CZ291991B6 - Aktinomycetový promotor - Google Patents

Abstract

5'-nek duj c oblast 1 kbp genu pro cytochrom P-450.sub.sca-2.n. v aktinomycet ch Streptomyces carbophilus m transkrip n promotorovou aktivitu, kter podl h substr tov indukci. Zkr cen 1 kbp oblasti vede ke konstitutivn transkrip n aktivit . Zkr cen promotory lze v²hodn vyu t v expresn ch syst mech, zejm na pro produkci pravastatinu sodn ho v syst mech exprimuj c ch P-450.sub.sca-2.n. v p° tomnosti ML-236B.\

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové formy transkripčního promotoru přidruženého ke genu kódujícího cytochrom P-450 ze Streptomyces carbophilus. Dále se týká vektorů obsahujících tento promotor, jejich použití při expresi proteinů, zvláště P-450_sca_₂, týká se hostitelských buněk, transformovaných tímto vektorem, expresního systému, který tyto buňky obsahuje a jeho využití. Vynález umožňuje průmyslovou produkci proteinů s použitím předkládaných promotorů.

Dosavadní stav techniky

V poslední době umožnil pokrok v oblasti genetického inženýrství zavádění cizích genů do různých mikroorganismů a jejich expresi. Velký pokrok byl učiněn v oblasti využití Escherichia coli (E.coli) jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních proteinů a výsledné postupy byly díky průmyslové aplikaci komerčně využity. Nedávno došlo k podstatnému pokroku ve výzkumu vy užití kvasinek jako alternativního hostitele místo E. coli.

Aktinomycetes (zejména druh Streptomycetes) jsou prokaryontní mikroorganismy běžně používané pro produkci antibiotik. Heterologní DNA se obvykle zavádí do aktinomycet systémem hostitel-vektor, který byl vyvinut v osmdesátých letech Hopwoodem a kol. [viz Hopwood, D. A., et al., (1987), Methods in Enzymology“, 153: 116-166, Academie Press, New York], Tento postup umožnil další výzkum a vývoj expresních vektorových systémů na aktinomycetách. Příkladem transkripčního promotoru použitého v aktinomycetovém expresním systému je tipA, promotor indukovaný antibiotikem thiostreptonem (viz Murakami, T. a kol., (1989), J. Bacteriol., 171,1495].

Pravastatin sodný, používaný při léčbě hyperlipidémie, má výhodný farmakologický účinek, neboť redukuje sérový cholesterol [viz Arai, a kol., (1988), Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38]. Pravastatin sodný primárně vzniká mikrobiální hydroxylací sodné soli ML-236B, látky produkované filamentózní plísní Penicillium citrinum. Hydroxylace obvykle probíhá v přítomnosti aktinomycet Streptomyces carbophilus. Bylo dokázáno, že činidlo s hydroxylační aktivitou je cytochrom typu P-450_sca (dále zkracován jako ,^-450^) [viz Serizawa, a kol., (1990), Bichimica et Biophysica Acta, 1084, 35-40].

Matsuoka a kol. purifikovali cytochrom P-450_sca ze Streptomyces carbophilus, který katalyzoval hydroxylací sodné soli ML-236B v poloze 6-, Tento P-450_sca se vyskytuje ve třech formách, jako Ρ-450_Κι-], P-450_Ka_₂ a P-450_sca_₃ [viz Matsuoka a kol., (1989), Eur. J. Biochem., 184, 707-713 a EP-A-0 281 245], nebylo však zjištěno, zda jde o izotopy nebo o produkty různých genů.

Serizawa a kol., klonovali a exprimovali DNA ze Streptomyces carbophilus kódující P-450_sca [viz Japonský patent Kokai č. Hei 6-70 780 a Watanabe, I., a kol., (1995), Gene, 163, 81-85]. DNA a část 5'-nekódující oblasti 1 kbp z genu pro Ρ-450_Μ3_₂ byly nakloňovány do plazmidu pIJ702, vyskytujícího se ve více kopiích, a použity na transformaci Streptomyces lividans TK21. Transformované buňky Streptomyces lividans TK21 převáděly ML-236B na pravastatin sodný dokonce rychleji než S. carbophilus, což prokázalo, že fragment 1 kbp měl silnou promotorovou aktivitu. Fragment 5'-nekódující oblasti 1 kbp nebyl dosud sekvenován.

Ve stejné době bylo potvrzeno, že exprese P-450_sca podléhá substrátem indukované transkripci, tj. ML-236B a fenobarbital zvyšující expresi P-450 třicetkrát. Northemovým blotingem bylo potvrzeno, že v nepřítomnosti ML-236B nedochází k transkripci a v přítomnosti sodné soli

-1 CZ 291991 B6

ML-236B vznikají tři transkripty. V přítomnosti substrátu roste rychlost transkripce v průběhu šesti hodin k maximu.

