KR960011917B1

KR960011917B1 - 신규 시토크롬 p-450 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR960011917B1
Application number: KR1019880000924A
Authority: KR
Inventors: 다쓰지 마쓰오까; 스니찌 미야꼬시
Original assignee: 상꾜 가부시끼가이샤; 가와무라 요시부미
Priority date: 1987-02-02
Filing date: 1988-02-02
Publication date: 1996-09-04
Also published as: IE63843B1; FI880458A0; FI94647C; FI880458A; EP0281245A3; AU605543B2; DK175425B1; DK53488A; FI94647B; DE3850589D1; AU1117988A; KR880010123A; CA1313637C; EP0281245B1; IE880278L; DK53488D0; ATE108483T1; EP0281245A2; HK1005747A1; DE3850589T2

Abstract

내용없음.

Description

신규 시토크롬 P-450 및 그의 제조방법

본 발명은 신규 시토크롬 P-450 효소에 관한 것이다.

효소 시토크롬 P-450은 동물, 식물 및 미생물에서 발견되어 왔다. 시토크롬 P450-의존 모노옥시게나아재계는 중요한 생리학적 화합물의 합성을 촉매하고, 외부물질, 즉 크세노비오틱(Xenobiotics)의 대사에 관여한다. 그것은 광범위한 천연 생성물 및 약품의 기체로서 사용될 수 있다.

그 효소 작용을 위해서 시토크롬 p-450은 NAD(P)H 같은 보효소(coenzyme), 페레독신과 같은 전자-전달 단백질, 및 산소 분자를 필요로 한다. 하기 기작은 기질 S가 대사되어 생성물 SOH를 생산하는 것을 설명하기 위해 가정된 것이며, Fe는 시토크롬 P-450의 활성부위를 나타낸다.

이 기작에서, 환원을 수행하는 전자는 전자-전달 단백질의 중재효과를 통하여 NAD(P)H에서 제공된다.

일반적으로, 시토크롬 P-450 효소는 주로 진핵생물에서 분리되어 왔고, 물에 불용성이다. 원핵생물에서 분리된 시토크롬 P-450 효소도 알려져 있는데, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas Rutida)에서 분리된 P-450cam[J Biol Chem(1974)249,94] 바실루스 메가테리움(Bacillys megaterium) ATCC 14581에서 분리된 P-450_BM-1및 P-450_BM-3[각각 BioChim Biophys Acta(1985), 838, 302 및 J Bial Chem(1986) 261,7160에 보고됨]; 리조비움 자포니큼(Rhizobium japonicum)에서 분리된 P-450a, P-450b 및 P-450c [Biochim Biophys Acta(1967) 147, 399; 및 노카르디아(Nocardia) NHI에서 분리된 P-450npd [Microbios(1974)9,119]를 포함한다.

스트렙토미세스(Streptomyces)미생물에서 정제된 시토크롬 P-450 효소는 비교적 보고되지 않은채로 남아 있다. 콩가루로 스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에서 시토크롬 P-450의 유도는 문헌[Biochem and Biophys Res Comm(1986)141, 405)에 기재되어 있다. 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea) [원래 스트렙토미세스에리트라에우스(Streptomyces erythraeus)로 분류됨]의 2가지 형태의 6-데옥시에리트로놀리드 B 히드록실라제의 분리 및 특성은 문헌[Biochemisry(1987) 26, 6204에 기재되어 있다.

유럽 특허 명세서 제215,665호(1987. 3. 25에 공고) 및 대응하는 미합중국 특허 출원 제906,034호(1986. 9. 10에 출원)에, 효소적 히드록실화가 기재되어 있다.

히드록실화는 스트렙토미세스 속 또는 노카르디아 속의 미생물에 의해 생산된 히드록실화 효소로 수행된다.

적절한 히드록실화 효소를 생산하는 새롭게 분리된 스트렙토미세스의 4가지 균주는 유럽 특허 제215,665호 및 미합중국 특허 출원 제906, 034호에 기재되어 있는데, 스트렙토미세스 sp SANK 62585가 포함된다.

스트렙토미세스 sp SANK 62585는 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업 기술연구소(FRI)에 수탁변호 FERM P-8440로 1985년 9월 5일에 기탁되었고 부다패스트 조약하에 수탁번호 FERM BP-1145로 1985년 8월 13일에 재기탁되었다.

본 발명의 목적은 신규 시토크롬 P-450 효소를 제공하는 것이다. 또한 본발명의 목적은 시토크롬 P-450 효소의 신규 생산 방법 및 이러한 효소를 이용하여 히드록실화된 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 시토크롬 P-450 효소를 제공한다. 이러한 효소의 분자량을 전형적으로 46,000±1,000이다. 효소는 스트렙토미세스에서 수득되고, 여러가지 다른 화합물을 히드록실화 할 수 있는 히드록실화 효소이다.

특히, 본 발명은 신규 효소 시토크롬 P-450_sca-1, P-450_sca-2및 P-450_sca-3를 제공한다. 효과적인 계를 얻기 위해 하나 또는 그 이상의 이들 효소를 적절한 성분과 결합시키면, 효소에 대한 기질을 히드록실화된 유도체로 전환할 수 있다.

효소 시토크롬 P-450_sca-1, 시토크롬 P-450_sca-2및/또는 시토크롬 P-450_sca-3을, 지금은 스트렙토미세스 카르보필루스 (Streptomyces carbophilus) 종으로 밝혀진, 곧지의 스트렙토미세스 SANK 62585 FERMEP-1145으로부터 추출 및 정제할 수 있다.

유럽 특허 제215,665호 및 미합중국 특허 출원 제906,034호에 기재된 대로, 스트렙토미세스 균주 SANK62585는 액티노미세테스(Actinomycetes)의 스트렙토미세스 속에 속하는 것으로 알려져 있다[유럽특허 제215,665호 및 미합중국 특허 출원 제906,034호 참고].

