JPS58190394A - Ｄ−グルコ−ソンの製造方法 - Google Patents
Ｄ−グルコ−ソンの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は概して、グルコースから１段階工程即ち酵素に
よる酸化により、フルクトース製造の中間体であるＤ−
グル）フンの製造方法に関する。 結晶性フルクトースのｒＳ業規模における候造面では種
々の重装な問題にｉｆ面して来た。これらの問題の最大
の一つは製造経費の点である。現在の発明に匹敵する唯
一の商業的に実行可能な生産方法は、先スグルコース（
グルコースイソメラーゼを用いるあるいはアルカリ異性
化を行うことにより）あるいは蔗糖（転化糖を経由して
）から、グルコース−フルクトース混合シロッフヲ生％
ｌ−ゲル、次に２種の糖を物理的に分離する（イオン交
換あるいは選択的カルシウム塩沈澱による）そして、最
終的に、水溶液中から結晶状（種を槽えるがメタノール
沈澱により） フルクトースを回収するという工程に基
すいている。２種の糖の物理的分離処理が必要とされる
。その理由はもし実質上すべてのイオン性物質、残余の
グルコースおよび他の夾雛物を除かない場合、結晶フル
クトースを水溶液から回収すること か最も困難であり
、しばしば不可能となるからである。その様な処理を行
うには費用がかさみ、それ故フルクトースに対する市場
価格が高いものになり一食用として角砂糖に太刀打ち出
来ない値段になる。 文献によればフルクトースはグルコーフンから低濃度で
あるが作られ得る。１８８９年という初酸水溶液中亜鉛
末で還元することにより生成された。にの還元は種々の
生体物質中のＤ−グルコーフンの検出用分析試験として
行われて来ている。 ８．１０．ｌｊ Ｄ−グルコーフンのＤ−フルクトー
スへの還元はナトリウムボロハイドライドでも達成サレ
る。Ｄ−〆ルコーランのフルクトースへの転換は一〇Ｈ
Ｏ→ＣＨ２Ｏを行う還元酵素が既知となって以来、実行
可能な酵素反応となった。 又グルコーフンがグルコースから低濃度作られ得るとい
う文献によれば、グルコースを酸化する。 種々の方法即ちＨ２０□４あるいは酢酸鋼５で行うもの
が報告されている。これらの反応それぞれにおいて変換
収量が低く（３０％以下）、多くの副生成物が出来てい
る。グルコースをＤ−グルコーフンへ変換するのは、先
ずグルコースの誘導体を製造しく例えばフェニルヒドラ
ジンと反応させゲルコサシン を作るか或はパラトルイ
ジンと反応させる）、それからその誘導体を化学的に処
理して、Ｄ−グルコーフンを製造するやり方で行って来
た。これらの反応では収率が５ｏｑｂ以上にならなかっ
たし、又試薬が回収不可能なため、市販の目的には高価
につき過ぎる。加うるに、芳香族化合物を含む試薬を使
用する麺と雛、食品としての品質の糖を得るために種々
の問題＆ 〜４１拳キ。 グルコースのＤ−グルコーフンへの変換は又酵素反応も
知られている。１９６２年、グルコースをＤ−グルコー
フンへ酸化するのに軟体動物の一種、サクシドームスギ
ガンテラス（ｓａｘｉｔＬｏｍｔＬｚ）！ｉすαｎｔｇ
ｏμＪＰ） という結晶状物を用いた記載がある。１
９！１７年に、Ｄ−グルコ−フンの製造が。 グルコース、澱粉、マルトースあるいは蔗糖を２種のか
び即ちアスはルギルスパラジテイクス（ｋｚｐａｒｇｉ
Ｌｌｕｚ ｐａｒａｚｉｔｉｃｕりおよびアスベルギス
フラプスーオリーザエ（ｋｚｐａｒｌｉｌｔｔＬｚ ｆ
ｌａｗ’ｓａｒｙｚｃＬｇ）の原形質離解物で酸化する
ことにより行われると報告された。１９５６年には、グ
ルコースのグルコーフンへの酵素による酸化が紅藻類の
一種イリドフイクスフラシドウム（ＩｒｉｄｏｐｋｙＷ
ｚｆＬａｃｃｉｔＬｕｍ）１０ により行われるとい
う報告があった。グルコースをＤ−グルコーフンに酸化
する炭水化物酸化酵素が坦子菌順ポリポルスオプッスス
（Ｐｏｔｙｐｏｒμｚ ｏｂｔｕルリの菌糸体から単離
された。 収率については貫及されていない。終りに、１９７８年
Ｋ、グルコース−２−酸化酵素活性が担子菌類、オウデ
マンシェラムシダ（ＯｔＬｄａｍａｎｚ ｉ ａ Ｚ
Ｌａルｃｉｄα）において、他の木材腐敗病菌類 と同
様に検出された。最上の収率が５ｏ％より高くなかった
。これらの場合すべてにおいてＤ−グルコーフンの生成
には過酸化水素の発生を伴うと信じられている。 下記の図式は本発明のＤ−グル５つ′ンを中心とする工
程図式である。 万ヤングー七 遠 凡 フルクトース 下記式はＤ−グルコースの分子構造式を表して〜・る。 Ｃ）ＩＯ −ｃ−ｏＨ ｏ−ｃ−Ｈ Ｈ−ｃ−ｏＨｔ −Ｃ−ＯＨ ０ＨＯ）（ 下記式はＤ−グルコーノンの分子構造式を表している。 ＯＨ０ Ｑ＝Ｑ ０−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ Ｈ−Ｃ−ＯＨＩｌ ＯＨＯＨ 下記式はＤ−フルクトースの分子Ｍ造式を表している。 Ｃ＝０ ！ ０−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ Ｈ−Ｃ−ＯＨＩ ＯＨＯＨ Ｄ−グルコーノンの分子構造式に関して、他の幾つかの
分子構造式が水溶液中で存在することが推定されること
が、この分野の専門家に認められるであろう。これらの
多くは型状構造式である。′・３こ−に用いられている
「グルコースＪ ｒＤ−グルコースｊおよび「デキスト
ローズｊという用語はこのモノサッカライドの溶液中あ
るいは乾燥状態のいずれの形態なも包含し、交代に用い
られる。 式１はグルコースを表わしている。 こへに用いられている「Ｄ−グルコーノン−１および「
Ｄ−アラビノ−２−へキソースウロース」の用語は交代
に用いられる。式■はＤ−グルコース／を表わしている
。 こ〜に用いられている「フルクトース」、「Ｄ−フルク
トース」および「レプロース」の用語はグルコースより
甘いグルコースの異性体に対して言うために交代に用い
られる。「結晶フルクトース」の語は無水状態における
このモノサッカライド９を包含する意味の応用で用いら
れる。式■はフルクトースを表わしている。 本発明によれば、一般的に言って、水溶液中におけるグ
ルコースは炭水化物オキシダーゼあるいはグルコース−
２−オキシダーゼの如き適当な酵素で、酵素的ＫＤ−グ
ルコーソラン変換される。 この変換は自発的に、急速にそして実質的に完全に進行
させられろ。Ｄ−グルコーノンは予め単離しておかずに
、適当な化学的水素化によってフルクトースへ変換され
る。この変換も又、急速にそして本質的に完全に進行さ
せられる。得られたフルクトースはグルコースおよび他
の糖類−ｔべてを実質的に含まない状態で、水溶液ある
いは固体かいずれかの形で回収される。 上記に言及され、参照された、グルコースからＤ−／ル
コーランへおよヒＤ−１’ルコーソンカラフルクトース
への低収塞の変換は科学文献で既知テアルが、グルコー
スからフルクトースを製造するこれらの２種の反応を結
合させる概念は現在まで他の文献に見られていない。加
うるに、経済的、商業的に有用な工程で、グルコースか
ら結晶フルクトースを製造するためこれらの２種の反応
を用いるのに成功したことは、我々の発明に先立って報
告されていない。グルコースからＤ−グルコーノンへの
変換もＤ−グルコ−フンからフルクトースへの変換のど
ちらの報告にも、グルコースから結晶フルクトースを製
造する概念は考察されていなかった。Ｄ−グルコーノン
は化学的標品として必要とされたので化学的に合成され
た。Ｄ−グルコーノンは生物系で、無意識的Ｋ（例えば
研究中に生化学経路における未知成分として）かあろ〜
・は意識的に（例えば血液中グルコースの生化学的酸化
の研究の一部として）発見された。Ｄ−グルコーノンは
Ｄ−グルコーノンの検出のためのＧまん点試験として、
フルクトースへ還元された。 本発明において得られたＤ−グルコ−ノンの収率はこの
酵素に対して文献に報告された収率を超えている。Ｄ−
グルコーランへの変換率が高いことにより、残余の未変
換グルコースな物理的に分離する必要がない。 数種のオキシド９レダクターゼはグルコースの２番目の
炭素にある水酸基を酸化することに関して、即ち水酸基
をケト基に酸化することを促進する、例えば式Ｉの構造
を弐Ｈの構造へ変換する如き触媒活性を有する。こ〜に
記した実施例における特別なオキシドレダクターゼ酵素
は［グルコース−２−オキシダーゼ」、［ピラノース−
２−オキシダーゼ］および［炭水化物オキシダーゼ」の
如き多種を意味するが、本発明はその様に示された酵素
に限定される訳ではない。グルコース−２−オキシダー
ゼは基質のグルコースに対して高度な特異性を有してい
るが、一方炭水化物オキシダーゼは適当な基質としてグ
ルコースが挙げられるが、より広い基質特異性を有して
いる。グルコースの第２の炭素にある水酸基をケト基に
変換し得て、グルコース分子の他の基に実質的に影響を
及はさる。その様な酵素はグルコース−２−オキシダー
ぜ活性を有する酵素の１ｆ市として明記され得る。 適当な炭水化物オキシダーゼ酵素は微生物ポリポールス
オブッスス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｚ ０ｈｔｕｓｔｔｚ）
に由来するものである。グルコース−２−オキシダーゼ
