FI69638B - Foerfarande foer framstaellning av d-glukoson - Google Patents

Description

1 69638

Menetelmä D-glukosonin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 802967 5 Tämä keksintö kohdistuu menetelmään D-glukosonin valmistamiseksi glukoosista, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan glukoosin vesiliuos, konvertoidaan vähintään noin 95 % liuoksen glukoosista D-glukosoniksi liuoksessa entsymaattisen hapetuksen 10 avulla hapen läsnäollessa poistaen tai käyttäen hyödyksi samanaikaisesti muodostunut vetyperoksidi.

Kantahakemuksessa (F1-patenttihakemus 802967) käsitellään fruktoosin valmistusta glukoosista, jolloin glukoosi konvertoidaan D-glukosoniksi entsymaattisella 15 hapetuksella ja sen jälkeen D-glukosoni hydrataan D-fruktoosiksi.

Kirjallisuudessa on esitetty, että pieniä määriä glukosoneja voidaan valmistaa glukoosista. Glukoosin hapettamiseksi on esitetty useita menetelmiä, joissa 4 20 hapetus suoritetaan H_0»:n avulla tai kupariasetaatin 5 avulla. Kaikissa näissä reaktioissa konversiosaannot ovat pieniä (<30 %) ja muodostuu useita sivutuotteita. Glukoosia on konvertoitu D-glukosoniksi valmistamalla ensin glukoosin johdannainen (esim. antamalla sen reagoi-25 da fenyylihydratsiinin kanssa glukosatsoninD valmistami- 7 seksi tai reaktion avulla p-toluidiinin kanssa ) ja käsittelemällä sitten kemial1isesti tätä johdannaista D-glukosonin saamiseksi. Näissä reaktioissa saannot olivat korkeintaan 50 % ja talteenottamattomat reaktantit 30 ovat liian kalliita kaupalliseen käyttöön. Lisäksi aro- maatteja sisältävien reagenssien käyttö voi aiheuttaa vaikeuksia ravintolaatua olevien sokerien saamiseksi.

Glukoosin konversio D-glukosoniksi on myös tunnettu entsyymireaktio. Niin aikaisin kuin 1932 ilmoitet-35 tiin glukoosin olevan hapetettavissa D-glukosoniksi 2 69638 mollusca'n (Saxidomus giganteous) kidemuodostuksen avul-

Q

la . Vuonna 1937 ilmoitettiin D-glukosonia valmistetun hapettamalla glukoosia, tärkkelystä, maltoosia tai sakkaroosia kahden homelajin, Aspergillus parasiticus ja 5 Aspergillus flavus-oryzae, plasmolysoidun valmisteen avulla. Vuonna 1956 ilmoitettiin glukoosin entsymaattinen hapetus glukosoniksi punalevässä, Iridophycus flaccidum1^. Hiilihydraattioksidaasia eristettiin Basidiomycete-lajin Polyporus obtusus huovastosta, mikä hapetti glukoosin 10 D-glukosoniksi . Saannosta ei ole mainintaa. Lopuksi vuonna 1978 gl.ukoosi-2-oksidaasi-aktivisuutta havaittiin basidiomycete'ssä, Oudemansiel1 a mucida, sekä muissa 12 puuta lahottavissa sienissä. Parhaat ilmoitetut saannot olivat korkeintaan 50 %. Kaikissa näissä tapauksissa 15 D-glukosonin muodostumisen oletetaan liittyvän vetyperok sidin muodostumiseen.

Toisin kuin edellä mainituissa tunnetuissa menetelmissä, joissa glukoosin konversio D-glukosoniksi on korkeintaan 50 %, saavutetaan keksinnön mukaisella mene-20 telmällä lähes täydellinen glukoosin konversio D-gluko soniksi; keksinnön mukaisella menetelmällä konversio on vähintään noin 95 %. Tähän suureen konversioon päästään, kun reaktiossa sivutuotteena syntyvä vetyperoksidi joko poistetaan tai käytetään jossain rinnakkaisprosessissa.

25 Mikäli vetyperoksidia ei poisteta, se vaikuttaa haital lisesti mikrobiaalisten entsyymien kykyyn katalysoida keksinnön mukaista menetelmää.

Keksintöä kuvataan mukaaniiitettyihin piirroksiin viitaten, joista 30 kuva 1 on kaavioesitys keksinnön mukaisen menetel män edullisesta toteutuksesta? kuva 2 on esitys D-glukoosin molekyylirakenteesta; ja kuva 3 on esitys D-glukosonin molekyylirakenteesta.

35 D-glukosonin molekyylirakenteen suhteen alan asian tuntijat tietävät, että useita muita molekyylimuotoja on 3 69638 oletettu esiintyvän vesiliuoksessa. Useat näistä ovat syklisiä.3'3 Tässä käytettyjä termejä "glukoosi", "D-glukoosi" ja "dekstroosi" käytetään keskenään vaihdellen ja ne 5 tarkoittavat tätä monosakkaridia kaikissa muodoissa liuoksena tai kuivana. Kuva 2 esittää glukoosia.

Tässä käytettynä termejä "D-glukosoni" ja "D-ara-bino-2-heksosuloosi" käytetään keskenään vaihdellen.

Kuva 3 esittää D-glukosonia.