DNA kódující P-450_Ka_2 má délku 1 233 bp, promotorová oblast je přibližně stejně dlouhá, 5 1013 bp, což podstatně ztěžuje transformaci ve srovnání s postupem, kdy se pro transformaci používá pouze otevřený čtecí rámec (ORF). Avšak zdálo se, že zkrácení tohoto komplexu, substrátem indukovaného promotoru, by mohlo způsobit neúčinnost promotoru. Kromě toho byla již úspěšně provedena transformace hostitele vektorem obsahujícím jak ORF tak oblast 1 kbp, takže nebylo nutné uvažovat o zkrácení ORF nebo 5'-nekódující oblasti.

Časová prodleva šesti hodin před dosažením maximální produkce P-450, však zůstala problémem, zvláště z hlediska průmyslového využití.

Podstata vynálezu

Nyní jsme s překvapením zjistili, že zkrácení délky 5'-nekódující oblasti přidružené ke genu kódujícímu P—450_SCa-2> nejen ruší úlohu ML-236B jako substrátu, ale též zvyšuje efektivitu promotoru.

Prvním předmětem předkládaného vynálezu je tedy DNA s transkripční promotorovou aktivitou, přičemž tato DNA koresponduje s částí, ne s celkem, 5'-nekódující oblasti 1 kbp, která přímo sousedí s otevřeným čtecím rámcem Streptomyces carbophilus, uvedený otevřený čtecí rámec kóduje cytochrom P-450.

Mimořádně výhodné je, pokud DNA s transkripční promotorovou aktivitou je obsažena alespoň v jednom kmeni Streptomyces carbophilus a/nebo alespoň v jednom kmeni Streptomyces lividans.

Předkládaný vynález poskytuje transkripční promotor pro expresi proteinu v aktinomycetách, výhodně streptomycetách, který vede k významné produkci proteinu ve vhodném expresním systému bez podmínky substrátové indukce transkripce. Tato exprese je výhodně konstitutivní.

Předkládaný vynález též poskytuje: nukleotidovou sekvenci celého promotoru nebo jeho částí; 35 DNA s částečnou nebo celou promotorovou aktivitou; vektory obsahující předkládané promotory; hostitelské buňky transformované těmito vektory; a způsoby produkce rekombinantních proteinů transformovanými hostitelskými buňkami.

Velkým přínosem předkládaného vynálezu je, že uvádí způsob produkce pravastatinu sodného 40 s využitím hostitele, kteiý exprimuje rekombinantní protein P—450, jehož transkripce je uvedeným promotorem regulována.

Předkládaný vynález stanovuje, že zmenšení 5'-nekódující oblasti přidružené ke genu P-450 ze S. carbophilus, konkrétně 5'-nekódující oblasti přidružené ke genu Ρ—450_Κ3_₂, nemá žádný nebo 45 jen malý vliv na rychlost transkripce, že zkrácení 5'-nekódující oblasti výhodně ruší podmínku substrátové indukce. Substrátová indukce je pozitivní efekt, takže se dalo očekávat, že jejím zrušením vznikne promotor vedoucí pouze k základní rychlosti transkripce. Ukázalo se však, že zkrácené promotorové oblasti výrazně převyšují základní rychlost promotoru 1 kbp. Dokonce i řetězce dlouhé pouhých 74 bp mají stále výhodnější účinnost než promotor 1 kbp.

Dále se ukázalo, že rychlost transkripce řízená zkrácenými promotory je konstitutivní, neboť vysoké transkripční rychlosti nastupující okamžitě bez šestihodinové prodlevy nutné pro dosažení maximální rychlosti exprese od okamžiku zavedení ML-236B nebo jiného substrátu, jako

-2CZ 291991 B6 v případě promotoru vyžadujícího substrátovou indukci. Tato okolnost je zvláště významná z průmyslového hlediska.

5'-nekódující oblast s transkripční promotorovou aktivitou, bezprostředně navazující na ORF P-450, je v textu též označována jako 5' promotor. Zejména je výhodné jde-li o promotor přidružený ke genu P-450_sca_₂ ze S. carbophilus.

Ačkoliv zde bylo uvedeno, že 5' promotor má délku 1 kbp, jde pouze o průměrnou délku oblasti rozprostírající se v 5' směru od iniciačního místa transkripce (tsr) v ORF. Tsr se nachází v okolí nukleotidu 384 v SEQ. ID. č. 1 a iniciační kodon ATG bezprostředně následuje za polohou 428. Konec oblasti obsahující 5' promotor je v místě Sací které se nachází 1013 bp v protisměru v ORF. Místo Sací v této oblasti popsal Watanabe, [Watanabe, I., a kol., (1995), Gene, 163, 81-85], neurčil však délku 5' promotoru. Pro jednoduchost je délka 5' promotoru označována jako 1 kbp místo přesnějšího 1013 bp, neboť jde o údaj v podstatě správný, který není základním rysem předkládaného vynálezu a v následujícím textu bude ještě vyjasněn. V každém případě musí být promotory předkládaného vynálezu kratší než plná délka 1013 bp 5' promotoru.