の原料は他の数種の微生物、上記の軟体動物および紅藻
類を含む。これらの酵素およびその原料は単に示されて
いるだけで、本発明の範噴における適当な酵素およびそ
の原料をすべて包含していることを意味しない。 議論を容易にするために、本発明の種々の様相は特徴的
にしかし絶対的でなく、ポリポルスオプツスｘ （Ｐｏ
Ｌｙｐｏｒｗｚ ０ｈｔ１Ｌｓｒｂｓ）の適当な炭水化
物オキシダーゼおよびアスはルギルスオリザエのグルコ
ース−２−オキシダーゼを用いることに関連して述べら
れるであろう。微生物は常法により、常温で振とう、深
部培養を行う。酵素は撮とう、深ｍ培養条件下培養した
？葭生物の菌糸体から製造される。 本酵素はそのま〜の酵素でも用いられ得ろが、むしろ固
定化して用いられる。酵素の固定化工程はこの分野の専
門家によく知られたもので、処理あるいは未処理有機お
よび無機坦体の広範囲の表面の一部と酵素溶液を反応さ
せることよりなる。 はプチド、スチレン−塩基重合体、ポリペプチド、スチ
レン−塩基重合体、Ｉりはプチビ、スチレン−塩基重合
体、アガロース、セルロース、デキストラン、シリカ、
多孔性のガラス玉、活性炭あるいはカーボンブラック、
木材およびおがくず、水酸燐灰石および水酸化アルミニ
ウムあるいは水酸化チタンが含まれる。この形態の酵素
は安定性を増加し、耐久性および有用性および再生能力
を拡大する。固定化酵素を用いて行う反応はカラム中を
通すことあるいは反応タンクあるいは他の適当な反応器
中で行われ得る。 炭水化物オキシダーゼあるいはグルコース−２−オキシ
ダーゼ酵素に加えて、酸素原料が必要とされる。又、過
酸化水素の除去あるいは利用法が。 グルコースのＤ−グルコーランへの変換反応を最も効果
的に行うために必要である。このことは過酸化水素が酵
素分子のある決定的部位を酸化してその機能を損傷する
からである。過酸化水素を除去する処理は （１）酵素
カタラーゼによる分Ｍ（２）既知の化学的手法による分
解、そして（３）オキシドレダクターゼ酵素のための固
定化坦体と同じ酸化マンガンあるいはカーボンブラック
！ の如き分解用鋳型を用いて分解する。別の適当
な方法は生成した過酸化水素を分解するよりむしろ、貴
重な副産物を作るために消費されてもよい。上記図式に
示される通り、Ｄ−グルコーランの製造とプロピレンハ
ロヒドリンあるいはプロピレンオキシドの製造とを組合
せろことは好適実施例である。 グルコースからＤ−グルコーランへのｉｌｌ＃素による
変換は水溶液中、はｇ中性のｐＨで行われるのが望まし
いが、適当な緩衝液を用いて、ｐＨ領域約６から約８以
内で行われ得る。この変換は室温で行われるのが適当で
あるが、約１５℃から約６５℃の温度範囲で行われ得る
。気圧条件は大気圧が適当であるが大気圧以下あるいは
以上に変動することも出来る。化学的あるいは酵素的手
段でグルコースを製造するどんな炭水化物物質でも、Ｄ
−グルコーランへの変換およびフルクトース合成のため
のグルコースの適当な原料である。これらの物質は以下
のものを含むが、これらのみに限定されない：セルロー
ス、澱粉、庶粘、とうもろこしシロップ、ＨＦＣ５およ
びグルコースおよびフルクトースを種々の量比で含有す
る他のシロップ。 本発明の糖の分析のために用いられた分析法は以下に示
さ第１る： １、薄層クロマトグラフィー（’ｒ Ｌｃ ）。アビセ
ル被覆ガラス板で、イソプロパツール：ピリジン：酢酸
：水の容量比８：８：２：４の溶媒系で展開する。グル
コースおよびフルクトースはＲｆＱ、５〜０．６ ；
Ｄ−グルコーフンはＲｆＯ，４〜０．５の条痕をボす。 （ｉ（ｆ＝物質の原点からの移動距離／溶媒の原点から
先端までの距離）プレ（２％ＴＴＣ０，５Ｎ水酸化ナト
リウム溶液）を噴霧すると、Ｄ−グルコーランおよびフ
ルクトース両名とも即時赤色スポットを生ずる。グルコ
ースは１００℃１０分間加熱する時のみ赤色スポットを
生ずる。プレートにジフェニルアミン／アニリン／燐酸
／酢酸エチル試薬（０，１５，！ｉ’１０．８ｆｉｌ／
１１１１１／１００１／）を噴霧すると、グルコースは
褐色スポットを生ずる；Ｄ−グルコーランは紫色の条痕
を生ずる；およびフルクトースは９５°０１０分間加熱
する時黄色スポットを生ずる。 ２、高性能液体クロマトグラフイボ（ＨＰＬＧ）Ａ、ミ
ューボンダバック（μｍＢｏｎｔＬａｐａｋ ） −
炭水化物カラム〔ウォータースアソシエイッ（”１ｉａ
ｔｔｒｚＡｚｚａｃｉａｔｔｚ）社から請人した〕を０
．００１Ｍリン酸カリウム緩衝液（７）Ｈ７）を含む１
５％アセトニ） ＩＪル水溶液を用い２ ｍｌ ７分の
流速で展開する。 グルコースろＲｔ ｉｉ、５、Ｄ−グルコーランはＨｔ
１４、Ｄ、フルクトースはＲ１９，５（Ｒｔ −保持時
間）を有している。分析はウオータースアソシエイツ（
Ｗｔｔｔｇｒｚ Ａｚｚｏｃｉａｔａｚ） 屈折率検
出器およびシェラフェル（Ｓｃｈｏｇｆｆｇり波長可変
紫外線検出８ （１９２ｎｍ） の両者を用いて、ス
ペクトル物理エスピー８０ＤＯ機器（Ｅ３ｐ −ｅｃｔ
ｒａｐｈｙｓｉｃｓ ５ｐ８０００ ｔｎｚｔｒ蕎ｎ
ｉｇｎｔ）で実験される。 ３− 質量分析法（ＭＳ）。次の様な誘導体ｔａ工程が
揮発性化学成分を作るために使われる：（α） 凍結乾
燥した試料約１００！Ｉ！ｙへＮ、Ｎ−ジフェニルヒド
ラジン（Ｈ２ＮＮΦ、）１１０〜および７５％エタノー
ル水１ｄを加える０反応混合物を攪拌し、室温１夜放置
する。 （Ａｌ この反応混合物へ水６ｄを加え、生ずる沈澱
を遠心分離および煩悶により上澄から分離する。 この沈澱ヘビリジン−無水酢酸１：１混合液１ｄを加え
る。この反応混合物を３５°〜４０℃の水浴中に１５分
間放置し、時々振とうする。 （Ｃ１反応を停止するために水２ｄを加え、それから混
合物をエチルエーテル６１ずつで２回抽出する。このエ
ーテル液を少量の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、それか
らエーテルを穏やかに加熱しく〜４０℃）、窒素を吹き
つけて飛ばす。 （ｄ） 得られた固形物あるいはシロップを質量分析
のために準備する。 予想反応ニ ーＣＨＯ−ＧＨ＝ＮＮ９２ グルコースは５５６マス（Ｃ２８Ｈ３□Ｎ２０□。）に
分子イオン、１６Ｂマス（Ｎ馬イオンフラグメント）Ｋ
ｄ−スイオンを生ずる；フルクトースは６９０マス（
０１６Ｈ２゜０□１）ニ分子イオンを生ずる；Ｄ−グル
コーランは５１２マス（Ｃ！６Ｈ２８Ｎ２０９） に
分子イオンモして２２６マス（ＯＣ−ＣＨ＝Ｎ−Ｎ９□
イオンフラグメント）に強い、物像的なフラグメントイ
オンを生ずる。分析はフインニガン（Ｆｉｎｎｉ（／（
Ｌｎ’）ガスクロマトグラフィ−７７質量分析／濃度計
（ＧＣ／ＭＳ／ＤＳ ） 型式４０２３ 機器テ、７０
＃Ｖ −ａｔ子術撃イオン化、そして試料温度２２０
°で実験を行う。 ４、試験管比色分析６Ｄ−グルコース過剰量の存在下Ｄ
−グルコーランの分析は２種の比色法で容易に定量され
る。トリフェニルテトラゾリウムクロライ）’（Ｔ’ｌ
Ｃ）を用いて、２種の糖の還元速度の差に基ずく検出法
がある。２０ｄの試験管内に試料０．５ｄ、１鳴ＴＴＣ
水溶液０，１ｄ、および６ ＮＮａＯＨ［１，４ａｔを
加える。正確［５分後、酢酸；エタノール（１：９）１
５ｗｔｌを加え、試験管内容物を攪拌する。空試験とし
て水を使用し、ノミリアｙ （ｖａｒｉａｎ） ６３５
紫外／可視（ｔＪＶ／ＶＩＳ）スペクトロメーターを用
い、４８０ｎＮで吸光度を測定する。グルコースがＴＴ
Ｇを還元して赤色々ｆｔ、−ＩＪフェニルホルマザンに
するのはＤ−／ルコーランの等都より約１００倍も遅い
速度である。ジフェニルアミン／アニリン／リン酸試薬
を用いて行う検出法は糖の構造の違いにより異なる呈色
をすることに基いている。’１Ｏａｌの試験管に試料０
．２ ｍ／および次の試薬混合物を５ｔｔｔｌ加えるニ
ジフェニルアミン ０．１５．９アニリン
０．８０ Ｋ／燐酸 １１＃Ｉ
Ｚ 試験管を３７°の水浴中に６０分間入幻ておく。 グルコースでは黄色溶液となる；Ｄ−グルコーランでは
紫色溶液となる。 本発明の種々の分析的両点で用いられる純品の糖の出所
は以下の通りである： １、 Ｄ−グルコースはアプライド・サイエンス・ラ
ボラトリーズ（ｋｐｐｌｉｇｄ Ｓｃｉｇｎｃｇ Ｌａ
ｂｏｒａ−１ｏｒ＊ａｚ） から購入した９９％純品
。 ２、 Ｄ−フルクトースはアプライド・サイエンス・
ラボラトリ公ズから請人した９９％以上紳品。 ３、 Ｄ−グルコーランは次の方法により化学的九合
成されたニゲルコース２０ｇを氷酢酸２７１１／を含む
蒸留水１１と混合する。フェニルヒドラジン４４ｇを加
える。反応を攪拌器により激しく攪拌しながら８０℃で
６時間続け、その後竿、温まで一夜冷却する。固形物を
−Ｊ過し、１０％酢醐水で、次いでエチルエーテルで洗
滌する。固形′吻を真空乾燥基中５０℃で充分（で乾燥
する。実験収量はゲルコサシン１６．１ 、！ｉ’であ
る。このゲルコサシンを３１の三頚フラスコに入れ、エ
タノール４５９ｔ／、蒸留水７５０ｄおよび木酢ｒｉ
９ ａｔを加えろ。新製ばンツアルデヒ）’ ２７．８
９を加え、攪拌器により激しく攪拌しながら還流にまで
導く。この反応を５時間還流させ続けろ。コンデンサー
を逆にして、蒸留水（添加１斗を経由して）７５０１Ｒ
１をフラスコに加えながら、４５０ｄ蒸留する。本反応