10 Keksinnön mukaan konvertoidaan glukoosi helposti ja oleellisesti täydellisesti D-glukosoniksi pyhdistettua oksidoreduktaasi-entsyymiä, kuten hiilihydraattioksidaa-sia tai glukoosi-2-oksidaasia käyttäen. Esiteltävän keksinnön avulla saatavat saannot ylittävät ne, jotka kir-15 jallisuudessa on mainittu tämän entsyymin yhteydessä. Tämä tehokas D-glukoosin konversio poistaa tarpeen muuttumattoman glukoosijäännöksen erottamiseksi fysikaalisesti.

Määrätyt oksidoreduktaasit vaikuttavat katalyyt-tisesti glukoosin toisen hiilen hydroksyyliryhmän suhteen, 20 edistäen tämän hydroksyyliryhmän hapettumista ketoryhmäk- si, esimerkiksi muuttaen kuvan 2 rakenteen kuvan 3 mukaiseksi rakenteeksi. Esimerkeissä esitetyt oksidoreduktaasi-entsyymit ovat glukoosi-2-oksidaasiaktiivisuutta omaava "glukoosi-2-oksidaasi", ja hiilihydraattioksidaasiaktii-25 visuuden omaava "hiilihydraatti-oksidaasi", mutta kek sintö ei välttämättä rajoitu täten määriteltyihin entsyymeihin. Glukoosi-2-oksidaasi omaa suuren spesifisyyden glukoosin suhteen substraattina, kun taas hiilihydraatti-oksidaasin, jonka suositeltava substraatti on glukoosi, 30 spesifisyys on laajempi substraatin suhteen. Jokainen entsyymi, joka pystyy konvertoimaan hydroksyyliryhmän glukoosin toisessa hiiliatomissa ketoryhmäksi ja joka ei muutoin oleellisesti vaikuta glukoosimolekyylin loppuosaan, kuuluu keksintömme alueeseen. Tällainen entsyymi 35 voidaan määritellä glukoosi-2-oksidaasivaikutuksen omaa vaksi .

4 69638

Edullinen hiilihydraatti-oksidaasi-entsyymi johdetaan mikro-organismista Polyporus obtusus. Glukoosi-2-oksidaasi-lähteisiin kuuluvat useat muut mikro-organismit, mollusca ja punalevä, kuten edellä on mainittu, esimer-5 kiksi Aspergillus oryzae ja Oudemansiella mucida.

Tarkastelun helpottamiseksi tätä keksintöä esitellään edullisen hiilihydraatti-oksidaasin Polyporus obtusus ja glukoosi-2-oksidaasin Aspergillus oryzae käytön yhteydessä. Mikro-organismit voidaan kasvattaa 10 sekoitetussa, upotetussa viljelmässä huoneen lämpötilas sa tavanomaisten menetelmien avulla. Entsyymi valmistetaan mikro-organismin huovastosta sekoitetuissa, pinnanalaisissa viljelyolosuhteissa.

Entsyymiä käytetään edullisesti liikkumattomaksi 15 tehdyssä muodossa, vaikkakin vapaata entsyymiä voidaan myös käyttää. Alan asiantuntijat tuntevat menetelmät entsyymien tekemiseksi liikkumattomiksi. Menetelmät käsittävät entsyymiliuoksen reaktion pintakäsitellyn tai pintakäsittelemättömänä orgaanisen tai epäorgaanisen 20 tukiaineen kanssa. Näihin kuuluvat polyakryyliamidin, etyleenimaleiinihappo-kopolymeerit, metakryylihappopoh-jaiset polymeerit, polypeptidit, styreenipohjaiset polymeerit, agaroosi, selluloosa, dekstraani, piidioksidi, huokoiset lasipallot, puuhiili tai hiilimusta, puu ja 25 sahajauho, hydroksiapatiitti sekä alumiini- ja titaani- hydroksidi. Tässä muodossa entsyymeillä on aikaisempaan verrattuna suurempi stabiilisuus, pidentynyt käyttöikä ja parempi käyttökelpoisuus ja taiteenottavuus. Reaktiot, joissa käytetään liikkumattomiksi tehtyjä entsyymejä, 30 voidaan suorittaa pylväissä tai reaktiotankeissa tai muis sa sopivissa reaktoreissa.

Hiilihydraatti-oksidaasi- tai glukoosi-2-oksidaa-si-entsyymin lisäksi tarvitaan happilähde. Edelleen tarvitaan menetelmä vetyperoksidin poistamiseksi tai sen 35 käyttämiseksi hyödyksi reaktiossa konvertoitaessa glukoo si D-glukosoniksi tehokkaimmin. Tämä aiheutuu siitä, että 5 69638 f^O^ hapettaa määrättyjä kriittisiä kohtia entsyymimole-kyylissä vaurioittaen sen toimintaa. Menetelmiin vetyperoksidin poistamiseksi kuuluvat: 1) hajottaminen katalaasientsyymin avulla, 5 2) hajottaminen tunnettujen kemiallisten menet telyjen avulla ja 3) hajottaminen käyttäen hajottavia matriiseja 16 17 kuten mangaanioksideja tai hiilimustaa ' liikkumattomaksi tekevänä alustana oksidoreduktaasientsyymiä var-10 ten. Suositeltavassa vaihtoehtoisessa menetelmässä muo dostunut vetyperoksidi sen hajottamisen asemesta voidaan kuluttaa arvokkaiden sivutuotteiden valmistamiseksi. Kytkemällä D-glukosonin valmistus propyleenihalogeenihyd-riinin tai propyleenioksidin valmistukseen on suositel-15 tava esimerkki, kuten kuvassa 1 on esitetty.