5' oblast 1 kbp přidružená ke genu P-450_sca_2 nemusí nutně obsahovat celý promotor, i když lze podle velikosti oblasti předpokládat, že jej obsahuje. Ve skutečnosti se zdá, že promotor nezabírá celou tuto dobře definovanou oblast, protože i část pouhých 74 bp má stále srovnatelnou nebo i vyšší aktivitu než původní 5' promotor 1 kbp. Tento fakt je zřejmě i příčinou podstatně vyšší účinnosti promotorů předkládaného vynálezu o délce přesahující 160 bp, výhodně 300 bp nebo vyšší.

DNA předkládaného vynálezu, též zde označované jako promotoiy předkládaného vynálezu, korespondují s 5' promotorem 1 kbp, za podmínky, že jsou kratší než 5' promotor 1 kbp. Zkrácení lze provést libovolným vhodným způsobem, jako je například odštěpení částí DNA restrikčními endonukleázami, konstrukce specifických kratších sekvencí, nebo štěpení od 3' nebo 5' konců. Uvedené prostředky lze i kombinovat.

Z hlediska promotorové aktivity je vhodné, aby byly předkládané promotory dvouvláknové (ds). Předkládaný vynález se věnuje i jednotlivým komplementárním vláknům, která tvoří předkládané promotory. Předkládaný vynález dále zahrnuje i části jednoho nebo obou komplementárních vláken, které lze použít při konečné konstrukci předkládaného promotoru.

Zejména bylo zjištěno, že k vynikajícím výsledkům vede štěpení od 5'konce, protože oblast o délce 75 bp nacházející se u 3' konce promotorové sekvence je stále vysoce aktivní. Podle výhodného provedení předkládaného vynálezu tedy předkládaná DNA odpovídá 5' promotoru částečně štěpenému po směru. Minimální délka promotorové DNA není ničím omezena za předpokladu, že zkrácená DNA má stále dostatečnou promotorovou aktivitu.

Ačkoliv dobrou promotorovou aktivitu mají i promotory kratší než 100 bp, zejména z oblasti 3'konce, objevuje se v rozmezí délek 158 až 320 bp významné zvýšení aktivity. Fragment 320 bp má 5 x vyšší aktivitu než fragment 158 bp. Oba tyto fragmenty pocházejí přitom z 3' konce 5' promotoru 1 kbp. Tento rozdíl v promotorové aktivitě není však pro předkládaný vynález důležitý, neboť délka 152 bp (rozdíl mezi dvěma uvedenými délkami) má minimální vliv na transformaci nebo expresi.

Pokud se bude odborník v oboru zabývat identifikací přesné délky promotorů v oblasti přechodu mezi vyšší a nižší aktivitou, je další postup známý a odborníkovi v oboru zřejmý. Taková identifikace však nepřinese žádnou výhodu, protože z praktického hlediska není v použití promotorové sekvence 158 bp nebo 320 bp žádný rozdíl.

-3 CZ 291991 B6

Obecně je výhodnější použít promotor s vyšší aktivitou, aby bylo dosaženo maximální transkripce. Při použití promotoru s vyšší aktivitou se však může stát, že rychlost transkripce je nevhodně vysoká a při výrobě proteinu pak dochází k vyčerpání příliš mnoha zdrojů hostitele.

V takovém případě je vhodnější volit promotor s nižší aktivitou.

Dále bylo zjištěno, že existuje délka promotoru, mezi 428 bp a plnou délkou 1 kbp, kde mizí závislosti na substrátové indukci. Promotor této specifické délky 428 bp byl získán štěpením z 5' konce. Je však velmi pravděpodobné že jako promotor může sloužit libovolná sekvence o délce 428 a podobně, pocházející z oblasti 1 kbp.

Jak bylo uvedeno výše, je ztráta závislosti na substrátové indukci velmi výhodná. Přesná délka promotoru, kde tato závislost mizí není důležitá. Bylo ukázáno, že aktivita promotoru délky 428 bp je stejná nebo mírně vyšší, než aktivita 5' promotoru 1 kbp, přinejmenším hodinu po indukci substrátem. Promotor s poloviční délkou původního promotoru tedy pracuje přinejmenším stejně dobře jako původní promotor, a bez podmínky substrátové indukce. To znamená, že je okamžitě zvýhodněn každý postup, pro kteiý je rychlost exprese důležitá. S délkami nad 428 bp se díky velikosti již nepohodlně pracuje a nejsou pro uživatele přínosné. Navíc delší promotory opět začínají vyžadovat substrátovou indukci, čímž zaniká přínos krácených promotorů předkládaného vynálezu.

DNA předkládaného vynálezu má tedy výhodně takovou délku, která vede k ekvivalentní nebo vyšší aktivitě než je aktivita 3' koncových fragmentů 320 bp a/nebo 428 z 5' promotoru. Výhodný promotor je dostatečně krátký, tak aby nevyžadoval substrátovou indukci.

