FI69314B - Foerfarande foer framstaellning av fruktos - Google Patents

Description

ΓΒ1 (11) KUULUTUSJULKAISU CQ-IA Λ jsrt ™ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6931 4 5¾¾¾ C (45) PltCnttl

p ' j- ·'.-λ + ,.. v » '.·,** t- 1 Q ^ ^ 1 Π p Q

'V " ' (51) Kv.lk.'/Int.CI.* C 12 P 19/02, C 13 K 11/00 SUOM I —Fl N LAN D (21) Patenttihakemus — Patentansökning 802967 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 1 9.09 · 8 0 (Fl) (23) Alkupäivä — Glltighetidag 19 · 09.8 0 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 25.04.81

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväkslpanon ja kuul.julkaisun pvm. — 30.09.85

Patent- och registerstyrelsen ' ’ Ansökan utlagd och utl.skrlften publieerad (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prloritet 24.10.79 USA(US) O88IO3 Toteennäytetty-Styrkt (71) Cetus Corporation, 600 Bancroft Way, Berkeley, California, USA(US) (72) Saul Lewis Neidleman, Oakland, California,

William Frederick Arnon, Jr., Danville, California,

John Geigert, Clayton, California, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä fruktoosin valmistamiseksi - Förfarande för framstälining av fruktos

Keksintö liittyy yleisesti kiteisen fruktoosin valmistamiseen glukoosista ja se koskee menetelmää fruktoosin valmistamiseksi glukoosista entsymaattisella hapetuksella, jota seuraa kemiallinen hydraus. Tämä menetelmä muodostaa uuden tavan kiteisen fruktoosin valmistamiseksi ilman, että vaaditaan glukoosijäännöksen fysikaalista erottamista lähtömateriaalista.

Kiteisen fruktoosin ainutlaatuiset fysikaaliset, kemialliset ja metaboliset ominaisuudet tarjoavat erikoisia sovellutusmahdollisuuksia, joita ei voida toteuttaa glukoosi-isomeraasin avulla valmistetun, runsaasti fruktoosia sisältävän maissisii-rapin (HFCS) avulla, joka tyypillisesti sisältää 42 % fruktoosia, 50 % dekstroosia ja 8 % polysakkarideja. Vaikka HFCS on suunnilleen yhtä makea kuin sakkaroosi, on kiteinen fruktoosi noin 50 % makeampaa ja sitä voidaan käyttää pienempinä määrinä saman makeuden saavuttamiseksi. HFCS kilpailee suorakustannusten suhteessa pääasiassa nestemäisten sokerien kanssa useissa tavanomaisissa 2 6931 4 ravintosovellutuksissa joko kuivana tai nestemäisinä, pääasiassa farmaseuttisissa sovellutuksissa ja ruuissa, joissa halutaan alentaa kalorimäärää makeusyksikköä kohti. Kiteistä fruktoosia käytetään dieettimakeisissa ja dieettijäätelössä ja sillä voidaan edullisesti korvata glukoosi, sakkaroosi tai HFCS virvoitusjuomissa.

Kiteisen fruktoosin kaupallista valmistusta ovat haitanneet lukuisat vaikeat hankaluudet. Eräs merkittävimmistä näistä vaikeuksista on valmistuskustannus. Ainoa kaupallisesti sopiva valmistusmenetelmä ennen esiteltävää keksintöä on perustunut glukoosi/fruktoosi-siirappiseoksen valmistamiseen ensin glukoosista (käyttäen joko glukoosi-isomeraasia tai alkalista isome-rointia) tai sakkaroosista (inverttiseoksen kautta), erottamalla sitten fysikaalisesti sokerit toisistaan (ioninvaihto tai selektiivinen kalsiumsuolasaostus) ja lopuksi fruktoosin talteenotto vesiliuoksesta kiteisessä muodossa (ymppäys tai metanolisaostus).^ Näiden kahden sokerin fysikaalista erottelukäsittelyä tarvitaan, koska kiteistä fruktoosia on parhaimmillaan vaikea ja usein mahdotonta ottaa talteen vesiliuoksesta, ellei oleellisesti kaikkia ionisia aineita, jäännösglukoosia ja muita epäpuhtauksia poiste- 15 ta. Tällainen käsittely on kallista ja aiheuttaa siten korkean markkinahinnan fruktoosille, joka hinta ei ole kilpailukykyinen ravintona käytettävän ruokosokerin hinnan kanssa.

Kirjallisuudessa on esitetty, että pieniä määriä fruktoosia voidaan valmistaa glukosonista. Niin aikaisin kuin 1889 muodostettiin fruktoosia D-glukosonista sinkkipölyn avulla etikka-hapon vesiliuoksessa.^ Tätä pelkistystä on käytetty analyyttisenä testinä D-glukosonin havaitsemiseen useissa biologisissa 8 10 12 materiaaleissa. ' ' D-glukosonin pelkistys D-fruktoosiksi on suoritettu myös natriumborohydridin avulla. D-glukosonin konversio fruktoosiksi on toteuttavissa oleva entsymaattinen reaktio, koska reduktaaseja, jotka suorittavat pelkistyksen 14 -CHO -^ - Ci^OH, tunnetaan.

Kirjallisuudessa on myös esitetty, että pieniä määriä glu- kosoneja voidaan valmistaa glukoosista. Useita menetelmiä glu- 4 koosin hapettamiseksi on esitetty joko I^C^n avulla tai kupari-asetaatin avulla. 5 Jokaisessa näistä reaktioista konversiosaan- 11 6931 4 not ovat pieniä (< 30 %) ja muodostuu useita sivutuotteita. Glukoosia on konvertoitu D-glukosoniksi valmistamalla ensin glukoosin johdannainen (esim. antamalla reagoida fenyylihydratsiinin kanssa glukosatsonin ^ valmistamiseksi tai reaktion avulla p-tolui-7 diinin kanssa ) ja käsittelemällä sitten kemiallisesti tätä johdannaista D-glukosonin saamiseksi. Näissä reaktioissa saannot olivat korkeintaan 50 % ja talteenottamattomat reaktantit ovat liian kalliita kaupalliseen käyttöön. Lisäksi aromaatteja sisältävien reagenssien käyttö voi aiheuttaa vaikeuksia ravintolaatua olevien sokerien saamiseksi.

Glukoosin konversio D-glukosoniksi on myös tunnettu entsyy-mireaktio. Niin aikaisin kuin 1932 ilmoitettiin glukoosin olevan hapetettavissa D-glukosoniksi mollusca'n (Saxidomus giganteous) g kidemuodostuksen avulla . Vuonna 1937 ilmoitettiin D-glukosonia valmistetun hapettamalla glukoosia, tärkkelystä, maltoosia tai sakkaroosia kahden homelajin, Aspergillus parasiticus ja Aspergillus flavus-oryzae, plasmolysoidun valmisteen avulla. Vuonna 1956 ilmoitettiin glukoosin entsymaattinen hapetus glukosoniksi punalevässä, Iridophycus flaccidum 10. Hiilihydraattioksidaasia eristettiin Basidiomycete-lajin Polyporus obtusus huovastosta, 11 mikä hapetti glukoosin D-glukosoniksi . Saannosta ei ole mainintaa.

Lopuksi vuonna 1978 glukoosi-2-oksidaasi-aktiivisuutta havaittiin basidiomycete'ssä, Oudemansiella mucida, sekä muissa puuta lahot- 12 tavissa sienissä . Parhaat ilmoitetut saannot olivat korkeintaan 50 %. Kaikissa näissä tapauksissa D-glukosonin muodostumisen oletetaan liittyvän vetyperoksidin muodostumiseen.