Glukoosin entsymaattinen konversio D-glukosonik-si suoritetaan edullisesti vedessä suunnilleen neutraalissa pH-arvossa, mutta se voidaan suorittaa pH-alueel-la arvosta noin kolme arvoon noin kahdeksan asianmukai-20 siä puskureita käyttäen. Tämä konversio suoritetaan edul lisesti huoneen lämpötilassa, mutta voidaan se suorittaa noin 15-65°C olevalla lämpötila-alueella. Paine on edullisesti normaali-ilmanpaine, mutta voi se olla sen ala-tai yläpuolella. Jokainen hiilihydraattimateriaali, joka 25 kemiallisen tai entsymaattisen käsittelyn vaikutuksesta antaa glukoosia, on sopiva glukoosilähde konversioon D-glukosoniksi. Näihin aineisiin voivat kuulua esimerkiksi seuraavat: selluloosa, tärkkelys, sakkaroosi ja mais-sisiirappi.

30 Esiteltävän keksinnön mukaan saatujen sokerien analysoinnissa käytetyt menetelmät ovat seuraavat.

1. Ohutkerroskromatografia (TLC). Avicel-päällys-teiset lasilevyt kehitetään suhteessa 8:8:2:4 (tilavuuden mukaan) olevassa isopropanoli:pyridiini:etikkahappo: 35 vesi-liuotinjärjestelmässä. Glukoosin R^-arvo on 0,5-0,6; 6 69638 D-glukosonin Rf-arvo on 0,4-0,5 (juova). (Rf = se etäisyys, jonka aine siirtyy alkupisteestä/liuottimen etu-reunan etäisyys alkupisteestä). Jos levyt ruiskutetaan trifenyylitetratsoliumkloridilla (2 % TTC 0,5 N NaOH:ssa 5 D-glukosoni muodostaa välittömästi punaisen täplän; glu koosi muodostaa punaisen täplän vain kuumennettaessa 10 minuuttia 100°C:n lämpötilassa. Jos levyjä ruiskutetaan difenyyliamiini/aniliini/fosforihappo/etyyliasetaatti-reagenssilla, (0,15 g/0,8 ml/11 ml/100 ml), antaa glu-10 koosi ruskean täplän; D-glukosoni antaa purppuranpunaisen juovan kuumennettaessa 10 minuuttia 95°C;ssa.

2. Suuritehoinen nestekromatografia (HPLC). Waters Associates'in toimittamaan ^u-Bondapak-hiilihydraatti-pylvääseen johdetaan 15 %:ista asetonitriilin vesiliuos- 15 ta, joka sisältää 0,001 M kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, nopeudella 2 ml/min. Glukoosin Rt~arvo on 11,5 ja D-glukosonin R^-arvo 14,0 (Rt~arvo = retentioaika). Analyysit suoritettiin Spectra Physics SP8000 laitteella käyttäen sekä Waters Associates1 in taitekerroinilmaisinta 20 ja Schoeffel'in muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisinta käyttäen asetettuna arvoon 192 nm.

3. Massaspektrometria (MS). Käytettiin seuraavia käsittelyohjeita kemiallisten aineosien saamiseksi liukoisiksi: 25 a) Noin 100 milligrammaan lyofilioitua näytettä lisätään 110 milligrammaa N,N-difenyylihydratsiinia (t^NNg^) ja 1 millilitra 75 %:ista etanolin vesiliuosta. Reaktioseosta sekoitetaan voimakkaasti ja sen annetaan seistä yön ylitse huoneen lämpötilassa.

30 b) Reaktioseokseen lisätään 3 millilitraa vettä ja muodostunut sakka erotetaan yläpuolella olevasta nesteestä linkoamalla ja dekantoimalla. Tähän sakkaan lisätään 1 millilitra suhteessa 1:1 olevaa pyridiini-etikka-happoanhydridiä. Reaktioseos sijoitetaan 35-40°C lämpö-35 tilassa olevaan vesihauteeseen 15 minuutiksi ravistelen ajoittain.

7 69638 c) Lisätään 2 millilitraa vettä reaktion keskeyttämiseksi ja seosta uutetaan sitten 2 kertaa 3 millilit-ran osuuksilla etyylieetteriä. Eetteri kuivataan pienen natriumsulfaattianhydridimäärän yläpuolella ja eetteri 5 poistetaan sitten kuumentamalla varovasti (^ 40°C) ja puhaltamalla typpeä seoksen lävitse.

d) Saatu kiinteä aine tai siirappi on valmis massaspektrometri analyysiä varten.

Odotetut reaktiot: 10 -CH0 -CH=NN02 >C=0 (1) H2NN02 >C=0 (ei vaikutusta) --> -OH (2) Ac20, pyridiini -OAc 15 Glukoosi antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 556 (C2gH32N20) ja emäsionin, jonka massa on 168 (N02~ioniosa),· fruktoosi antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 390 (C^gH220^j), D-glukosoni antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 512 (C2gH2gN20g) ja voimakkaan 20 diagnostisen ioniosan, jonka massa on 223 (OC-CH=N-N02- ioniosa). Analyysit suoritettiin Finningan GC/MS/DS Model 4023 laitteella asennettuna 70 eV:n elektroni-iskuionisaatiolle ja 220° olevaan näytteen lämpötilaan.

