FI94647C - Hydroksylointientsyymit, menetelmä niiden valmistamiseksi sekä menetelmä milbemysiinin tai ML-236B-substraatin hydroksyloimiseksi - Google Patents

Description

94647

Hydroksylointientsyymit, menetelmä niiden valmistamiseksi sekä menetelmä milbemysiinin tai ML-236B-substraatin hydroksyloimiseksi Hydroxyleringsenzymer, förfarande för framställning av dessa, samt förfarande för hydrolysering av ett milbemycin eller ML-236B-substrat 5

Keksinnön kohteena on hydroksylointientsyymit, menetelmä niiden valmistamiseksi sekä menetelmä milbemysiinin tai ML-236B-substraatin hydrok-10 syloimiseksi.

Sytokromi P-450-entsyymiä on löydetty eläimistä, kasveista ja mikro-organismeista. Sytokromi P-450-entsyymistä riippuva mono-oksygenaasi-järjestelmä katalysoi tärkeiden fysiologisten yhdisteiden biosynteesiä 15 ja osallistuu vieraiden aineiden, ksenobioottien, aineenvaihduntaan.

Sitä voidaan käyttää hyvin monien luonnollisten tuotteiden ja lääkeaineiden substraattina.

Sytokromi P-450-entsyymin entsymaattiseen vaikutukseen tarvitaan koe-20 ntsyymiä, kuten NAD(P)H, elektroneja siirtävää proteiinia, kuten fer-redoksiinia, ja molekulaarista happea. Seuraava mekanismi on esitetty substraatin S aineenvaihdunnalle, jossa tuotteena on SOH, symbolin Fe tarkoittaessa sytokromi P-450:n aktiivista kohtaa: 25

SH

P-450-F·®· a ✓ ** P-450^f*flnj SOH / \

Y P-450-FfflD-SH

\ 0*

30 CP-4S0-WVW-SH] Y

HjoJ j

1 P-*S0-f*(lD· SH

35 PHSO-ftflia-SH P-*»-F*flB*SH

Ρ-<50-%(Π1 · SH ''V’ 0,· e 2 - 94647 Tässä mekanismissa pelkistymisen aiheuttavat elektronit ovat peräisin yhdisteestä NAD(P)H elektroneja siirtävän proteiinin välittävän vaikutuksen avulla.

5 Yleisesti, sytokromi P-450-entsyymejä on eristetty pääasiallisesti eukariooteista, ja ne ovat veteen liukenemattomia. Tunnettuja ovat myös prokariooteista eristetyt sytokromi P-450-entsyymit, mukaan lukien P-450cani organismista Pseudomonas putida [J. Biol. Chem. (1974) 249.

94]; P-450BM.! ja P-450BM.3, molemmat organismista Bacillus meaaterium 10 ATCC 14581 [kuvattu vastaavasti julkaisuissa Biochim. Biophys. Acta (1985) 838, 302 ja J. Biol. Chem. (1986) 261, 1986, 7160]; P-450a, P-450b ja P-450c organismista Rhizobium iaponicum [Biochim. Biophys.

Acta (1967) 147. 399]; sekä P-450npd organismista Nocardia NHI [Micro-bios (1974) 9, 119].

15

Streptomvces-mikro-organismeista puhdistettuja sytokromi P-450-entsyy-mejä on kuvattu suhteellisen vähän. Sytokromi P-450-entsyymin induktio organismissa Streotornvces griseus soijajauhon avulla kuvataan julkaisussa Biochem. and Biophys. Res. Comm. (1986) 141, 405. 6-deok-20 sierytronolidi B hydroksylaasin kahden muodon ominaisuudet ja eristäminen organismista Saccharopolvspora ervthraea (joka luokiteltiin aikaisemmin nimellä Streotornvces ervthraeus) kuvataan julkaisussa Biochemistry (1987) 26, 6204.

25 Eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 215 665, joka on julkaistu maaliskuun 25. päivänä 1987, kuvataan entsymaattinen hydroksylaatio. Hyd-roksylaatio toteutetaan hydroksyloivalla entsyymillä, joka on sukuun Streotornvces tai sukuun Nocardia kuuluvan mikro-organismin tuottamaa. Julkaisussa EP 215 665 kuvataan neljä vastikään eristettyä Streotomv-30 ces-kantaa, mukaan lukien Streotornvces sp SANK 62585, jotka tuottavat sopivia hydroksyloivia entsyymejä.

Streotornvces sp SANK 62585 talletettiin tutkimuslaitokseen Fermentation Research Institute, Japani, syyskuun 5. päivänä 1985 talletusnumerolla 35 FERM P-8440, ja se talletettiin uudestaan Budapestiin sopimuksen mukaisesti elokuun 13. päivänä 1985 talletusnumerolla FERM BP-1145.

3 94647

Oheisen keksinnön tavoitteena on saada aikaan uusia sytokromi P-450-entsyymejä. Tämän keksinnön tavoitteena on samoin saada aikaan uusi menetelmä sytokromi P-450-entsyymien tuottamiseksi sekä prosesseja hydroksyloitujen yhdisteiden valmistamiseksi tällaisia entsyymejä käyt-5 täen.

Oheisessa keksinnössä saadaan aikaan uusia sytokromi P-450-entsyymejä. Tällaisten entsyymien molekyylipaino on tyypillisesti 46 000 ± 1000. Entsyymit saadaan organismista Strentornvces. ja ne ovat hydroksyloivia 10 entsyymejä, jotka kykenevät hydroksyloimaan lukuisia erilaisia yhdisteitä.

Erityisesti, oheisessa keksinnössä saadaan aikaan uudet entsyymit sytokromi P-450sca.1 ja P-450sca-2· Kun yksi tai useampi näistä entsyymeistä 15 yhdistetään sopiviin komponentteihin tehokkaan järjestelmän saamiseksi, se kykenee muuntamaan tämän entsyymin substraatin hydroksyloituneeksi j ohdannaiseks i.

Entsyymit sytokromi P-450sca.1( sytokromi P-450eca_2 ja/tai sytokromi P-20 4508ca_3 voidaan eristää ja puhdistaa tunnetusta kannasta Streptomvces SANK 62585 FERM BP-1145, joka on tunnistettu lajiksi Streptomvces car-boohilus.

Keksinnön mukainen hydroksylointientsyymi on tunnettu siitä, että se on !’ 25 tuotettu organismin Streptomvces carbophilus SANK 62585 FERM BP-1145 avulla ja eristetty siitä, ja että se on jokin seuraavista: (i) elektroforeettisesti puhdas sytokromi P-4508ca.1-entsyymi, jonka molekyylipaino on 46000 ± 1000 määriteltynä SDS-polyakryyliamidisähkö-30 foreesilla, maksimiabsorptio on aallonpituudella 449 nm spektrissä, : jossa absorptio johtuu CO-ryhmästä ja joka entsyymi eluoituu kasvualus tasta, joka on saatu viljelemällä organismia Streptomvces carbophilus SANK 62585, hydroksyyliapatiittikromatografiällä fosfaattipurskuripi-toisuudessa 0,06 M; 35 4 94647 ii) elektroforeettisesti puhdas sytokromi P-4506ca.2-entsyymi, jonka molekyylipaino on 46000 ± 1000 määriteltynä SDS-polyakryyliamidisähkö-foreesilla, maksimiabsorptio on aallonpituudella 448 nm spektrissä, jossa absorptio johtuu CO-ryhmästä ja joka entsyymi eluoituu kasvualus -5 tästä, joka on saatu viljelemällä organismia Streptomvces carbonhilus SANK 62585, hydroksyyliapatiittikromatografiällä fosfaattipuskuripitoi-suudessa 0,08 M.

Keksinnön mukainen menetelmä hydroksylointientsyymin valmistamiseksi on 10 tunnettu siitä, että menetelmässä Streptomvces carbophilus-kantaa SANK 62585 FERM BP-1145 viljellään viljelyalustassa, viljelyalustaan lisätään sellaista induktioainetta, joka kykenee indusoimaan entsyymin tuotannon, jossa induktioaine ja entsyymin substraatti ovat sama yhdiste, Streptomvces carbophilus-kantaa SANK 62585 viljellään edelleen, 15 minkä jälkeen hydroksylointientsyymi eristetään.

Keksinnön mukainen menetelmä milbemysiinin tai ML-236B-substraatin hydroksyloimiseksi on tunnettu siitä, että saadaan aikaan vähintään yksi patenttivaatimuksen 1 mukainen hydroksylointientsyymi sekä milbe-20 mysiini tai ML-2368-substraatti entsyymille; tämä substraatti hydrok-syloidaan käyttäen mainittua hydroksylointientsyymiä; ja saadaan hyd-roksyloitunut substraatti.

Kuten julkaisussa EP 215 665 kuvataan, Streptomvces-kannan SANK 62585 25 tiedetään kuuluvan Actinomycetes-sukuun Streptomvces. Tässä yhteydessä viitataan julkaisuun EP 215 665, joka liitetään oheen tällä viittauksella.