스트렙토미세스 균주 SANK 62585의 형태학적 및 생리학적 특성은 통상적인 배지 및 쉴링 및 고틀리에브[Shirling and Gottlieb : International Journal of systematic Bacterilogy(1966)16 313∼340]에 기재된 방법을 몇가지 보충시험과 함께 사용하여 결정했다. 28℃에서 14일 동안 보온한 후 배지를 관찰했다. 사용하는 색채명은 문헌[Guideto Colour Standard, 일본국, 도꾜, 니뽕 시끼사이 겡뀨쇼에서 출판된 매뉴얼]에 따라 선정했다. 배양물의 특성을 ISP(International Streptomyces Project) 표준에 따라 기재된, 그리고 문헌[The Actinomycetes, volume 2 by Waksman : The ISP Report by Shirling and Gottlieb; Bergey's Manual of Determinative Bacteriolgy 8th edition 및 액티노미세테스의 분류에 관한 기타 최근 문헌에 기재된 각종 공지된 액티노미세테스 종의 특징과 비교하였다.

1. 형태학적 특성

현미경 및 전자 현미경으로 관찰했을때에, 균주 SANK 62585의 영양균사는 완전히 가지를 치고 발달했으며, 기균사는 한방향으로만 가지를 쳤다. 균주 SANK 62585의 포자 사슬은 보통 곧거나 또는 굴곡성이지만, 때때로 나선형이고 포자 표면은 매끄럽다. SANK 62585에서는 휠, 피체, 기본적인 균사분열(basalhyphae fragmentation) 및 포자낭과 같은 특별한 기관은 관찰할 수 없다.

2. 분류용 배지에서의 성장

각종 배지에서의 균주의 성장은 다음 표에서 나타내지는데 하기 약칭을 사용한다 :

G : 성장

AM : 기균사체

R : 뒷면

SP : 가용성 색소

3. 생리학적 특성

균주 SANK 62585의 생리학적 특성은 다음 표에 나타내지는데, 배지 1∼4로 표시된 배지는 하기와 같다 :

배지 1 : 효모추출액 맥아 추출액 한천(ISP 2)

배지 2 : 트립톤 효모 추출액 브로쓰(ISP 1)

배지 3 : 펩톤 효모 추출액 철 한천(ISP 6)

배지 4 : 티로신 한천(ISP 7)

* 가양성 : 배양말기에 멜라닌이 형성되는 경우가 있음

프리드함-고틀리에브(Pridham-Gottlieb)한천을 사용하여, 14일 동안 배양한 후 각종 탄소원의 동화를 연구했다. 균주 SANK 62585는 탄소원이 없는 이러한 대조 배지에서 잘 자라기 때문에 정확한 동화 능력을 평가하기는 어렵다. 따라서, 다음 표에서는 참고 대조 배지에서의 균주의 상대적인 동화 능력을 참고로 나타낸다(예, 대조 배지에 탄소원을 첨가한 때와 첨가하지 않은 때의 성장 차이의 평가).

4. 세포 성분

균주 SANK 62585의 세포벽은 비. 벡커 등(B. Becker

)의 방법[Applied Microbiology

, 421∼423(1964)]에 따라 분석했다. 모든 균주의 세포벽에서

,

-디아미노피멜산 및 글리신이 확인되었기 때문에, 세포벽은 형태 I으로 여겨졌다. 미생물의 모든 세포의 당성분은 M.P. 르슈발리에의 방법[M. P. Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine

, 934(1968)]에 따라 결정했다. 독특한 형태는 관찰할 수 없었다.

유럽 특허 제215,665호 및 미합중국 특허 출원 906,034호에서는 균주 SANK 62585의 종이 나타나 있지 않았다. 통상적인 기준[the ISP(The International Streptomyces Project); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Eighth Edition; The Actinomycetes by S. A. Waksman : 액티노미세테스에 관한 기타 최근 문헌]에 따른 부가적인 조사는 형태학적 및 생리학적 특성이 대체로 스트렙토미세스카르보필루스의 특성과 일치하는 것을 나타냈다.

이런 이유에서, 시토크롬 P 450 효소를 생산하는 스트렙토미세스 균주 SANK 62585를 스트렙토미세스카르보필루스 SANK 62585로 명명했다. 언급했듯이, 이 균주는 부다페스트 조약에 따라 1985년 8월 13일에 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소(FRI)에 기탁되어, 수탁번호 FERM EP-1145를 받았다. 균주의 견본은 부다페스트 조약의 관련 조항하에 공급받을 수 있다.

스트렙토 미세스 카르보필루스 SANK 62585를 포함하는 액티노미세테스는 자연적 요인 및 UV 방사, 방사선 처리 및 화학처리와 같은 인공적인 처리의 결과로 쉽게 돌연변이를 일으킨다.

본 발명은 균주 SANK 62585의 모든 생산적 돌연변이주를 포함한다. 이 돌연변이 균주는 또한 유전자재조합, 형질도입 및 형질 전환과 같은 유전자 조작에 의해 수득된 어떤 균주도 포함한다. 또한 액티노미세테스의 특성이, 연속 배양 후에는 동일한 균주에서 조차 어느 정도 변한다는 점은 잘 알려져 있다. 그러므로, 항상 균주가 배양 특성의 작은 차이 때문에 분류학적으로 구별될 수는 없다.

본 발명은 하나 이상의 시토크롬 P 450 효소를 생산할 수 있는 모든 균주를 포함하는데, 특히 균주 SANK 6285 또는 그의 돌연변이주와 명백히 주별될 수 없는 균주가 포함된다.