Keksinnön kohteena on parannettu menetelmä oleellisesti puhtaan fruktoosin valmistamiseksi glukoosista.

Tässä menetelmässä ei tarvita glukoosijäännöksen kallista fysikaalista eristämistä fruktoosista tai fruktoosipitoisesta siirapista, joten keksinnön kohteena olevalla menetelmällä voidaan valmistaa puhdasta fruktoosia glukoosista taloudellisesti ja kaupallisesti hyväksyttävällä tavalla.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle fruktoosin valmistamiseksi glukoosista, on tunnusomaista, että muodostetaan D-glukoosin vesiliuos, konvertoidaan vähintään noin 95 prosenttia liuoksen D-glukoo- 6931 4 sista D-glukosoniksi liuoksessa entsymaattisella hapetuksella käyttämällä oksidoreduktaasientsyymiä hapen läsnäollessa ja poistamalla tai käyttämällä rinnakkaisprosessissa samanaikaisesti muodostunut vetyperoksidi, ja konversion jälkeen D-glukosoni hydrataan D-fruk-toosiksi hydrauskatalyytin avulla, joka edullisesti on ryhmän VIII alkuaine tai kantajalle tuettu palladium.

Saatu fruktoosi otetaan talteen joko vesiliuoksena tai kiinteänä .

Keksintöä kuvataan seuraavassa sekä suoritusesimerkein että piirroksiin viitaten: kuva 1 on kaavioesitys keksinnön mukaisen menetelmän suositeltavasta toteutuksesta: kuva 2 on esitys D-glukoosin molekyylirakenteesta; kuva 3 on esitys D-glukosonin molekyylirakenteesta; ja kuva 4 on esitys D-fruktoosin molekyylirakenteesta. D-glukosonin molekyylirakenteen suhteen alan asiantuntijat tietävät, että useita muita molekyylimuotoja on oletettu esiin- 2 3 tyvän vesiliuoksessa. Useat näistä ovat syklisiä. ' Tässä käytettynä termejä "glukoosi", "D-glukoosi" ja "deks-troosi" käytetään keskenään vaihdellen ja ne tarkoittavat tätä monosakkaridia kaikissa muodoissa - liuoksena tai kuivana. Kuva 2 esittää glukoosia.

Tässä käytettynä termejä "D-glukosoni" ja "D-arabino-2-hekso-suloosi" käytetään keskenään vaihdellen. Kuva 3 esittää D-gluko-sonia.

Tässä käytettynä termejä "fruktoosi", "D-fruktoosi" ja "le-vuloosi" käytetään keskenään vaihdellen tarkoittamaan glukoosin isomeeriä, joka on makeampi kuin glukoosi. Termiä "kiteinen fruktoosi” käytetään tässä patenttihakemuksessa tarkoittamaan tätä monosakkaridia vedettömässä muodossa. Kuva 4 esittää fruktoosia.

Kuten edellä on mainittu ja viitattu, glukoosin pienimittakaavainen konversio D-glukosoniksi ja D-glukosonin fruktoosiksi tunnetaan tieteellisestä kirjallisuudesta, mutta menettely, jolloin nämä kaksi reaktiota kytketään yhteen fruktoosin valmistamiseksi glukoosista, ei ole ollut ilmeinen. Lisäksi näiden kahden reaktion onnistunutta käyttöä kiteisen fruktoosin valmistamiseksi li 6931 4 glukoosista taloudellisen, kaupallisesti käyttökelpoisen menetelmän avulla, ei ole esitetty ennen keksintöämme. Ei enempää esitetyssä glukoosin konversiossa D-glukosoniksi tai D-glukosonin konversiossakaan fruktoosiksi ole tarkasteltu menettelyä kiteisen fruktoosin valmistamiseksi glukoosista. D-glukosonia syntetisoitiin kemiallisesti, koska se haluttiin kemiallisesti stadardiksi. D-glu-kosoni havaittiin biologisissa järjestelmissä, joko vahingossa (esimerkiksi tuntemattomana komponenttina tutkittavassa biokemiallisessa tapahtumaketjussa) tai tarkoituksellisesti (esimerkiksi osana tutkimuksessa hapetettaessa glukoosia kemiallisesti veressä). D-glu-kosoni pelkistettiin fruktoosiksi analyyttisenä täplätestinä D-glukosonin osoittamiseksi.

Mikäli sekä glukoosin konversiota D-glukosoniksi ja D-glukosonin konversiota fruktoosiksi ei voida suorittaa suurina saantoina, on kiteisen fruktoosin teollinen valmistus tämän menetelmän mukaan epäkäytännöllinen kalliin fysikaalisen erottelukäsit-telyn vuoksi, mikä kuitenkin vaaditaan glukoosijäännösten poistamiseksi. Esiteltävän keksinnön mukaan konvertoidaan glukoosi helposti ja täydellisesti G-glukosoniksi puhdistettua oksidoreduktaa-si-entsyymiä, kuten hiilihydraattioksidaasia tai glukoosi-2-oksi-daadia käyttäen. Esiteltävän keksinnön avulla saatavat saannot ylittävät ne, jotka kirjallisuudessa on mainittu tämän entsyymin yhteydessä. Tämä tehokas D-glukoosin konversio poistaa tarpeen muuttumattoman glukoosijäännöksen erottamiseksi fysikaalisesti.

Määrätyt oksidoreduktaasit vaikuttavat katalyyttisesti glukoosin toisen hiilen hydroksyyliryhmän suhteen, edistäen tämän hyd-roksyyliryhmän hapettumista ketoryhmäksi, esimerkiksi muuttaen kuvan 2 rakenteen kuvan 3 mukaiseksi rakenteeksi. Esimerkeissä esitetty dksidoreduktaasi-entsyymit ovat glukoosi-2-oksidaasiak-tiivisuuden omaava "glukoosi-2-oksidaasi" ja hiilihydraattioksi-daasiaktiivisuuden omaava "hiilihydraatti-oksidaasi", mutta keksintö ei välttämättä rajoitu täten määriteltyihin entsyymeihin. Glukoosi-2-oksidaasi omaa suuren spesifisyyden glukoosin suhteen substraattina, kun taas hiilihydraatti-oksidaasin, jonka suositeltava substraatti on glukoosi, spesifisyys on laajempi substraatin suhteen. Jokainen entsyymi, joka pystyy konvertoimaan hydroksyyliryhmän glukoosin toisessa hiiliatomissa ketoryhmäksi ja joka ei muutoin oleellisesti vaikuta 6931 4 glukoosimolekyylin loppuosaan, kuuluu keksintömme alueeseen. Tällainen entsyymi voidaan määritellä glukoosi-2-oksidaasi-aktii- v i suuden omaavak s i.

Suositeltava hiilihydraatti-oksidaasi-entsyymi johdetaan mikro-organismista Polyporus obtusus. Glukoosi-2-oksidaasi-läh-teisiin kuuluvat useat muut mikro-organismit, mollusca ja puna-levä, kuten edellä on mainittu.

Tarkastelun helpottamiseksi esitellään tämän keksinnön eri kohteita yksityiskohtaisesti, suositeltavan hiilihydraatti-oksidaasin Polyporus obtusus ja glukoosi-2-oksidaasin Aspergillus oryzae käytön yhteydessä. Mikro-organismit voidaan kasvattaa sekoitetussa, upotetussa viljelmässä huoneen lämpötilassa tavanomaisten menetelmien avulla. Entsyymi valmistetaan mikro-organismin huovastosta sekoitetuissa, pinnanalaisissa viljely-olosuhteissa .