4. Kolorimetrinen koeputkianalyysi. D-glukosonin 25 analyysi glukoosin ylimäärän läsnäollessa suoritetaan helposti kahden kolorimetrisen menetelmän avulla. Käytettäessä trifenyylitetratsoliumkloridia (TTC) havaitsemis-menetelmä perustuu kahden sokerin pelkistymisnopeuden eroon. 20 millilitran koeputkeen lisätään 0,5 millilit-30 ran näyte sekä 0,1 millilitra 1 %:ista TTC-vesiliuosta ja 0,4 millilitraa 6 N NaOH-liuosta. Tarkalleen 5 minuutin kuluttua lisätään 15 millilitraa etikkahappo/etanoli-seosta (1:9) ja koeputken sisältöä ravistellaan. Käyttäen vettä vertailuna mitataan absorbanssi arvolla 480 nm 35 käyttäen Varian 635 UV/VIS spektrometriä. Glukoosi pel- 8 69638 kistää TTC:n punaiseksi pigmentiksi - trifenyyliformatsaa-niksi - noin 100 kertaa hitaammin kuin vastaava määrä D-glukosonia. Käytettäessä difenyyliamiini/aniliini/fos-forihappo-reagenssia perustuu havaitsemismenetelmä eri-5 laisen rakenteen omaavien sokerien muodostamiin erilai siin väreihin. 20 ml:n koeputkeen lisätään 0,2 ml:n näyte sekä 5 ml:aa seuraavaa reagenssiseosta: Difenyyliamiinia 0,15 g

Aniliinia 0,80 ml 10 Isopropanolia 100 ml

Fosforihappoa 11 ml

Koeputket sijoitetaan 37°C lämpötilassa olevaan vesihauteeseen 60 minuutiksi. Glukoosi muodostaa keltaiseksi värittyneen liuoksen, D-glukosoni antaa purppuran-15 punaisen liuoksen.

Puhtaiden sokerien lähteet, joita käytettiin keksinnön erilaisissa analyyttisissä tutkimuksissa, ovat seuraavat: 1. D-glukoosin toimitti Applied Science Laboratories, 20 puhtaus 99 %.

2. D-glukosoni syntetisoitiin seuraavan menetelmän avulla: 20 g glukoosia sekoitetaan 1 litran kanssa tislattua vettä, joka sisältää 27 ml jääetikkahappoa. Lisätään 4 4 g fenyylihydratsiinia. Reaktion annetaan jatkua 25 3 tuntia 80°C:ssa voimakkaasti sekoittaen mekaanisen se koittajan avulla ja jäähdytetään sitten huoneen lämpötilaan yön ajaksi. Kiinteä aine erotetaan suodattamalla ja pestään 10 %:sella etikkahapolla, vedellä ja sitten etyylieetterillä. Kiinteä aine kuivataan hyvin tyhjö-30 uunissa 50°C:ssa. Kokeellinen saanto on 16,1 g glukosat- sonia. Glukosatsoni sijoitetaan 3-kaulaiseen 3 litran vetoiseen pulloon ja lisätään 450 ml etanolia, 750 ml tislattua vettä ja 9 ml jääetikkahappoa. Lisätään 27,8 g tuoretta bentsaldehydiä ja seosta keitetään palauttaen 35 voimakkaasti sekoittaen mekaanisella sekoittajalla. Reak- tioseosta keitetään palauttaen 5 tuntia. Jäähdytin käänne- 9 69638 tään ja poistetaan tislaamalla 450 ml lisäten 750 ml tislattua vettä (lisäysputken kautta) pulloon. Reaktio-seoksen annetaan jäähtyä yön ajan, jolloin saadaan bents-aldehydifenyylihydratsonisakka. Liuos suodatetaan ja 5 jäännöstä pestään tislatulla vedellä (noin 1 1), kunnes vesi on kirkasta. Suodos ja pesunesteet väkevöidään 500 ml:n tilavuuteen ja niitä uutetaan sitten 10 kertaa 300 ml:n annoksilla etyylieetteriä. Etyylieetterin jäännösten poistamiseksi vesiliuoksesta sijoitetaan se 10 pyörrehaihduttimeen 30 minuutiksi. Vesiliuos johdetaan 4 x 100 cm pylvään lävitse, joka sisältää perusteellisesti asetonilla pestyä Amberlite XAD-2 hartsia. Pylväs pestään 200 ml :11a lisävettä glukosonijäännösten poistamiseksi, yhdistetyt vesiosuudet lyofiloidaan. Glukosonin kokeel-15 linen saanto on 3,4 g (kokonaissaanto 16 %).

Seuraavat esimerkit esittelevät keksintöä. Ellei toisin ole mainittu, kaikki lämpötilat ovat huoneen lämpötiloja (noin 25°C) ja kaikki paineet normaali-ilmanpaineita (noin 1 atm).

20 Esimerkki 1 Tässä esimerkissä esitetään glukoosin oleellisesti täydellinen konversio D-glukosoniksi liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia käyttäen.

Glukoosia (2 g) lisätään 20 ml:n tislattua vettä 25 100 ml:n vetoisessa Pyrex-pullossa ja sokeriliuosta se koitetaan. Happikaasun annetaan kuplia pulloon ja lisätään 3 mg katalaasia (Sigma Chemical Co., C-40, naudan maksasta). Seuraavassa esitettävällä tavalla 200 ml:sta viljelmää valmistettua liikkumattomaksi tehtyä hiilihyd-30 raattioksidaasia lisätään myös pulloon.