P-450 효소를 생산하기 위한 스트렙토미세스 카르보필루스 균주 62585의 배양은 잘 알려진 영양소를 포함하는 통상적인 배양 배지에 이러한 미생물을 접종하여 적절히 수행한다. 그러므로 배양 배지에는 동화 가능한 탄소원 및 동화 가능한 질소원이 포함되고, 때때로 무기염도 포함된다. 동화 가능한 탄소원의 예로는 글루코우즈, 슈크로우즈, 녹말, 글러세린, 기장젤리, 당밀 및 콩기름이 포함된다. 동화 가능한 질소원의 예로는 콩 고형분(예, 두육(soybean meaI) 또는 콩가루), 밀 메아, 고기즙, 펩톤, 옥수수 침지액, 건조 효모 및 황산 암모늄과 같은 암모늄염이 포함된다. 필요에 따라 염화나트륨, 염화칼륨, 탄산칼슘 및 각종 인산염과 같은 무기염도 또한 포함할 수 있다. 배지는 보통 멸균되고 pH 5∼8로 조정된다. 사용되는 특별한 배양기술이 본 발명에 중요하지는 않으며 스트렙토미세스의 배양에 사용되는 일반적인 어떤 기술도 본 발명에 동등하게 사용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 기술은 상업적 효율을 고려하여 선택한다. 그러므로 액체 배양이 보통 더 바람직하고 액침 배양법이 상업적인 관점에서 볼때 가장 편리하다. 배양은 호기성 조건하에서 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 효소는 유도 효소이고, 유도제가 존재하지 않는한 생산되지 않는다. 바람직하게는, 분리된 효소에 대한 목적 기질과 동일한 유도제를 선택한다. 접종 후 4시간∼3일이 경과했을때, 바람직하게는 1∼5mM, 더 바람직하게는 2mM의 유도체를 첨가한 후, 배양을 2시간∼1주일간, 바람직하게는 약 하루동안 계속한다.

배양온도는 전형적으로 20∼45℃, 바람직하게는 25∼30℃, 약 28℃가 최적하다. 진탕 배양 또는 통기 기술을 체택한다.

배양에서 수득된 세포는 완충용액내에서 초음파 처리하여 파괴한후 원심분리로 수득된 상층액은 초(crude) 효소 용액을 제공한다. 본 발명의 효소는 105,000g로 1시간 동안 원심분리하여 수득된 상충액 내에 존재한다.

전기 연동적으로 순수한 P-450_sca-1, P-450_sca-2, P-450_sca-3를 수득하기 위해서, 세포 파괴후에 수득된 조(crude)효소 용액을 투석, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 겔여과, 히드록실아파타이트 컬럼 크로마토그래피, 또는 이들의 조합으로 정제할 수 있다.

정제의 실례가 되는 방법은 하기 표에 나타내진다.

인산염 완충액의 농도구배를 사용하는 히드록실아파타이트 크로마토그래피에서, 시토크롬 P-450_sca-1이 가장 먼저 용출되고 (약 0.06M 인산염 완충액에서), 시토크를 P-450cac-2는 두번째로 용출되며(약 0.08M 인산염 완충액에서), 시토크롬 P-450_sca-3는 세번째로 용출된다(약 0.10M 인산염 완충액에서).

이 방법에서 수득된 각각의 정제된 시토크롬 P-450 효소는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에서 양극쪽을 향해 단일 밴드로 이동되었다.

본 발명에 따라서 제공된 시토크롬 P-450_sca-1, 시토크롬 P-450_sca-2및 시토크롬 P-450_sca-3은 기타 시토크롬 P-450 효소와는 다르다.

본 발명의 각 효소는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 이용한 측정에 기초했올때 46,000±1,000의 분자량을 갖는다.

최대 자외선 흡수는 417nm에서 일어난다. 감소된 CO대 감소된 차 스팩트럼(difference spectrum)에서, 시토크롬 P-450_sca-1은 449nm에서 최대 흡수를 갖고, 시토크롬 P-450_sca-2및 시토크롬 P-450_sca-3은 모두 448nm에서 최대 흡수를 갖는다.

각 효소는 독특한 아미노산 조성을 갖는다. 하기 자료에서 나타내진다.

본 발명의 효소는 히드록실화 효소로 유용하다. 그것은 각종 다른 화합물을 히드록실화할 수 있다. 따라서, 본 발명은 더 나아가 본 발명의 효소를 이용하여 하나 또는 그 이상의 히드록시기를 도입함을 특징으로 하는 기질의 히드록실화 방법을 제공한다.

효소와 기질이 접촉은 바람직하게는 수용성 배지에서, 예를들면 pH 값이 5∼9, 더 바람직하게는 6.5∼8.0인 범위 및 인산염 완충용액 내에서 효과적이다. 반응 온도는 바람직하게는 20∼45℃, 더 바람직하게는 25∼30℃의 범위내이다. 최적 온도는 약 30℃이다. 반응 배지에서 기질의 농도는 바람직하게는 0.01∼5.0 중량%의 범위내이다. 반응에 필요한 시간은 다양한다. 반응 혼합물내의 기질 농도, 반응온도 및 기타 요인등에 의존하지만, 보통 1분∼5일이고, 더 일반적으로는 1일∼5일이다.

전환 반응을 관찰한 후에, 히드록실화 화합물을 예를들면 여과, 용매 추출, 크로마토그래피, 결정화, 및 기타 분리 방법 등이 포함되는 통상적인 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 이러한 방법은 생성물의 동정성(identity)을 고려하여 선택된다.

그전에, 분리동안 또는 분리후에, 생성물을 목적한 대로 유동할 수 있다.

본 발명을 전혀 다른 구조의 2가지 종류의 기질, 및 밀베마이신과 같은 마크롤리드 화합물 및 ML-236B 화합물을 참고로 하여 더 설명하겠다.

16-원 마크롤리드 고리에 기초한 구조를 갖는 공지된 화합물에는 몇 종류가 있다. 그것들은 각종 미생물을 발효시켜 수득하거나 또는 이러한 천연 발효 생산물의 화학적 유도에 의해 반-합성적으로 수득되고, 살비력, 살충력, 구충력 및 기타 기생충방체력을 나타낸다. 밀베마이신 및 아베르멕틴은 공지된 화합물의 이러한 2가지 종류의 예이지만, 또한 각종 다른 종류도 존재하며 다른 이름 또는 코드 번호로 명명된다. 이들 각종 마이롤리드 화합물에 대한 이름은 일반적으로 각 종류의 천연 화합물을 생산하는 미생물의 이름 또는 코드 번호에서 취해지며, 이들 이름은 동일 종류의 화합물 유도체를 포괄적으로 나타낼 수 있으며, 결과적으로 일반적으로 사용하기 위한 이러한 화합물의 표준 계통명은 있다.

