６５ｋＰａ）の酸素下 で１５℃、４００ｒｐｍで撹拌した。反応は、定期的に反応混合物のアリコート １００ｍＬを採取し、そのアリコートを０．１Ｎの硫酸３００ｍＬと混合して反 応を終結させ、アリコートを濾過しそしてＨＰＬＣにより分析することにより監 視した。３５、７０、１０５、又は１４０ｐｓｉｇ（２４２，４８３，７２４又 は９６５ｋＰ ａ）の酸素下で実施された反応の速度はそれぞれグリコール酸の０．４８、０． ５４、０．５３、及び０．５７ｍｍｏｌ／分であった。比較例２ 撹拌オートクレーブ反応器中でのグリコール酸の、酸素による、酸素非散布によ る酸化の反応速度 反応混合物中に酸素の気泡を通気しない点を除いて実施例９における反応を撹 拌オートクレーブ反応器中で繰り返した。３５、７０、又は１０５ｐｓｉｇ（２ ４２、４８３、又は７２４ｋＰａ）の酸素下で実施された反応の速度はそれぞれ グリコール酸の０．０３２、０．０５３、及び０．０７１ｍｍｏｌ／分であった 。実施例１０ 固定化グリコラートオキシダーゼと浸透可能化されたベーカーズイースト(Baker s Yeast)を用いてのグリコール酸の酵素酸化 Eupergit C約１５ｇ上に固定化された５０ＩＵのホウレンソウのグリコラート オキシダーゼ、及びイソプロパノールにより浸透可能化され、そして１００，０ ００ＩＵのカタラーゼ活性を有する新鮮なサッカロマイセス・セレビシエ(Sacch aromyces cerevisiae )(ベイカースイースト(Bakers yeast)、レッドスターブラ ンド、Universal Foods社)４．０ｇを触媒として使用した点を除いて、実施例７ 及び実施例８に記載の方法を繰り返した。反応混合物は、その混合物中に２０ｍ Ｌ／分で酸素気泡を通気しながら、７０ｐｓｉｇ（４８３ｋＰａ）の酸素下で１ ５℃、４００ｒｐｍで撹拌した。６回の連続バッチ反応を実施し、そして反応時 間、グリコラートオキシダーゼ（Ｇ．Ｏ．）及びカタラーゼ活性の回復率、並び にグリオキル酸の収率は下表に示す。 実施例１１ 酸素散布速度に対するグリコール酸の酸化速度の依存性 実施例７に記載の方法を、Eupergit C約１８ｇに共固定化された５２ＩＵのホ ウレンソウのグリコラートオキシダーゼ及び９５，０００ＩＵのアスペルギルス ・ニガー(Aspergillus niger)のカタラーゼを使用して繰り返した。反応混合物 は５−５０ｍＬ／分でその混合物中に酸素を散布しながら、７０ｐｓｉｇ（４８ ３ｋＰａ）の酸素下で、１５℃、５００ｒｐｍで撹拌した。異なった酸素散布量 におけるグリコール酸の酸化速度を下表に示す。 実施例１２ オートクレーブの撹拌速度に対するグリコール酸の酸化速度の依存性 Eupergit C約１５ｇ上に共固定化された５０ＩＵのホウレンソウのグリコラー トオキシダーゼ及び４７，０００ＩＵのアスペルギルス・ニガー(Aspergullus n iger )のカタラーゼを使用して、実施例７に記載の方法を繰り返した。反応混合 物はその混合物に２０ｍＬ／分で酸素を散布しながら、７０ｐｓｉｇ（４８３ｋ Ｐａ）の酸素下で１５℃で１００−５００ｒｐｍで撹拌した。異なった撹拌速度 でのグリコール酸の酸化速度は下表に示す。 実施例１３ グリコラートオキシダーゼの濃度に対するグリコール酸の酸化速度の依存性 実施例７に記載の方法は、Eupergit C上にそれぞれ共固定化された８０、６０ 、４０、又は２０ＩＵのホウレンソウのグリコラートオキシダーゼ及び１，４０ ０，０００、１，０００，０００、７０，０００、又は３５，０００ＩＵのアス ペルギルス・ニガー(Aspergullus niger)のカタラーゼを使用して繰り返した。 反応混合物をその混合物に２０ｍＬ／分で酸素を散布しながら７０ｐｓｉｇの酸 素下で１５℃で４００ｒｐｍで撹拌した。異なった濃度のグリコラートオキシダ ーゼを使用して得られたグリコール酸の酸化速度は下表に示す。 以上のように、本発明をある程度の具体性をもって記述しそして例示したが、 下記の請求の範囲はそのように限定されるべきでなく、請求の範囲の各項の言葉 使い及びそれらの同義語に相応した範囲を与えるべきである点を認識して頂きた い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガバガン，ジヨン・エドワード アメリカ合衆国デラウエア州19810ウイル ミントン・ドーバルロード2300

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グリコール酸を、ｐＨが約７から１０の水溶液中で、不溶性の担体上に固定 化されたグリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼを含んでなる触媒の存在下で 、酸素、及びグリオキシル酸と化学付加物を形成することができるアミン緩衝液 に接触させることを含んでなる、グリオキシル酸の製造方法であって、グリコー ル酸の初期の濃度が２００ｍＭから約２５００ｍＭであり、グリコール酸に対す るアミンの初期のモル比は１．０から３．０の範囲内にある方法。 ２．グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼが同じ不溶性の担体上に共固定化 される請求の範囲第１項の方法。 ３．０．０１から１０．０ＩＵ／ｍＬの固定化グリコラートオキシダーゼが存在 する請求の範囲第１項の方法。 ４．５０から１００，０００ＩＵ／ｍＬの固定化カタラーゼが存在する請求の範 囲第３項の方法。 ５．反応が０℃から４０℃で実施される請求の範囲第４項の方法。 ６．酸素圧が１から５０気圧である請求の範囲第５項の方法。 ７．約０．１から約４ＩＵ／ｍＬの固定化グリコラートオキシダーゼが存在する 請求の範囲６の方法。 ８．３５０から１４，０００ＩＵ／ｍＬの固定化カタラーゼが存在する請求の範 囲第７項の方法。 ９．反応が５℃から１５℃で実施される請求の範囲第８項の方法。 １０．アミン緩衝液がエチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルア ミン、ピペラジン、グリシルグリシン、及びそれらの混合物からなる群から選ば れる請求の範囲第９項の方法。 １１．グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼが共有結合によりオキシランア クリルビーズに固定化される請求の範囲第１０項の方法。 １２．固定化グリコラートオキシダーゼに対する固定化カタラーゼの比率（ＩＵ で測定）が少なくとも２５０：１である請求の範囲第１項の方法。 １３．添加されるフラビンモノヌクレオチドの初期濃度が０から２．０ｍＭであ る請求の範囲第１項の方法。 １４．前記アミン緩衝液がエチレンジアミンである請求の範囲第１項の方法。 １５．前記アミン緩衝液がトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンである請求 の範囲第１項の方法。 １６．前記アミン緩衝液がピペラジンである請求の範囲第１項の方法。 １７．前記アミン緩衝液がグリシルグリシンである請求の範囲第１項の方法。