Streptomvces-kannan SANK 62585 morfologiset ja fysiologiset ominaisuu-30 det määritettiin käyttäen perinteisiä alustoja ja menetelmiä, jotka ; kuvataan julkaisussa Shirling ja Gottlieb, International Journal of

Systematic Bacteriology (1966) 16, 313-340, yhdessä monien täydentävien kokeiden kanssa. Havaintoja viljelmistä tehtiin sen jälkeen, kun niitä oli inkuboitu 28 °C:n lämpötilassa 14 vuorokautta. Väreistä käytetyt 35 nimet olivat julkaisun "Guide to Colour Standard" mukaisia (laitoksen Nippon Shikisai Kenkyusho, Tokio, Japani julkaisema käsikirja). Viljel- 5 94647 mien tunnusomaisia piirteitä verrattiin lukuisten tunnettujen Actinomy-cetes-lajien vastaaviin ominaisuuksiin, jotka on kuvattu ISP-standardeissa (International Streptomyces Project), teoksissa Waksman, "The Actinomycetes, Volume 2", Shirling ja Gottlieb, "The ISP Report", "Ber-5 gey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. laitos sekä muussa viimeaikaisessa kirjallisuudessa, jossa käsitellään Actinomycetes-or-ganismien taksonomiaa.

1. Morfologiset ominaisuudet 10

Mikroskoopilla ja elektronimikroskoopilla tarkasteltuna kannan SANK 62585 vegetatiiviset hyfit olivat täysin kehittyneet ja haaroittuneet, ja ilmahyfit olivat haaroittuneet monopodiaalisesti.

15 Kannan SANK 62585 itiöketju on tavallisesti suora tai mutkitteleva, joskus kuitenkin myös kierukkamainen, ja itiöiden pinnat ovat sileät. Kannassa SANK 62585 ei voida todeta erityisiä elimiä, kuten pyörteitä, kovettumia, perushyfien fragmentoitumista tai sporangioita.

20 2. Kasvu taksonomisessa alustassa

Kannan kasvu erilaisissa alustoissa nähdään seuraavasta taulukosta, jossa käytetään seuraavia lyhenteitä: G: kasvu 25 AM: ilmamyseeli R: käänteinen SP: liukoinen pigmentti.

6 94647

Alusta Ominaisuus Kannan SANK 62585 tapauksessa 5 _

Sakkaroosi- G Ei kovin kyvä, vaalean kellanoranssi nitraatti- (2-9-9) agar AM Normaali, jauhemainen, harmaanval koinen R Vaalean kellanoranssi (2-9-9) 10 SP Puuttuu

Glukoosi/ G Ei kovin hyvä, kellanharmaasta rus asparagiini- keanharmaaseen [(2-5-9) - (1-9-10)] agar AM Jälkiä, harmaanvalkoinen (N-9) 15 R Kellanharmaasta ruskeanharmaaseen [(2-5-9) - (1-9-10)] SP Puuttuu

Glyseriini/ G Ei kovin hyvä, vaalean kellanruskea, 20 asparagiini- (2-7-9) agar AM Normaali, jauhemainen, harmaanval koinen (ISP 5) R Vaalean kellertävänruskea (4-8-9) SP Puuttuu : 25 _ Tärkkelys/ G Erittäin hyvä, ruskeanharmaa (2-6-9) epäorgaaninen AM Runsas, jauhemainen, kellertävänhar- suola-agar maasta kirkkaaseen oliivinvihreään (ISP 4) [(1-9-10) - (2-8-12)] 30 R Vaaleanruskeasta ruskeanharmaaseen [(2-8-9) - (2-4-9)] SP Puuttuu 94647

Tyrosiini- G Hyvä, tumman kellanruskea (4-4-9) agar AM Hyvin runsas, jauhemainen, kellan- (ISP 7) harmaasta kirkkaaseen oliivinhar- maaseen [(1-9-10) - (2-8-11)] 5 R Tumman ruskeanharmaa (2-3-9) SP Puuttuu

Peptoni- G Hyvä, kellanruskea (4-6-9) hiiva- AM Puuttuu 10 rauta-agar R Kellanruskea (4-6-9) (ISP 6) SP Puuttuu

Ravinne- G Ei kovin hyvä, kirkkaan oliivinharmaa agar (4-8-10) 15 (Difco) AM Puuttuu R Kirkkaan oliivinharmaa (4-8-10) SP Puuttuu

Hiiva- G Erittäin hyvä, kellanruskea (6-7-9) 20 mallas-agar AM Hyvin runsas, jauhemainen, kirkas (ISP 2) oliivinharmaa (2-8-11) R kellanruskea (6-5-9) SP Puuttuu 25 Kaurajauho- G Erittäin hyvä, harmahtavan kellan- agar ruskea (4-5-9) (ISP 3) AM Hyvin runsas, jauhemainen, kirkkaan oliivinharmaa (2-8-12) R Tumman ruskeanharmaa (2-3-9) 30 SP Puuttuu

Peruna/ G Huono, kellanharmaasta likaisen porkkana- oranssiin [(1-9-10) - (6-8-6)] uuteagar AM Normaali, jauhemainen, vaalean 35 kellanoranssi (2-9-9) R Vaalean ruskea (3-8-6) SP Puuttuu 8 94647 3. Fysiologiset ominaisuudet

Kannan SANK 62585 fysiologiset ominaisuudet esitetään seuraavassa taulukossa, jossa alustat 1-4 ovat: 5

Alusta 1: Hiivauute-mallasuute-agar (ISP 2)

Alusta 2: Tryptoni-Hiivauute-liuos (ISP 1)

Alusta 3: Peptöni-Hiivauute-Rauta-agar (ISP 6)

Alusta 4: Tyrosiiniagar (ISP 7) 10

Kannan SANK 62585 ominaisuudet: Tärkkelyksen hydrolyysi positiivinen

Gelatinin nesteyttäminen negatiivinen 15 Nitraatin pelkistyminen positiivinen

Maidon koaguloituminen positiivinen

Maidon peptonisoiturainen positiivinen

Kasvun lämpötila-alue (alusta 1) 4-45 °C

Kasvun optimilämpötila (alusta 1) 15-33 eC

20 Melanoidin muodostuminen (alusta 2) negatiivinen (alusta 3) pseudopositiivinen* (kyseenalainen) kyseenalainen * pseudopositiivinen: eräissä tapauksissa esiintyy melaniinin 25 muodostumista viljelyn lopussa.

Erilaisten hiililähteiden assimiloitumista tarkasteltiin 14 vuorokautta kestäneen viljelyn jälkeen käyttäen Pridham-Gottlieb-agaria. Koska kanta SANK 62585 kasvaa hyvin tällaisella vartailualustalla ilman hii-30 lilähdettä, niin täsmällisen assimiloitumiskyvyn määrittäminen on vaikeata. Näin ollen seuraavassa taulukossa esitetään referenssinä kannan suhteellinen assimilointikyky vertailualustalla (eli kokeissa määritettiin kasvun ero vertailualustalla ilman lisättyä hiililähdettä ja lisätyn hiililähteen kanssa).

35 9 94647

Hiilen assimiloiminen D-glukoosi käytettiin L-arabinoosi ei käytetty 5 D-ksyloosi käytettiin

Inositoli käytettiin D-mannitoli ei käytetty D-fruktoosi ei käytetty

Sakkaroosi ei käytetty 10 Raffinoosi käytettiin

Sellobioosi käytettiin

Trehaloosi käytettiin

Vertailu ei käytetty 15 4. Solun komponentit

Kannan SANK 62585 soluseinämä analysoitiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa B. Becker et ai., Applied Microbiology 12, 421-423 (1964)]. 20 Koska kaikkien kantojen soluseinämistä voitiin tunnistaa L,L-diaminopi-meelihappo ja glysiini, niin soluseinämien katsottiin olevan tyyppiä I. Mikro-organismien koko solujen sokerikomponentit määritettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa M.P. Lechevalier, Journal of Laboratory and Clinical Medicine 71, 934 (1968). Tunnusomaista profiilia ei 25 voitu todeta.

Julkaisussa EP 215 665 ei esitetä kannan SANK 62585 lajia. Muu vertaaminen tavallisiin standardeihin [ISP (The International Streptomyces Project); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. laitos; 30 S.A. Waksman, The Actinomycetes; sekä muut viimeaikaiset, Actinomyce-tes-heimoa käsittelevät julkaisut] osoitti, että morfologiset ja fysiologiset ominaisuudet olivat olennaisesti samanlaiset kuin lajilla Streptomyces carbophilus.