혼동을 파하기 위하여 본 발명의 명세서에서는 하기 일반식(C)의 가설적인 모화합물을 기초로 명명한다 :

의심을 피하기 위하여, 일반식(C)에서는 또한 본 발명 화합물에 가장 적절한 몇몇 탄소 원자의 번호를 보여준다. 4번 위치의 메틸기는 C-26으로 번호가 매겨졌다.

천연적으로 생산된 밀베마이신은 일련의 화합물을 형성한다. 다른 것 중에서 밀베마이신 A₃및 A₄는 미합중국 특허 제3,950,360호에 기재되어 있고, 밀베마이신 D는 화합물 B-410로 표기되었지만, 미합중국 특허 제4,346,171호에 기재되어 있다. 이 화합물들은 위치 25가 각기 메틸기, 에틸기 또는 이소프로필기로 치환되어 있는 상기 일반식(C)로 나타내진다. 위치 25가 2차-부틸로 치환된 밀베마이신 유사체는 미합중국 특허 제4,173,571호에 기재되어 있다.

13-히드록시밀베마이신은 미합중국 특허 4,093,629호 및 유럽특허 명세서 제246,739호에 기재되어 있다. 13-히드록시-5-케토밀베마이신 유도체는 미합중국 특허 제4,423,209호, 또한 유럽특허 명세서 제184,308호 및 일본 특허공개 제108,785(1984)호에 기재되어 있다. 밀베마이신 5-옥심 유도체는 미합중국 특허 제4,547,520호 및 유럽 특허 명세서 제203,832호에 기재되어 있다. 영국 특허 명세서 제2,168,345호에서는 위치 13에 카르복시 또는 에스테르화된 카르복시 치환체를, 위치 5에 히드록시 또는 에스테르화된 히드록시 치환체와 함께 갖는 밀베마이신 유도체가 기재되어 있다.

14-히드록시메틸밀베마이신 화합물은 문헌[J Am Chem Soc(1977)99, 5526]에 기재된 대로 5-케토밀베마이신을 셀렌옥시드/t-부틸 히드로퍼옥시드를 이용하여 산화한 후, 위치 5의 케토리를 수소화 붕소나트륨을 이용하여 환원시켜 제조할 수 있다.

24-히드록시메틸밀베마이신 화합물은 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에FERM P-6181, FERM P-6182 및 FERM P-6183으로 기탁된 아미콜라타 오토트로피카(

)의 균주를 이용하여 밀베마이신 화합물을 미생물적으로 히드록실화시켜 제조할 수 있다. 기탁된 균주는, 기탁 당시 각기 노카르디아 sp SANK 6278l, 노카르디아 sp SANK 62881 및 노카르디아 sp SANK 62981로 명명되었다.

그것들의 균류학적 특징은 일본국 특허 공개 58-89191에 기재되어 있다. 분류학적 견지에서, 세포벽 성분의 차이 때문에 노카르디아속과는 무관하고, 현재는 아미콜라타 속으로 분류된다.

[lnternational Journal of Systemetic Baciteriology(1986),

, 29].

밀베마이신과 마찬가지로 아베르멕틴은 동일한 16-원 마크롤리드 고리를 기초로 한다. 아메르팩틴은, 예를들면 문헌[J Autimicrob Agents Chemother, 1979,

, 361(1979) 및 J Am Chem Soc, 1981,

, 4216]에 기재되어 있다. 이 화합물은 상기 일반식(C)으로 나타내지지만, 위치 13은 4'-(α)-

-올레안드로실-α-

-올레안드로실옥시기로 치환되어 있다.

위치 25는 이소프로필기 또는 2차-부틸기로 치환될 수 있고, 위치 22와 23 사이에 탄소-탄소 이중 결합이 있거나 위치 23에 히드록시기가 있을 수 있다.

아베르멕틴은 아래와 같이 정의된다 :

상기 표중에서, R₂₅는 위치 25의 치환체이고; R₂₃은 위치 23의 치환체이며 : R₅는 위 5의 치환체이다 : db는 위치 22와 23 사이의 이중 결합을 나타내며; sb는 위치 22와 23 사이의 단일 결합을 나타낸다.

아베르멕틴 A₂a, A₂b, B₂a 및 B₂b의 23-케토 유도체는 미합중국 특허 제4,289,760호에 공지되어 있다. 22,23-디히드로아베르멕틴은 위치 22와 23 사이의 이중결합을 환원하여 수득하는데 미합증국 특허 제4,199,569호에 기재되어 있다. 아베르멕틴의 애글리클론 유도체는 13-히드록시밀베마이신 유도체인데 문헌에 기재되어있다. 그것은 때때로 C-076 화합물로 언급된다. 각종 유도체가 알려져 있는데, 예를들면, 미합중국 특허 제4,201,861호에 위치 13이 저급알카노일기로 치환된 이러한 유도체가 기재되어 있다.

유럽특허 명세서 제l70,006호에서는, 발효에 의해 생산되고, 총체적으로 코드 번호 LL-F 28249로 명명된 생활성 화합물 족이 기재되어 있다, 이것들 중 몇가지는 상기 일반식(C)에 대응하는 16-원 마크롤리드 구조를 갖는데, 위치 23은 히드록시기로 위치 25는 1-메틸-1-프로페닐, 1-메틸-1-부테닐 또는 1,3-디메틸-1-부테닐로 치환되어 있다. 이 화합물중에서, 위치 5의 히드록시는 또한 메톡시로 치환될 수 있다.

S-541로 명명된 동일 화합물 또는 유사한 화합물을 영국특허 명세서 제2,166,436호에 공지되어 있다. S-541외 23-케토 유도체 및 23-데옥시 유도체는 벨기에 특허 제904,709호에 공지되어 있다. 위치 22와 23 사이에 탄소-탄소 이중결합을 가지는 S-541 유도체는 유럽 특허 명세서 제215,654호에 기재되어 있다. S-541의 26-히드록시 및 26-C_1~4알카노일옥시 유도체 및 S-541의 23-케토 및 23-데옥시 유도체의 26-히드록시 및 26-C_1~4알카노일옥시 유도체는 유럽 특허 명세서 제237,341호에 공지되어 있다.