Výraz „substrátová indukce“ je v oblasti techniky známý. Obecně platí, že některé expresní produkty jsou v přirozených podmínkách průběžně produkovány pouze v přítomnosti určitého substrátu, s nímž reagují. V nepřítomnosti substrátu by organismus exprimováním produktu zbytečně vyčerpával své zdroje. V přírodě se proto vyvinuly různé systémy, v nichž k expresi dochází pouze v přítomnosti substrátu.

V případě P-450_sca-2 je substrátem ML-236B, který působí v místě promotoru a indukuje transkripci mRNA. Není pochyb, že ML-236B je přirozeným substrátem pro cytochromy Ρ-450_Κϊ. Mohou existovat i jiné substráty, odlišné od ML-236B, které mohou indukovat 5' promotor. Jiným vhodným substrátem, který indukuje 5' promotor, je fenobarbital. Přesná povaha induktoru pro 5' promotor není však z hlediska předkládaného vynálezu důležitá a již nebude dále diskutována.

Bez ohledu na teorii se zdá pravděpodobné a překvapující, že substrátová indukce cytochromů P-450_sca-2 nějakým způsobem překonává transkripční blok. Zkrácení promotorové oblasti 1 kbp, zejména štěpením z 5' konce, tedy zřejmě vede k odstranění bloku. Proto lze předpokládat, že neexistuje nějaká konkrétní délka promotoru, při níž by po překročení určitého bodu docházelo k obnově substrátové indukce, ale že spíše promotorové aktivita s rostoucí délkou promotoru klesá, protože dochází k regeneraci transkripčního bloku. Substrátová indukce začíná být účinná buď přímo úměrně regeneraci transkripčního bloku, nebo od dosažení určité délky promotoru.

V každém případě jsou výhodné promotory, jejichž aktivita není redukována rostoucí délkou, promotory kratší než 500 bp. Jinými slovy promotory delší než 500 bp, konkrétně delší než 428 bp, vykazující sníženou aktivitu a nejsou výhodné.

DNA předkládaného vynálezu odpovídá části nebo částem 5’ promotoru. Výraz „odpovídá“ znamená, že předkládaná DNA vykazuje stejný typ promotorové aktivity jako 5' promotor, v tom smyslu, že podporuje transkripci ORF kódujícího cytochrom P-450_sca. Úroveň, na níž k promoci dochází není z hlediska předkládaného vynálezu podstatná a hladiny promotorové aktivity předkládaných promotorů jsou v textu uvedeny. Jediným požadavkem je, aby aktivita předkládaných promotorů byla vyšší než aktivita 5' promotoru, jak již bylo uvedeno.

-4CZ 291991 B6

Promotory předkládaného vynálezu odpovídají části nebo částem 5' promotoru. Podle jednoduchého provedení vynálezu byl 5' promotor štěpen od 5' konce, takže sekvence výsledného promotoru předkládaného vynálezu odpovídala sekvenci zbytku 5' promotoru z 3' konce. V případě, kdy byl 5' promotor štěpen od 5' konce, určitá jeho část dále odštěpena endonukleázami a provedena ligace, odpovídala sekvence výsledného promotoru předkládaného vynálezu přímo příslušným dvěma částem 5' promotoru. V obou uvedených příkladech měl výsledný promotor identickou sekvenci s jednou nebo více částmi 5' promotoru.

Předkládané promotory obvykle obsahují jednu nebo několik sekvencí identických s příslušnými sekvencemi 5' promotoru. Nukleotidové sekvence předkládaných promotorů však nemusí přesně odpovídat příslušným sekvencím 5' promotoru. Ačkoli je obecně výhodné pokud v podstatě sdílejí sekvenční homologii s příslušnými částmi odpovídajícího 5' promotoru, není to nezbytné. Jediným požadavkem je, aby vykazovaly očekávanou promotorovou aktivitu.

Promotory předkládaného vynálezu se mohou od původního 5' promotoru dle požadavků velmi lišit, ovšem za předpokladu že stále vykazují očekávanou promotorovou aktivitu. Obecně však variace v sekvenci přinášejí jen malé výhody a nelze zajistit, aby změny v sekvenci bází vedly k něčemu jinému než ke zrušení, aby změny v sekvenci bází vedly k něčemu jinému než ke zrušení, či snížení promotorové aktivity. Není však pravděpodobné, že by určitý malý počet modifikací v sekvenci bází měl nějaký výrazný účinek, podobně jako to nelze očekávat u sekvence bází kódující protein.

Modifikace v sekvenci bází obvykle nastávají při transformaci, nebo jsou prováděny záměrně, například při vytváření restrikčního místa. Předkládaný vynález zahrnuje promotory lišící se od původní 5' promotorové sekvence v jednom nebo několika úsecích změnami, které vznikly např. delecí, inverzí, inzercí a substitucí. Variace přírodně se vyskytujícího 5' promotoru mohou být i přirozeného původu, předkládaný vynález zahrnuje promotory vycházející i z těchto přirozených variant.