35 Näistä syistä Streptomyces-kanta SANK 62585, joka tuottaa sytokromi ίο 94647 P-450-entsyymejä, on tunnistettu lajiksi Streptomvces carboohilus SANK 62585. Kuten mainittiin, tämä kanta on talletettu Budapestiin sopimuksen ehtojen mukaisesti elokuun 13. päivänä 1985 kantakokoelmaan Fermentation Research Institute, Japani, ja sille on annettu talletus-5 numeroksi FERM BP-1145. Näytteitä kannasta on saatavana Budapestiin sopimuksen asiaankuuluvien ehtojen puitteissa.

Actinomycetes-organismi, mukaan lukien Streptomvces carboohilus SANK 62585, mutatoituu helposti sekä luonnollisista syistä että keinotekois-10 ten käsittelyjen, kuten UV-säteilytyksen, säteilyllä käsittelyn ja kemiallisen käsittelyn, seurauksena. Näihin mutanttikantoihin kuuluvat myös kaikki ne mahdolliset kannat, jotka on saatu geenimanipulaatiolla, kuten geenejä yhdistelemällä, transduktiolla ja transformaatiolla.

Hyvin tunnettua on myös se, että Actinomycetes-organismin ominaisuudet 15 muuttuvat jossain määrin jopa samankin kannan tapauksessa peräkkäisten viljelmien jälkeen. Tästä syystä kantoja ei voida aina erottaa toisistaan taksonomisesti viljelyominaisuuksien poiketessa hieman toisistaan.

Organismin Streptomvces carboohilus kannan 62585 viljely P-450-entsyy-2C mien tuottamiseksi toteutetaan sopivasti siirrostamalla kanta perinteiseen viljelyalustaan, joka sisältää tällaisille mikro-organismeille hyvin tunnettuja ravinteita. Täten, viljelyalusta sisältää assimiloituvan hiilen ja assimiloituvan typen lähteet ja se sisältää usein epäorgaanisia suoloja. Esimerkkeinä assimiloituvan hiilen lähteistä mainit-25 takoon glukoosi, sakkaroosi, tärkkelys, glyseriini, hirssihyytelö, melassi ja soijaöljy. Esimerkkeinä assimiloituvan typen lähteistä mainittakoon soijapavuista saatava kiintoaines (kuten erilaiset soijajauhot), vehnäidut, lihauutteet, peptoni, maissin liotusliemi, kuiva-hiiva ja ammoniumsuolat, kuten ammoniumsulfaatti. Alustaan voidaan myös 30 sisällyttää tarvittaessa epäorgaanisia suoloja, kuten natriumkloridia, . kaliumkloridia, kalsiumkarbonaattia ja erilaisia fosfaatteja. Alusta steriloidaan tavallisesti ja sen pH on asetettu arvoon 5-8.

Erityinen käytetty viljelytekniikka ei ole kriittinen keksinnölle, ja 35 ohisessa keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa sellaista tekniikkaa, jota käytetään tavallisesti Streptomvces-organismin viljelemiseen.

Il 11 94647

Yleisesti, käytettävät tekniikat valitaan ottamalla huomioon niiden tehokkuus teollisuudessa. Täten, yleensä käytetään mielellään nestevil-jelyä, ja teollisuuden kannalta tarkoituksenmukaisin on uppoviljelyyn perustuva menetelmä. Viljeleminen toteutetaan mielellään aerobisissa 5 olosuhteissa.

Tämän keksinnön mukaiset entsyymit ovat indusoitavia entsyymejä, ja niitä ei muodostu, mikäli läsnä ei ole indusoivaa ainetta. Indusoiva aine valitaan mielellään siten, että se on samaa ainetta kuin eristetyn 10 entsyymin aiottu substraatti. Kun siirrostuksesta on kulunut 4 tunnista 3 vuorokauteen, niin alustaan lisätään mielellään 1-5 mM, mieluumin 2 mM, indusoivaa ainetta, minkä jälkeen viljelemistä jatketaan 2 tunnista 1 viikkoon, mielellään noin 1 vuorokauden ajan. Viljelyn lämpötila on tyypillisesti 20-45 °C, mielellään 25-30 °C, optimin ollessa noin 15 28 °C. Viljelyyn voidaan käyttää ravistelukasvatusta tai ilmastustek- niikoita.

Viljelemällä saadut solut voidaan rikkoa käsittelemällä niitä ultraäänellä puskuriliuoksessa, minkä jälkeen sentrifugoimalla saatava su-2C pernatantti on raakaentsyymiliuos. Keksinnön mukaisia entsyymejä on läsnä supernatantissa, joka saatiin sentrifugoimalla nopeudella 105 000 x g 1 tunnin ajan.

Jotta saataisiin elektroforeettisesti puhtaita entsyymejä P-450JC-J ja 25 P-450eca.2> niin solujen rikkomisen jälkeen saatu raakaentsyymiliuos voi daan puhdistaa dialysoimalla, käsittelemällä pylväskromatografisesti ioninvaihtohartsilla, geelisuodatuksella, käsittelemällä pylväskromatografisesti hydroksyyliapatiitilla tai näiden menetelmien yhdistelmällä.

30 Havainnollinen puhdistusmenetelmä esitetään seuraavassa taulukossa: • « ·> * 12 94647

TAULUKKO A

Viljelty nestealusta 5000 ml

Solujen talteenotto 8000 rpm, 15 minuuttia 5 4

Solujen rikkominen ultraäänikäsittely, 10 minuuttia 4

Supernatantin talteenotto 14 000 rpm, 30 minuuttia 10 4

Dialyysi pH 7,4, käyttäen 0,1 M

Tris-kloorive tyhappo-puskur ia 4

Pylväskromatografinen käsittely 0-0,30 M NaCl-gradientti, 15 käyttäen tuotetta DEAE Toyopearl eluoitu noin 0,10 M NaCl- (tuotenimi, Toyo Soda Industries liuoksella

Inc. ) 4

Pylväskromatografinen käsittely 0-0,20 M NaCl-gradientti, 20 DEAE Toyopearl-tuotteella eluoitu noin 0,10 M NaCl-liuoksella 4

Pylväskromatografinen käsittely Cellurofine- tuotteella (tuotenimi,

Chisso Inc.) 25 4

Dialyysi pH 7,4 käyttäen 0,01 M

fosfaattipuskuria 4

Pylväskromatografinen käsittely gradientti fosfaattipusku-hydrok- 30 syyliapatiitilla rilla, jonka pitoisuus on

(Bio-Rad Inc.) 0,01-0,20 M

4 P-450^..!, P-450Bca_2 ja P-450sca_3.

35 * · ♦

II

13 94647

Hydroksyyliapatiitilla toteutetussa kromatografisessa käsittelyssä, jossa käytettiin fosfaattipuskurin pitoisuusgradienttia, sytokromi P-450JC,,.! eluoituu ensin (fosfaattipuskurin pitoisuuden ollessa noin 0,06 M), sytokromi P-450sca.2 eluoituu seuraavana (fosfaattipuskurin 5 pitoisuuden ollessa noin 0,08 M) ja sytokromi P-450sca_3 eluoituu kolmantena (jolloin fosfaattipuskurin pitoisuus on noin 0,10 M).

Kukin tällä tavalla puhdistettu sytokromi P-450-entsyymi liikkui yhtenä vyöhykkeenä anodia kohden SDS-polyakryyliamidia käyttäen toteutetussa 10 elektroforeettisessa käsittelyssä.

Keksinnön mukaisesti aikaansaadut entsyymit sytokromi P-450sca.1, sytokromi P-450sca.2 ja sytokromi P-450sca_3 eroavat muista sytokromi P-450-entsyymeistä.

15

Kunkin oheisen keksinnön mukaisen entsyymin molekyylipaino on 46000 ± 1000 perustuen mittauksiin, jotka toteutettiin elektroforeettisesti SDS-polyakryyliamidilla. UV-absorption maksimi todetaan aallonpituudella 417 nm. Spektrissä, jossa pienennetty CO riippuu pienentyneestä 20 erosta, sytokromin P-450sca-1 maksimiabsorptio todetaan aallonpituudella 449 nm, ja sekä sytokromin P-450aca.2 että sytokromin P-450aca_3 maksimiabsorptio todetaan aallonpituudella 448 nm.

Kullakin entsyymillä on ainutlaatuinen aminohappokoostumus. Tähän liit-25 tyen esitetään seuraavat tiedot:

Aminohappo- jäännöstä molekyylissä jäännös P-450sca.1 P-450sca_2

Asx 39,1 36,9 30 Thr 30,9 30,0

Ser 22,4 21,1

Glx 41,8 39,6

Pro 26,8 26,7

Gly 28.7 25,9 35 Ala 48,0 45,4

Cys 3,1 1,9 14 94647

Vai 31,4 30,0

Met 7,8 8,1

Ile 18,2 18,0

Leu 49,7 49,1 5 Tyr 4,9 5,0

Phe 15,2 15,0

His 13,6 13,8

Lys 9,0 8,4

Arg 34,0 34,2 10 Trp 1,0 1,1

Yhteensä 425,6 410,2

Keksinnön mukaisia entsyymejä voidaan käyttää hydroksyloivina entsyy-15 meinä. Ne kykenevät hydroksyloimaan monia erilaisia yhdisteitä. Näin ollen, oheisessa keksinnössä saadaan lisäksi aikaan menetelmä substraatin hydroksyloimiseksi, jossa menetelmässä käytetään keksinnön mukaista entsyymiä yhden tai useamman hydroksiryhmän liittämiseksi.