영국 특허 명세서 제2,176,182호에는 상기 일반식(C)에 대응하는 마크롤리드 항생제의 또다른 군의 기재되어 있는데, 위치 5에 히드록시 또는 치환된 히드록시기, 위치 23에 히드록시, 치환된 히드록시 또는 케토기 및 위치 25에 α-측쇄 알케닐기를 갖는다.

관련 마크롤리드 유도체의 또다른 군은 일본 특허 공개 62-29590호에 기재되어 있다. 이것은 상기 일반식(C)에 대응하는 구조를 갖는데 위치 5에 히드록시 또는 메톡시기를 갖는다. 고리의 위치 13은 아베로멕틴에서와 마찬가지로 4'-(α-

-올레인드로실) -α-

-올레안드로실옥시기로 치환될 수 있고, 위치 22와 23 사이에 탄소-탄소 이중결합이 있을 수 있거나, 또 다르게는 위치 23이 히드록시기로 치환될 수도 있다. 위치 25의 치환체는 천연 생산된 밀베마이신 및 아베르멕틴에서는 발견할 수 없는 형태인데, 각종 α_측쇄알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬 알킬티오알킬 및 시클로알킬알킬기, 또는 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 헤테로고리기를 포함한다. 이 25-치환체는 대응 카르복실산 또는 그의 유도체를 아베르멕틴-생산-미생물의 발효 브로쓰에 첨가하여 도입시킨다.

상술한 각군의 밀베마이신-관련 마크롤리드 화합물을 모두 항생제, 구충제, 외부기생충제, 살비제 또는 기타 살충제로서 한가지 또는 그 이상의 종류의 작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나, 여전히 이러한 마크롤리드 화합물에 한가지 또는 그 이상의 기생충군에 대항하는 변형된 작용을 계속적으로 부여해야 할 필요가 있다. 또한 공지의 화합물에 대한 개선된 경로를 계속 개발해야 할 필요가 있다.

본 발명의 효소를 사용하여, 신규 히드록실화된 마크롤리드 화합물을 수득할 수 있다. 게다가, 공지된 히드록실화된 마크롤리드를 제조할 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 하기 일반식(Ⅰ)의 마크롤리드 화합물의 제조방법을 포함한다 :

상기 식중에서 R¹은 메틸기, 에틸기, 이소프로필기, 2차-부틸기 또는 일반식 -C(CH₃)=CHR⁵(R⁵는 메틸기, 에틸기 또는 이소프로필기이다)인데, R¹이 히드록시기이면, R³는 메틸기, 에틸기, 이소프로필기 또는 2차-부틸기이고 : -X(-Y)-는 -CHOH- 또는 -C(=N-OH)-를 나타낸다.

마크롤리드 화합물(Ⅰ)을 제조하는 방법은 본 발명의 효소를 이용하는 하기 일반식(Ⅱ)의 화합물의 효소적 히드록실화를 포함한다 :

상기 식중에서 R¹및 -X(-Y)-는 상기 정의와 동일하다.

일반식(Ⅱ)의 출발물질은 공지된 화합물이거나, 또는 본 명세서에서 참고로 기술한 마크롤리드에 관한 문헌에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다. 일반식(Ⅱ)의 천연적으로 생산되는 밀베마이신은 발효에 의해 형성되는데, 때때로 혼합물로 생성된다.

이러한 혼합물은 반응전에 분리하거나, 그대로 사용할 수 있다.

전환 반응을 관찰한 후, 목적 화합물을 통상적인 방법으로 반응계에서 수득, 수집, 분리 및 정제할 수 있다. 예를들면, 반응 생성물을 여과하고, 여액을 에틸 아세테이트와 같은 물-불혼화성 유기용매로 추출한다. 추출액의 용매를 출발시킨 후, 잔류 조히드록실화된 마크롤리드 화합물을 실리카겔 또는 알루미나를 사용하여 컬럼 크로마토그래피하고 적절한 용출액으로 용출시켜 정제할 수 있다. 출발물질이 혼합물이라면,생성물을 목적에 따라 크로마토그래피 또는 기타 적절한 기술을 이용하여 분리할 수 있는 히드록실화된 화합물의 혼합물로서 분리할 수 있다.

일반적으로, 일반식(Ⅰ)의 화합물은 기생충 방제 작용을 갖는데, 살충, 살비 및 구층 작용도 가지며/갖거나, 다른 화합물, 특히 다른 살충, 살비 및 구충 작용을 갖는 13-에스테르화된 유도체의 합성을 위한 중간체로서 유용하다.

특별히, 화합물(I )은 과일나무, 채소 및 화훼작물에 기생하는 테트라니쿠스

, 파노니쿠스

및 녹균 응애의 성충, 유충 및 알에 대해, 그리고 동물에 기생하는 익소디다에(lxodidae), 데르마니시다에

, 사르콥티다에

등에 대해 살비 작용을 갖는다.

그것은 또한 오에스트루스

, 루실리아(Lucilia), 히포더르마

, 가우트로필루스

등에 대해; 동물 및 새에 대해 외부 기생인 벼룩, 이 등; 잔디, 집파리 등의 가축 곤총; 및 농업 및 원예에 해로운 진딧물 및 나비목

의 유충과 같은 각종 해충에 대한 활성을 갖는다. 게다가 그것은 토양속의 멜로이도지내

, 부르사펠렌쿠스

, 리조글리푸스

등에 대해서도 활성을 갖는다.

화합물(Ⅰ)은 또한 식물에 해로운 곤충, 특히 식식성 곤층(Phytophagous insects)과 같은 곤충에 대해 활성을 갖는다.