を一夜冷却して、インクアルデヒドフェニルヒト９ラゾ
ンを沈澱させる。この溶液を濾過し、残漬を洗液が６明
になる迄、蒸留水（約１／）で洗滌する。 ｉ：ｊ液と洗液を５００ｍ／！まで濃縮し、エチルエー
テル３０ Ｑ ＊ｌずつで１０同抽出する。水溶液中に
ある残りのエチルエーテルを取り除くために、ロータリ
ーエバポレーターに移してろ０分留去する。 この水溶液は厳密にアセトンで洗やしたアンバーライト
（ＡｍｈｅｒＬｉｔｔ） Ｘ Ａ Ｄ −２を含む４Ｘ
１００爾のカラムＫＡ過させる。このカラムは残りのグ
ルコーランを除（ために、更に２００ｍ／！の水で洗滌
する。水溶液を集めて凍結乾燥する。グルコーランの実
験収量は３．４．！９（全体の収量１６％）。 次の実施例は本発明の種々の特徴を説明するが、しかし
付加した特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲
に限ることを意味するのでは全くない。もし他に指示が
ない場合、温度はすべて室温（約２５℃）であり、圧力
はすべて常圧（約１気圧である。 実施例１ 固定化炭水化物オキシダーゼを用いて、グルコースのＤ
−グルコーシンへの実質的に完全な変換がこの実施例で
示されている。 グルコース（２，１を１ＱＱａ／のパイレックス（Ｐｙ
ｙｔＩｚ） フラスコ中の蒸留水２［ＩＫ／へ加え、
この糖溶液を攪拌する。酸素ガスをフラスコ中へ吹き込
み、カタラーゼ〔シグマ化学（Ｓすｍａ Ｃんトｍ１ｃ
ａＬ ＧＯ，、）、 Ｃ−４０、牛の肝臓より製造〕３
〜を加える。培養液２００Ｋｔから以下の様に製造され
たアガロース固定化炭水化物オキシ（−ゼも又このフラ
スコ中に加虹る。 この酵素を製造するために、ポリボルスオブツスｘ （
ｐｏＬｙｐｏｒｕｚ ｏｂｔｔｔ、ｚｔＬｚ） Ａ Ｔ
ＣＣ＃２６７３３の菌糸体を以下の様に清母／麦芽エ
キス寒天斜面培地上に発育させる：酵母エキス（３ｇ）
、麦芽エキス（３ｇ）、寒天＜２０ｇ）、はプトン（５
Ｉ）およびグルコース（１０，！ｉ’）を蒸留水（１１
）中へ加え、そしてｐＨを６．７に調整する。培地を１
２１℃１５分間で滅菌する。ｐＨをそれから６．４に調
整する。この寒天斜面培地に菌を接種し７日間２５℃で
生育させる。この斜面で生育した菌を次に、上記の様に
（しかし寒天を加えずに）調整した酵母／麦芽エキス培
地（１２５ａｌ／のエルレアーｑイヤーフラ、ｔ、コ（
ＥｙＺｇｎｍｇｙｓｒ ｆｌａｓｋ）中培地２０ｄ）に
接種する。この菌は回転振とう器で２５℃９日間生育さ
せる。この培地をブフナー（Ｂｕｃｈｔ％ｇｒ）漏斗で
＃５４１ワットマン（ＶｉａｔｎＬａｎ）１紙を通して
吸引ｒ遇する。１紙上に保持された菌糸体圧この酵素が
含まれる。 培地４００ｄから得られた菌糸体をＰＨ７，０の０．０
５Ｎ燐酸カリ緩衝液７Ｑａ／を含むワーリングブレンダ
ー（Ｗａｒｉｎｇ ｈＺｔｎｉｇｒ）に入れ、３分間２
０分間遠沈し、上澄液を固形物から煩悶法で分１１ｔｆ
ル。５ＱＱ＊Ａ！のエルレンマイヤーフラスコに入れた
上澄液にポリエチレングリコール（分子量４０００）１
９．Ｖを加えて、溶液を３０分間撹拌する。それから懸
濁液を７００ Ｏｒｐｍ で２０分間遠心分離する。 上澄液を傾斜分離し棄てる。 ０．２Ｍ塩化ナトリウム１５ｍ／と０．０５Ｍ燐酸カリ
ウム緩衝液（３ｏＨ７，０） １５ａ／をこの沈澱物に
加え、撹拌する。溶液を３０分放置するとその間に沈澱
が生成する。この混合物を１４０００ ｒＰｍで２０分
間遠心分離する。細胞不含の純品の酵素を含む不透明な
白色上澄液が傾斜法で分離される。 この酵素のアガロースへの固定化は以下の様に行われる
：細胞不含の純品の酵素を蒸留水５００ｄに対して一晩
透析させろ。それから？りＨ８，Ｏで０．１Ｍ炭炭水水
素ナトリウム５ｌを加える。この溶液に活性化ＣＨ−セ
ファｏ −ス（Ｓｇｐｈａｒａｚｇ ）４Ｂ（洗滌し、
１ｙｘＭＨｃ／ ５０Ｑａ７を用いて半融グラスフィル
ター上、内膨潤させておく）を加える。 エンドオーバーエンドミキサー（ｇｒＬｄ−ｏｖｇｒ−
ａ３ｄ ｍｚｓｇｒ）を用いて、ゲル懸濁液を２５℃で
１時間攪拌する。それからゲル懸濁液を先ず０．１Ｍ炭
酸水素す） ＩＪウム（ＰＨ８，０）４０ｓ＋ｊで洗滌
し、次九０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪ
ス（Ｔｒｉ ＃ ）緩衝液（ｐＨ８，０）４ｏｙで、次
忙０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍ蟻酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ４，０）で洗滌する。 反応混合物のサンプルは伺か変化がある度に引出すれ、
グルコースとＤ−グルコーランの分析がなされた。ＨＰ
ＬＣを用いて、Ｒｔ １１．５分（グルコース）とＲ４
１４，０分（ｐ−グルコーラン）におけるピーク面積を
定量し、存在する糖の程度を計算する。次の様な結果が
得られた：１ １．２ ０．８
４０２ ０．５ Ｈ５７５ ３０，２Ｈ８９０ ４＜０．１ ＞１．９ ９９＋反応の全
経過を追って、グルコースのＤ−グル’：１−：／ｙへ
のＪ質的変換はＲｆ ０．５８（グルコース）のスポッ
トが消えて、Ｒｆ Ｏ，４３−０，４９（Ｄ−グルコー
ラン）のすじの出現にょっ
よる酸化により、フルクトース製造の中間体であるＤ−
グル）フンの製造方法に関する。 結晶性フルクトースのｒＳ業規模における候造面では種
々の重装な問題にｉｆ面して来た。これらの問題の最大
の一つは製造経費の点である。現在の発明に匹敵する唯
一の商業的に実行可能な生産方法は、先スグルコース（
グルコースイソメラーゼを用いるあるいはアルカリ異性
化を行うことにより）あるいは蔗糖（転化糖を経由して
）から、グルコース−フルクトース混合シロッフヲ生％
ｌ−ゲル、次に２種の糖を物理的に分離する（イオン交
換あるいは選択的カルシウム塩沈澱による）そして、最
終的に、水溶液中から結晶状（種を槽えるがメタノール
沈澱により） フルクトースを回収するという工程に基
すいている。２種の糖の物理的分離処理が必要とされる
。その理由はもし実質上すべてのイオン性物質、残余の
グルコースおよび他の夾雛物を除かない場合、結晶フル
クトースを水溶液から回収すること か最も困難であり
、しばしば不可能となるからである。その様な処理を行
うには費用がかさみ、それ故フルクトースに対する市場
価格が高いものになり一食用として角砂糖に太刀打ち出
来ない値段になる。 文献によればフルクトースはグルコーフンから低濃度で
あるが作られ得る。１８８９年という初酸水溶液中亜鉛
末で還元することにより生成された。にの還元は種々の
生体物質中のＤ−グルコーフンの検出用分析試験として
行われて来ている。 ８．１０．ｌｊ Ｄ−グルコーフンのＤ−フルクトー
スへの還元はナトリウムボロハイドライドでも達成サレ
る。Ｄ−〆ルコーランのフルクトースへの転換は一〇Ｈ
Ｏ→ＣＨ２Ｏを行う還元酵素が既知となって以来、実行
可能な酵素反応となった。 又グルコーフンがグルコースから低濃度作られ得るとい
う文献によれば、グルコースを酸化する。 種々の方法即ちＨ２０□４あるいは酢酸鋼５で行うもの
が報告されている。これらの反応それぞれにおいて変換
収量が低く（３０％以下）、多くの副生成物が出来てい
る。グルコースをＤ−グルコーフンへ変換するのは、先
ずグルコースの誘導体を製造しく例えばフェニルヒドラ
ジンと反応させゲルコサシン を作るか或はパラトルイ
ジンと反応させる）、それからその誘導体を化学的に処
理して、Ｄ−グルコーフンを製造するやり方で行って来
た。これらの反応では収率が５ｏｑｂ以上にならなかっ
たし、又試薬が回収不可能なため、市販の目的には高価
につき過ぎる。加うるに、芳香族化合物を含む試薬を使
用する麺と雛、食品としての品質の糖を得るために種々
の問題＆ 〜４１拳キ。 グルコースのＤ−グルコーフンへの変換は又酵素反応も
知られている。１９６２年、グルコースをＤ−グルコー
フンへ酸化するのに軟体動物の一種、サクシドームスギ
ガンテラス（ｓａｘｉｔＬｏｍｔＬｚ）！ｉすαｎｔｇ
ｏμＪＰ） という結晶状物を用いた記載がある。１
９！１７年に、Ｄ−グルコ−フンの製造が。 グルコース、澱粉、マルトースあるいは蔗糖を２種のか
び即ちアスはルギルスパラジテイクス（ｋｚｐａｒｇｉ
Ｌｌｕｚ ｐａｒａｚｉｔｉｃｕりおよびアスベルギス
フラプスーオリーザエ（ｋｚｐａｒｌｉｌｔｔＬｚ ｆ
ｌａｗ’ｓａｒｙｚｃＬｇ）の原形質離解物で酸化する
ことにより行われると報告された。１９５６年には、グ
ルコースのグルコーフンへの酵素による酸化が紅藻類の
一種イリドフイクスフラシドウム（ＩｒｉｄｏｐｋｙＷ
ｚｆＬａｃｃｉｔＬｕｍ）１０ により行われるとい
う報告があった。グルコースをＤ−グルコーフンに酸化
する炭水化物酸化酵素が坦子菌順ポリポルスオプッスス
（Ｐｏｔｙｐｏｒμｚ ｏｂｔｕルリの菌糸体から単離
された。 収率については貫及されていない。終りに、１９７８年
Ｋ、グルコース−２−酸化酵素活性が担子菌類、オウデ
マンシェラムシダ（ＯｔＬｄａｍａｎｚ ｉ ａ Ｚ
Ｌａルｃｉｄα）において、他の木材腐敗病菌類 と同
様に検出された。最上の収率が５ｏ％より高くなかった