Entsyymin valmistamiseksi Polyporus obtusus-lajia olevia rihmastoja ATCC ft .26733 kasvateen hiiva/mallas-uutetta olevilla agaralustoilla seuraavasti: Hiivauutet-ta (3 g), mallasuutetta (3 g), agaria (20 g), peptonia 35 (5 g) ja glukoosia (10 g) lisätään tislattuun veteen 10 69638 (1 1) ja pH säädetään arvoon 6,7. Väliainetta steriloidaan 121°C:ssa 15 minuuttia. Sitten säädetään pH arvoon 6,4. Organismia inokuloidaan agar-alustoille ja kasvatetaan 7 vuorokautta 25°C:ssa. Alustalla kasvatet-5 tua organismia käytetään sitten hiiva/mallas-uuteväliai- neen inokulointiin (20 ml väliainetta 125 ml Erlenmeyer-pullossa) valmistettuna edelläesitetyllä tavalla (paitsi että agaria ei lisätä). Organismin annetaan kasvaa 9 vuorokautta pyörivässä ravistelulaitteessa 25°C:ssa.

10 Viljelmä tyhjiösuodatetaan No 541 Whatman-paperin lävit se Buchner-suppilossa. Suodatinpaperille jäänyt rihmasto sisältää entsyymin.

Rihmastoa saatuna 400 ml:sta viljelmää pestään kahdesti 0,05 M kaliumfosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,0.

15 Rihmasto sijoitetaan sitten Waring-sekoittimeen, joka sisältää 70 ml 0,05 M kaliumfosfaattipuskuria pH-arvos-sa 7,0 ja homogenisoidaan 3 minuutin ajan. Seosta lingo-taan sitten nopeudella 6000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan ja yläpuolinen neste poistetaan dekantoimalla 20 kiinteistä aineista. Yläpuolinen neste sijoitetaan 500 ml:n

Erlenmeyer-pulloon, lisätään 19 g polyetyleeniglykolia (paino 4000) ja liuosta sekoitetaan 30 minuuttia. Suspensiota lingotaan sitten nopeudella 7000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan. Yläpuolinen neste poistetaan dekan-25 toimalla ja hävitetään. Sakkaan lisätään sitten 15 ml 0,2 M natriumkloridiliuosta ja 15 ml 0,05 M kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0 ja sekoitetaan voimakkaasti. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia, minä aikana muodostuu sakka. Seosta lingotaan nopeudella 14000 kierrosta 30 minuutissa 20 minuutin ajan. Samea, valkoinen yläpuolinen neste, joka sisältää soluvapaata, puhdistettua entsyymiä, poistetaan dekantoimalla.

Entsyymin tekeminen liikkumattomaksi agaroosille voidaan suorittaa seuraavasti: Soluvapaata, puhdistettua 35 entsyymiä dialysoidaan yön aikana 500 ml:aan vasta tis- 11 69638 lattua vettä. Sitten lisätään 5 ml 0,1 M natriumbikarbonaattia pH-arvossa 8,0. Tähän liuokseen lisätään 5 g aktivoitua CH-Sepharose 4B:tä (pestynä ja turvotettuna sintratuila lasisuodattimella käyttäen 500 ml 1 mM HC1-5 liuosta). Käyttäen pystyasentoista rumpusekoitinta sekoi tetaan geelisuspensiota 1 tunti 25°C:ssa. Geelisuspen-siota pestään sitten ensin 40 ml:11a 0,1 M natriumbikarbo-naattiliuosta pH-arvossa 8,0, sitten 40 ml :11a 0,05 M Tris-puskuria pH-arvolla 8,0 sisältäen 0,5 M natriumklo-10 ridiliuosta ja sitten 0,5 M natriumformiaattipuskuria pH-arvossa 4,0, joka myös sisältää 0,5 M natriumkloridia.

Reaktioseoksesta otetaan näytteitä eri aikoina ja niistä analysoidaan glukoosi ja D-glukosoni. Käyttäen HPLC-analyysiä huippujen alat kohdissa 11,5 min (glu-15 koosi) ja R 14,0 min (D-glukosoni) määrätään kvantita tiivisesti ja lasketaan sokeritasot. Saadaan seuraavat tulokset:

Reaktio- Glukoosi D-glukosoni Glukoosin konvertoitumis-% aika g g D-glukosoniksi 20 0 2,0 0,0 0 1 1,2 0,8 40 2 0,5 1,5 75 3 0,2 1,8 90 4 <1,9 >1,9 99+ 25 Glukoosin oleellisesti täydellisen konversion D-glukosoniksi osoittaa myös täplän häviäminen kohdassa 0,58 (glukoosi) ja juovan esiintyminen kohdassa R^ 0,43-0,49 (D-glukosoni) reaktion aikana ja absorbanssin kasvu kohdassa 480 nm reaktion aikana käytettäessä TTC-30 kolorimetrista koeputkianalyysiä.

Se, että tuote todella on D-glukosonia, varmistuu edelläesitetyn perusteella ja massaspektrometrian avulla, kuten edellä on esitetty. Tuotteelle saadaan diagnostiset D-glukosonimassaionit massa-arvolla 512 (molekyyli-35 ioni) ja massa-arvolla 223 (OC-CH=N-N02-ioni tähde)· 12 6 9 6 3 8

Esimerkki 2

Glukoosia (1 g) lisätään 50 ml:n tislattua vettä 250 ml:n vetoisessa Pyrex-pullossa ja sokeriliuosta sekoitetaan. Agaroosilla liikkumattomaksi tehtyä hiilihyd-5 raattioksidaasia, valmistettuna esimerkin 1 mukaisesti 50 ml:sta soluvapaata puhdistettua entsyymiä, lisätään sitten pulloon yhdessä 1 mg:n kanssa katalaasia (kuten esimerkissä 1).