20 Entsyymi saatetaan kosketuksiin substraatin kanssa mielellään vesipohjaisessa väliaineessa, esimerkiksi fosfaattipuskuriliuoksessa, jonka pH-arvo on alueella 5-9, mielellään 6,5-8,0, mieluiten noin 7,4. Reak-tiolämpötila on mielellään 20-45 °C, mieluiten noin 25-30 °C. Optimi-lämpötila on noin 30 ®C. Substraatin pitoisuus reaktion väliaineessa on 25 mielellään alueella 0,01-5,0 paino-%. Reaktion annetaan edetä normaalisti 1 minuutista 5 vuorokauteen, tavallisemmin 1 vuorokaudesta 5 vuorokauteen, vaikka tämä aika voikin vaihdella riippuen substraatin pitoisuudesta reaktioseoksessa, reaktion lämpötilasta ja muista tekijöistä.

30

Konversioreaktion päättymisen jälkeen hydroksyloitunut yhdiste voidaan eristää perintesillä toimenpiteillä, joista mainittakoon esimerkiksi suodatus, liuotinuutto, kromatografia, kiteytys ja muut eristämismenetelmät. Tällaiset toimenpiteet valitaan tuotteesta riippuen. Tuote 35 voidaan muuntaa johdannaisekseen ennen eristämistä, eristämisen aikana tai sen jälkeen.

II

15 94647

Oheista keksintöä havainnollistetaan edelleen kahden rakenteeltaan selvästi erilaisen substraattiluokan avulla, nimittäin makrolidiyhdis-teiden, kuten milbemysiinien, ja ML-236B-yhdisteiden avulla.

5 Olemassa on lukuisia luokkia sellaisia tunnettuja yhdisteitä, joiden rakenne perustuu 16-jäseniseen makrolidirenkaaseen. Niitä saadaan käymisteitse monilla mikro-organismeilla tai puolisynteettis^sti muodostamalla kemiallisesti johdannainen tällaisista luonnollisista käymistuot-teista, ja niillä on punkkeja, hyönteisiä, matoja ja muita parasiitteja 10 torjuvaa aktiivisuutta. Milbemysiinit ja avermectiinit ovat esimerkkejä kahdesta tällaisesta tunnettujen yhdisteiden luokasta, mutta olemassa on myös monia muita luokkia, joiden tunnistamiseen käytetään eri nimiä tai koodinumeroita. Näiden erilaisten makrolidiyhdisteiden nimet on saatu yleensä niiden mikro-organismien nimistä tai koodinumeroista, 15 jotka mikro-organismit tuottavat kunkin luokan luonnossa esiintyviä jäseniä, ja sitten nämä nimet on ulotettu kattamaan saman luokan kemialliset johdannaiset sillä seurauksella, ettei näiden yhdisteiden kohdalla yleisessä käytössä ole standardoitua systemaattista nimistöä.

20 Sekaannusten välttämiseksi tässä patenttispesifikaatiossa käytetään nimiä, jotka perustuvat kaavan (C) mukaiseen hypoteettiseen perusyhdisteeseen: " 25 »ry*3

Ji2 i jv

CHML o J

30 (C> T'cm3

OH

16 94647

Edelleen sekaannusten välttämiseksi, kaavassa (c) esitetään myös eräiden, oheisen keksinnön mukaisille yhdisteille olennaisimpien hiiliatomien numerointi. 4-aseman metyyliryhmälle on annettu numeroksi C-26.

5

Luonnollisesti syntyneet milbemysiinit muodostavat joukon yhdisteitä. Muiden muassa milbemysiinit A3 ja A4 kuvataan US-patenttijulkaisussa 3 950 360, ja milbemysiini D on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 346 171, jossa sitä kuitenkin nimitetään "Yhdisteeksi B-41D". Nämä 10 yhdisteet voidaan esittää edellä olevalla kaavalla (C), jossa asema 25 on substituoitunut vastaavasti metyyliryhmällä, etyyliryhmällä tai isopropyyliryhmällä. Milbemysiinin analogi, joka on substituoitunut asemasta 25 see-butyyIillä, kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 173 571.

15 13-hydroksimilbemysiinit kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 093 629 ja eurooppalaisessa patenttispesifikaatiossa 246 739. 13-hydroksi-5-keto-milbemysiinin johdannaisia kuvataan US-atenttijulkaisussa 4 423 209, samoin eurooppalaisessa patenttispesifikaatiossa 14 308 ja japanilaisessa patenttihakemuksessa Kokai 108785 (1984) . Milbemysiinin 5-oksii-20 mijohdannaiset kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 547 520 sekä eurooppalaisessa patenttispesifikaatiossa. Brittiläisessä patenttispesifikaatiossa 2 168 345 kuvataan milbemysiinin johdannaiset, joissa on karbok-si- tai esteröitynyt karboksisubstituentti asemassa 13 sekä hydroksi-tai esteröitynyt hydroksisubstituentti asemassa 5.

25 14-hydroksimetyylimilbemysiiniyhdisteet voidaan valmistaa hapettamalla 5-ketomilbemysiini seleenioksidilla/t-butyylihydroperoksidilla, mitä seuraa 5-asemassa sijaitsevan ketoryhmän pelkistäminen natriumboorihyd-ridillä, kuten julkaisussa J. Am. Chem. Soc. (1977) 99, 5526 kuvataan. 30 24-hydroksimetyylimilbemysiiniyhdisteet voidaan valmistaa hydroksyloi-malla milbemysiiniyhdiste mikrobien avulla käyttäen Amvcolata auto-trophica-kantoja, joita on talletettuna kokoelmassa Fermentation Research Institute, Japani, talletusnumeroitta FERM P-6181, FERM P-6182 35 ja FERM P-6183. Nämä talletetut kannat nimettiin talletettaessa seuraavasti: Nocardia sp SANK 62781, Nocardia sp SANK 62881 ja Nocardia sp 17 94647 SANK 62981, vastaavasti. Niiden mykologiset ominaisuudet on kuvattu japanilaisessa patenttihakemuksessa Kokai 58-89191. Taksonomisen yleis -selvityksen tuloksena nämä kannat sijoitettiin jokin aika sitten sukuun Amvcolata. joka on riippumaton suvusta Nocardia. soluseinämän koostu-5 muksessa todettavien erojen johdosta [International Journal of Systematic Bacteriology (1986), 36, 29].

Milbemysiinien tavoin avermektiinit perustuvat samaan 16-jäseniseen makrolidirengasyhdisteeseen. Avermektiinit kuvataan esimerkiksi jul-10 kaisuissa J. Antimicrob. Agents Chemother., 1979, 15, 361 (1979) ja J. Am. Chem. Soc., 1981, 103. 4216. Nämä yhdisteet voidaan esittää edellä olevalla kaavalla (C), jolloin kuitenkin asema 13 on substituoi-tunut 4'-(α-L-oleandrosyyli)-Q-L-oleandrosyylioksiryhmällä. Asema 25 voi olla substituoitunut isopropyyliryhmällä tai see.-butyyliryhmällä, 15 ja joko asemien 22 ja 23 välissä on hiili-hiili-kaksoissidos tai asemassa 23 on hydroksiryhmä.

Avermektiinit määritellään seuraavasti: 20 avermektiini C22-C23 R25 R23 R5

Axa db sec-Bu H OMe

Ajb db i-Pt H OMe A2a sb sec-Bu OH OMe 25 A2b sb i-Pr OH OMe

Bja db sec-Bu H OH

Bjb db i-Pr H OH

B2a sb sec-Bu OH OH

B2b sb i-Pr OH OH

30

Ainoastaan seuraavassa taulukossa R25 on substituentti asemassa 25;R23 on substituentti asemassa 23; ja R5 on substituentti asemassa 5; "db" tarkoittaa kaksoissidosta asemien 22 ja 23 välissä; ja "sb" tarkoittaa yksinkertaista sidosta asemien 22 ja 23 35 välissä.

« » 18 94647

Avermektiinin A2a, A2b, B2a ja B2b 23-ketojohdannaiset tunnetaan US-patenttijulkaisun 4 289 760 perusteella. 22,23-dihydroavermektiinit voidaan saada pelkistämällä asemien 22 ja 23 välinen kaksoissidos, ja ne kuvataan US-patenttijulkaisussa 4 199 569. Avermektiinien aglyklo-5 nijohdannaiset, jotka ovat 13-hydroksimilbemysiinin analogeja, on kuvattu kirjallisuudessa. Niitä on joskus nimitetty C-076-yhdisteiksi. Lukuisia johdannaisia tunnetaan: esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 201 861 kuvataan johdannaiset, jotka ovat substituoituneet asemasta 13 alemmalla alkanoyyliryhmällä.