Další běžné rozdíly a změny v sekvencích a prostředky k jejich vyvolání jsou odborníkům v oboru známé a všechny tyto jevy jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty. Předkládané promotory, které obsahují změny jiné než přirozeného původu, jsou zde označovány jako mutace, předkládaný vynález tedy zahrnuje mutace a variace. Vyjádření „tato DNA koresponduje s částí, ne s celkem, 5'-nekódující oblasti 1 kbp, která přímo sousedí s ORF Streptomyces carbophilus, uvedená ORF kóduje cytochrom P-450“ zahrnuje mutace a variace.

Všeobecně platí, že vhodné mutace a variace hybridizují při 60 °C v 6 x SSC s DNA o sekvenci nukleotidů 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 ze seznamu sekvencí. DNA, která hybridizuje s mutacemi a variacemi může a nemusí být částí další sekvence.

Jak již bylo diskutováno, vykazují předkládané promotory vyšší aktivitu než 5' promotor 1 kbp. To však nezbytně neznamená, že rychlost transkripce ORF regulovaná předkládaným promotorem musí být vyšší, než rychlost transkripce regulovaná 5' promotorem 1 kbp, který vyžaduje substrátovou indukci. Konstitutivní produkce regulovaná předkládaným promotorem často slouží ktomu, aby stále zajišťovala vyšší hladiny proteinové aktivity, např. při porovnání s hladinami proteinové aktivity s použitím 5' promotoru jednu hodinu po indukci substrátem. Konstitutivní produkce je mnohem výhodnější než pomalý nájezd, který posléze dosáhne požadované nebo užitečné úrovně.

Ačkoliv fragmenty DNA předkládaného vynálezu se s výhodou používají ve spojitosti s cytochromy P—450_sca, lze je použít i pro jinou vhodnou sekvenci určenou k expresi a v libovolném vhodném prokaryontním hostiteli. Předkládané promotory je zejména vhodné používat ve vhodných aktinomycetových hostitelích, zvláště ve streptomycetách. Předkládané promotory

-5CZ 291991 B6 odpovídají jednomu úseku nebo několika úsekům promotoru ze S. carbophilus, takže očekávaná promotorová aktivita předkládaných promotorů je promoce transkripce ORF kódující cytochrom

P-450_sca.

Z předcházejícího textu vyplývá, že je výhodně jsou-li promotory předkládaného vynálezu operativně připojeny k vhodnému ORF. Předkládaný vynález zahrnuje též vektory, jako např. plazmidy, obsahující předkládané promotory, zejména promotory operativně připojené kORF, a také hostitele obsahující tyto vektory.

Použité vektory nemusí být nutně expresní. Mohou sloužit k multiplikaci předkládaných promotorů, nebo poskytovat snadno dostupnou knihovnu. Expresní vektory jsou však výhodnější, zejména výhodné jsou expresní systémy zahrnující hostitele a expresní vektor předkládaného vynálezu.

Pokud jsou jako hostitelské buňky pro expresi produktů z heterologní DNA voleny aktinomycety, je obvykle výhodné použít S. lividans. V případě cytochromů P-450_sca, zejména P-450_sca_₂, S. lividans exprimuje rovněž nezbytný elektron-transferový systém umožňující funkci cytochromu při hydroxylaci ML-236B. Expresní systém obsahující předkládaný promotor však lze použít i pro expresi jiného vhodného proteinu nebo produktu exprese.

Obvykle není výhodné exprimovat eukaryotickou DNA v prokaryontech, jako je S. lividans, protože v prokaryontních buňkách neprobíhají některé post-translační děje přirozené pro eukaryonty, jako například glykosylace. Přesto lze předkládané systémy využít pro expresi eukaryontních produktů, ovšem s vědomím, že neproběhne žádná další post-translační modifikace, která není expresnímu systému přirozeně vlastní, pokud není do systému speciálně včleněna.

Expresní systémy předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné pro expresi velkých množství prokaryontních expresních produktů. Expresní produkty lze produkovat ve velkém měřítku zejména pokud expresní systém zahrnuje plazmidy vyskytující se v mnoha kopiích, jako např. pIJ702.

Expresní systémy předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné pro expresi produktů, které jsou v přirozených podmínkách produkovány pouze po substrátové indukci. Tyto systémy lze použít pro produkci látek jako jsou antibiotika. Předkládané expresní systémy jsou vhodné například pro postupy, kdy expresní produkt převádí substrát na konečný produkt, nebo na pozdní stadium intermediátu, nebo dokonce substrát rozkládá. Pokud je to vhodné, mohou v takovém postupu společně působit expresní systém a systém, který produkuje substrát vstupující do zmiňovaných reakcí.