。これらの場合すべてにおいてＤ−グルコーフンの生成
には過酸化水素の発生を伴うと信じられている。 下記の図式は本発明のＤ−グル５つ′ンを中心とする工
程図式である。 万ヤングー七 遠 凡 フルクトース 下記式はＤ−グルコースの分子構造式を表して〜・る。 Ｃ）ＩＯ −ｃ−ｏＨ ｏ−ｃ−Ｈ Ｈ−ｃ−ｏＨｔ −Ｃ−ＯＨ ０ＨＯ）（ 下記式はＤ−グルコーノンの分子構造式を表している。 ＯＨ０ Ｑ＝Ｑ ０−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ Ｈ−Ｃ−ＯＨＩｌ ＯＨＯＨ 下記式はＤ−フルクトースの分子Ｍ造式を表している。 Ｃ＝０ ！ ０−Ｃ−Ｈ −Ｃ−ＯＨ Ｈ−Ｃ−ＯＨＩ ＯＨＯＨ Ｄ−グルコーノンの分子構造式に関して、他の幾つかの
分子構造式が水溶液中で存在することが推定されること
が、この分野の専門家に認められるであろう。これらの
多くは型状構造式である。′・３こ−に用いられている
「グルコースＪ ｒＤ−グルコースｊおよび「デキスト
ローズｊという用語はこのモノサッカライドの溶液中あ
るいは乾燥状態のいずれの形態なも包含し、交代に用い
られる。 式１はグルコースを表わしている。 こへに用いられている「Ｄ−グルコーノン−１および「
Ｄ−アラビノ−２−へキソースウロース」の用語は交代
に用いられる。式■はＤ−グルコース／を表わしている
。 こ〜に用いられている「フルクトース」、「Ｄ−フルク
トース」および「レプロース」の用語はグルコースより
甘いグルコースの異性体に対して言うために交代に用い
られる。「結晶フルクトース」の語は無水状態における
このモノサッカライド９を包含する意味の応用で用いら
れる。式■はフルクトースを表わしている。 本発明によれば、一般的に言って、水溶液中におけるグ
ルコースは炭水化物オキシダーゼあるいはグルコース−
２−オキシダーゼの如き適当な酵素で、酵素的ＫＤ−グ
ルコーソラン変換される。 この変換は自発的に、急速にそして実質的に完全に進行
させられろ。Ｄ−グルコーノンは予め単離しておかずに
、適当な化学的水素化によってフルクトースへ変換され
る。この変換も又、急速にそして本質的に完全に進行さ
せられる。得られたフルクトースはグルコースおよび他
の糖類−ｔべてを実質的に含まない状態で、水溶液ある
いは固体かいずれかの形で回収される。 上記に言及され、参照された、グルコースからＤ−／ル
コーランへおよヒＤ−１’ルコーソンカラフルクトース
への低収塞の変換は科学文献で既知テアルが、グルコー
スからフルクトースを製造するこれらの２種の反応を結
合させる概念は現在まで他の文献に見られていない。加
うるに、経済的、商業的に有用な工程で、グルコースか
ら結晶フルクトースを製造するためこれらの２種の反応
を用いるのに成功したことは、我々の発明に先立って報
告されていない。グルコースからＤ−グルコーノンへの
変換もＤ−グルコ−フンからフルクトースへの変換のど
ちらの報告にも、グルコースから結晶フルクトースを製
造する概念は考察されていなかった。Ｄ−グルコーノン
は化学的標品として必要とされたので化学的に合成され
た。Ｄ−グルコーノンは生物系で、無意識的Ｋ（例えば
研究中に生化学経路における未知成分として）かあろ〜
・は意識的に（例えば血液中グルコースの生化学的酸化
の研究の一部として）発見された。Ｄ−グルコーノンは
Ｄ−グルコーノンの検出のためのＧまん点試験として、
フルクトースへ還元された。 本発明において得られたＤ−グルコ−ノンの収率はこの
酵素に対して文献に報告された収率を超えている。Ｄ−
グルコーランへの変換率が高いことにより、残余の未変
換グルコースな物理的に分離する必要がない。 数種のオキシド９レダクターゼはグルコースの２番目の
炭素にある水酸基を酸化することに関して、即ち水酸基
をケト基に酸化することを促進する、例えば式Ｉの構造
を弐Ｈの構造へ変換する如き触媒活性を有する。こ〜に
記した実施例における特別なオキシドレダクターゼ酵素
は［グルコース−２−オキシダーゼ」、［ピラノース−
２−オキシダーゼ］および［炭水化物オキシダーゼ」の
如き多種を意味するが、本発明はその様に示された酵素
に限定される訳ではない。グルコース−２−オキシダー
ゼは基質のグルコースに対して高度な特異性を有してい
るが、一方炭水化物オキシダーゼは適当な基質としてグ
ルコースが挙げられるが、より広い基質特異性を有して
いる。グルコースの第２の炭素にある水酸基をケト基に
変換し得て、グルコース分子の他の基に実質的に影響を
及はさる。その様な酵素はグルコース−２−オキシダー
ぜ活性を有する酵素の１ｆ市として明記され得る。 適当な炭水化物オキシダーゼ酵素は微生物ポリポールス
オブッスス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｚ ０ｈｔｕｓｔｔｚ）
に由来するものである。グルコース−２−オキシダーゼ
の原料は他の数種の微生物、上記の軟体動物および紅藻
類を含む。これらの酵素およびその原料は単に示されて
いるだけで、本発明の範噴における適当な酵素およびそ
の原料をすべて包含していることを意味しない。 議論を容易にするために、本発明の種々の様相は特徴的
にしかし絶対的でなく、ポリポルスオプツスｘ （Ｐｏ
Ｌｙｐｏｒｗｚ ０ｈｔ１Ｌｓｒｂｓ）の適当な炭水化
物オキシダーゼおよびアスはルギルスオリザエのグルコ
ース−２−オキシダーゼを用いることに関連して述べら
れるであろう。微生物は常法により、常温で振とう、深
部培養を行う。酵素は撮とう、深ｍ培養条件下培養した
？葭生物の菌糸体から製造される。 本酵素はそのま〜の酵素でも用いられ得ろが、むしろ固
定化して用いられる。酵素の固定化工程はこの分野の専
門家によく知られたもので、処理あるいは未処理有機お
よび無機坦体の広範囲の表面の一部と酵素溶液を反応さ
せることよりなる。 はプチド、スチレン−塩基重合体、ポリペプチド、スチ
レン−塩基重合体、Ｉりはプチビ、スチレン−塩基重合
体、アガロース、セルロース、デキストラン、シリカ、
多孔性のガラス玉、活性炭あるいはカーボンブラック、
木材およびおがくず、水酸燐灰石および水酸化アルミニ
ウムあるいは水酸化チタンが含まれる。この形態の酵素
は安定性を増加し、耐久性および有用性および再生能力
を拡大する。固定化酵素を用いて行う反応はカラム中を
通すことあるいは反応タンクあるいは他の適当な反応器
中で行われ得る。 炭水化物オキシダーゼあるいはグルコース−２−オキシ
ダーゼ酵素に加えて、酸素原料が必要とされる。又、過
酸化水素の除去あるいは利用法が。 グルコースのＤ−グルコーランへの変換反応を最も効果
的に行うために必要である。このことは過酸化水素が酵
素分子のある決定的部位を酸化してその機能を損傷する
からである。過酸化水素を除去する処理は （１）酵素
カタラーゼによる分Ｍ（２）既知の化学的手法による分
解、そして（３）オキシドレダクターゼ酵素のための固
定化坦体と同じ酸化マンガンあるいはカーボンブラック
！ の如き分解用鋳型を用いて分解する。別の適当
な方法は生成した過酸化水素を分解するよりむしろ、貴
重な副産物を作るために消費されてもよい。上記図式に
示される通り、Ｄ−グルコーランの製造とプロピレンハ
ロヒドリンあるいはプロピレンオキシドの製造とを組合
せろことは好適実施例である。 グルコースからＤ−グルコーランへのｉｌｌ＃素による
変換は水溶液中、はｇ中性のｐＨで行われるのが望まし
いが、適当な緩衝液を用いて、ｐＨ領域約６から約８以
内で行われ得る。この変換は室温で行われるのが適当で
あるが、約１５℃から約６５℃の温度範囲で行われ得る
。気圧条件は大気圧が適当であるが大気圧以下あるいは
以上に変動することも出来る。化学的あるいは酵素的手
段でグルコースを製造するどんな炭水化物物質でも、Ｄ
−グルコーランへの変換およびフルクトース合成のため
のグルコースの適当な原料である。これらの物質は以下
のものを含むが、これらのみに限定されない：セルロー
ス、澱粉、庶粘、とうもろこしシロップ、ＨＦＣ５およ
びグルコースおよびフルクトースを種々の量比で含有す
る他のシロップ。 本発明の糖の分析のために用いられた分析法は以下に示
さ第１る： １、薄層クロマトグラフィー（’ｒ Ｌｃ ）。アビセ
ル被覆ガラス板で、イソプロパツール：ピリジン：酢酸
：水の容量比８：８：２：４の溶媒系で展開する。グル
コースおよびフルクトースはＲｆＱ、５〜０．６ ；
Ｄ−グルコーフンはＲｆＯ，４〜０．５の条痕をボす。 （ｉ（ｆ＝物質の原点からの移動距離／溶媒の原点から
先端までの距離）プレ（２％ＴＴＣ０，５Ｎ水酸化ナト
リウム溶液）を噴霧すると、Ｄ−グルコーランおよびフ
ルクトース両名とも即時赤色スポットを生ずる。グルコ
ースは１００℃１０分間加熱する時のみ赤色スポットを
生ずる。プレートにジフェニルアミン／アニリン／燐酸
／酢酸エチル試薬（０，１５，！ｉ’１０．８ｆｉｌ／
１１１１１／１００１／）を噴霧すると、グルコースは
褐色スポットを生ずる；Ｄ−グルコーランは紫色の条痕
を生ずる；およびフルクトースは９５°０１０分間加熱
する時黄色スポットを生ずる。 ２、高性能液体クロマトグラフイボ（ＨＰＬＧ）Ａ、ミ
ューボンダバック（μｍＢｏｎｔＬａｐａｋ ） −
炭水化物カラム〔ウォータースアソシエイッ（”１ｉａ