10

Eurooppalaisessa patenttispesifikaatiossa 170 006 kuvataan joukko käymisteitse tuotettuja, biologisesti aktiivisia yhdisteitä, jotka tunnistetaan yhteisellä koodinumerolla LL-F28249. Eräillä niistä on 16-jäseninen, edellä olevaa kaavaa (C) vastaava makrolidirakenne, joka on 15 substituoitunut hydroksilla asemasta 23, ja 1-metyyli-1-propenyyIillä, 1-metyyli-1-butenyylillä tai 1,3-dimetyyli-l-butenyylillä asemasta 25. Näissä yhdisteissä asemassa 5 oleva hydroksi voi myös olla korvautunut nietoksilla.

20 Samat tai samankaltaiset yhdisteet, joita nimitetään S-541-yhdisteiksi, tunnetaan brittiläisen patenttispesifikaation 2 166 436 perusteella. Yhdisteiden S-541 23-ketojohdannaiset ja 23-deoksijohdannaiset tunnetaan belgialaisesta patenttijulkaisusta 904 709. S-541-johdannaiset, joissa on hiili-hiili-kaksoissidos asemien 22 ja 23 välissä, on kuvattu 25 eurooppalaisessa patenttispesifikaatiossa 215 654. Yhdisteiden S-541 26-hydroksijohdannaiset ja 26-C1.il-alkanoyylioksijohdannaiset, sekä yhdisteiden S-541 23-keto- ja 23-deoksijohdannaiset tunnetaan eurooppalaisesta patenttispesifikaatiosta 237 341.

30 Brittiläisessä patenttispesifikaatiossa 2 176 182 kuvataan edellä olevaa kaavaa (C) vastaavien makrolidiantibioottien toinen ryhmä, joiden yhdisteiden asemassa 5 on hydroksi- tai substituoitunut hydroksiryhmä, asemassa 23 hydroksi-, substituoitunut hydroksi- tai ketoryhmä, ja asemassa 25 α-haaroittunut alkenyyliryhmä.

35 94647 19

Edelleen eräs toinen samankaltaisten makrolidijohdannaisten ryhmä kuvataan japanilaisessa patenttihakemuksessa Kokai 62-29590. Niiden rakenne vastaa edellä esitettyä kaavaa (C), jolloin asemassa 5 on hydroksi- tai metoksiryhmä. Renkaan asema 13 voi olla substituoitunut 4'-(a-L-ole-5 androsyyli)-α-L-oleandrosyylioksiryhmällä kuten avermektiineissäkin, ja asemien 22 ja 23 välissä voi olla hiili-hiili-kaksoissidos, tai vaihtoehtoisesti, asema 23 voi olla substituoitunut hydroksiryhmällä. Aseman 25 substituentti on tyypiltään sellainen, ettei sitä esiinny luonnollisesti muodostuneissa milbemysiineissä eikä avermektiineissä, ja 10 näihin substituentteihin kuuluu erilaisia α-haaroittuneita alkyyliryh-miä, alkenyyli-, alkynyyli-, alkoksialkyyli-, alkyylitioalkyyli- ja sykloalkyylialkyyliryhmiä tai sykloalkyyli-, sykloalkenyyliryhmiä tai heterosyklisiä ryhmiä. Tämä 25-substituentti liitetään lisäämällä vastaavaa karboksyylihappoa tai sen johdannaista avermektiiniä tuottavan 15 mikro-organismin käymisalustaan.

Kaikilla edellä kuvatuilla, eri luokkia muodostavilla, milbemysiinin kaltaisilla makrolidiyhdisteillä esitetään olevan yhden- tai monenlaista aktiivisuutta antibioottisena, matoja torjuvana, ektoparasiitteja 20 torjuvana tai punkkeja torjuvana aineena tai muita tuholaisia torjuvana aineena. Alalla on kuitenkin edelleen olemassa tarve saada aikaan tällaisia makrolidiyhdisteitä, joilla on toisenlaista aktiivisuutta yhteen tai useampaan luokkaan kuuluvia parasiitteja vastaan. Olemassa on samoin jatkuvaa tarvetta saada kehitetyksi parempi valmistusreitti näihin 25 tunnettuihin yhdisteisiin.

Keksinnön mukaisia entsyymejä käyttämällä voidaan saada uusia hydrok-syloituja makrolidiyhdisteitä. Näin voidaan myös valmistaa tunnettuja hydroksyloituja makrolideja.

30 Näitä tavoitteita varten oheinen keksintö kohdistuu menetelmään kaavan (I) mukaisen makrolidiyhdisteen valmistamiseksi: 35 20 94647 CH3 5 CH3ii ΊΓ 10 0 x\h3

Y

missä R1 tarkoittaa metyyliryhmää, etyyliryhmää, isopropyyliryhmää, sec. -15 butyyliryhmää tai kaavan -C(CH3)-CHR5 mukaista ryhmää, jossa kaavassa R5 tarkoittaa metyyliryhmää, etyyliryhmää tai isopropyyliryhmää, edellyttäen, että mikäli R1 on hydroksiryhmä, niin tällöin R3 tarkoittaa metyyliryhmää, etyyliryhmää, isopropyyliryhmää tai see.-butyyliryhmää; ja 20 -X(-Y)- tarkoittaa ryhmää -CH0H- tai -C(=N-0H)-.

Menetelmä makrolidiyhdisteiden (I) valmistamiseksi käsittää kaavan (II) mukaisen yhdisteen entsymaattisen hydroksyloimisen käyttäen keksinnön mukaista entsyymiä: 25 CH3 ^YCH3 30 CH3I1 ir

•L

]|ohT

35 0 ch3 r

II

21 94647 (missä R1 ja -X(-Y)- ovat edellä esitetyn määritelmän mukaisia.

Kaavan (II) mukaiset lähtöyhdisteet ovat tunnettuja yhdisteitä, tai niitä voidaan valmistaa edellä mainitussa, makrolideja käsittelevässä 5 kirjallisuudessa kuvatuilla menetelmillä, jonka kirjallisuuden sisältö liitetään oheen tällä viittauksella. Kaavan (II) mukaiset, luonnossa esiintyvät milbemysiinit saadaan käymisteitse, ja ne esiintyvät usein seoksina. Tällaiset seokset voidaan erottaa ennen reaktiota, tai niitä voidaan käyttää sellaisenaan.

10

Sen jälkeen, kun muunnosreaktio on edennyt loppuun, toivottu yhdiste voidaan saada reaktiojärjestelmästä, kerätä, eristää ja puhdistaa perinteisellä tavalla. Esimerkiksi, reaktiotuote suodatetaan ja suodos uutetaan veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimella kuten 15 etyyliasetaatilla. Sen jälkeen, kun liuotin on haihdutettu uutteesta, jäljelle jäävä raaka hydroksyloitunut makrolidiyhdiste voidaan puhdistaa pylväskromatografisesti silikageelillä tai alumiinioksidilla, sopivalla eluentilla eluoiden. Mikäli lähtömateriaali on seos, niin tällöin tuote voidaan eristää hydroksyloituneiden tuotteiden seoksena, joka 20 voidaan erottaa toivottaessa kromatografisesti tai muilla sopivilla tekniikoilla.

Yleisesti, kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on parasiitteja torjuvaa aktiivisuutta, kuten hyönteisiä, punkkeja ja matoja torjuvaa aktiivi-25 suutta, ja/tai niitä voidaan käyttää välituotteina muiden yhdisteiden, erityisesti 13-esteröityneiden johdannaisten, synteesissä, joilla yhdisteillä on erilaista hyönteisiä, punkkeja ja matoja torjuvaa aktiivisuutta .

30 Erityisesti, kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on punkkeja torjuvaa aktiivisuutta Tetranvchus-. Panonvchus- ja lahopunkkien, jotka esiintyvät loisina hedelmäpuissa, vihanneksissa ja kukkivissa kasveissa, täysikasvoisia yksilöitä, niiden toukkia ja munia vastaan, sekä eläimissä loisina esiintyviä Ixodidae-, Dermanvssidae-ia Sarcoptidae-ounk-35 keja ja muita vastaavia vastaan.

22 94647

Niillä on myös Oestrus-. Lucilia-. Hvnoderma- ja Gautrophilus-eliöitä ja muita vastaavia torjuvaa aktiivisuutta; aktiivisuutta eläimissä ja linnuissa ektoparasiitteina esiintyviä kirppuja ja täitä vastaan; kotitalouksissa esiintyviä hyönteisiä kuten torakoita ja kotikärpäsiä vas-5 taan; sekä maataloudessa ja puutarhan viljelyssä esiintyviä erilaisia haitallisia hyönteisiä, kuten kirvoja ja Leoidootera-toukkia. vastaan. Tämän lisäksi ne ovat aktiivisia maaperässä esiintyviä eliöitä Meloido-gvne. Bursaohelenchus. Rhizoglvphus ja muita vastaavia vastaan.