Entsyymiä käytetään edullisesti liikkumattomaksi tehdyssä muodossa, vaikkakin vapaata entsyymiä voidaan myös käyttää. Alan asiantuntijat tuntevat menetelmät entsyymien tekemiseksi liikkumattomiksi. Menetelmät käsittävät entsyymiliuoksen reaktion pin-takäsitellyn tai pintakäsittelemättömän orgaanisen tai epäorgaanisen tukiaineen kanssa. Näihin tukiaineisiin kuuluvat polyakryy-liamidin, etyleenimaleiinihappo-kopolymeerit, metakrylaattihappo-pohjäiset polymeerit, polypeptidit, styreenipohjäiset polymeerit, agaroosi, selluloosa, dekstraani, piidioksidi, huokoiset lasipallot, puuhiili tai hiilimusta, puu ja sahajauho, hydroksiapatiitti sekä alumiini- ja titaanihydroksidi. Tässä muodossa entsyymeillä on aikaisempaan verrattuna suurempi stabiilisuus, pidentynyt käyttöikä ja parempi käyttökelpoisuus ja talteenotettavuus. Reaktiot, joissa käytetään liikkumattomiksi tehtyjä entsyymejä, voidaan suorittaa pylväissä tai reaktiotankeissa tai muissa sopivissa reaktoreissa.

Hiilihydraatti-oksidaasi- tai glukoosi-2-oksidaasi-entsyy-min lisäksi tarvitaan happilähde. Edelleen tarvitaan menetelmä vetyperoksidin poistamiseksi tai sen käyttämiseksi hyödyksi reaktiossa konvertoitaessa glukoosi D-glukosoniksi tehokkaimmin.

Tämä aiheutuu siitä, että haPettaa määrättyjä kriittisiä 7 6931 4 kohtia entsyymimolekyylissä vaurioittaen sen toimintaa. Menetelmiin vetyperoksidin poistamiseksi kuuluvat: 1) hajottaminen katalaasientsyymin avulla, 2) hajottaminen tunnettujen kemiallisten menettelyjen avulla ja 3) hajottaminen käyttäen hajottavia matriiseja, kuten 16 17 mangaanioksideja tai hiilimustaa ' liikkumattomaksi tekevänä alustana oksidoreduktaasientsyymille. Suositeltavassa vaihtoehtoisessa menetelmässä muodostunut vetyperoksidi sen hajoittamisen asemesta voidaan kuluttaa arvokkaiden sivutuotteiden valmistamiseksi. Kytkemällä D-glukosonin valmistus propyleenihalohydriinin tai propyleenioksidin valmistukseen on suositeltava esimerkki, kuten kuvassa 1 on esitetty.

Glukoosin entsymaattinen konversio D-glukosoniksi suoritetaan edullisesti vedessä suunnilleen neutraalissa pH-arvossa, mutta se voidaan suorittaa pH-alueella arvosta noin kolme arvoon noin kahdeksan asianmukaisia puskureita käyttäen. Tämä konversio suoritetaan edullisesti huoneenlämpötilassa, mutta se voidaan suorittaa noin 15-65°C olevalla lämpötila-alueella. Paine on edullisesti normaali-ilmanpaine, mutta se voi olla sen ala- tai yläpuolella. Jokainen hiilihydraattimateriaali, joka kemiallisen tai entsymaattisen käsittelyn vaikutuksesta antaa glukoosia, on sopiva glukoosilähde konversiota varten D-glukosoniksi ja fruktoosi-synteesiin. Näihin aineisiin voivat kuulua, mutta ei rajoittavasti seuraavat: selluloosa, tärkkelys, sakkaroosi, maissisiirappi, HFCS ja muut siirapit, jotka sisältävät vaihtelevia osuuksia glukoosia ja fruktoosia.

Kun oleellisesti kaikki glukoosi on konvertoitu D-glukosoniksi, konvertoidaan D-glukosoni helposti ja oleellisesti täydellisesti fruktoosiksi molekulaarista vetyä ja sopivaa katalyyttiä käyttäen. Tämän menetelmän toiseen vaiheeseen sopiviin katalyyt-teihin kuuluvat kaikki hyvin tunnetut hydrauskatalyytit. Nämä katalyytit muodostuvat yhdestä tai useammasta metallista tai me-talliyhdisteestä, joilla on hydrausvaikutus. Katalyyttejä voidaan __ - r 8 6931 4 käyttää yksinään tai sekoitettuina katalyyttien kiihdyttäjien kanssa. Suositeltavat katalyytit valitaan jaksottaisen järjestelmän ryhmän VIII alkuaineista. Näihin alkuaineisiin, joita usein kutsutaan jalometalleiksi, kuuluvat nikkeli, platina, palladium, rodium jne. Suositeltavimpia katalyyttejä ovat palladium ja nikkeli. Muita tyydyttäviä katalyyttejä ovat jaksottaisen järjestelmän ryhmien IB ja IIB metallialkuaineet, mukaanluettuina kupari ja sinkki. Siirtymämetallit ovat myös tyydyttäviä katalyyttejä tätä menetelmää varten. Näihin kuuluvat kromi, volframi ja mangaani.

Katalyyttejä voidaan käyttää katalyyttisinä metalleina tai metalliyhdisteinä tuettuina inerteille, kiinteille kantaja-osasille. Nämä tuetut katalyytit ovat käyttökelpoisia heterogeenisissa hydrauksissa, joissa vetykaasun ja orgaanisen aineksen annetaan koskettaa toisiaan liukenemattomassa muodossa olevan katalyytin yläpuolella. Sopiviin kantajiin kuuluvat piidioksidi, aluminiumoksidi, zirkoniumoksidi, piigeeli, hiili ja näiden seokset. Suositeltava katalyytti on hiilelle tuettu palladium.

Katalyytti voi olla myös pieninä, liukenemattomina osasina, jotka muodostavat lietteen reaktiotilassa, esimerkiksi Raney-nikkeli.

Heterogeeniset katalyytit valmistetaan yleensä saosta-malla metallin suolaa, esimerkiksi oksidia, karbonaattia tai hydroksidia, kiinteälle kantajalle. Nämä materiaalit muutetaan sitten in situ katalyytin aktiivimuotoon. Vaihtoehtoisesti välituotteet tässä menetelmässä voidaan pelkistää lopulliseksi tuotteeksi käyttäen kemiallisia pelkistystapoja. Suositeltava materiaali tätä homogeenista pelkistystä varten on natriumborohydridi, jota täytyy olla läsnä stökiometrisessä määrässä. Hydrogenointi voidaan suorittaa huoneenlämpötilassa ja normaalipaineessa, mutta se voidaan suorittaa korkeammassa tai alemmassa lämpötilassa ja paineessa.

Esiteltävän keksinnön mukaan saatujen sokerien analysoinnissa käytetyt menetelmät ovat seuraavat.

1. Ohutkerroskromatografia (TLC). Avicel-päällysteiset lasilevyt kehitetään suhteessa 8:8:2:4 (tilavuuden mukaan) olevassa isopropanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi-liuotinjärjestelmässä.

6931 4 9

Glukoosin ja fruktoosin R^-arvot ovat 0,5-0,6; D-glukosonin R^-arvo on 0,4-0,5 (juova). (R^ = se etäisyys, jonka aine siirtyy alkupisteesiä/liuottimen etureunan etäisyys alkupisteestä).