ｔｔｒｚＡｚｚａｃｉａｔｔｚ）社から請人した〕を０
．００１Ｍリン酸カリウム緩衝液（７）Ｈ７）を含む１
５％アセトニ） ＩＪル水溶液を用い２ ｍｌ ７分の
流速で展開する。 グルコースろＲｔ ｉｉ、５、Ｄ−グルコーランはＨｔ
１４、Ｄ、フルクトースはＲ１９，５（Ｒｔ −保持時
間）を有している。分析はウオータースアソシエイツ（
Ｗｔｔｔｇｒｚ Ａｚｚｏｃｉａｔａｚ） 屈折率検
出器およびシェラフェル（Ｓｃｈｏｇｆｆｇり波長可変
紫外線検出８ （１９２ｎｍ） の両者を用いて、ス
ペクトル物理エスピー８０ＤＯ機器（Ｅ３ｐ −ｅｃｔ
ｒａｐｈｙｓｉｃｓ ５ｐ８０００ ｔｎｚｔｒ蕎ｎ
ｉｇｎｔ）で実験される。 ３− 質量分析法（ＭＳ）。次の様な誘導体ｔａ工程が
揮発性化学成分を作るために使われる：（α） 凍結乾
燥した試料約１００！Ｉ！ｙへＮ、Ｎ−ジフェニルヒド
ラジン（Ｈ２ＮＮΦ、）１１０〜および７５％エタノー
ル水１ｄを加える０反応混合物を攪拌し、室温１夜放置
する。 （Ａｌ この反応混合物へ水６ｄを加え、生ずる沈澱
を遠心分離および煩悶により上澄から分離する。 この沈澱ヘビリジン−無水酢酸１：１混合液１ｄを加え
る。この反応混合物を３５°〜４０℃の水浴中に１５分
間放置し、時々振とうする。 （Ｃ１反応を停止するために水２ｄを加え、それから混
合物をエチルエーテル６１ずつで２回抽出する。このエ
ーテル液を少量の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、それか
らエーテルを穏やかに加熱しく〜４０℃）、窒素を吹き
つけて飛ばす。 （ｄ） 得られた固形物あるいはシロップを質量分析
のために準備する。 予想反応ニ ーＣＨＯ−ＧＨ＝ＮＮ９２ グルコースは５５６マス（Ｃ２８Ｈ３□Ｎ２０□。）に
分子イオン、１６Ｂマス（Ｎ馬イオンフラグメント）Ｋ
ｄ−スイオンを生ずる；フルクトースは６９０マス（
０１６Ｈ２゜０□１）ニ分子イオンを生ずる；Ｄ−グル
コーランは５１２マス（Ｃ！６Ｈ２８Ｎ２０９） に
分子イオンモして２２６マス（ＯＣ−ＣＨ＝Ｎ−Ｎ９□
イオンフラグメント）に強い、物像的なフラグメントイ
オンを生ずる。分析はフインニガン（Ｆｉｎｎｉ（／（
Ｌｎ’）ガスクロマトグラフィ−７７質量分析／濃度計
（ＧＣ／ＭＳ／ＤＳ ） 型式４０２３ 機器テ、７０
＃Ｖ −ａｔ子術撃イオン化、そして試料温度２２０
°で実験を行う。 ４、試験管比色分析６Ｄ−グルコース過剰量の存在下Ｄ
−グルコーランの分析は２種の比色法で容易に定量され
る。トリフェニルテトラゾリウムクロライ）’（Ｔ’ｌ
Ｃ）を用いて、２種の糖の還元速度の差に基ずく検出法
がある。２０ｄの試験管内に試料０．５ｄ、１鳴ＴＴＣ
水溶液０，１ｄ、および６ ＮＮａＯＨ［１，４ａｔを
加える。正確［５分後、酢酸；エタノール（１：９）１
５ｗｔｌを加え、試験管内容物を攪拌する。空試験とし
て水を使用し、ノミリアｙ （ｖａｒｉａｎ） ６３５
紫外／可視（ｔＪＶ／ＶＩＳ）スペクトロメーターを用
い、４８０ｎＮで吸光度を測定する。グルコースがＴＴ
Ｇを還元して赤色々ｆｔ、−ＩＪフェニルホルマザンに
するのはＤ−／ルコーランの等都より約１００倍も遅い
速度である。ジフェニルアミン／アニリン／リン酸試薬
を用いて行う検出法は糖の構造の違いにより異なる呈色
をすることに基いている。’１Ｏａｌの試験管に試料０
．２ ｍ／および次の試薬混合物を５ｔｔｔｌ加えるニ
ジフェニルアミン ０．１５．９アニリン
０．８０ Ｋ／燐酸 １１＃Ｉ
Ｚ 試験管を３７°の水浴中に６０分間入幻ておく。 グルコースでは黄色溶液となる；Ｄ−グルコーランでは
紫色溶液となる。 本発明の種々の分析的両点で用いられる純品の糖の出所
は以下の通りである： １、 Ｄ−グルコースはアプライド・サイエンス・ラ
ボラトリーズ（ｋｐｐｌｉｇｄ Ｓｃｉｇｎｃｇ Ｌａ
ｂｏｒａ−１ｏｒ＊ａｚ） から購入した９９％純品
。 ２、 Ｄ−フルクトースはアプライド・サイエンス・
ラボラトリ公ズから請人した９９％以上紳品。 ３、 Ｄ−グルコーランは次の方法により化学的九合
成されたニゲルコース２０ｇを氷酢酸２７１１／を含む
蒸留水１１と混合する。フェニルヒドラジン４４ｇを加
える。反応を攪拌器により激しく攪拌しながら８０℃で
６時間続け、その後竿、温まで一夜冷却する。固形物を
−Ｊ過し、１０％酢醐水で、次いでエチルエーテルで洗
滌する。固形′吻を真空乾燥基中５０℃で充分（で乾燥
する。実験収量はゲルコサシン１６．１ 、！ｉ’であ
る。このゲルコサシンを３１の三頚フラスコに入れ、エ
タノール４５９ｔ／、蒸留水７５０ｄおよび木酢ｒｉ
９ ａｔを加えろ。新製ばンツアルデヒ）’ ２７．８
９を加え、攪拌器により激しく攪拌しながら還流にまで
導く。この反応を５時間還流させ続けろ。コンデンサー
を逆にして、蒸留水（添加１斗を経由して）７５０１Ｒ
１をフラスコに加えながら、４５０ｄ蒸留する。本反応
を一夜冷却して、インクアルデヒドフェニルヒト９ラゾ
ンを沈澱させる。この溶液を濾過し、残漬を洗液が６明
になる迄、蒸留水（約１／）で洗滌する。 ｉ：ｊ液と洗液を５００ｍ／！まで濃縮し、エチルエー
テル３０ Ｑ ＊ｌずつで１０同抽出する。水溶液中に
ある残りのエチルエーテルを取り除くために、ロータリ
ーエバポレーターに移してろ０分留去する。 この水溶液は厳密にアセトンで洗やしたアンバーライト
（ＡｍｈｅｒＬｉｔｔ） Ｘ Ａ Ｄ −２を含む４Ｘ
１００爾のカラムＫＡ過させる。このカラムは残りのグ
ルコーランを除（ために、更に２００ｍ／！の水で洗滌
する。水溶液を集めて凍結乾燥する。グルコーランの実
験収量は３．４．！９（全体の収量１６％）。 次の実施例は本発明の種々の特徴を説明するが、しかし
付加した特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲
に限ることを意味するのでは全くない。もし他に指示が
ない場合、温度はすべて室温（約２５℃）であり、圧力
はすべて常圧（約１気圧である。 実施例１ 固定化炭水化物オキシダーゼを用いて、グルコースのＤ
−グルコーシンへの実質的に完全な変換がこの実施例で
示されている。 グルコース（２，１を１ＱＱａ／のパイレックス（Ｐｙ
ｙｔＩｚ） フラスコ中の蒸留水２［ＩＫ／へ加え、
この糖溶液を攪拌する。酸素ガスをフラスコ中へ吹き込
み、カタラーゼ〔シグマ化学（Ｓすｍａ Ｃんトｍ１ｃ
ａＬ ＧＯ，、）、 Ｃ−４０、牛の肝臓より製造〕３
〜を加える。培養液２００Ｋｔから以下の様に製造され
たアガロース固定化炭水化物オキシ（−ゼも又このフラ
スコ中に加虹る。 この酵素を製造するために、ポリボルスオブツスｘ （
ｐｏＬｙｐｏｒｕｚ ｏｂｔｔｔ、ｚｔＬｚ） Ａ Ｔ
ＣＣ＃２６７３３の菌糸体を以下の様に清母／麦芽エ
キス寒天斜面培地上に発育させる：酵母エキス（３ｇ）
、麦芽エキス（３ｇ）、寒天＜２０ｇ）、はプトン（５
Ｉ）およびグルコース（１０，！ｉ’）を蒸留水（１１
）中へ加え、そしてｐＨを６．７に調整する。培地を１
２１℃１５分間で滅菌する。ｐＨをそれから６．４に調
整する。この寒天斜面培地に菌を接種し７日間２５℃で
生育させる。この斜面で生育した菌を次に、上記の様に
（しかし寒天を加えずに）調整した酵母／麦芽エキス培
地（１２５ａｌ／のエルレアーｑイヤーフラ、ｔ、コ（
ＥｙＺｇｎｍｇｙｓｒ ｆｌａｓｋ）中培地２０ｄ）に
接種する。この菌は回転振とう器で２５℃９日間生育さ
せる。この培地をブフナー（Ｂｕｃｈｔ％ｇｒ）漏斗で
＃５４１ワットマン（ＶｉａｔｎＬａｎ）１紙を通して
吸引ｒ遇する。１紙上に保持された菌糸体圧この酵素が
含まれる。 培地４００ｄから得られた菌糸体をＰＨ７，０の０．０
５Ｎ燐酸カリ緩衝液７Ｑａ／を含むワーリングブレンダ
ー（Ｗａｒｉｎｇ ｈＺｔｎｉｇｒ）に入れ、３分間２
０分間遠沈し、上澄液を固形物から煩悶法で分１１ｔｆ
ル。５ＱＱ＊Ａ！のエルレンマイヤーフラスコに入れた
上澄液にポリエチレングリコール（分子量４０００）１
９．Ｖを加えて、溶液を３０分間撹拌する。それから懸
濁液を７００ Ｏｒｐｍ で２０分間遠心分離する。 上澄液を傾斜分離し棄てる。 ０．２Ｍ塩化ナトリウム１５ｍ／と０．０５Ｍ燐酸カリ
ウム緩衝液（３ｏＨ７，０） １５ａ／をこの沈澱物に
加え、撹拌する。溶液を３０分放置するとその間に沈澱
が生成する。この混合物を１４０００ ｒＰｍで２０分
間遠心分離する。細胞不含の純品の酵素を含む不透明な
白色上澄液が傾斜法で分離される。 この酵素のアガロースへの固定化は以下の様に行われる
：細胞不含の純品の酵素を蒸留水５００ｄに対して一晩
透析させろ。それから？りＨ８，Ｏで０．１Ｍ炭炭水水
素ナトリウム５ｌを加える。この溶液に活性化ＣＨ−セ
ファｏ −ス（Ｓｇｐｈａｒａｚｇ ）４Ｂ（洗滌し、
１ｙｘＭＨｃ／ ５０Ｑａ７を用いて半融グラスフィル
ター上、内膨潤させておく）を加える。 エンドオーバーエンドミキサー（ｇｒＬｄ−ｏｖｇｒ−
ａ３ｄ ｍｚｓｇｒ）を用いて、ゲル懸濁液を２５℃で
１時間攪拌する。それからゲル懸濁液を先ず０．１Ｍ炭
酸水素す） ＩＪウム（ＰＨ８，０）４０ｓ＋ｊで洗滌
し、次九０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭＩＪ
ス（Ｔｒｉ ＃ ）緩衝液（ｐＨ８，０）４ｏｙで、次
忙０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍ蟻酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ４，０）で洗滌する。 反応混合物のサンプルは伺か変化がある度に引出すれ、
グルコースとＤ−グルコーランの分析がなされた。ＨＰ
ＬＣを用いて、Ｒｔ １１．５分（グルコース）とＲ４
１４，０分（ｐ−グルコーラン）におけるピーク面積を
定量し、存在する糖の程度を計算する。次の様な結果が
得られた：１ １．２ ０．８
４０２ ０．５ Ｈ５７５ ３０，２Ｈ８９０ ４＜０．１ ＞１．９ ９９＋反応の全
経過を追って、グルコースのＤ−グル’：１−：／ｙへ
のＪ質的変換はＲｆ ０．５８（グルコース）のスポッ
トが消えて、Ｒｆ Ｏ，４３−０，４９（Ｄ−グルコー
ラン）のすじの出現にょっ
【も又示され、ＴＴＣの試験
管比色分析を用いて、反応の経過と共ＦＣ４８Ｑ ｒｈ
ｒｎの吸収の増加により示される。 生成物が確実にＤ−グルコーランであるということは前
述の通り質量分析により追跡したフラグメンテーション
によって確められる。 ５１２マス（分子イオン）と２２６マス（ＯＣ−ＣＨ＝
Ｎ−Ｎ９イ万ンフラグメント）における特檄的なり一グ
ルコーフンのマスイオンがこの生成物に対し得られる。 実施例■ 本実施例はグルコース−２−オキシダーゼを用いて、ク
ルコースをＤ−グルコーフンへ本質的に完全な酵素的変
換を行うことを示す。 実施例■（固定化坦体としてアガロースを用う）の反応
と条件を、炭水化物オキシダーゼに代ってグルコース−
２−オキシダーゼを用いて繰返す。 反応開示５時間後、９９％以上のグルコースがＤ−グル
コーランへ変換された。 グルコース−２−オキシダーゼ酵素を作るために、アス
ベルギルスオリザエＡＴＴＣ＃７２５２の菌糸体培養を
以下の如き牛、酵母エキス／トリプトン培地で行う：牛
エキス（５ｇ）、酵母エキス（５ｇ）、トリプトン（６
ｇ）、デキストローズ（ＩＩりおよびディフコ（Ｄτｆ
ＣＯ）澱粉（２１）を蒸留水（１１）中に加え、ｐＨを
７．６に調整する。培地を１２１℃で３５分滅菌する。 常法で得られた胞子を用いて、培地に約６×１０ 胞子
／ｄの量接種し、回転振とう機（１８０ｒｐｍ＞でろＯ
℃２日間生育させる。この培養物を＃５４１ワットマン
１紙でブフナーｆ斗を用いて吸引ｆ過し、水で数回洗滌
する。１紙に残った菌糸体にこの酵素が含まれろ。 本酵素の精製および固定化は実施例Ｉの処理を用いて進
め得る。 して炭水化物オキシダーゼとグルコースのＲ応ＶＣよっ
て生成する遊離の過酸化水素のレベルをカタラーゼによ
り過酸化水素を分解して最低にさせた。 遊離の過酸化水素のレベルを最低にする他の方法は適当
な（有益な）副産物を生産する過酸化水素利用反応にこ
の生成法を結びつけることである。 本実施例において、過酸化水素の生成をプロピレン−ブ
ロモヒドリン（著者のアメリカ特許出願第３．９，３３
７号および米国特許第４．２４ス６４１号に詳述された
理論によりプロピレンオキシビ合成の中間体である）の
製造と結びつける。グルコースとポリポルスオブツスス
ＡＴＣ（４２６７３３の固定化した炭水化物オキシダー
ゼと処理して、Ｄ−グルコーランと過酸化水素を生成す
る反応はブロマイドとプロピレンの存在下コラリーナ種
（ＣＯｒａＬｉｒＬａｒｐ、）から得た固定化した海藻
・ξ−オキシダーゼの反応と結合させることにより、プ
ロピレンブロモヒドリンを生成する。それからこの結合
反応の最終結果はフルクトースの製造のためノクルコー
ランと特許出願第３９．３３：ｌおよび第４２，２１９
号に記した通り容易にプロピレンオキシドに変化しやす
いプロピレンブロモヒドリンの共同生産である。過酸化
水素の生成と連合してグルコースの炭素２の水酸基を酸
化しうるどんな酵素でも、著者の先行の参考文献である
出願中の特許の数えに従って、アルケン−ハロヒドリン
製造のために用いられる複合物とハロゲン化用過酸化酵
素とを結合することが出来る。 細胞不含の精製海藻パーオキシダーゼ酵素は以下の様に
製造される。 カリホルニアのラジョラ（Ｌα）ａｌｌα）海岸沿いで
得られたカロリナＮ （ＧｏｒａＬｉｎａ ＪＰ７）、
） をビルテイス（■１ｒｔｉｓ） ４５ホモゲナイ
ザーに入れ蒸留水中５分間摩砕する。均質化物を２０．
００ Ｏｒｐｍ２０分間遠心機にかけろ。上置を傾斜法
で移し保存する。残漬の塊を蒸留水で再懸濁し再度遠沈
する。この上澄と耐■の上置ケ合する。この溶液を硫酸
アンモニウムを加えて、先ず６６俤、次に５５％飽和に
する。遠沈および塊の分離の操作を各段Ｆｉ［’行５゜
この６３％〜５５％の塊のフラクション−＆ＤＥＡＫカ
ラムにがけ、０．３ Ｍから１Ｍリン酸緩衝液（７）Ｈ
６，Ｏ）を用いてこう配溶出を行う。 １Ｍ濃度で溶出したフラクションを２０ ｍ Ｍリン酸
緩衝液（ＰＨ６）に対して一夜透析を行う。 固定化された海藻／ξミーオキシダーゼ以下の様に製造
するニ ガラスピーズ（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） より入手、
ＰＧ−７００−２００）を脱イオン水１８ｇＬＩ！中ガ
ラスピーズ１ｇを懸濁するごとにより活性化させろ。 １０％（容（１／容量）α−アミノプロピルトリエトキ
シシラン２ｄ加え、混合物のｐＨを６ ＮＨＣｌで３〜
５に調整する。混１合物を７５℃２時間振とうする。ガ
ラスピーズを８０℃−夜真空乾燥スル。 上記の・…り製造した柁季゛ノカロリナ種（ＣｏｒαＬ
Ｌｎα＃Ｐ、）酵素６．２フおよび水溶性カルボジイミ
ド５０〜をガラスピーズに加えろ。ｐＨを４．５ Ｋ調
整し、混合物を４℃−夜振とりする。この生成物（酵素
被覆ビーズ）を水洗する。このものの活性は２モノクロ
ロジメドン単位／ビーズの重量ｇとして測定される。 アガロースに固定化した炭水化物オキシダーゼは実施例
Ｉと同様、細胞不含精製酵素１０ａｌから製造される。 次の様な成分を含む反応混合物を１００ａｌ１７．Ｊイ
レツクスフラスコ中に一整よる： α）海藻パーオキシダーゼ被覆ガラスピーズ、１ｇ、 ｂ）上記の如く製造した固定化炭水化物オキシダーゼ、 Ｃ）臭化カリ８００ＩＩｇおよび ｄ）０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）２
０＠ｌ。 このフラスコにプロピレンと酸素の両者を連続的に吹き
込む。この反応を２ｇ−のグルコースで開始する。２０
時間後反応液から試料を採取し、残漬のグルコース、Ｄ
−グルコーラン、およびプロピレンブロモヒドリンに対
して分析を行う。製造したプロピレンブロモヒト１リン
は以下の様に分反応混合物５μｌをヘラレット・パラカ
ード（ＨｅｗｎＬｇｔｔ−ｐａｃｋａｒｄ）型式４０２
ガスクロマトグラフに６−フィート×稀インチのガラス
カラムにボラパック＜Ｐａｒａｐａｋ） Ｒ（８０／
１００メツシユ）をつめたものへ注入する。流速はヘ
リウムガスに対し３０１／分に調整し、カラム温度２０
０℃にする。プロピレンブロモヒドリンの保持時間は１
−ブロモ−２−プロパツールは９分、２−ブロモー１−
プロパツールは１０分である。 生成物の同定はプロピレンブロモヒドリンの標品と比較
することにより確認する：１−ブロモー２−ｉａパノー
ルはブラシノ・エンド・バクニル社（ＰｆａＬｔｚ ａ
ｒＬｄ、 ＢｃＬａｇｒ、ＩｙｃＣ，）から購入された
もの。２−ブロモ−１−プロパツールは１−ブロモプロ
ピオニルクロライドの水素化リチウムアルミニウム還元
により合成されイ】。反応生成物と標品は同−保持時間
と同一質量分析結果を不す：臭素は等しい強度のＭおよ
びＭ＋２同位元素群の存在により同定される：異性体の
両者に対する分子イオンはイソブタン試薬のガスで化学
的にイオン化させることにより確められる（Ｍ”；ｍ７
ｇ１３８十１４０）；１−ブロモ−２−プロパツール九
対する主なフラグメンテーションはＣ）（２Ｂｒが失わ
れたと予測されろフラグメントで、一方２−ブロモ〜１
−プロパツールでは主なフラグメンテーションはＧＨｓ
ＣＨＢ ｒの欠損と予測されるものである。 試料の分析結果により、グルコースがらＤ−グルコーラ
ンへの変換は９９係以上であり、プロピレンブロモヒド
リン製造は２０．９ｆｆｉ ／ｌであると見積られる。 この実施例は、実施例■で示された概念を更に詳しく説
明することに役立つものである。この場合は固定化グル
コース−２−オキシダーゼを固定化炭水化物オキシダー
ゼにおき替えている。 固定化海藻パーオキシダーゼ酵素は実施例■と同様に製
造されろ。固定化グルコース−２−オキシダーゼは実施
例■におけると同様製造される。 反応器１合物は実施例■と同様に、固定化炭水化物オキ
シダーゼの代りに固定化グルコース−２−オキシダーゼ
におき替えてつくられろ、２０時間後、反応物から試料
を採取して残余のグルコース、Ｄ−グルコーラン、およ
ヒフロピレンブロモヒドリンに対する分析を行う。この
結果はグルコースのＤ−グルコーランへの変換側１９９
％以上、プロピレンブロモヒドリン製造は１９５ｇ−／
ｌ であることが示された。 本実施例はカラムの反応４中固定化炭水化物オキシダー
ゼを用いて長い反応時間をかけてグルコースのＤ−グル