10 Kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on myös aktiivisuutta kasveille haitallisia hyönteisiä vastaan, erityisesti kasveja syöviä hyönteisiä vastaan.

Tämän lisäksi kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä on loisia torjuvaa 15 aktiivisuutta, ja niitä voidaan käyttää eläimissä ja ihmisissä esiintyviä matoja torjuvana aineena. Ne tehoavat erityisesti koti- ja lemmikkieläimissä sekä siipikarjassa, kuten sioissa, lampaissa, vuohissa, karjassa, hevosissa, koirissa, kissoissa ja kanoissa, loisina esiintyviä nematodeja vastaan.

20

Maatalouden ja puutahran hoidon tarkoituksia varten kaavan (I) mukaisista yhdisteistä voidaan tehdä erilaisia alalla jo tunnettuja valmistemuotoja, kuten jauheita, kostuvia jauheita, emulgoituvia tiivisteitä ja niin edelleen. Tällaiset valmisteet voidaan laimentaa vedellä siten, 25 että aktiivisen aineen pitoisuus on 1-10 ppm.

Käytettäessä kaavan (I) mukaisia yhdisteitä matoja torjuvana aineena eläimissä, niistä voidaan tehdä erilaisia alalla jo tunnettuja valmisteita, kuten jauheita, tabletteja, kapseleita ja injektioita. Kun niitä 30 annetaan suun kautta, niin annos on mielellään 0,01-100 mg, edullisesti , 0,5-50 mg, vaikuttavaa ainetta ruumiin yhtä painokiloa kohden.

Keksinnön mukaisten hydroksyloivien entsyymien toinen havainnollistava käyttömuoto on ML-236B-yhdisteiden hydroksyloiminen.

« 4 35 23 94647 US-patenttijulkaisussa 4 346 227 kuvataan yhdisteen ML-236B tai ML-236B-karboksyylihapon tai sen suolan tai esterin entsymaattinen hyd-roksylointi.

5 ML-236B on laktoni, jolla on rakenne (D):

Oyy°H

10 S

15 ja se voi esiintyä avoimen renkaan käsittävässä muodossa karboksyyli-happona, jolla on rakenne (E): ^ .OH HOOC^^V^

20 H0VJ

H^C^Y^O k 25 ^ΝίίΑ^’

Hydroksylaatiossa saadaan tyypillisesti kahden yhdisteen seos, mielenkiinnon kohteena olevan tuotteen rakenteen ollessa (F) (laktonina): 30

O^^OH

35 H3CX"Y'Is0 S

VtYCH3

HO

24 94647 US-patenttijulkaisussa 4 346 227 tätä yhdistettä nimitetään M-4-lak-toniksi. Yhdisteen M-4 natriumsuola tunnetaan nykyään pravastatiini-natriumina. Täten, ML-236B-karboksyylihapon 6^-hydroksijohdannaisen natriumsuola on pravastatiininatrium.

5

Kukin tämän keksinnön mukainen entsyymi hydroksyloi vähintään ML-236B-yhdisteiden 6-aseman ferredoksiinin, ferredoksiini-NADP+-reduktaasin, NADPH:n ja liuenneen hapen läsnäollessa seuraavan kaavion mukaisesti: 10 M h. ^ ,,Ηθ-f odon. ö, η,ο e*

(ί^ΤΎ' .Ferredokslini Ferredoksllni 15 (pelkistynyt) (hapettunut) [TT

\ S

ferredoksivil -*«F^nMuktaaj( MAflp' mam f 20 H· "tri COONt o «V o.

25 e Täten, esimerkiksi, natrium-6&-hydroksi-ML-236B-karboksylaatti eristetään varsinaisena tuotteena yhdessä sivutuotteena toimivan natrium-6a-hydroksi-ML-236B-karboksylaatin kanssa.

30

Kun kukin keksinnön mukainen sytokromi P-450-entsyymi saatetaan reagoimaan substraattina toimivan natrium-ML-236B-karboksylaatin kanssa pH-arvossa 7,4 5 minuutin ajan (a) ferredoksiinin, (b) ferredoksiini-NADP+-reduktaasin, (c) NADP+:n, (d) NADPH-elvytysjärjestelmän ja (e) 35 liuenneen hapen läsnäollessa, niin vaikutuslämpötila vaihtelee vähintään alueella 4-60 °C. Kunkin sytokromin optimi-pH vaihtelee alueella • · · n 25 94647 6,5-8,0. Kukin sytokromi on stabiili pidettäessä 24 tuntia 4 eC:n lämpötilassa, pH-alueella 6,0-9,0.

Ferredoksiinin, ferredoksiini-NADP+-reduktaasin, hapen ja NADPH:n käyttö 5 ei ole olennaista. Menetelmässä voidaan käyttää mitä tahansa komponenttia, joka kykenee aktivoimaan sytokromi P-450-entsyymin.

Lisäksi substraatti ei rajoitu ML-236-karboksyylihapon natriumsuolaan. ML-236B-lähtöyhdiste voi olla vapaa karboksyylihappo, sitä vastaava 10 laktoni tai sen suola (esimerkiksi metalli-, aminohappo- tai amiini- suola) . Keksinnön mukainen sytokromi P-450-entsyymi ei itse vaikuta ML-236B-yhdisteen karboksiryhmään. Täten, muiden tekijöiden pysyessä samoina, ML-236B-laktoni tuottaa hydroksi-ML-236B-laktonin, ML-236B-kar-boksyylihappo tuottaa hydroksi-ML-236B-karboksyylihappoa ja ML-236B-15 karboksyylihapon suola tuottaa hydroksi-ML-236B-karboksyylihapon samaa suolaa. Muut tekijät, erityisesti reaktioseoksen pH-arvo, voivat kuitenkin vaikuttaa tuotteeseen tavalla, joka on ennustettavissa normaalien kemian lakien perusteella. Lähtömateriaali ja muut tekijät valitaan mielellään siten, että ne helpottavat pravastatiininatriumin valmis-20 tusta.

Lähtömateriaaleina käytetyistä ML-236B-yhdisteistä erityisen edullisia ovat alkalimetallisuolat, esimerkiksi natrium- tai kaliumsuolat, nat-riumsuolan ollessa edullisin, koska sillä saavutetaan lähtöyhdisteen « : 25 paras konversio toivotuksi hydroksyloiduksi yhdisteeksi, pravasta- tiininatrlumiksi.

Tämän keksinnön mukainen sytokromi P-450-entsyymi substraattina toimivan ML-236B-yhdisteen hydroksyloimiseksi on tuotettu mielellään 30 Strentornvces carbophilus-kannalla SANK 62585 käyttäen induktioaineena ML-236B-yhdistettä, erityisesti natrium-ML-236B-karboksylaattia.

Entsyymiaktiivisuuden mittaaminen toteutetaan tavallisesti jommalla kummalla tavalla: 35 (i) Entsyymien sytokromi P-450sca_1( sytokromi P-450SCB_2 ja sytokromi • · • · 26 94647 P-450sca-3 määrittäminen Määrittäminen toteutetaan menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Omura ja Sato et ai., J. Biol. Chem. 239. 1964, 2370. Toisin sanoen, 5 sytokromi P-450S,.,-!, sytokromi P-450sca_2 ja sytokromi P-450sca_3 analysoidaan kvantitatiivisesti käyttäen seuraavaa kaavaa, perustuen ab-sorbanssien eroon spektrissä, jossa pienentynyt CO riippuu pienentyneestä erosta, aallonpituuksilla 450 nm ja 490 nm.

10 sytokromi P-450 (nmol/ml) - (O.D. 450 nm - O.D. 490 nm) x 1.000/91 (nmol/ml) (ii) Sen nopeuden, jolla pravastatiininatriumia muodostuu natrium-ML-236B-karboksylaatista, määrittäminen.

15 Tähän tarkoitukseen käytetään seuraavia komponentteja: P-450-entsyymiä sisältävä liuos 0,14 ml NADPH-elvytysj ärj e s telmä:

20 NADP+ 0,26 mM

Glukoosi-6-fosfaatti 14,0 mM

Glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasi 0,2 yksikköä

Nikotiiniamidi 10,0 mM

MgCl2 2,5 mM

·, 25 Ferredoksiini-NADP+-reduktaasi (pinaatti) 0,04 yksikköä

Ferredoksiini (pinaatti) 320,0 pg

Natrium-ML-236B-karboksylaatti 0,233 mM

Tilavuus yhteensä 0,20 ml 30 Taulukossa esitetyt komponentit sekoitetaan, liuosta ravistellaan 5 minuuttia 30 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen lisätään 10 μΐ 6N NaOH-liuosta ja reaktio pysäytetään. Entsyymijärjestelmän tuottaman pravas-tatiininatriumin määrä määritetään HPLC-kromatografisesti.