Jos levyt ruiskutetaan trifenyylitetratsoliumkloridilla (2 % TTC 0,5N NaOHrssa sekä D-glukosoni että fruktoosi muodostavat välittömästi punaiset täplät; glukoosi muodostaa punaisen täplän vain kuumennettaessa 10 minuuttia 100°C:n lämpötilassa. Jos levyjä ruiskutetaan difenyyliamiini/aniliini/fosforihappo/etyyli-asetaatti-reagenssilla,(0,15 g/0,8 ml/11 ml/100 ml), antaa glukoosi ruskean täplän; D-glukosoni antaa purppuranpunaisen juovan ja fruktoosi antaa keltaisen täplän kuumennettaessa 10 minuuttia 95°C:ssa.

2. Suuritehoinen nestekromatografia (HPLC). Waters Associatesin toimittamaan ^u-Bondapak-hiilihydraattipylvääseen johdetaan 15-prosenttista asetonitriilin vesiliuosta, joka sisältää 0,001 M kaliumfosfaattipuskuria, pH-arvo 7, nopeudella 2 ml/min. Glukoosin Rt~arvo on 11,5, D-glukosonin R^-arvo 14,0 ja fruktoosin Rt~arvo 9,5 (Rfc-arvo = viipymisaika). Analyysit suoritettiin Spectra Physics SP8000 laitteella käyttäen sekä Waters Associatesin taitekerroinilmaisinta ja Schoeffelin muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisinta käyttäen asetettuna arvoon 192 nm.

3. Massaspektrometria (MS). Käytettiin seuraavia käsittely-ohjeita kemiallisten aineosien saamiseksi liukoisiksi: a) Noin 100 milligrammaan lyofiloitua näytettä lisätään 110 milligrammaa N,N-difenyylihydratsiinia (I^NN^) 3a 1 milli-litra 75-prosenttista etanolin vesiliuosta. Reaktioseosta sekoitetaan voimakkaasti ja sen annetaan seistä yön ylitse huoneenlämpötilassa.

b) Reaktioseokseen lisätään 3 millilitraa vettä ja muodostunut sakka erotetaan yläpuolella olevasta nesteestä linkoamalla ja dekantoimalla. Tähän sakkaan lisätään 1 millilitra suhteessa 1:1 olevaa pyridiini-etikkahappoanhydridiä. Reaktioseos sijoitetaan 35-40°C lämpötilassa olevaan vesihauteeseen 15 minuutiksi ravistellen ajoittain.

c) Lisätään 2 millilitraa vettä reaktion keskeyttämiseksi ja seosta uutetaan sitten 2 kertaa 3 millilitran osuuksilla etyy-lieetteriä. Eetteri kuivataan pienen natriumsulfaattianhydridi- 10 6931 4 määrän yläpuolella ja eetteri poistetaan sitten kuumentamalla varovasti ( 40°C) ja puhaltamalla typpeä seoksen lävitse.

d) Saatu kiinteä aine tai siirappi on valmis massa-spektrometrianalyysiä varten.

Odotetut reaktiot: -CHO -CH=NN^2 ^C=0 (1) H2NN<ji2 ^C=0 (ei vaikutusta) -OH (2) Ac2Of pyridiini -OAc

Glukoosi antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 556 (C2gH22N20^g) ja emäsionin, jonka massa on 168 (NC^-ioniosa) ; fruktoosi antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 390 (C^gH220^) , D-glukosoni antaa molekyyli-ionin, jonka massa on 512 (C2gH2gN20g) ja voimakkaan diagnostisen ioniosan, jonka massa on 223 (OC-CH=N-N$2-ioniosa). Analyysit suoritettiin Finningan GC/MS/DS Model 4023 laitteella asennettuna 70 eV:n elektroni-iskuionisaatiolle ja 220° olevaan näytteen lämpötilaan.

4. Kolorimetrinen koeputkianalyysi. D-glukosonin analyysi glukoosin ylimäärän läsnäollessa suoritetaan helposti kahden kolorimetrisen menetelmän avulla. Käytettäessä trifenyylitetrat-soliumkloridia (TTC) havaitsemismenetelmä perustuu kahden sokerin pelkistymisnopeuden eroon. 20 millilitran koeputkeen lisätään 0,5 millilitran näyte sekä 0,1 millilitra 1-prosenttista TTC-vesiliuosta ja 0,4 millilitraa 6N NaOH-liuosta. Tarkalleen 5 minuutin kuluttua lisätään 15 millilitraa etikkahappo/etanoli-seosta (1:9) ja koeputken sisältöä ravistellaan. Käyttäen vettä vertailuna mitataan absorbanssi arvolla 480 nm käyttäen Varian 635 UV/VIS spektrometriä. Glukoosi pelkistää TTC:n punaiseksi pigmentiksi -trifenyyliformatsaaniksi - noin 100 kertaa hitaammin kuin vastaava määrä D-glukosonia. Käytettäessä difenyyliamiini/aniliini/-fosforihappo-reagenssia perustuu havaitsemismenetelmä erilaisen rakenteen omaavien sokerien muodostamiin erilaisiin väreihin.

20 millilitran koeputkeen lisätään 0,2 millilitran näyte sekä 5 millilitraa seuraavaa reagenssiseosta: 6931 4 11

Difenyyliamiinia 0,15 g

Aniliinia 0,80 ml

Isopropanolia 100 ml

Fosforihappoa 11 ml

Koeputket sijoitetaan 37°C lämpötilassa olevaan vesi-hauteeseen 60 minuutiksi. Glukoosi muodostaa keltaiseksi värittyneen liuoksen, D-glukosoni antaa purppuranpunaisen liuoksen.

Puhtaiden sokerien lähteet, joita käytettiin keksinnön erilaisissa analyyttisissä tutkimuksissa, ovat seuraavat: 1. D-glukoosin toimitti Applied Science Laboratories, puhtaus 99 %.

2. D-fruktoosin toimitti Applied Science Laboratories, puhtaus 99+ %.

3. D-glukosoni syntetisoitiin seuraavan menetelmän avulla: 20 grammaa glukoosia sekoitetaan 1 litran kanssa tislattua vettä, joka sisältää 27 millilitraa jääetikkahappoa. Lisätään 44 grammaa fenyylihydratsiinia. Reaktion annetaan jatkua 3 tuntia 80°C:ssa voimakkaasti sekoittaen mekaanisen sekoittajan avulla ja jäähdytetään sitten huoneenlämpötilaan yön ajaksi. Kiinteä aine erotetaan suodattamalla ja pestään 10-prosenttisella etikkahapolla, vedellä ja sitten etyylieetterillä. Kiinteä aine kuivataan hyvin tyhjöuunissa 50°C:ssa. Kokeellinen saanto on 16,1 grammaa glukosatsonia. Glukosatsoni sijoitetaan 3-kaulaiseen 3 litran vetoiseen pulloon ja lisätään 450 millilitraa etanolia, 750 millilitraa tislattua vettä ja 9 millilitraa jääetikkahappoa. Lisätään 27,8 grammaa tuoretta bentsaldehydiä ja seosta keitetään palauttaen voimakkaasti sekoittaen mekaanisella sekoittajalla. Reaktioseosta keitetään palauttaen 5 tuntia. Jäähdytin käännetään ja poistetaan tislaamalla 450 millilitraa lisäten 750 millilitraa tislattua vettä (lisäysputken kautta) pulloon. Reaktioseoksen annetaan jäähtyä yön ajan, jolloin saadaan bentsaldehydifenyyli-hydratsonisakka. Liuos suodatetaan ja jäännöstä pestään tislatulla vedellä (noin 1 1), kunnes vesi on kirkasta. Suodos ja pesunesteet väkevöidään 500 millilitran tilavuuteen ja niitä uutetaan sitten 10 kertaa 300 millilitran annoksilla etyylieette-riä. Etyylieetterin jäännösten poistamiseksi vesiliuoksesta si- --- τ _ 12 6931 4 joitetaan se pyörrehaihduttimeen 30 minuutiksi. Vesiliuos johdetaan 4 x 100 cm pylvään lävitse, joka sisältää perusteellisesti asetonilla pestyä Amberlite XAD-2 hartsia. Pylväs pestään 200 millilitralla lisävettä glukosonijäännösten poistamiseksi. Yhdistetyt vesiosuudet lyofiloidaan Glukosonin kokeellinen saanto on 3,4 grammaa (kokonaissaanto 16 %) .