コーランへ高収量で変換することを欣明する。 実施例Ｉと同様に製造した炭水化物オキシダーゼ（細胞
不含、Ｎ製酵素） （１０Ｒ／）を以下の様 −に水酸
化燐灰石（リン酸水素カルシウム）に固定化する： 細胞不含の精製酵素１００ｄに水酸化燐灰石２０ｇの１
ｍＭｍ酸力ＩＪウム緩ｆｆｆ［（ＰＨ７，０）１ＱＱｓ
ｔ／溶液を加えろ。混合物を６０分攪拌し、それから煩
悶法により固形物を液体から分離する。 そして固形物を先ず１ＯＮＭの燐酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）２００＋／で、次イテ蒸留水２００ｄで洗滌
する。 それからこの物質をガラスカラム（０，５（１１１Ｘ４
、５ ｃｗｒ ）につめろ。１％グルコース溶液をこの
カラムに１時間１．５１の流速で流す。溶出液を残余１
７）クルコースおよび生成したＤ−グルコーフンの検出
のため定期的に分析する。 ５日間連続的に流した溶出液では、グルコースのＤ−グ
ルコーフンへの変換が９５係以上であったことを示した
。過酸化水素は検出されな、かった。 本研究は酵素の真の半減期を定量する前に終了してしま
った。この実験のように緩慢な流出速度においては、酸
素の利用と過酸化水素を蓄積させない点の両ｆＪ”クル
コースのＤ−グルコ−フンへの実質的に完全な変換へ導
（きめ手となる。この場合は坦体の母体である、水酸化
燐灰石か過酸化水１、を分解させた。 １、 ＳｐｇｃｉａＬｉｚｇｄ ＳｔＬｇａｒｙ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ＦｏｏｄＸｎｄｕｔｔｒｙ、ｍｅｒｉｔ
ｅｄ、ｂｙ Ｊａαｔｓｎｇ Ｇ、 Ｊｏｈｎｔｏｎ
。 Ｎｏｙａｚ Ｄａｔａ Ｇｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、
１，９７６． ｐｐ。 １３０−２０１゜ ２、 Ｇ、Ｒ，Ｂｓｃｋａｒ ａｎｃＬ Ｃ，Ｅ、Ｍ
ｃＬｙ、 Ｊ、 Ａｍａｒ。 Ｇｈａｍ、Ｓｏｃ、、７１．１４９１（１９４９）。 ３、Ｆ、 ｐｇｔｕｇＬｙ、 Ｍｏｎａｔｚｃｈ、ｆｕ
ｒ Ｇｈｇｍ、、 ３３゜７６５（１９５２）。 ４、 Ｒ，５ａＬｂｙ、 Ｍ、ｆｉ、、ＭｏｒｒｔＬ
Ｌ ａｎｄ Ｊ、Ｍ、Ｃｒｏｆｔｚ。 Ｊ、ＣＡｇ１１Ｌ、 Ｓａｃ、、７５．７８７（１８
９９） 。 ５、 Ｗ、Ｌ、Ｆ、ｖｅＬ＋ｓｚ、 Ｗ、Ｄ、Ｎ１ｃ
ｏＬＬ、 Ｇ、 Ｃ，５ｔｒｏｕ、ｚｅａｎｄ Ｇ、Ｙ
！Ｊ、Ｗａｒｔｎｇ、 Ｊ、ｆｉ、ｍａｒ、 Ｇｈａ
ｍ、 Ｓａｃ、。 ５０．２２６７（１９２８）。 ５、 ｋｄｖａｒ＆ｃｔｚ ｔｎ Ｃｒａｒｈｏ
ｈｙｃＬｒａｔｇ Ｇｈｅｒｎｉｚｔｒｙ。 ＶＯｎ、 ｌ［、ｇｃＬｉｔｇｃＬ ｂｙ Ｍ、
Ｌ、 ＷＯＬｆｒｏｍ。 １９５６．７’７’・４３″″９６・ ７、 Ｈ，Ｊ、Ｈａｓｐ ａｎｄ Ｐ、 Ｓ
ｃルｌｉｍｒｎａｒ、 Ｌｉｅｂｉｇｓ（１９３３）
。 ９、 Ｇ、Ｒ，Ｂｏｎｄ、 ＦＪ、 Ｃ，Ｋｎｉ、
ｑｈｔ ａｒＬｄ Ｔ、 Ｋ。 ＷａＬｋｇｒ、 Ｂｉｏｃｈｔｍ Ｊ、、 ３１．
１０３３（１９３７）。 １０、 Ｒ，Ｇ、 ＢｇａｒＬａｎｔｉ Ｗ、 Ｚ
、 Ｈａｚｚｉｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ。 １２４．１７１（１９５６）。 １１、 Ｆ、 Ｗ、 Ｊａｎｉｓ＃ｒＬｔｘｎｄ Ｈ
，Ｗ、 ＲｕｔＬ＊ｗｚＢｉｏｃｈｅｔｎ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｚ、 ｋｃ’ｔａ、 １６７、 ５Ｑ１（１９６８
）。 １２、 Ｊ、 Ｖｏｔｃ、 Ｍ、 Ｗｕｒｚｔ ａｒ
ＬｃＬ Ｖ、 ＭｔｂｚｉＬｇｋ。 １３、 Ｂ、Ｎ、Ｗｈｉｔｇ ａｎｔｉ Ｒ，Ｇ
ａｒｕｂｇＬＬｉ。 Ｋ、ＫｉａｚＬｉｃｈ、Ｃｒｔｏｒｇ Ｔルｒａｔｎ
ｇ ＰｔＬｈＬｉｚルｔｒｙ。 ＳｔｔＬｔｔｇａｒｔ、 １９７６、ｐｐ、２７９−
２８０゜１５、 Ｕ、 Ｓ、 ＰａｔｇｒＬｔ ＠ろ
、０５０．４４４；Ａ、Ｇ。 ＨａＬｚｔｔｉｎＣ１９６２） 。 １６゜ Ｚ、 Ｄｉｗｎｊａｋ ａｎｄ−Ｍ、
Ｄ、 ＬｉＬＬｙ。 ７３７−７３９（１９７６）。
管比色分析を用いて、反応の経過と共ＦＣ４８Ｑ ｒｈ
ｒｎの吸収の増加により示される。 生成物が確実にＤ−グルコーランであるということは前
述の通り質量分析により追跡したフラグメンテーション
によって確められる。 ５１２マス（分子イオン）と２２６マス（ＯＣ−ＣＨ＝
Ｎ−Ｎ９イ万ンフラグメント）における特檄的なり一グ
ルコーフンのマスイオンがこの生成物に対し得られる。 実施例■ 本実施例はグルコース−２−オキシダーゼを用いて、ク
ルコースをＤ−グルコーフンへ本質的に完全な酵素的変
換を行うことを示す。 実施例■（固定化坦体としてアガロースを用う）の反応
と条件を、炭水化物オキシダーゼに代ってグルコース−
２−オキシダーゼを用いて繰返す。 反応開示５時間後、９９％以上のグルコースがＤ−グル
コーランへ変換された。 グルコース−２−オキシダーゼ酵素を作るために、アス
ベルギルスオリザエＡＴＴＣ＃７２５２の菌糸体培養を
以下の如き牛、酵母エキス／トリプトン培地で行う：牛
エキス（５ｇ）、酵母エキス（５ｇ）、トリプトン（６
ｇ）、デキストローズ（ＩＩりおよびディフコ（Ｄτｆ
ＣＯ）澱粉（２１）を蒸留水（１１）中に加え、ｐＨを
７．６に調整する。培地を１２１℃で３５分滅菌する。 常法で得られた胞子を用いて、培地に約６×１０ 胞子
／ｄの量接種し、回転振とう機（１８０ｒｐｍ＞でろＯ
℃２日間生育させる。この培養物を＃５４１ワットマン
１紙でブフナーｆ斗を用いて吸引ｆ過し、水で数回洗滌
する。１紙に残った菌糸体にこの酵素が含まれろ。 本酵素の精製および固定化は実施例Ｉの処理を用いて進
め得る。 して炭水化物オキシダーゼとグルコースのＲ応ＶＣよっ
て生成する遊離の過酸化水素のレベルをカタラーゼによ
り過酸化水素を分解して最低にさせた。 遊離の過酸化水素のレベルを最低にする他の方法は適当
な（有益な）副産物を生産する過酸化水素利用反応にこ
の生成法を結びつけることである。 本実施例において、過酸化水素の生成をプロピレン−ブ
ロモヒドリン（著者のアメリカ特許出願第３．９，３３
７号および米国特許第４．２４ス６４１号に詳述された
理論によりプロピレンオキシビ合成の中間体である）の
製造と結びつける。グルコースとポリポルスオブツスス
ＡＴＣ（４２６７３３の固定化した炭水化物オキシダー
ゼと処理して、Ｄ−グルコーランと過酸化水素を生成す
る反応はブロマイドとプロピレンの存在下コラリーナ種
（ＣＯｒａＬｉｒＬａｒｐ、）から得た固定化した海藻
・ξ−オキシダーゼの反応と結合させることにより、プ
ロピレンブロモヒドリンを生成する。それからこの結合
反応の最終結果はフルクトースの製造のためノクルコー
ランと特許出願第３９．３３：ｌおよび第４２，２１９
号に記した通り容易にプロピレンオキシドに変化しやす
いプロピレンブロモヒドリンの共同生産である。過酸化
水素の生成と連合してグルコースの炭素２の水酸基を酸
化しうるどんな酵素でも、著者の先行の参考文献である
出願中の特許の数えに従って、アルケン−ハロヒドリン
製造のために用いられる複合物とハロゲン化用過酸化酵
素とを結合することが出来る。 細胞不含の精製海藻パーオキシダーゼ酵素は以下の様に
製造される。 カリホルニアのラジョラ（Ｌα）ａｌｌα）海岸沿いで
得られたカロリナＮ （ＧｏｒａＬｉｎａ ＪＰ７）、
） をビルテイス（■１ｒｔｉｓ） ４５ホモゲナイ
ザーに入れ蒸留水中５分間摩砕する。均質化物を２０．
００ Ｏｒｐｍ２０分間遠心機にかけろ。上置を傾斜法
で移し保存する。残漬の塊を蒸留水で再懸濁し再度遠沈
する。この上澄と耐■の上置ケ合する。この溶液を硫酸
アンモニウムを加えて、先ず６６俤、次に５５％飽和に
する。遠沈および塊の分離の操作を各段Ｆｉ［’行５゜
この６３％〜５５％の塊のフラクション−＆ＤＥＡＫカ
ラムにがけ、０．３ Ｍから１Ｍリン酸緩衝液（７）Ｈ
６，Ｏ）を用いてこう配溶出を行う。 １Ｍ濃度で溶出したフラクションを２０ ｍ Ｍリン酸
緩衝液（ＰＨ６）に対して一夜透析を行う。 固定化された海藻／ξミーオキシダーゼ以下の様に製造
するニ ガラスピーズ（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） より入手、
ＰＧ−７００−２００）を脱イオン水１８ｇＬＩ！中ガ
ラスピーズ１ｇを懸濁するごとにより活性化させろ。 １０％（容（１／容量）α−アミノプロピルトリエトキ
シシラン２ｄ加え、混合物のｐＨを６ ＮＨＣｌで３〜
５に調整する。混１合物を７５℃２時間振とうする。ガ
ラスピーズを８０℃−夜真空乾燥スル。 上記の・…り製造した柁季゛ノカロリナ種（ＣｏｒαＬ
Ｌｎα＃Ｐ、）酵素６．２フおよび水溶性カルボジイミ
ド５０〜をガラスピーズに加えろ。ｐＨを４．５ Ｋ調
整し、混合物を４℃−夜振とりする。この生成物（酵素
被覆ビーズ）を水洗する。このものの活性は２モノクロ
ロジメドン単位／ビーズの重量ｇとして測定される。 アガロースに固定化した炭水化物オキシダーゼは実施例
Ｉと同様、細胞不含精製酵素１０ａｌから製造される。 次の様な成分を含む反応混合物を１００ａｌ１７．Ｊイ