게다가, 화합물(Ⅰ)은 기생충 방제 작용을 가지며, 동들 및 인간에 대한 구충제로서 사용될 수 있다. 그것은 돼지, 양, 염소, 소, 말, 개, 고양이 및 여유와 같은 가축, 가금 및 애완동물에 기생하는 선충에 대해 특히 효과적이다.

농업적 및 원예적 목적으로 화합물(Ⅰ)을 분말, 수화분말, 유화농축물 등과 같은 이 방면에 이미 공지된 각종 제제로 만들 수 있다. 이러한 제제를 물로 희석하여 1∼10ppm 유효 성분의 농도로 만들 수 있다.

동물에 대한 구충제용으로, 화합물(Ⅰ)을 분달, 정제, 캔슐 및 주사제와 같은 이 방면에 이미 공지된 각종 조제 형태로 만들 수 있다·그것을 경구 투여할때, 체중 1kg당 성분 0.01∼100mg의, 바람직하게는 0.5∼50mg의 투여량이 바람직하다.

본 발명의 히드록실화 효소의 다른 실례적인 용도는 ML-236B화합물의 히드로실화이다.

미합중국 특허 제4,346,227호에서는 화합물 ML-236B 또는 ML-236B 카르복실산 또는 그의 염 또는 그의 에스테르의 효소적 히드록실화가 기술되어 있다.

ML-236B는 하기 구조식(D)의 락톤이고 :

하기 구조식(E)의 카르복실산으로서 고리-열립 형으로 존재할 수 있다 :

전형적으로 히드록실화로 두 화합물의 혼합물을, 하기 구조식(F)로 존재하는 목적 생성물(락톤 형태)과 함께 수득한다 :

미합중국 특허 제4,346,227호에서 이 화합물은 M-4 락톤으로 명명되었다. 현재 M-4의 나트륨염은 프라바스테틴 소듐(pravastatin sodium)으로 공지되어 있다. 그러므로 ML-236B 카로복실산의 6β-히드록시 유도체의 나트륨염은 프라바스테틴 소듐이다.

본 발명의 각 효소는 페레독신, 페레독신-NADP⁺-환원효소, NADPH 및 용해된 산소의 존재하에서 다음 도식에 따라 ML-236B 화합물의 최소한 위치 6을 히드록실화 시킨다.

그러므로, 예를들면, 주산물인 소듐 6β-히드록시-ML-236B 카로복실레이트가 부산물인 소듐 6α-히드록시-ML-236B 카르복실레이트와 함께 분리된다.

본 발명의 각 시토크롬 P-450 효소를 pH 7.4에서 5분 동인 기질인 소듐 ML-236B 카르복실레이트와(a) 페레독신,(b) 페레독신-NADP⁺-환원효소,(c) NADP⁺,(d) NADPH재생계, 및 (e) 용해된 산소와 함께 반응시킬때, 작용온도는 적어도 4℃∼60℃에 이른다. 각 시토크롬에 대한 최적 pH는 6.5∼8.0에 이른다. 각 시토크론은 pH 6.0∼9.0범위에서 4℃로 24시간 보관할때 안정하다.

페레독신, 페레독신-NADP⁺-환원효소, 산소 및 NADPH의 사용은 필수적이지는 않다. 시토크롬 P-450을 활성화시킬 수 있는 어떤 성분을 이용할 수도 있다.

게다가, 기질은 ML-236 카로복실산의 소듐염에만 국한되지 않는다. ML-236B 출발 화합물은 유리 카르복실산, 그에 대응하는 락톤 또는 그의 염(예, 금슥, 아미노산 또는 아민염)일 수 있다. 본 발명의 시토크롬 P-450 효소는 ML-236B 화합물의 카르복시기에 본질적으로 아무런 영향을 미치지 않는다.

그러므로, 다른 요인들도 동등한데, ML-236B 락톤은 히드록시 ML-236B 락톤으로 되고, ML-236B 카르복실산은 히드록시 ML-236B 카르복실산으로 되며, ML-236B 카르복실산의 염은 히드록시 ML-236B 카로복실산외 동일한 염이 된다. 그러나, 생성물의 동정성은 다른 요인, 특히 혼합물의 pH 값에 의해 영향을 받을 수 있는데, 화학의 일반법칙에 의해 예상할 수 있다. 출발물질 및 기타 요인들은 바람직하게는 프라바스테틴 소듐의 생산을 용이하게 하도록 선택된다.

출발물질로 사용되는 ML-236B 화합물에서, 알칼리금속염, 예를들면 나트륨 또는 칼륨염이 특히 바람직하고, 나트륨염이 가장 바람직한데, 이는 출발 화합물이 목적 히드록실화된 화합물 프라바스테틴 소듐으로 가장 잘 전환되기 때문이다.

ML-236B 화합물의 히드록실화에 기질로서 사용되는 본 발명의 시토크롬 P-450 효소는, 바람직하게는 ML-236B 화합물을, 특히 소듐 ML-236B 카르복실레이트를 유도제로서 사용하여 스트렙토미세스 카로보필루스 SANK 62585에서 생산된 것이다.

효소 활성의 측정은 보통 두가지 방법중 한가지로 실시한다.

(Ⅰ) 시토크롬 P-450_sca-1, 시토크롬 P-450_sca-2, 및 시토크롬 P-450_sca-3을 측정, 측정은 오무라 및 사또 등 (Omura and Sato

., J Bio1 Chem, 239, 1964, 2370)의 방법에 따라 실시한다.

즉, 시토크름 P-450_sca-1, 시토크롬 P-450_sca-2, 및 시토크롬 P-450_sca-3을 450nm 및 490nm에서 감소된 CO 대 감소된 차스팩트럼의 흡수 차이에 기초하여, 하기 일반식을 이용하여 정량적으로 분석한다.