Seuraavat esimerkit esittelevät keksinnön eri piirteitä

Ellei toisin ole mainittu, kaikki lämpötilat ovat huoneenlämpötiloja (noin 25°C) ja kaikki paineet normaali-ilan-paineita (noin 1 atm.).

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä esitetään glukoosin oleellisesti täydellinen konversio D-glukosoniksi liikkumattomaksi tehtyä hiili-hydraattioksidaasia käyttäen.

Glukoosia (2 g) lisätään 20 millilitraan tislattua vettä 100 millilitran vetoisessa Pyrex-pullossa ja sokeriliuosta sekoitetaan. Happikaasun annetaan kuplia pulloon ja lisätään 3 milligrammaa katalaasia (Sigma Chemical Co., C-40, naudan maksasta). Seuraavassa esitettävällä tavalla 200 millilitrasta viljelmää valmistettua liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia lisätään myös pulloon.

Entsyymin valmistamiseksi Polyporus obtusus-lajia olevia rihmastoja ATCC 7^ 26733 kasvatetaan hiiva/mallas-uutetta ole villa agaralustoilla seuraavasti: Hiivauutetta (3 g), mallas-uutetta (3 g), agaria (20 g), peptonia (5 g) ja glukoosia (10 g) lisätään tislattuun veteen (1 1) ja pH säädetään arvoon 6,7. Väliainetta steriloidaan 121°C:ssa 15 minuuttia. Sitten säädetään pH arvoon 6,4. Organismia inokuloidaan agar-alustoille ja kasvatetaan 7 vuorokautta 25°C:ssa. Alustalla kasvatettua organismia käytetään sitten hiiva/mallas-uuteväliaineen inokulointiin (20 ml väliainetta 125 ml Erlenmeyer-pullossa) valmistettuna edellä-esitetyllä tavalla (paitsi että agaria ei lisätä). Organismin annetaan kasvaa 9 vuorokautta pyörivässä ravistelulaitteessa 25°C:ssa. Viljelmä tyhjiösuodatetaan No 541 Whatman-paperin lävitse Buchner-suppilossa. Suodatinpaperille jäänyt rihmasto sisältää entsyymin.

13 6931 4

Rihmastoa saatuna 400 millilitrasta viljelmää pestään kahdesti 0,05 M kaliumfosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,0. Rihmasto sijoitetaan sitten Waring-sekoittimeen, joka sisältää 70 milli-litraa 0,05 M kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0 ja homogenisoidaan 3 minuutin ajan. Seosta lingotaan sitten nopeudella 6000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan ja yläpuolinen neste poistetaan dekantoimalla kiinteistä aineista. Yläpuolinen neste sijoitetaan 500 millilitran Erlenmeyer-pulloon, lisätään 19 grammaa polyetyleeniglykolia (paino 4000) ja liuosta sekoitetaan 30 minuuttia. Suspensiota lingotaan sitten nopeudella 7000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan. Yläpuolinen neste poistetaan dekantoimalla ja hävitetään. Sakkaan lisätään sitten 15 millilitraa 0,2M natriumkloridiliuosta ja 15 millilitraa 0,05M kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0 ja sekoitetaan voimakkaasti. Liuoksen annetaan seistä 30 minuuttia, minä aikana muodostuu sakka. Seosta lingotaan nopeudella 14000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan. Samea, valkoinen yläpuolinen neste, joka sisältää soluvapaata, puhdistettua entsyymiä, poistetaan dekantoimalla.

Entsyymien tekeminen liikkumattomaksi agaroosille voidaan suorittaa seuraavasti: Soluvapaata, puhdistettua entsyymiä dialysoidaan yön aikana 500 millilitraa vastaan tislattua vettä. Sitten lisätään 5 millilitraa 0,IM natriumbikarbonaattia pH-ar-vossa 8,0. Tähän liuokseen lisätään 5 grammaa aktivoitua CH-Sep-harose 4B:tä (pestynä ja turvotettuna sintratulla lasisuodatti-mella käyttäen 500 millilitraa 1 mM HCl-liuosta). Käyttäen pystyasentoista rumpusekoitinta sekoitetaan geelisuspensiota 1 tunti 25°C:ssa. Geelisuspensiota pestään sitten ensin 40 millilitralla 0,1M natriumbikarbonaattiliuosta pH-arvossa 8,0, sitten 40 milli-litralla 0,05M Tris-puskuria pH-arvolla 8,0 sisältäen 0,5M natriumkloridiliuosta ja sitten 0,5M natriumformiaattipuskuria pH-arvossa 4,0, joka myös sisältää 0,5M natriumkloridia.

Reaktioseoksesta otetaan näytteitä eri aikoina ja niistä analysoidaan glukoosi ja D-glukosoni. Käyttäen HPLC-analyysiä huippujen alat kohdissa Rfc 11,5 min (glukoosi) ja Rfc 14,0 min (D-glukosoni) määrätään kvantitatiivisesti ja lasketaan sokeri-tasot. Saadaan seuraavat tulokset: 14 6931 4

Reaktioaika Glukoosi D-glukosoni Glukoosin konvertoitumis-% tuntia grammaa grammaa D-glukosoniksi 0 2,0 0,0 0 1 1,2 0,8 40 2 0,5 1,5 75 3 0,2 1,8 90 4 < 0,1 > 1,9 > 99

Glukoosin oleellisesti täydellisen konversion D-glukosoniksi osoittaa myös täplän häviäminen kohdassa 0,58 (glukoosi) ja juovan esiintyminen kohdassa Rf 0,43-0,49 (D-glukosoni) reaktion aikana ja absorbanssin kasvu kohdassa 480 nm reaktion aikana käytettäessä TTC-kolorimetrista koeputkianalyysiä.

Se, että tuote todella on D-glukosonia, varmistuu edelläesitetyn perusteella ja massaspektrografian avulla, kuten edellä on esitetty. Tuotteelle saadaan diagnostiset D-glukosonimassa-ionit massa-arvolla 512 (molekyyli-ioni) ja massa-arvolla 223 (OC-CH=N-N^2-ionitähde).

Esimerkki 2

Seuraava esimerkki esittelee D-glukosonin kemiallista konversiota fruktoosiksi eri katalyyttejä käyttäen.

D-glukosonia (20 mg) lisätään 2 millilitraan tislattua vettä mikrohydrauslaitteessa (Supelco, Inc.). Sitten lisätään katalyyttiä ja laitteeseen johdetaan vetykaasua - jatkuvasti kuplien, jos käytetään normaalipainetta, panoksittain, jos käytetään ylipainetta.

D-glukosonijäännös ja muodostunut fruktoosi analysoidaan 5 tunnin kuluttua.