Kahdeksantoista tunnin kuluttua vesiliuos erote-10 taan kiinteistä aineista dekantoimalla. Tämän liuoksen analyysi osoittaa,että yli 99% glukoosista on muuttunut D-glukosoniksi.

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä esitellään glukoosin oleellises-15 ti täydellinen konversio D-glukosoniksi glukoosi-2-oksi- daasia käyttäen.

Esimerkin 1 mukainen reaktio ja siinä käytetyt olosuhteet (käyttäen agaroosia liikkumattomaksi tekevänä alustana) toistetaan korvaten glukoosi-2-oksidaasil-20 la hiilihydraattioksidaasi. Viiden tunnin reaktioajan jälkeen enemmän kuin 99 % glukoosista oli muuttunut D-glukosoniksi.

Entsyymin valmistamiseksi glukoosi-2-oksidaasia, Aspergillus oryzae-lajin ATTC 1^7252 huovastoviljelmiä 25 kasvatetaan lihaliemi/hiivauute/tryptoni-väliaineessa seuraavasti: lihaliemiuutetta (5 g), hiivauutetta (5 g) tryptonia (3 g), dekstroosia (1 g) ja Difco-tärkkelys-tä (24 g) lisätään tislattuun veteen (1 1) ja pH säädetään arvoon 7,3. Väliainetta steriloidaan 121°C:ssa 35 30 minuuttia. Yleisesti tunnetulla tavalla saatuja itiöitä käyttäen väliaine ympätään niin, että saadaan noin 3 x 4 10 itiötä ml kohti ja kasvatus suoritetaan pöyrivässä ravistuslaitteessa (180 rpm) 30°C:ssa 2 vuorokauden aika na. Viljelmä suodatetaan tyhjiössä Whatman No 541 suoda-35 tinpaperin lävitse Blichner-suppilossa ja pestään useita kertoja vedellä. Suodatinpaperille jäänyt huovasto sisältää entsyymin.

13 69638

Entsyymin puhdistus ja sen tekeminen liikkumattomaksi voidaan suorittaa sitten esimerkin 1 mukaisen menettelyn avulla.

Esimerkki 4 5 Esimerkissä 1 glukoosin reaktiossa hiilihydraat- tioksidaasin kanssa ja siihen liittyvässä D-glukosonin muodostuksessa kehittyneen vapaan vetyperoksidin taso minimoidaan käyttäen katalaasia vetyperoksidin hajottamiseksi. Vaihtoehtoinen menetelmä vapaan vetyperoksin mää-10 rän minimoimiseksi on kytkeä sen muodostuminen vetyper oksidia kuluttavaan reaktioon halutun (arvokkaan) sivutuotteen muodostamiseksi.

Tässä esimerkissä vetyperoksidin muodostuminen yhdistetään propyleenibromihydriinin valmistamiseen, 15 joka on välituote propyleenioksidin synteesissä, joka on esitetty US-patenttijulkaisussamme 4 247 641. Glukoosin^ ja liikkumattomaksi tehdyn Polyporus obtusus-lajin ATCC 26733 hiilihydraattioksidaasin reaktio D-glukosonin ja vetyperoksidin saamiseksi yhdistetään liikkumattomaksi 20 tehdyn Coralina sp.-lajin meriheinän peroksidaasin reak tioon bromidin ja propyleenin kanssa propyleenibromihydriinin muodostamiseksi. Lopputuotteena tästä yhdistetystä reaktiosta on sitten seuraavassa fruktoosin valmistuksessa tarvittavan glukosonin ja propyleenibromi-25 hydriinin samanaikainen muodostuminen, mikä jälkimmäinen voidaan helposti muuttaa propyleenioksidiksi, kuten US-patenttijulkaisussamme 4 247 641 on esitetty. Jokainen entsyymi, joka pystyy hapettamaan hydroksyyliryhmän glukoosin 2- hiiliatomissa ja johon liittyy vetyperoksidin 30 muodostuminen, voidaan yhdistää jokaisen halogenoivan peroksidaasin kanssa ja yhdistelmää voidaan käyttää alkee-ni-halogeenihydriinin tuotantoon edellämainitun US-patentti julkaisun periaatteiden mukaan.

Soluvapaa, puhdistettu meriheinän peroksidaasi-35 entsyymi valmistetaan seuraavasti.

14 69638

Coralina sp.:tä saatuna La Jolla'n rannikolta Kaliforniasta jauhetaan Virtis 45 homogenointilaittees-sa 5 minuutin ajan tislatussa vedessä. Homogenoitua tuotetta lingotaan nopeudella 20 000 kierrosta minuutis-5 sa 20 minuutin ajan. Yläpuolinen neste poistetaan dekan- toimalla ja otetaan talteen. Jäännös suspendoidaan uudestaan tislattuun veteen ja lingotaan. Tämä yläpuolinen neste ja aikaisempi yläpuolinen neste yhdistetään. Liuos saatetaan ensin 33 prosentin sitten 55 prosentin kylläs-10 tystilaan ammoniumsulfaatissa. Linkoaminen ja jäännöksen erottaminen suoritetaan jokaisessa vaiheessa. Jäännösjae 33-55 prosenttia johdetaan DEAE-pylvään lävitse käyttäen 0,3 M - 1 M fosfaattipuskurigradienttia (pH-arvo 6,0). Jae, joka eluoituu arvolla ] M, dialysoidaan 20 mM 15 fosfaattipuskuria (pH-arvo 6) vastaan yön aikana.