시토크롬 P-450(nmo1/ml) = (O. D. 450nm-O. D.490nm) ×1,000/91(nmo1/ml)

(Ⅱ) 소듐 ML-236B 카로복실레이트로부터의 프라바스테린 소듐의 생성율의 측정

하기 성분의 칵테일을 사용한다 :

P-450을 포함하는 효소용액 0.14ml

NADPH재생계 : NADP⁺0.26mM

글루코우즈-6-포스메이트 14.0mM

글루코우즈-6-포스페이트 데히드로게나제 0.2단위

니고틴아미드 10.0mM

MgC12 2.5mM

페레독신 - NADP⁺- 환원효소(시금치 ) 0.04단위

페레독신(시금치) 320.0μg

소듐 ML-236B 카르복실레이트 0.233mM

총부피 0.20ml

상기표의 성분을 혼합하고, 용액을 30℃에서 5분간 진탕한후, 10μl의 6N NaOH를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 효소계에 의해 형성된 프라바스테린 소듐의 양은 HPLC로 결정한다.

활성을 결정하기 위해 시험방법을 사용할때에, 온도 및 pH의 변화에 따른 활성의 손실도 결정할 수 있다.

예를들면, 각 시토크롬은 20% 글리세롤 및 2mM 디티오트레이톨의 존재하에서 60분 동안 pH 7.4 및 70℃에서 완전히 불활성화 된다. 각 시토크롬은 pH 3 또는 그 이상의 산성 pH에서, 그리고 pH l1 또는 그 이상의 염기성 pH에서 불활성화된다(20% 글리세롤 및 2mM 디티오트레이톨의 존재하에서 4℃ 24시간 동안 처리할때).

시토크롬 P-450_sca-1, P-450_sca-2, P-450_sca-3에 대한 잠정적인 억제제의 효과 및 시토크롬 P-450의 작용에 대한 금속이온의 효과는 방법(Ⅱ)를 이용하여 정량적으로 평가할 수 있다. 전형적으로 하기 결과가 얻어진다.

* SKF-525A : 2-디에틸아미노에틸-2,2-디페닐 발레레이트 히드로클로라이드

각각의 시토크롬은 Co²⁺, Mn²⁺및 Cu²⁺에 의해 억제되었다. 또한 각각의 시토크롬은 SKF-525A (2-디에틸아미노에틸-2,2-디페닐 발레레이트 히드로클로라이드), 시메티딘, 및 일산화탄소와 같은 시토크롬 P-450 효소의 전형적인 억제제에 의해 억제되었다.

본 발명의 실시예

본 발명은 제한되지 않는 하기 실시예에 의해 설명된다.

[실시예 1]

2% 글루코우즈, 1% 펩톤 및 0.1% 효모 추출액을 포함하는 배양배지를 제조하여 pH 7.0으로 조정했다. 각각 20ml의 배지를 포함하는 100ml 부피의 에를렌메이어 플라스크 10개를 121℃에서 15분간 멸균했다. 그런뒤 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585(FERM BP-l145)의 백금 루프로 접종한 후 220rpm으로 진탕하면서 28℃에서 3일 동안 계속 배양하여 종배양액을 수득했다.

배지의 100ml 분액을 500ml 에를렌메이어 플라스크에 붓고, 12℃에서 15분간 멸균했다. 0.5ml의 종 배양액을 각각의 500ml 플라스크에 가하고 50개의 플라스크를 전체 배양했다. 전체 배양 하루후에 소듐 ML-236B 카르복실레이트를 0.1% 수준으로 각 플라스크에 첨가한 후 하룻동안 계속 배양했다.

배양후에, 세포를 원심분리로 수거하여 190g의 세포를 수득했다. 세포 덩어리를 2mM 디티오트레이톨 및 20% 그리세린을 포함하는 동일 부피의 80mM 트리스-염산 완충용액에 2회 현탁한 후 세포를 초음파 처리로 파쇄했다. 조(crude) 효소용액을 원심분리하여 상층액으로 수득했다.

조효소 용액으로부터, 상기 표 A에 나타내진 방법에 따라 시토크롬 P-450_sca-1, 시토크롬 P-450_sca-2및 시토크롬 P-450_sca-3을 정제했다. 조효소 용액을 투석한후, DEAE 도요펄 크로마토그래피를 2회 한후 셀루로핀을 이용하여 셀 여과 크로마토그래피를 실시했다. 마지막으로, 히드록실아파타이트 크로마토그래피를 실시한 후, 효소를 인산염 관충액으로 용출시켰다.

시토크롬 P-450_sca-1은 약 0.06M 인산염 완충액으로 용출되고, 시토그롬 P-450_sca-2는 약 0.08M 인산염 완충액으로 용출되고, 시트크롬 P-450_sca-3는 약 0.10M 인산염 완충액으로 용출되었다. 각 효소는 전기영동적으로 순수한 P-450으로 얻어졌다. 정제 결과는 하기 표에 나타내진다.

* 히드록실아파타이트 : DNA-그레이드 바이오-겔 HTP 그런후, 아미노산 분석을 실시하였다.

문헌[J. W. Eveleigh and G. D. Winter(1970) Protein Sequence Determination,

S. B. Needleman, Springer-Verlag

]에 기재된 방법에 따라 110℃에서 24시간 동안 6N HCl로 가수분해시켜 Cys 및 Trp을 제외한 아미노산을 수득했다.

아미노산 Cys은 문헌[E. Schrau et al. Biochem J.(1954)

, 33]에 기재된 방법에 따라 H₂O₂/HCOOH를 이용하여 산화시키고 연속적으로 HCl로 가수분해하여 분석함으로써 시스테인산을 수득했다. 이 특별하게는, 80μl의 시료 용액을 100μl의 99% 포름산 및 20μl의 메탄올에 용해시켰다.

그 동안에, 10μl의 H₂O₂및 190μl의 99% 포름산을 25℃에서 2시간 동안 밀봉 튜브내에서 보존하였다. 두 용액을 -10℃에서 30분간 냉각시킨 후 혼합하였다. 혼합물을 -10℃에서 2.5시간 동안 유지시킨 후, 160μl의 반응 혼합물을 증발 건조시키고 동결 건조시켰다. 그런후 동결 건조된 시료를 다른 아미노산과 마찬가지로 110℃에서 24시간 동안 6N HCl로 가수분해시켰다.