HPLC-analyysiä käyttäen määrätään kvantitatiivisesti huippujen alueet kohdissa R^ 14,0 min (D-glukosoni) ja R^_ 9,5 min (fruktoosi) lasketaan läsnäolevat sokeritasot. Saadaan seuraavat tulokset:

II

15 6931 4

Katalyytti a Paine Fruktoosiksi konvertoi tunut D-glukosonipro- _______senttimäärä 5 % ruteniumia aluminiumoksidilla normaali 40 5 % rodiumia hiilellä normaali 50 5 % platinaa hiilellä normaali 60 3.9 kp/cm^ 70 10 % platinaa hiilellä normaali 75

Platinamusta normaali 80 2

Platinaoksidi 3,9 kp/cm 65 5 % palladiumia hiilellä normaali suurempi kuin 90 2 3.9 kp/cm suurempi kuin 90

Raney-nikkeli normaali 30^ aKatalyytit toimitti Engelhard Industries, paitsi Raney-nikkelin, jonka toimitti Pfaltz and Bauer, Inc.

^Tämä katalyytti myös pelkistää muodostunutta fruktoosia - epäedullinen vaikutus D-glukoosin konversion fruktoosiksi osoittaa myös juovan häviäminen R^-arvolla 0,43-0,49 (D-glukoosi) ja täplän muodostuminen kohdassa R^ 0,52.

Se, että tuote todella on fruktoosia, varmistetaan edelläesitetyn ja massaspektrografiän perusteella, kuten aikaisemmin on esitetty. Tuotteelle saadaan diagnostinen fruktoosimassaioni massa-arvolla 390 (molekyyli-ioni).

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä esitetään D-glukosonin oleellisesti täydellinen konversio fruktoosiksi vaihtelevissa hydrausolosuh-teissa.

Reaktio A

D-glukosonia (1 g) lisätään 200 millilitraan tislattua vettä mikrohydrauslaitteessa. Sitten lisätään 5 % palladiumia (Pd) hiilellä sisältävää katalyyttiä (1 g) ja vetykaasun annetaan jatkuvasti kuplia astiaan normaalipaineessa ja huoneenlämpötilassa.

6931 4 16 24 tunnin kuluttua lisätään 5 % palladiumia hiilellä (500 mg).

Reaktio on päättynyt 30 tunnin kuluttua.

Reaktio B

D-glukosonia (1 g) liuotetaan 136 millilitraan vettä ja liuokseen lisätään 0,1 grammaa 5 % palladiumia hiilellä sisältävää katalyyttiä. Liuos pannaan tehokkaalla magneettisekoittimella 2 varustettuun paineastiaan. Laitteeseen muodostetaan 35 kp/cm oleva paine vedyn avulla tavanomaisen ilmanpoiston jälkeen. Astia kuumennetaan 135°C lämpötilaan sekoittaen sen sisältöä voimakkaasti. Laskettu I^-määrä on kulunut 75 minuutin aikana. Katalyytin poistamisen ja veden haihduttamisen jälkeen tyhjiössä saadaan siirappimainen jäännös. Tuote todetaan fruktoosiksi. Lisäksi protoni-NMR-spektri varmistaa mannitolin ja sorbitolin puuttumisen, jotka ovat jatkopelkistystuotteita.

Reaktio C

D-glukosonin (2 g) liuotetaan 140 millilitraan 88-prosent-tista etanolia ja suoritetaan reaktio kuten kohdassa B. Teoreettinen F^-määrä on kulunut 16 tunnin kuluttua.

Olosuhteet kussakin reaktiossa ja saadut tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

Painosuhde Paine Aika 2

Reaktio Katalyytti/ Liuotin Lämpöt. Kp/cm h Konversio-% _glukosoni_________ A 1,5 H20 25° 0 30 95 B 0,1 H20 130° 43,9 1,25 100 C 0,1 (88:12) 130° 40,4 4 100

Et0H:H20

Voidaan havaita, että D-glukosonin hydraus fruktoosiksi voidaan suorittaa vaihtelevin tai eroavin menettelyin käyttäen muutoksia lämpötilassa, paineessa, liuottimessa, reaktioajassa ja katalyytin ja alustan painosuhteessa. Palladiumkatalyytti ei pelkistä fruktoosia edelleen.

Esimerkki 4

Seuraava esimerkki esittelee glukoosin oleellisesti täydellisen konversion fruktoosiksi liikkumattomaksi tehdyn hiili- 6931 4 17 hydraattioksidaasin avulla kemiallisen pelkistyksen seuraamana.

Glukoosia (1 g) lisätään 50 millilitraan tislattua vettä 250 millilitran vetoisessa Pyrex-pullossa ja sokeriliuosta sekoitetaan. Agaroosilla liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraatti-oksidaasia, valmistettuna esimerkin 1 mukaisesti 50 millilitras-ta soluvapaata puhdistettua entsyymiä, lisätään sitten pulloon yhdessä 1 milligramman kanssa katalaasia (kuten esimerkissä 1).

Kahdeksantoista tunnin kuluttua vesiliuos erotetaan kiinteistä aineista dekantoimalla. Tämän liuoksen analyysi osoittaa, että >99% glukoosista on muuttunut D-glukosoniksi.

Vesiliuos sijoitetaan 100 millilitran vetoiseen Pyrex-pulloon ja sekoitetaan. Lisätään 1 gramma 5 % palladiumia hiilellä sisältävää katalyyttiä ja aloitetaan vetykaasun syöttö kuplimalla.

24 tunnin kuluttua vesiliuos erotetaan suodattamalla kiinteistä aineista käyttäen Whatman No 1 suodatinpaperia ja Celite-suodatusapu-ainetta. Analyysi osoittaa, että se sisältää enemmän kuin 95 % fruktoosia.

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä esitellään kiteisen fruktoosin valmistus glukoosista.

Glukoosin entsymaattisessa konversiossa D-glukosoniksi ja D-glukosonin kemiallisessa pelkistyksessä fruktoosiksi saadaan esimerkin 4 mukainen vesiliuos. Tämä vesipitoinen suodos haihdutetaan kuiviin tyhjössä 45°C:ssa. Saadaan valkoista kiinteää materiaalia, joka nopeasti muuttuu kumimaiseksi jäännökseksi.

Tämä jäännös liuotetaan 10 millilitraan kuumaa etanolia ja liuoksen annetaan sitten jäähtyä huoneenlämpötilassa 5 vuorokautta. Saadaan valkoinen, kiteinen materiaali, jonka fysikaaliset ominaisuudet (so. ulkonäkö, sulamispiste ja optinen kierto) ovat Selmat kuin kiteisen fruktoosin; se on kiteistä fruktoosia.

Esimerkki 6 Tässä esimerkissä esitellään glukoosin oleellisesti täydellinen konversio D-glukosoniksi glukoosi-2-oksidaasia käyttäen.

Esimerkin 1 mukainen reaktio ja siinä käytetyt olosuhteet (käyttäen agaroosia liikkumattomaksi tekevänä alustana) tois- 18 6931 4 tetaan korvaten glukoosi-2-oksidaasilla hiilihydraattioksidaasi. Viiden tunnin reaktioajan jälkeen enemmän kuin 99 % glukoosista oli muuttunut D-glukosoniksi.