V případě, kdy exprese, prováděná též s využitím předkládaného expresního systému, je v přirozených podmínkách substrátově indukována, pak systém působící společně s expresním systémem, který produkuje substrát, zahrnuje časovou prodlevu, protože musí čekat na expresi dostatečného množství substrátu. Využití předkládaného expresního systému tento problém řeší, neboť systém syntetizuje produkt automaticky, bez substrátové indukce a tedy nepodléhá časové prodlevě.

Předkládané expresní systémy lze zvláště výhodně použít pro expresi cytochromů P-450, zejména P-450_sca a nejvýhodněji P-450_sca_₂. Cytochrom P-450_sca_₂ je exprimován v S. carbophilus, jak je uvedeno výše, a S. carbophilus je při produkci pravastatinu sodného výhodně kultivován spolu s Pennicillium citrinum. V tomto systému má cytochrom P-450_sca_₂ funkci při hydroxylaci substrátu ML-236B, který je exprimován kmenem Pennicillium citrinum. Systém však zahrnuje časovou prodlevu substrátové indukce transkripce P-450_sca_₂ účinkem ML-236B. Při použití předkládaného expresního systému pro výrobu pravastatinu sodného

-6CZ 291991 B6 nedochází k časové prodlevě, což je pro průmyslovou produkci pravastatinu sodného velmi výhodné.

Některá výhodná provedení předkládaného vynálezu:

Výhodné promotory předkládaného vynálezu hybridizují s DNA o nukleotidové sekvenci 1 až 428 nebo 1 až 320 ze SEQ ID č. 1.

Výhodné jsou promotory o sekvenci nukleotidů 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 Promotory o sekvenci nukleotidů 1 až 320 ze SEQ ID č. 1 jsou rovněž výhodné. Předkládaný vynález dále zahrnuje mutace a variace těchto promotorů.

Vynález rovněž zahrnuje vektory rekombinantní DNA obsahující předkládané promotory, zvláště vektory, které dále obsahují DNA kódující polypeptid tímto promotorem regulovaný. Uvedené vektory jsou přitom schopné exprimovat polypeptid ve vhodné hostitelské buňce. Je výhodné, pokud exprimovaným polypeptidem je cytochrom P-450_sca_₂.

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje hostitelské buňky transformované uvedenými vektory. Výhodné hostitelské buňky jsou aktinomycety, zejména Streptomyces lividans. Zvláště výhodný je kmen Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Předkládaný vynález rovněž zahrnuje postup produkce požadovaného polypeptidu, jak byl definován výše, zahrnující kultivaci transformovaných hostitelských buněk, jak byly definovány výše, produkci polypeptidu v odpovídajících podmínkách a jeho odebírání.

Předkládaný vynález dále zahrnuje postup produkce pravastatinu sodného zahrnující kultivaci Streptomyces lividans kmene TK21 transformovaných expresním vektorem předkládaného vynálezu, který kóduje P-450_sca_₂. Produkce pravastatinu probíhá v médiu se sodnou solí ML-236B a v podmínkách, které vyhovují produkci cytochromu Ρ-450_Κ3_₂ a umožňují přeměnu sodné soli ML-236B na pravastatin sodný v transformovaných buňkách za katalytického působení vyprodukovaného cytochromu P-450_sca_₂. Dále vynález zahrnuje postup izolace pravastatinu sodného z transformovaných buněk a/nebo média. Výhodný kmen transformovaných buněk je Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299). Rovněž je výhodné, aby ML-236B bylo produkováno kmenem Pennicilium citrinum kultivovaným spolu s S. lividans.

5' promotor není homologní s žádným jiným známým promotorem pocházejícím z aktinomycet nebo i z jiného zdroje. Stejně jako jiné promotory, promotory předkládaného vynálezu iniciují transkripci DNA kódující protein nebo polypeptid na mRNA. To je první část intracelulámí biosyntézy proteinů nebo polypeptidů (jde o záměnné výrazy). Promotory předkládaného vynálezu jsou transkripční promotory, jejich funkce je označována jako transkripční promotorová aktivita. 5' promotor, stejně jako všechny promotory 428, 320, 158, 101 a 74 bp o nukleotidové sekvenci ze SEQ ID č. 1, mají tuto aktivitu.

Předkládané promotory výhodně obsahují jeden nebo několik dodatečných párů bází v tandemovém uspořádání v protisměru a/nebo po směru. Jediným omezením pro tyto dodané sekvence je, že nesmí vést k obnově substrátové indukce a že musí zachovávat dostatečnou promotorovou aktivitu.

Polypeptidy, jejichž syntéza je regulována předkládanými promotory, byly již popsány výše. Mohou mít libovolnou sekvenci aminokyselin pocházející, ne výhradně, například z následujících proteinů: přírodní forma, variace nebo polymer nového nebo známého proteinu; protein vzniklý sloučením dvou nebo několika různých proteinů; nebo polypeptid nové sekvence. Jak bylo uvedeno výše, výhodný polypeptid je cytochrom P-450_sca_₂.