35 Käyttämällä koemenetelmiä aktiivisuuden määrittämiseksi aktiivisuushä-viö lämpötilan ja pH-arvon muuttuessa voidaan määrittää.

* t

II

94647 27

Esimerkiksi, kukin sytokromi inaktivoituu täydellisesti pH-arvossa 7,4 ja 70 °C:n lämpötilassa 60 minuutin aikana, kun läsnä on 20 % glyserolia ja 2 mM ditiotreitolia. Kukin sytokromi inaktivoituu pH-arvossa 3 tai sitä happamammassa pHrssa, sekä pH-arvossa 11 tai sitä emäksisem-5 mässä pH:ssa (käsiteltäessä 4 °C:n lämpötilassa 24 tuntia siten, että läsnä on 20 % glyserolia ja 2 mM ditiotreitolia).

Mahdollisten inhibiittoreiden vaikutus entsyymeihin sytokromi P-450sca.1, P-450sca_2 ja P-450sea_3 sekä metalli-ionien vaikutukset syto-10 kromi P-450-entsyymin aktiivisuuteen voidaan määrittää kvantitatiivisesti menetelmällä (ii).

Tällöin saadaan tyypillisesti seuraavat tulokset: 15 Lisätty yhdiste Entsyymin jäännösaktiivisuus P-450^.! P-450 sca~2 P-450sca_3 1 mM CoCl2 65,0 % 67,5 % 60,1 % 1 mM MnCl2 20,0 % 18,7 % 17,5 % 1 mM CuCl2 0 % 0 % 0 % 20 1 mM CaCl2 100,0 % 100,0 % 100,0 % 2 mM SKF-525A* 25,8 % 22,8 % 24,1 % 2 mM Simetidiini 58,7 % 45,7 % 43,8 % CO-kaasua kuplitettu 50,0 % 55,0 % 60,4 % liuokseen 1 minuutin 25 ajan * SKF-525A: 2-dietyyliaminoetyyli-2,2-difenyyli-valeraatti-hydrokloridi

Ionit Co2+, Mn2+ ja Cu2+ inhiboivat kunkin sytokromin. Kukin sytokromi 30 inhiboitui myös sytokromi P-450-entsyymien tyypillisten inhibiittoreiden, kuten yhdisteen SKF-525A (2-dietyyliaminoetyyli-2,2-difenyyli-valeraatti-hydrokloridi), simetidiinin ja hiilimonoksidin, vaikutuksesta.

35 t 28 - 94647

Esimerkkejä keksinnöstä

Oheista keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, jotka eivät rajoita sitä.

5

Esimerkki 1

Viljelyalusta, joka sisältää 2 % glukoosia, 1 % peptonia ja 0,1 % hii-vauutetta, valmistettiin ja sen pH asetettiin arvoon 7,0. Kymmenen 100 10 millilitran Erlenmeyer-pulloa, joista kukin sisälsi 20 ml alustaa, steriloitiin 121 °C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Sitten kuhunkin pulloon siirrostettiin platinasilmukallinen Streotornvces carboohilus-kan-taa SANK 62585 (FERM BP-1145), minkä jälkeen viljelyä, nopeudella 220 rpm ravistellen, jatkettiin 28 eC:n lämpötilassa 3 vuorokautta, jolloin 15 saatiin siirrosteviljelmä.

100 millilitran suuruinen määrä alustaa kaadettiin 500 millilitran suuruisiin Erlenmeyer-pulloihin, joita steriloitiin 121 ®C:n lämpötilassa 15 minuuttia. Kuhunkin 500 millilitran pulloon lisättiin 0,5 ml 20 siirrosteviljelmää, ja 50 pullosta muodostuva täyden mitan viljelmä toteutettiin. Sitten, kun täyden mitan viljelmä on yhden vuorokauden ikäinen, kuhunkin pulloon lisättiin ML-236B-karboksylaattia pitoisuudeksi 0,1 %, ja viljelyä jatkettiin edelleen yksi vuorokausi.

25 Viljelyn jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla, jolloin niitä saatiin 190 grammaa. Solumassa suspendoitiin kaksinkertaiseen tilavuuteen puskuriliuosta, joka sisältää 80 mM Tris-hydrokloorihappoa sekä 2 mM ditiotreitolia ja 20 % glyseriiniä, minkä jälkeen solut rikottiin ultraäänikäsittelyllä. Raakaentsyymin liuos saatiin supernatanttina 30 sentrifugoimalla toteutetun erottamisen jälkeen.

Entsyymit sytokromi P-450,ca.lt sytokromi P-450sca.2 ja sytokromi P-4508ca-3 puhdistettiin raakaentsyymin liuoksesta edellä olevassa taulukossa A esitetyn menetelmän mukaisesti. Raakaentsyymin dialyysin jäl-35 keen toteutettiin kahdesti kromatografinen käsittely käyttäen tuotetta DEAE-Toyopearl, minkä jälkeen geelisuodatukseen perustuva kromatogra-

II

29 94647 finen käsittely toteutettiin tuotteella Cellurofine. Lopuksi toteutettiin kromatografinen käsittely hydroksyyliapatiittia käyttäen, ja entsyymit eluoitiin fosfaattipuskurilla.

5 Sytokromi P-450S,,,,-! eluoitui fosfaattipuskurilla, jonka pitoisuus on noin 0,06 M, sytokromi P-450sca_2 eluoitui fosfaattipuskurilla, jonka pitoisuus on noin 0,08 M, ja sytokromi P-450sca.3 eluoitui fosfaattipuskurilla, jonka pH on noin 0,10 M. Kukin entsyymi saatiin elektroforeet-tisesti puhtaana P-450-entsyyminä. Puhdistamiseen liittyvät tulokset 10 esitetään seuraavassa taulukossa.

Puhdistusvaihe Kokonais- Kokonais- P-450/ P-450- proteiini P-450 proteiini saanto (mg) (nmol) (nmol/mg) (%) 15 Raakaentsyymiliuos 34268,0 1439 0,04 100,0 DEAE Toyopearl 650S 660,1 1439 2,18 100,0 DEAE Toyopearl 650S 55,3 466 8,43 32,4

Cellurofine GCL 2000m 27,7 302 10,90 21,0

Hydroksyyliapatiitti* 20 P-450sca.1 8,4 110 13,05 7.6 P-450sca-2 9,5 121 12,74 8,4 P-450sca_3 1,9 24,1 12,80 1,7 * Hydroksyyliapatiitti: DNA-laatuluokan Bio-geeli HTP 25

Aminohappoanalyysi toteutettiin.

Aminohapot happoja Cys ja Trp lukuunottamatta tuotettiin hydrolysoimalla 6N HC1-liuoksella 110 °C:n lämpötilassa 24 tuntia noudattaen 30 menetelmää, joka kuvataan teoksessa J.W. Eveleigh ja G.D. Winter (1970) Protein Sequence Determination, toimittaja S.B. Needleman, Springer-Verlag, 92.

Aminohappo Cys analysoitiin käyttämällä hapettamista seoksella 30 94647 H202/HC00H ja hydrolysoimalla sitten suolahapolla HC1 kysteiinihapoksi menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa E. Schrau et ai., Biochem. J. (1954), 57, 33. Erityisemmin, 80 μΐ näyteliuosta liuotettiin 100 mikrolitraan 99-prosenttista muurahaishappoa ja 20 mikrolitraan 5 metanolia. Tällä välin 10 μΐ vetyperoksidia H202 ja 190 μΐ 99-prosenttista muurahaishappoa säilytettiin tiiviisti suljetussa putkessa 25 eC:n lämpötilassa 2 tuntia. Molempia liuoksia jäähdytettiin -10 °C:n lämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen ne sekoitettiin. Seosta pidettiin -10 eC:n lämpötilassa 2,5 tuntia, ja sitten 160 μΐ 10 reaktioseosta haihdutettiin kuiviin ja lyofilisoitiin. Sitten tätä lyofilisoitua näytettä hydrolysoitiin 6 N HCl-liuoksella 110 °C:n lämpötilassa 24 tuntia samalla tavalla kuin muidenkin aminohappojen kohdalla.

15 Aminohappo Trp tuotettiin hydrolysoimalla 3 N merkaptoetaanisulfoniha-polla 110 °C:n lämpötilassa 24 tuntia noudattaen menetelmää, joka kuvataan julkaisussa B. Penke et ai., Anal. Biochem. (1974) 60, 45.

Koe toteutettiin yhtiön Hitachi aminohappoanalysaattorilla, malli 835.