Entsyymin valmistamiseksi glukoosi-2-oksidaasia, Aspergillus oryzae-lajin ATTC 9^ 7252 huovastoviljelmiä kasvatetaan lihaliemi/hiivauute/tryptoni-väliaineessa seuraavasti: liha-liemiuutetta (5 g), hiivauutetta(5 g) tryptonia (3 g), dekstroo-sia (1 g) ja Difco-tärkkelystä (24 g) lisätään tislattuun veteen (1 1) ja pH säädetään arvoon 7,3. Väliainetta steriloidaan 121°C: ssa 35 minuuttia. Yleisesti tunnetulla tavalla saatuja itiöitä 4 käyttäen väliaine ympätään niin, että saadaan noin 3 x 10 itiötä millilitraa kohti ja kasvatus suoritetaan pyörivässä ravistus-laitteessa (180 rpm) 30°C:ssa 2 vuorokauden aikana. Viljelmä suodatetaan tyhjiössä Whatman No 541 suodatinpaperin lävitse Buchner-suppilossa ja pestään useita kertoja vedellä. Suodatinpaperille jäänyt huovasto sisältää entsyymin.

Entsyymin puhdistus ja sen tekeminen liikkumattomaksi voidaan suorittaa sitten esimerkin 1 mukaisen menettelyn avulla.

D-glukosoni voidaan sitten konvertoida fruktoosiksi esimerkin 3 mukaisen menettelyn avulla.

Esimerkki 7

Esimerkissä 1 glukoosin reaktiossa hiilihydraattioksi-daasin kanssa ja siihen liittyvässä D-glukosonin muodostuksessa kehittyneen vapaan vetyperoksidin taso minimoidaan käyttäen kata-laasia vetyperoksidin hajottamiseksi. Vaihtoehtoinen menetelmä vapaan vetyperoksin määrän minimoimiseksi on kytkeä sen muodostuminen vetyperoksidia kuluttavaan reaktioon halutun (arvokkaan) sivutuotteen muodostamiseksi.

Tässä esimerkissä vetyperoksidin muodostuminen yhdistetään propyleenibromihydriinin valmistamiseen, joka on välituote propyleenioksidin synteesissä, joka on esitetty US-patentti- julkaisuissamme 4 247 641 ja 4 284 723. Glukoosin ja liikkumattomaksi tehdyn Polyporus obtusus-lajin ATCC 7^ 26733 hiilihydraat- tioksidaasin reaktio D-glukosonin ja vetyperoksidin saamiseksi yhdistetään liikkumattomaksi tehdyn Coralina sp.-lajin meriheinän peroksidaasin reaktioon bromidin ja propyleenin kanssa propylee- 19 6931 4 nibromihydriinin muodostamiseksi. Lopputuotteena tästä yhdistetystä reaktiosta on sitten seuraavassa fruktoosin valmistuksessa tarvittavan glukosonin ja propyleenibromihydriinin samanaikainen muodostuminen, mikä jälkimmäinen voidaan helposti muuttaa propy-leenioksidiksi, kuten US-patenttijulkaisuissamme 4 247 641 ja 4 284 723. Jokainen entsyymi, joka pystyy hapettamaan hydroksyyli-ryhmän glukoosin 2-hiiliatomissa ja johon liittyy vetyperoksidin muodostuminen, voidaan yhdistää jokaisen halogenoivan peroksidaa-sin kanssa ja yhdistelmää voidaan käyttää alkeeni-halohydriinin tuotantoon edellämainittujen US-patenttijulkaisujen periaatteiden mukaan.

Soluvapaa, puhdistettu meriheinän peroksidaasientsyymi valmistetaan seuraavasti.

Coralina sp.:tä saatuna La Jolla'n rannikolta Kaliforniasta jauhetaan Virtis 45 homogenointilaitteessa 5 minuutin ajan tislatussa vedessä. Homogenoitua tuotetta lingotaan nopeudella 20 000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan. Yläpuolinen neste poistetaan dekantoimalla ja otetaan talteen. Jäännös sus-pendoidaan uudelleen tislattuun veteen ja lingotaan. Tämä yläpuolinen neste ja aikaisempi yläpuolinen neste yhdistetään. Liuos saatetaan ensin 33 prosentin sitten 55 prosentin kyllästystilaan ammoniumsulfaatissa. Linkoaminen ja jäännöksien erottaminen suoritetaan jokaisessa vaiheessa. Jäännösjae 33-55 prosenttia johdetaan DEAE-pylvään lävitse käyttäen 0,3M - IM fosfaattipusku-rigradienttia (pH-arvo 6,0). Jae, joka eluoituu arvolla IM, di-alysoidaan 20 mM fosfaattipuskuria (pH-arvo 6) vastaan yön aikana .

Liikkumattomaksi tehty meriheinä-peroksidaasi valmistetaan seuraavasti.

Lasipalloja (myy Sigma Chemical Company, PG-700-200) aktivoidaan upottamalla 1 gramma lasipalloja 18 millilitraan de-ionisoitua vettä. Lisätään 2 millilitraa 10-prosenttista (tilav./ tilav) .tö -aminopropyylitrietoksisilaania ja seoksen pH säädetään arvoon 3-5 6N HCl-liuoksen avulla. Seosta ravistellaan 75°C:ssa kaksi tuntia. Lasipallot kuivataan sitten tyhjössä yön aikana 80°C:ssa. Lasipalloihin lisätään 3,2 millilitraa edelläesite- 20 6931 4 tyllä tavalla valmistettua puhdistettua Coralina sp.-entsyymiä ja 50 milligrammaa vesiliukoista karbodi-imidiä. Seoksen pH säädetään arvoon 4,5 ja sitä ravistellaan 4°C:ssa yön ylitse. Tuote (entsyymipäällysteiset pallot) pestään vedellä. Aktiviteetti mitataan 2 monoklooridimedoniyksikköinä grammaa kohti palloja.

Agaroosille liikkumattomaksi tehty hiilihydraattioksidaasi valmistetaan kuten esimerkissä 1 10 millilitrasta soluvapaata, puhdistettua entsyymiä.

Reaktioseos, joka sisältää seuraavat aineosat, pannaan 100 millilitran vetoiseen Pyrex-pulloon: a) 1 gramma meriheinä-peroksidaasilla päällystettyjä lasipalloja, b) edelläesitetyllä tavalla valmistettua, liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia, c) 800 milligrammaa kaliumbromidia ja d) 20 millilitraa 0,01M kaliumfosfaatti-puskuria, pH-arvo 7,0.

Sekä propyleenin että hapen annetaan kuplia jatkuvasti pulloon. Reaktio aloitetaan 1 grammalla glukoosia. 20 tunnin kuluttua reaktioseoksesta otetaan näyte ja siitä analysoidaan jäännös-glukoosi, D-glukosoni ja propyleenibromihydriini. Muodostunut pro-pyleenibromihydriini analysoidaan seuraavasti: 5 mikrolitraa reaktioseosta injektoidaan Hewlett-Packard Model 402 kaasukromatografiseen laitteeseen, joka on varustettu kooltaan 1,8 m x 0,32 cm suuruisella lasipylväällä pakattuna Po-rapak R materiaalilla (80/100 mesh). Virtausnopeus on 30 ml/mi-nuutissa heliumille ja pylvään lämpötila säädetään arvoon 200°C. Propyleenibromihydriinin viipymisaika on 9 minuuttia l-bromi-2-propanolille ja 10 minuuttia 2-bromi-l-propanolille.