レツクスフラスコ中に一整よる： α）海藻パーオキシダーゼ被覆ガラスピーズ、１ｇ、 ｂ）上記の如く製造した固定化炭水化物オキシダーゼ、 Ｃ）臭化カリ８００ＩＩｇおよび ｄ）０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）２
０＠ｌ。 このフラスコにプロピレンと酸素の両者を連続的に吹き
込む。この反応を２ｇ−のグルコースで開始する。２０
時間後反応液から試料を採取し、残漬のグルコース、Ｄ
−グルコーラン、およびプロピレンブロモヒドリンに対
して分析を行う。製造したプロピレンブロモヒト１リン
は以下の様に分反応混合物５μｌをヘラレット・パラカ
ード（ＨｅｗｎＬｇｔｔ−ｐａｃｋａｒｄ）型式４０２
ガスクロマトグラフに６−フィート×稀インチのガラス
カラムにボラパック＜Ｐａｒａｐａｋ） Ｒ（８０／
１００メツシユ）をつめたものへ注入する。流速はヘ
リウムガスに対し３０１／分に調整し、カラム温度２０
０℃にする。プロピレンブロモヒドリンの保持時間は１
−ブロモ−２−プロパツールは９分、２−ブロモー１−
プロパツールは１０分である。 生成物の同定はプロピレンブロモヒドリンの標品と比較
することにより確認する：１−ブロモー２−ｉａパノー
ルはブラシノ・エンド・バクニル社（ＰｆａＬｔｚ ａ
ｒＬｄ、 ＢｃＬａｇｒ、ＩｙｃＣ，）から購入された
もの。２−ブロモ−１−プロパツールは１−ブロモプロ
ピオニルクロライドの水素化リチウムアルミニウム還元
により合成されイ】。反応生成物と標品は同−保持時間
と同一質量分析結果を不す：臭素は等しい強度のＭおよ
びＭ＋２同位元素群の存在により同定される：異性体の
両者に対する分子イオンはイソブタン試薬のガスで化学
的にイオン化させることにより確められる（Ｍ”；ｍ７
ｇ１３８十１４０）；１−ブロモ−２−プロパツール九
対する主なフラグメンテーションはＣ）（２Ｂｒが失わ
れたと予測されろフラグメントで、一方２−ブロモ〜１
−プロパツールでは主なフラグメンテーションはＧＨｓ
ＣＨＢ ｒの欠損と予測されるものである。 試料の分析結果により、グルコースがらＤ−グルコーラ
ンへの変換は９９係以上であり、プロピレンブロモヒド
リン製造は２０．９ｆｆｉ ／ｌであると見積られる。 この実施例は、実施例■で示された概念を更に詳しく説
明することに役立つものである。この場合は固定化グル
コース−２−オキシダーゼを固定化炭水化物オキシダー
ゼにおき替えている。 固定化海藻パーオキシダーゼ酵素は実施例■と同様に製
造されろ。固定化グルコース−２−オキシダーゼは実施
例■におけると同様製造される。 反応器１合物は実施例■と同様に、固定化炭水化物オキ
シダーゼの代りに固定化グルコース−２−オキシダーゼ
におき替えてつくられろ、２０時間後、反応物から試料
を採取して残余のグルコース、Ｄ−グルコーラン、およ
ヒフロピレンブロモヒドリンに対する分析を行う。この
結果はグルコースのＤ−グルコーランへの変換側１９９
％以上、プロピレンブロモヒドリン製造は１９５ｇ−／
ｌ であることが示された。 本実施例はカラムの反応４中固定化炭水化物オキシダー
ゼを用いて長い反応時間をかけてグルコースのＤ−グル
コーランへ高収量で変換することを欣明する。 実施例Ｉと同様に製造した炭水化物オキシダーゼ（細胞
不含、Ｎ製酵素） （１０Ｒ／）を以下の様 −に水酸
化燐灰石（リン酸水素カルシウム）に固定化する： 細胞不含の精製酵素１００ｄに水酸化燐灰石２０ｇの１
ｍＭｍ酸力ＩＪウム緩ｆｆｆ［（ＰＨ７，０）１ＱＱｓ
ｔ／溶液を加えろ。混合物を６０分攪拌し、それから煩
悶法により固形物を液体から分離する。 そして固形物を先ず１ＯＮＭの燐酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）２００＋／で、次イテ蒸留水２００ｄで洗滌
する。 それからこの物質をガラスカラム（０，５（１１１Ｘ４
、５ ｃｗｒ ）につめろ。１％グルコース溶液をこの
カラムに１時間１．５１の流速で流す。溶出液を残余１
７）クルコースおよび生成したＤ−グルコーフンの検出
のため定期的に分析する。 ５日間連続的に流した溶出液では、グルコースのＤ−グ
ルコーフンへの変換が９５係以上であったことを示した
。過酸化水素は検出されな、かった。 本研究は酵素の真の半減期を定量する前に終了してしま
った。この実験のように緩慢な流出速度においては、酸
素の利用と過酸化水素を蓄積させない点の両ｆＪ”クル
コースのＤ−グルコ−フンへの実質的に完全な変換へ導
（きめ手となる。この場合は坦体の母体である、水酸化
燐灰石か過酸化水１、を分解させた。 １、 ＳｐｇｃｉａＬｉｚｇｄ ＳｔＬｇａｒｙ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ＦｏｏｄＸｎｄｕｔｔｒｙ、ｍｅｒｉｔ
ｅｄ、ｂｙ Ｊａαｔｓｎｇ Ｇ、 Ｊｏｈｎｔｏｎ
。 Ｎｏｙａｚ Ｄａｔａ Ｇｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、
１，９７６． ｐｐ。 １３０−２０１゜ ２、 Ｇ、Ｒ，Ｂｓｃｋａｒ ａｎｃＬ Ｃ，Ｅ、Ｍ
ｃＬｙ、 Ｊ、 Ａｍａｒ。 Ｇｈａｍ、Ｓｏｃ、、７１．１４９１（１９４９）。 ３、Ｆ、 ｐｇｔｕｇＬｙ、 Ｍｏｎａｔｚｃｈ、ｆｕ
ｒ Ｇｈｇｍ、、 ３３゜７６５（１９５２）。 ４、 Ｒ，５ａＬｂｙ、 Ｍ、ｆｉ、、ＭｏｒｒｔＬ
Ｌ ａｎｄ Ｊ、Ｍ、Ｃｒｏｆｔｚ。 Ｊ、ＣＡｇ１１Ｌ、 Ｓａｃ、、７５．７８７（１８
９９） 。 ５、 Ｗ、Ｌ、Ｆ、ｖｅＬ＋ｓｚ、 Ｗ、Ｄ、Ｎ１ｃ
ｏＬＬ、 Ｇ、 Ｃ，５ｔｒｏｕ、ｚｅａｎｄ Ｇ、Ｙ
！Ｊ、Ｗａｒｔｎｇ、 Ｊ、ｆｉ、ｍａｒ、 Ｇｈａ
ｍ、 Ｓａｃ、。 ５０．２２６７（１９２８）。 ５、 ｋｄｖａｒ＆ｃｔｚ ｔｎ Ｃｒａｒｈｏ
ｈｙｃＬｒａｔｇ Ｇｈｅｒｎｉｚｔｒｙ。 ＶＯｎ、 ｌ［、ｇｃＬｉｔｇｃＬ ｂｙ Ｍ、
Ｌ、 ＷＯＬｆｒｏｍ。 １９５６．７’７’・４３″″９６・ ７、 Ｈ，Ｊ、Ｈａｓｐ ａｎｄ Ｐ、 Ｓ
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。 ９、 Ｇ、Ｒ，Ｂｏｎｄ、 ＦＪ、 Ｃ，Ｋｎｉ、
ｑｈｔ ａｒＬｄ Ｔ、 Ｋ。 ＷａＬｋｇｒ、 Ｂｉｏｃｈｔｍ Ｊ、、 ３１．
１０３３（１９３７）。 １０、 Ｒ，Ｇ、 ＢｇａｒＬａｎｔｉ Ｗ、 Ｚ
、 Ｈａｚｚｉｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ。 １２４．１７１（１９５６）。 １１、 Ｆ、 Ｗ、 Ｊａｎｉｓ＃ｒＬｔｘｎｄ Ｈ
，Ｗ、 ＲｕｔＬ＊ｗｚＢｉｏｃｈｅｔｎ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｚ、 ｋｃ’ｔａ、 １６７、 ５Ｑ１（１９６８
）。 １２、 Ｊ、 Ｖｏｔｃ、 Ｍ、 Ｗｕｒｚｔ ａｒ
ＬｃＬ Ｖ、 ＭｔｂｚｉＬｇｋ。 １３、 Ｂ、Ｎ、Ｗｈｉｔｇ ａｎｔｉ Ｒ，Ｇ
ａｒｕｂｇＬＬｉ。 Ｋ、ＫｉａｚＬｉｃｈ、Ｃｒｔｏｒｇ Ｔルｒａｔｎ
ｇ ＰｔＬｈＬｉｚルｔｒｙ。 ＳｔｔＬｔｔｇａｒｔ、 １９７６、ｐｐ、２７９−
２８０゜１５、 Ｕ、 Ｓ、 ＰａｔｇｒＬｔ ＠ろ
、０５０．４４４；Ａ、Ｇ。 ＨａＬｚｔｔｉｎＣ１９６２） 。 １６゜ Ｚ、 Ｄｉｗｎｊａｋ ａｎｄ−Ｍ、
Ｄ、 ＬｉＬＬｙ。 ７３７−７３９（１９７６）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） グルコースの水溶液をつくり、該溶液状態の
グルコースな、酵素による酸化によって、副生成物の過
酸化水素を除去しつつ溶液状態のＤ−グルコーフンに実
質的に完全に転化することからなるＤ−グルコーフンの
製造方法。 （２）酵素がグルコース−２−オキシダーゼ活性を有す
るオキシドゝレダクタ−ぜである特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ｔ３１ 酵素カアスベルギルス・オＩＪ サエ（Ａｓ
ｐｅγｇｉｌｌＬＬｓｏｒｙｚａｅ）からのグルコース
−２−オキシダーゼおよヒホリボラス・オプッススＣＰ
ｏ１ｙｐｏｒＬＬｓｏｂｔｕｓｕｓ） からのピラノ
ース−２−オキシダーゼからなる群から選択される特許
請求の範囲第２項記・成の方法。 （１）酵素が固定化されている特許請求の範囲第６項罵
載り方法。 （５）過酸化水素がカタラーゼによる酵素的分解によっ
て除去される特許請求の範囲第１項記載の方法。 （６） グルコースの水溶液をつくり、該溶液状態の
グルコースをグルコース−２−オキシダーゼ活性を有す
る固定化オキシドレダクターゼ酵素を使用することによ
って、副生成物の過酸化水素を除去しつつ、実質的に完
全に溶液状態のＤ−グルコーフンに転化し、Ｄ−グルコ
ーフンを実質的に純粋な形で回収することからなるＤ−
グルコーフンの製造方法。 （７） カラムリアクター中で行なわれる特許請求の
範囲第６項記載の方法。
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| JPH0157956B2 JPH0157956B2 (ja) | 1989-12-08 |
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