Liikkumattomaksi tehty meriheinä-peroksidaasi valmistetaan seuraavasti.

Lasipalloja (myy Sigma Chemical Company, PG-700-200) aktivoidaan upottamalla 1 gramma lasipalloja 18 ml:aan 20 deionisoitua vettä. Lisätään 2 ml 10 %:ista (tilav./ tilav.) o^-aminopropyylitrietoksisilaania ja seoksen pH säädetään arvoon 3-5 HCl-liuoksen avulla (6 M). Seosta ravistellaan 75°C:ssa kaksi tuntia. Lasipallot kuivataan sitten tyhjössä von aikana 80°C:ssa. Lasipalloihin 25 lisätään 3,2 ml edelläesitetyllä tavalla valmistettua puhdistettua Coralina sp.-entsyymiä ja 50 mg vesiliukoista karbodi-imidiä. Seoksen pH säädetään arvoon 4,5 ja sitä ravistellaan 4°C:ssa yön ylitse. Tuote (entsyymi-päällysteiset pallot) pestään vedellä. Aktiviteetti mi-30 tataan 2 monoklooridimedoniyksikköinä g kohti palloja.

Agaroosille liikkumattomaksi tehty hiilihydraatti-oksidaasi valmistetaan kuten esimerkissä 1 10 ml:sta soluvapaata, puhdistettua entsyymiä.

Reaktioseos, joka sisältää seuraavat aineosat, 35 pannaan 100 ml:n vetoiseen Pyrex-pulloon: 15 69638 a) 1 g meriheinä-peroksidaasilla päällystettyjä lasipalloja, b) edellä esitetyllä tavalla valmistettua, liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia, 5 c) 800 mg kaliumbromidia ja d) 20 ml 0,01 M kaliumfosfaatti-puskuria, pH-arvo 7,0.

Sekä propyleenin että hapen annetaan kuplia jatkuvasti pulloon. Reaktio aloitetaan 1 g:11a glukoosia. 20 10 tunnin kuluttua reaktioseoksesta otetaan näyte ja siitä analysoidaan jäannösglukoosi, D-glukosoni ja propyleeni-bromihydriini. Muodostunut propyleenibromihydriini analysoidaan seuraavasti: 5 mikrolitraa reaktioseosta injektoidaan Hewlett-15 Packard Model 402 kaasukromatograafiseen laitteeseen, joka on varustettu kooltaan 1,8 m x 0,32 cm suuruisella lasipylväällä pakattuna Porapak R materiaalilla (80/100 mesh). Virtausnopeus on 30 ml/minuutissa heliumille ja pylvään lämpötila säädetään arvoon 200°C. Propyleenibro-20 mihydriinin viipymisaika on 9 minuuttia l-bromi-2-pro- panolilla ja 10 minuuttia 2-bromi-l-propanolille.

Tuote tunnistetaan vertaamalla propyleenibromi-hydriinin autenttisiin näytteisiin; l-bromi-2-propanolia myy Pfaltz and Bauer, Inc.; 2-bromi-l-propanoli synte-25 tisoidaan pelkistämällä 1-bromipropionyylikloridi li- tiumaluminiumhydridin avulla. Reaktiotuotteiden ja alkuperäisten näytteiden viipymisajat ovat samat ja niiden massaspektrit ovat identtiset; bromi tunnistetaan saman voimakkuuden M ja M+2 isotooppikasaumien läsnäolon avul-30 la;molempien isomeerien molekyyli-ioni tunnistetaan kemi allisen ionisoinnin avulla isobutaanireagenssikaasua käyttäen (M+; m/e 138+140); l-bromi-2-propanolille päälohkea-minen on odotettu CH2Br-häviö, kun taas 2-bromi-l-propa-nolille päälohkeaminen on odotettu CH^CHBr-häviö.

35 Näytteen analyysi osoittaa >99 %:n glukoosin kon- 16 69638 version D-glukosoniksi ja propyleenibromihydriinin tuotto on 20 g/1.

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä esitellään edelleen esimerkis-5 sä 4 mainittuja ja esitettyjä käsitteitä. Tässä tapauk sessa liikkumattomaksi tehdyllä glukoosi-2-oksidaasilla korvataan liikkumattomaksi tehty hiilihydraattioksidaasi.

Liikkumattomaksi tehty meriheinä-peroksidaasient-syymi valmistetaan kuten esimerkissä 4. Liikkumattomaksi 10 tehty glukoosi-2-oksidaasi valmistetaan kuten esimerkis sä 3.

Reaktioseos valmistetaan esimerkissä 4 esitetyllä tavalla korvaten liikkumattomalla glukoosi-2-oksidaasilla liikkumattomaksi tehty hiilihydraattioksidaasi. Reaktio-15 seoksesta otetaan näyte 20 tunnin kuluttua ja analysoi daan siitä jäännösglukoosi, D-glukosoni ja propyleeni-bromihydriini. Tulokset osoittavat >99 %:isen glukoosin muuttumisen D-glukosoniksi ja propyleenibromihydriinin tuotanto on 19,5 g/1.