-7 CZ 291991 B6

Dále je vhodné aby vektory určené k transformaci byly typem vektorů, u nichž dochází ve vhodné hostitelské buňce k auto-replikaci. Tyto vektory pak obsahují sekvence vzniklé autoreplikací, neboli replikon. Pro aktinomycety je vhodným vektorem pIJ702.

Výběr vhodné hostitelské buňky nepodléhá žádnému zvláštnímu omezení, pouze musí vyhovovat vybranému vektoru. Obecně lze použít libovolné hostitelské buňky, vybrané mezi divokými kmeny, zakoupené či získané jinak. Vhodné hostitelské buňky jsou aktinomycety, výhodně Streptomyces carbophilus nebo Streptomyces lividans, nej výhodněji kmen Streptomyces lividans TK21.

Ve výše uvedeném postupu produkce pravastatinu sodného, který zahrnuje kultivaci transformovaného kmene Streptomyces lividans v přítomnosti sodné soli ML-236B, se produkovaný pravastatin sodný izoluje běžnými postupy.

Podle vhodného provedení vynálezu byly předkládané promotory získány klonováním DNA ze Streptomyces carbophilus, známým postupem Watanabe a kol., [Gene, (1995) 163, 81-85]. Výhodným zdrojem DNA pro klonování předkládaných promotorů je Streptomyces carbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145).

Podle předkládaného provedení vynálezu lze z celého genomu DNA Streptomyces carbophilus vytvořit genomovou knihovnu s použitím pUC18 (dodávaného Takara Shuzo Ltd., Japonsko), např. jako klonovacího vektoru. Vzniklé genomové knihovny i vektory jsou součástí předkládaného vynálezu. Využití knihovny vyžaduje syntézu oligonukleotidické proby, jejíž sekvence vychází z N-koncové aminokyselinové sekvence Ρ-450^₃_2. Proba slouží k identifikaci klonu z knihovny, který kóduje alespoň část P-450_sca_₂. Protože je N-konec proteinu kódován v oblasti 5' konce ORF, je pravděpodobné, že každý klon nalezený tímto postupem bude obsahovat značnou část nepřeložené a 5'-nekódující oblasti, tedy oblasti 5' promotoru. Vhodný způsob screeningu, který využívá knihovnu a oligonukleotidickou probu, je postup hybridizace na koloniích [viz Maniatis, T. a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold

Spring Harbor Laboratory, New York - všechny postupy předkládaného popisu, u nichž není uveden konkrétní odkaz, jsou obecně popsány v příručce „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“].

Pokud klon identifikovaný uvedeným nebo jiným postupem obsahuje pouze část sekvence předkládaného promotoru, lze ještě dalším postupem získat klon plné délky. Z klonu obsahujícího pouze část sekvence požadované DNA se připraví značená proba. Značená proba poslouží jako templát pro další screening genomové knihovny a pomůže identifikovat a izolovat klon obsahující požadovanou část 5' promotoru.

Předkládaný vynález zahrnuje rovněž postup izolace klonu obsahujícího celý 5' promotor nebo jeho část. Pokud se získá celá sekvence 5' promotoru, lze předkládané promotory připravit dalším postupem, např. sub-klonováním. Pokud se získá částečná sekvence, lze také použít postup jako v předcházejícím případě, nebo sekvence vyhovuje jako předkládaný promotor bez další úpravy.

Je vhodné poznamenat, že výše navržený postup klonování a přípravy promotorů předkládaného vynálezu není jediným použitelným postupem a že odborníkovi v oboru jsou zřejmé i další vhodné postupy. Lze změnit jednotlivé kroky i celý postup. Například místo proby odpovídající n-terminální sekvenci P-450_sca_₂ lze připravit probu odpovídající 3' konci 5' promotoru. Volba vektorů není omezena, lze použít libovolný vhodný klonovací vektor jako např. komerčně 50 dostupné vektory, včetně pBR322.

Podle předkládaného vynálezu lze promotory rovněž syntetizovat chemicky podle sekvence SEQ. IDč. 1. Při chemické syntéze předkládaných promotorů lze zvolit např. fosfit-triesterový postup [viz Hunkapillar, M. a kol., (1984), Nátuře, 310, 105-111]. Možné jsou i semisyntetické

-8CZ 291991 B6 postupy, například kombinace klonování a konstrukce, využívající předkládané informace.

Vhodné semisyntetické postupy jsou v oblasti techniky známé.

K výše uvedenému postupu získání předkládaného promotoru screeningem v knihovně lze ještě poznamenat, že promotor DNA lze získat z klonu obsahujícího zvolenou sekvenci postupy známými v této oblasti techniky [viz Maniatis, T. a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. Například lze izolovat plazmidovou frakci DNA a z DNA plazmidu izolovat promotor DNA s využitím jednoho nebo několika restrikČních enzymů.