문헌[B. Penke et al., Anal Biochem(1974)

, 45]에 기재된 방법에 따라 110℃에서 24시간 동안 메르캅토에탄설폰산으로 가수분해시켜 아미노산 Trp을 수득했다.

분석은 히따지 아미노산 아날라이져 모델 835[Hitachi Amino Acid Analyzer Mode1 835]을 이용하여 실시했다.

하기 자료를 수득했다 :

아미노산 자료

분석에서 오차는 견본이 상당히 순수하다면, 24시간 동안 가수분해한 경우에 약 ±5%의 범위일 것으로 믿어진다.

만일 가수분해를 주기적으로, 예 24시간, 48시간, 72시간 등으로 실시한다면 오차가 약 ±2%로 줄어든다.

신뢰도는 두가지 요인에 의해 좌우된다. 한가지는 가수분해에 대한 저항성이다. 실험적으로 Va1-Va1,Val-Gly 등과 같은 연결이 가수분해에 저항성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이 요인에 의한 오차는 가수분해의 시간올 연장시켜서 최소화할 수 있다.

다른 요인은 그렇게 생성된 아미노산의 가수분해에 대한 민감성이다. 예를들면, Ser 및 Thr은 HC1을 이용한 가수분해에 민감한 것으로 알려져 있다. 따라서, 이들 아미노산에 관한한 가수분해의 시간을 연장하면 오차가 증가할 수 있다.

[실시예 2]

13-히드록시밀베마이신 A₄

반응은 하기 혼합에 따라 밀베미아신 A₄를 기질로 사용하여 30℃에서 한시간 동안 실시했다 :

P-450의 양은, P-450_sca-1일 경우에 0.431nmol이고, P-450_sca-2일 경우 0.646nmol이며, P-450_sca-3일 경우에 0.188nmol이다.

결과는 하기 표에서 나타내진다 :

HPLC 자료는 하기와 같다 :

컬럼 : 센슈 팩(Senshu Pack) ODS-1251-P(4.6mm×250mm)

용매 :65% 아세토니트릴

용출속도 : 5μl

검출기 : UV 240nm

머무름시간 : 4.97분

질량 스팩트럼은 정격 시료에 대한 것과 일치했다.

[실시예 3]

13-히드록시 -3-케토밀베마이신 A₄5-옥심

실시예 2의 방법을 5-케토밀베마이신 A₄5-옥심을 기질로 이용하여 반복하여 13-히드록시-5-게토밀베마이신 A₄5-옥심을 수득했다.

HPLC 자료는 하기와 같다 :

컬럼 : 센슈 팩 ODS-1251-P(4.6mm×250mm)

용매 : 65% 아세토니트릴 용출속도 : 5μl

검출기 : UV 240nm

머무름 시간 : 5.747분

질량 스팩트럼은 정격 시료에 대한 것과 일치했다.

[실시예 4]

프라바스타틴 소듐

반응은 하기 혼합에 따라 소듐 ML-236B 카르복실레이트를 기질로 사용하여 30℃에서 한시간 동안 실시했다.

P-450의 양은, P-450_sca-1일 경우에 0.862nmol이고, P-450_sca-2일 경우에는 1.292nmol이며, P-450_sca-3의 경우에는 0.377nmol이다.

결과는 하기 표에 나타내진다.

HPLC 자료는 하기와 같다.

컬럼 : 라디알-PAX 카르트리지 C₁₈(5.0mm×100mm)

용매 : 27% 아세토니트릴/0.1% 트리에틸아민-인산(pH 3.2)

용출속도 : 5μl

검출기 : UV 240nm

머무름시간 : 10.89분

질량 스펙트럼은 정격 시료에 대한 것과 일치했다.

결과는 프라바스타틴 소듐이 소듐 ML-236B 카르복실레이트로부터 고선택도로 제조되었음을 나타낸다. 시금치의 페레독신은 클로스트리디움 파스테우리아눔

의 페레독신을 대치될 수 있다.

Claims

스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585에 의해 생산 및 분리한 시토크롬 P-450 효소로서, 전기영동적으로 순수한 시토크롬 P-450_sca-1, 전기영동적으로 순수한 시토크롬 P-450_sca-2, 및 전기영동적으로 순수한 시토크롬 P-450_sca-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 히드록실화 효소.
배지에서 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585를 배양하고, 상술한 배지에 상술한 효소의 생산을 유도할 수 있는 ML236B 화합물 및 밀베마이신을 포함하는 매크롤리드 화합물과 같은 유도제를 1∼5mM 첨가하고, 상술한 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 6258를 더 배양하고, 상술한 히드록실화 효소를 분리함을 특징으로 하는 히드록실화 효소의 제조방법.
효소를 사용하여 기질을 히드록실화하는 방법에 있어서, 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585에 의해 생산 및 분리된 시토크롬 P-450_sca-1, P-450_sca-2및 시토크롬 P-450_sca-3으로 이루어진 군으로부터 선택한 시토크롬 P-450 효소를 상술한 효소로 채택함을 특징으로 하는 방법.
시토크롬 P-450_sca-1, P-450_sca-2및 시토크롬 P-450_sca-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 히드록실화 효소를 공급하고, 상술한 효소에 대한 기질로서 ML 236B 화합물 및 밀베마이신을 포함하는 매크롤리드 화합물과 같은 기질을 공급하고, 상술한 히드록실화 효소를 사용하여 상술한 기질을 히드록실화하고, 히드록실화된 기질을 수득함을 특징으로 하는 히드록실화 방법.
제 4 항에 있어서, 배지에서 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585를 배양하고, 상술한 배지에 상술한 효소의 생산을 유도할 수 있는 ML236B 화합물 및 밀베마이신을 포함하는 매트롤리드 화합물과 같은 유도제를 1∼5mM 첨가하고, 상술한 스트렙토미세스 카르보필루스 SANK 62585를 더 배양하고, 상술한 히드록시화 효소를 분리함을 특징으로 하는 히드록실화 방법.
제 5 항에 있어서, 상술한 유도제 및 상술한 기질이 동일한 화합물임을 특징으로 하는 히드록실화 방법.