20 Esimerkki 6 Tässä esimerkissä esitellään glukoosin tehokasta konversiota D-glukosoniksi pitkähkön ajan aikana liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia käyttäen pylväsreaktorissa.

Esimerkin 1 mukaan valmistettua hiilihydraatti-25 oksidaasia (soluvapaata, puhdistettua entsyymiä, 10 ml) tehdään liikkumattomaksi hydroksiapatiitille (kalsiumfos-faattihydroksidi) seuraavasti.

100 ml:aan soluvapaata, puhdistettua entsyymiä lisätään 20 g hydroksiapatiitia 100 ml:ssa 1 mM kalium-30 fosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0. Seosta sekoitetaan 30 minuuttia, kiinteät aineet erotetaan sitten nesteestä dekantoimalla ja kiinteät aineet pestään ensin 200 ml:11a 10 mM kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0 ja sitten 200 ml:11a tislattua vettä.

35 Tämä materiaali pakataan sitten lasipylvääseen

II

17 69638 (0/5 cm x 4,5 cm). Pylvään lävitse johdetaan 1 %:ista glu-koosiliuosta virtausnopeudella 1,5 ml tunnissa. Eluaatista analysoidaan aika ajoin jäännösglukoosi ja muodostunut D-glukosoni.

5 Eluaatti, jota valmistettiin jatkuvasti 5 vuorokauden ajan, osoitti, että enemmän kuin 95 % glukoosista oli muuttunut D-glukosoniksi. Vetyperoksidia ei havaittu. Tutkimus päätettiin ennen entsyymin todellisen puoliintumisajan määräämistä. Tässä kokeessa käytetyllä pienellä virtausnopeu-10 della sekä hapen saatavuus että kerääntyneen vetyperoksidin puuttuminen vaikuttivat glukoosin oleellisesti täydelliseen konversioon D-glukosoniksi. Tässä tapauksessa tukialusta, hydroksiapatiitti, aiheutti vetyperoksidin hajaantumisen.

Täten voidaan havaita, että menetelmä voidaan suorittaa 15 helposti huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa, jolloin haluttaessa energiatarve voidaan minimoida. Menetelmän sivutuotteita ei ole vaikea hävittää tai käyttää hyödyksi.

69638 18

Viitteet; 1. Specialized Sugars for the Food Industry, toimittanut

Jeanne C. Johnson, Noyes Data Corporation, 1976, sivut 130- c 201.

5 2. C.R. Becker ja C.E. May, J. Amer. Chem. Soc. 71 (1949) 1491 .

3. F. Petuely, Monatsch. fur Chem. 83 (1952) 765.

4. R. Selvy, M.A. Morrel ja J.M. Crofts, J. Chem. Soc., 10 75 (1899) 787.

5. W.L. Evans, W.D. Nicoll, G.C. Strouse ja C.E. Waring, J. Amer. Chem. Soc. 50 (1928) 2267.

6. Advances in Carbonhydrate Chemistry, Voi. II, toimittanut M.L. Wolfram, 1956, sivut 43-96.

^ 7. H.J. Hass ja P. Schlimmer, Liebigs Ann. Chem. 759,208.

8. C. Berkeley, Biochem. J. 27 (1933) 1357.

9. C. R. Bond, E.C. Knight ja T.K. Walker, Biochem. J.

31 (1937) 1033.

10. R.C. Bean ja W.Z. Hassid, Science 124 (1956) 171.

2Q 11. F.W. Janssen ja H.W. Ruelius, Biochem. Biophys. Acta 157 (1968) 501.

12. J. Vole, M. Wurst ja V. Musilek, Folia Microbiol.

23 (1978) 448.

13. B. N. White ja R. Carubelli, Carbohydr, Res. 33 25 (1974) 366.

14. Microbial Transformation of Non-steroid Cyclic Compounds, toimittanut K. Kieslich, Gerg Threme Publishers, Stuttgart, 1976, sivut 279-280.

15. US-patenttijulkaisu 3 050 444, A.G. Holstein (1962).

2q 16. Z. Diwnjak ja M.D. Lilly, Biotechnology and Bioengineering 18 (1976) 737-739.

17. Y.K. Cho ja J. E. Bailey, Biotechnology and Bioengineering 19 (1977) 769-775.

35

Claims (5)

19 69638

1. Menetelmä D-glukosonin valmistamiseksi glukoosista, tunnettu siitä, että muodostetaan glukoosin 5 vesiliuos, konvertoidaan ainakin noin 95 % liuoksessa olevasta glukoosista D-glukosoniksi entsymaattisen hapetuksen avulla hapen läsnäollessa käyttäen oksidoreduktaasientsyy-miä ja samanaikaisesti hapetuksessa muodostuva vetyperoksidi poistetaan tai käytetään rinnakkaisprosessituotteen, ku-10 ten propyleenihalogeenihydriinin tai propyleenioksidin valmistukseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on oksidoreduktaasi, jolla on glukoosi-2-oksidaasiaktiivisuutta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että entsyymi on Aspergillus oryzae-la-jista saatu glukoosi-2-oksidaasi tai Polyporus obtusus-la-jista saatu hiilihydraattioksidaasi.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että entsyymi on tehty liikkumattomaksi.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vetyperoksidi poistetaan entsymaattisen hajottamisen avulla katalaasia käyttäen.