Tuote tunnistetaan vertaamalla propyleenibromihydriinin autenttisiin näytteisiin; l-bromi-2-propanolia myy Pfaltz and Bauer, Inc.; 2-bromi-l-propanoli syntetisoidaan pelkistämällä 1-bromipropionyylikloridi litiumaluniniumhydridin avulla. Reaktio-tuotteiden ja alkuperäisten näytteiden viipymisajat ovat samat ja niiden massaspektrit ovat identtiset; bromi tunnistetaan saman voimakkuuden M ja M+2 isotooppikasaumien läsnäolon avulla; 6931 4 21 molempien isomeerien molekyyli-ioni tunnistetaan kemiallisen ioni-soinnin avulla isobutaanireagenssikaasua käyttäen (M+; m/e 138+140); 1- bromi-2-propanolille päälohkeaminen on odotettu CI^Br-häviö, kun taas 2-bromi-l-propanolille päälohkeaminen on odotettu CH^CHBr-häviö.

Näytteen analyysi osoittaa >99 prosentin glukoosin konversion D-glukosoniksi ja propyleenibromihydriinin tuotto on 20 g/1.

Esimerkki 8 Tässä esimerkissä esitellään edelleen esimerkissä 7 mainittuja ja esitettyjä käsitteitä. Tässä tapauksessa liikkumattomaksi tehdyllä glukoosi-2-oksidaasilla korvataan liikkumattomaksi tehty hiilihydraattioksidaasi.

Liikkumattomaksi tehty meriheinä-peroksidaasientsyymi valmistetaan kuten esimerkissä 7. Liikkumattomaksi tehty glukoosi- 2- oksidaasi valmistetaan kuten esimerkissä 6.

Reaktioseos valmistetaan esimerkissä 7 esitetyllä tavalla korvaten liikkumattomalla glukoosi-2-oksidaasilla liikkumattomaksi tehty hiilihydraattioksidaasi. Reaktioseoksesta otetaan näyte 20 tunnin kuluttua ja analysoidaan siitä jäännösglukoosi, D-glukosoni ja propyleenibromihydriini. Tulokset osoittavat >99-prosenttisen glukoosin muuttumisen D-glukosoniksi ja propyleenibromihydriinin tuotanto on 19,5 g/1.

Esimerkki 9 Tässä esimerkissä esitellään glukoosin tehokasta konversiota D-glukosoniksi pitkähkön ajan aikana liikkumattomaksi tehtyä hiilihydraattioksidaasia käyttäen pylväsreaktorissa.

Esimerkin 1 mukaan valmistettu hiilihydraattioksidaasi (soluvapaata, puhdistettua entsyymiä, 10 millilitraa) tehdään liikkumattomaksi hydroksiapatiitille (kalsiumfosfaattihydroksidi) seuraavasti.

Sataan millilitraan soluvapaata, puhdistettua entsyymiä lisätään 20 grammaa hydroksiapatiittia 100 millilitrassa 1 mM kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0. Seosta sekoitetaan 30 minuuttia, kiinteät aineet erotetaan sitten nesteestä de-kantoimalla ja kiinteät aineet pestään ensin 200 millilitralla 6931 4 22 10 mM kaliumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,0 ja sitten 200 milli-litralla tislattua vettä.

Tämä materiaali pakataan sitten lasipylvääseen (0,5 cm x 4,5 cm). Pylvään lävitse johdetaan 1-prosenttista glukoosiliuosta virtausnopeudella 1,5 millilitraa tunnissa. Eluaatista analysoidaan aika ajoin jäännösglukoosi ja muodostunut D-glukosoni.

Eluaatti, jota valmistettiin jatkuvasti 5 vuorokauden ajan, osoitti, että enemmän kuin 95 prosenttia glukoosista oli muuttunut D-glukosoniksi.. Vetyperoksidia ei havaittu. Tutkimus päätettiin ennen entsyymin todellisen puoliintymisajan määräämistä. Tässä kokeessa käytetyllä pienellä virtausnopeudella sekä hapen saatavuus että kerääntyneen vetyperoksidin puuttuminen vaikuttivat glukoosin oleellisesti täydelliseen konversioon D-glukosoniksi. Tässä tapauksessa tukialusta, hydroksiapatiitti, aiheutti vetyperoksidin hajaantumisen.

Täten voidaan havaita, että keksintö edustaa ensimmäistä, kaupallisesti käyttökelpoista menetelmää glukoosin konvertoimiseksi fruktoosiksi, jolloin ei vaadita kalliita vaiheita glukoosin ja fruktoosin erottamiseksi. Jokainen menetelmävaihe voidaan suorittaa helposti huoneen lämpötilassa ja normaalipaineessa, jolloin haluttaessa energiatarve voidaan minimoida. Menetelmän sivutuotteita ei ole vaikea hävittää tai käyttää hyödyksi ja päätuote on oleellisesti puhdasta fruktoosia, joka voidaan helposti saada kiteisessä muodossa.

Viitteet: 1. Specialized Sugars for the Food Industry, toimittanut Jeanne C. Johnson, Noyes Data Corporation, 1976, sivut 130-201.

2. C.R. Becker ja C.E. May, J.Amer.Chem.Soc., 71, 1491 (1949).

3. F. Petuely, Monatsch. fur Chem., 83, 765 (1952).

4. R. Selby, M.A. Morrel ja J.M. Crofts, J.Chem.Soc., 75, 787 (1899).

5. W.L. Evans, W.D. Nicoll, G.C. Strouse ja C.E. Waring, J. Amer. Chem. Soc., 50, 2267 (1928) 6. Advances in Carbonhydrate Chemistry, Vol. II, toimittanut M.L. Wolfrom, 1956, sivut 43-96.

7. H.J. Hass ja P.Schlimmer, Liebigs Ann.Chem., 759,208.

8. C.Berkeley, Biochem. J., 27, 1357 (1933).

23 6931 4 9. C.R.Bond, E.C.Knight ja T.K.Walker, Biochem. J., 31, 1033 (1937).

10. R.C. Bean ja W.Z. Hassid, Science, 124, 171 (1956).

11. F.W. Janssen ja H.W. Ruelius, Biochem. Biophys. Acta, 167, 501 (1968).

12. J. Vole. M. Wurst ja V. Musilek, Folia Microbiol., 23, 448 (1978).

13. B.N. White ja R. Carubelli, Carbohydr. Res., 33, 366 (1974) .

14. Microbial Transformation of Non-Steroid Cyclic Compounds, toimittanut K. Kieslich, Gerg Threme Publishers, Stuttgart, 1976, sivut 279-280.

15. US-patentti no 3 050 444, A.G. Holstein (1962).

16. Z. Diwnjak ja M.D. Lilly, Biotechnology and Bioengineering, 18, 737-739, (1976).

17. Y.K. Cho ja J.E. Bailey, Biotechnology and Bioengineering, 19, 769-775, (1977).

Claims (6)

6931 4 24

1. Menetelmä fruktoosin valmistamiseksi glukoosista, tunnettu siitä, että muodostetaan D-glukoosin vesiliuos, konvertoidaan vähintään noin 95 % liuoksen D-glukoosista D-glukosoniksi liuoksessa entsymaattisella hapetuksella käyttämällä oksidoreduk-taasientsyymiä hapen läsnäollessa ja poistamalla tai käyttämällä rinnakkaisprosessissa samanaikaisesti muodostunut vetyperoksidi, ja konversion jälkeen D-glukosoni hydrataan D-fruktoosiksi hydraus-katalyytin avulla, joka edullisesti on ryhmän VIII alkuaine tai kantajalle tuettu palladium.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on Aspergillus oryzae-lajista saatu glukoosi-2-oksidaasi tai Polyporus obtusus-lajista saatu hiilihydraattioksidaa-si.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on tehty liikkumattomaksi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vetyperoksidi poistetaan entsymaattisen hajottamisen avulla katalaasia käyttäen.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vetyperoksidi käytetään rinnakkaisprosessissa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se suoritetaan pylväsreaktorissa.