20 Tällöin saatiin seuraavat tulokset: aminohappotiedot • 25 aminohappo- jäännöstä molekyylissä jäännös P-450sca.1 P-4505CB.2

Asx 39,1 36,9

Thr 30,9 30,0

Ser 22,4 21,1 30 Glx 41,8 39,6

Pro 26,8 26,7

Gly 28,7 25,9

Ala 48,0 45,4

Cys 3,1 1,9 35 Vai 31,4 30,0

Met 7,8 8,1 ·· • · n 94647 31

Ile 18,2 18,0

Leu 49,7 49,1

Tyr 4,9 5,0

Phe 15,2 15,0 5 His 13,6 13,8

Lys 9,0 8,4

Arg 34,0 34,2

Trp 1,0 1,1 10 Yhteensä 425,6 410,2

Analyysivirheiden uskotaan olevan suurin piirtein alueella ± 5 % 24 tunnin pituisen hydrolyysin tapauksessa, edellyttäen, että näyte on suhteellisen puhdas. Virhe pienenee suurin piirtein alueelle ± 2 %, 15 mikäli hydrolyysi toteutetaan säännöllisin väliajoin, esim. 24 tunnin, 48 tunnin, 72 tunnin, jne. pituisena.

Luotettavuus riippuu kahdesta tekijästä. Yksi niistä on kyky vastustaa hydrolyysiä. Kokeiden perusteella tiedetään, että sellaiset sidokset 20 kuin Val-Val, Val-Gly, jne. vastustavat hydrolyysiä. Tämän tekijän aiheuttama virhe voidaan minimoida pidentämällä hydrolyysin pituutta.

Toinen tekijä on tällä tavalla saatujen aminohappojen herkkyys hydro-lyysille. Esimerkiksi Ser ja Thr tiedetään herkiksi suolahapolla HC1 25 toteutettavalle hydrolyysille. Virhe voi suurentua hydrolyysin kestäessä pitkiä aikoja näiden aminohappojen tapauksessa.

Esimerkki 2 30 13-hvdroksimilbemvsiini A/.

Reaktion annettiin edetä 30 eC:n lämpötilassa tunnin ajan käyttäen mil-bemysiiniä A* substraattina, ja käyttäen seuraavaa seosta: • « 35 - 94647 32 P-450 (puhdistettu entsyymi) katso alla NADPH-elvytysjärjestelmä

NADP+ 0,26 mM

glukoosi-6-fosfaatti 14,0 mM

5 glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasi 0,2 yksikköä

nikotinamidi 10,0 mM

MgCl2 2,5 mM

Ferredoksiini-NADP+-reduktaasi (pinaatti) 0,04 yksikköä Ferredoksiini (pinaatti) 320,0 /ig

10 Milbemysiini Aa 0,92 mM

1,4-dioksaani 1,0 μΐ

Kokonaistilavuus 0,2 ml

Entsyymin P-450sca.1 tapauksessa P-450-määrä oli 0,431 nmol, entsyymin P-15 450aca.2 tapauksessa 0,646 nmol ja entsyymin P-450gea_3 tapauksessa 0,188 nmol.

Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

13-hydroksimilbemysiini Aa (/*g/ml) 20 P-450sca.1-järjestelmä 3,605 P-450aca.2-järjestelmä 5,035 P-4508Ca-3-j ärjestelmä 2,451 Järjestelmä ilman P-450-entsyymiä 0 ; 25 HPLC-tulokset olivat seuraavat: kolonni: Senshu Pack ODS-1251-P (4,6 mm x 250 mm) liuotin: 65 % asetonitriili virtausnopeus: 5 μΐ 30 ilmaisin: UV 240 nm retentioaika: 4,97 minuuttia

Massaspektri oli yhtäpitävä autenttisen näytteen spektrin kanssa.

j · 35 33 94647

Esimerkki 3 13-hvdroksi-5-ketomilbemvsiini A., 5-oksiimi 5 Esimekissä 2 esitetty menetelmä toistettiin käyttäen substraattina 5-ketomilbemysiinin A* 5-oksiimia, jolloin saatiin 13-hydroksi-5-keto-milbemysiinin A* 5-oksiimia.

HPLC-tulokset olivat seuraavat: 10 kolonni: Senshu Pack ODS-1251-P (4,6 mm x 250 mm) .

liuotin: 65 % asetonitriili virtausnopeus: 5 μΐ ilmaisin: UV 240 nm 15 retentioaika: 5,747 minuuttia

Massaspektri oli yhtäpitävä autenttisen näytteen spektrin kanssa.

Esimerkki 4 20

Pravastatiininatrium

Reaktion annettiin edetä 30 °C:n lämpötilassa tunnin ajan, käyttäen substraattina natrium-ML-236B-karboksylaattia seuraavassa seoksessa: 25 P-450 (puhdistettu näyte) katso alla NADPH-elvytysjärjestelmä

NADP+ 0,26 mM

glukoosi-6-fosfaatti 14,0 mM

30 glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasi 0,2 yksikköä

nikotinamidi 10,0 mM

MgCl2 2,5 mM

Ferredoksiini-NADP+-reduktaasi (pinaatti) 0,04 yksikköä

Ferredoksiini (pinaatti) 320,0 μg

35 Natrium-ML-236B-karboksylaatti 2,33 mM

Yhteensä 0,2 ml 34 94647

Entsyymin P-ASO^,-! tapauksessa P-450-määrä oli 0,862 nmol, entsyymin P-450eca.2 tapauksessa 1,292 nmol ja entsyymin P-4508ca.3 tapauksessa 0,377 nmol.

5 Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

pravastätiini-Na Na-6a-hydroksi-ML-236B-^g/ml) karboksylaatti (pg/ml) P - 450^,^-järj estelmä 29,4 2,9 10 P-450sca.2-järjestelmä 50,3 6,3 p*450sca-3-järjestelmä 17,11 2,99 Järjestelmä ilman P-450- entsyymiä 0 0 15 HPLC-tulokset olivat seuraavat: kolonni: Radial-PAK-hylsy C18 (5,0 mm x 100 mm) liuotin: 27 % asetonitriili/ 0,1 % trietyyliamiini- fosforihappo (pH 3,2) 20 virtausnopeus: 5 μΐ ilmaisin: UV 240 nm retentioaika: 10,89 minuuttia

Massaspektri oli yhtäpitävä autenttisen näytteen spektrin kanssa.

25

Tuloksista nähdään, että pravastatiini-natriumia saatiin valmistetuksi erittäin spesifisesti natrium-ML-236B-karboksylaatista.

Pinaatin ferredoksiini voidaan korvata mikro-organismin Clostridium 30 pasteurianum ferredoksiinilla.

Claims (3)

94647

1. Hydroksylointientsyymi, tunnettu siitä, että se on tuotettu organismin Streptomvces carbophilus SANK 62585 FERM BP-1145 avulla ja 5 eristetty siitä, ja että se on jokin seuraavista: (i) elektroforeettisesti puhdas sytokromi P-450eca.1-entsyymi, jonka molekyylipaino on 46000 ± 1000 määriteltynä SDS-polyakryyliamidisähkö-foreesilla, maksimiabsorptio on aallonpituudella 449 nm spektrissä, 10 jossa absorptio johtuu CO-ryhmästä ja joka entsyymi eluoituu kasvualustasta, joka on saatu viljelemällä organismia Streptomvces carbophilus SANK 62585, hydroksyyliapatiittikromatografialla fosfaatti-purskuripitoisuudessa 0,06 M; 15 ii) elektroforeettisesti puhdas sytokromi P-450sca.2-entsyymi, jonka molekyylipaino on 46000 ± 1000 määriteltynä SDS-polyakryyliamidisähkö-foreesilla, maksimiabsorptio on aallonpituudella 448 nm spektrissä, jossa absorptio johtuu CO-ryhmästä ja joka entsyymi eluoituu kasvualustasta, joka on saatu viljelemällä organismia Streptomvces 20 carbophilus SANK 62585, hydroksyyliapatiittikromatografiällä fosfaat-tipuskuripitoisuudessa 0,08 M.

2. Menetelmä vaatimuksen 1 mukaisen hydroksylointientsyymin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä Streptomvces car- 2b bophilus-kantaa SANK 62585 FERM BP-1145 viljellään viljelyalustassa, viljelyalustaan lisätään sellaista induktioainetta, joka kykenee indusoimaan entsyymin tuotannon, jossa induktioaine ja entsyymin substraatti ovat sama yhdiste, Streptomvces carbophilus-kantaa SANK 62585 viljellään edelleen, minkä jälkeen hydroksylointientsyymi eristetään. 30

3. Menetelmä milbemysiinin tai ML-236B substraatin hydroksyloimiseksi käyttämällä patenttivaatimuksen 1 mukaista hydroksylointientsyymiä, tunnettu siitä, että saadaan aikaan vähintään yksi patenttivaatimuksen 1 mukainen hydroksylointientsyymi sekä milbemysiini tai ML- 35 2368-substraatti entsyymille; tämä substraatti hydroksyloidaan käyttäen mainittua hydroksylointientsyymiä; ja saadaan hydroksyloitunut substraatti . 94647