Výhodným zdrojem 5' promotoru je kmen Streptomyces lividans SANK 62795. Tento kmen byl uložen v souladu s Budapešťskou dohodou o Rejstříku mikroorganismů 21. listopadu 1995 v National Institut of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, pod přírůstkovým číslem FERM BP-5299. Streptomyces lividans SANK 62795 je 15 aktinomyceta obsahující vektor rekombinantní DNA pSCA1013-Á (1013/428), který zahrnuje

DNA s transkripční promotorovou aktivitou a je tvořen nukleotidovou sekvencí 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 ze seznamu sekvencí, a DNA kódující cytochrom P-450_sca~2, tento plazmid je díky aktivitě promotoru 428 bp schopen produkovat protein v aktinomycetách.

V přiloženém seznamu sekvencí je jako zdroj SEQ. ID. č. 1 uveden S. carbophilus SANK 62585 s přírůstkovým číslem FERM BP-1154. Toto byl původní zdroj 5'promotoru 1 kbp, snímž korespondují kratší promotory předkládaného vynálezu, a byl uložen 5. 9. 1985 ve Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology v souladu s Budapešťskou dohodou o Rejstříku mikroorganismů.

Oba kmeny S. lividans 62795 a S carbophilus 62585 jsou typickými příklady 5. lividans aS. carbophilus a lze je kultivovat známými postupy, Hopwood, D. A., a ko.., (1985), „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual“, The John Innes Foundation, Norwich, UK, kde jsou rovněž popsány typické fyzické znaky těchto kmenů. Uvedené kmeny lze vyhledat 30 podle thiostreptonové rezistence.

Podle výhodného provedení předkládaného vynálezu lze transkripční promotor s nukleotidovou sekvencí 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 ze seznamu sekvencí izolovat z nakultivovaných Streptomyces lividans SANK 62795 s využitím pSCA1013-A (1013/428) a rozštěpením plazmidu restrikční 35 enzymy.

Pokud je to žádoucí, lze stanovit nukleotidovou sekvenci libovolné nakloňované DNA, například podle Maxam-Gilbertova chemického modifikačního postupu [viz Maxam, A. M., Gilbert, W., (1980), Methods in Enzymology, 65, 499-599] nebo terminačním dideoxy postupem s využitím 40 fágu M13 [viz Messing, J., Viviera J., (1992), Gene 19, 269-276].

Pokud je žádoucí stanovit, zda specifická sekvence DNA hybridizuje s DNA obsahující celou sekvenci 1 až 428 ze SEQ. ID č. 1 ze seznamu sekvencí nebo její část, lze tak učinit následujícím postupem.

Nejprve se provede elektroforéza testované DNA na agarózovém gelu. Dále se provede bloting DNA na nitrocelulózový film nebo nylon a teplem nebo UV zářením se zafixuje naadsorbovaná DNA. Dále se využije proba. Proba má požadovanou délku nukleotidové sekvence 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 a je izotropicky značena např. ³²P, biotinem, digoxigeninem nebo enzymem a lze ji 50 připravit postupem náhodného primeru [viz Feinberg, A. P., a kol., (1983), Anal. Biochem., 132, 6—13] nebo nick translačním postupem [viz Maniatis, T., a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York].

-9CZ 291991 B6

Nitrocelulózový nebo nylonoxý film se ponoří do roztoku s probou a je inkubován při vhodné předem stanovené teplotě, asi při 60 °C. Po inkubaci se film opláchne a proba se detekuje na základě zvoleného značení.

Hybridizační roztok obvykle obsahuje SSC (fyziologický roztok-citrát sodný; 1 x SSC obsahuje 0,15 mol.l'¹ chlorid sodný a 15 mmol.f¹ citrát sodný v deionizované vodě). Hybridizační roztok obsahuje koncentraci 4-8 x SSC, výhodně 6 x SSC. Inkubační teplota je výhodně 30 až 70 °C, výhodněji 60 °C.

DNA, která hybridizuje s DNA obsahující celou sekvenci 1 až 428 ze SEQ ID č. 1 ze seznamu sekvencí nebo její část, lze klonovat z různých genomových knihoven uvedenými postupy. Je výhodnější, hybridizuje-li většina předkládaných promotorů s DNA o sekvenci 428 bp, než s DNA o sekvenci 320 nebo dokonce kratší. Délku vybraných sekvencí pro hybridizační pokusy lze však snadno volit, jak je odborníkům v oboru zřejmé ze zde uvedených informací.

Jak již bylo popsáno, lze takto získanou DNA modifikovat známými postupy, jako je substituce, delece nebo inzerce jednoho nebo několika nukleotidů v cílovém místě, například cílově specifickou mutagenezí [viz Mark, D. F., a kol., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci USA, 81, 5662-5666]. Je zřejmé, že předkládaný vynález zahrnuje i takto modifikovanou DNA, za podmínky že má požadovanou transkripční promotorovou aktivitu.

Zda DNA získaná výše uvedeným postupem zachovává požadovanou transkripční promotorovou aktivitu, lze ověřit konstrukcí vektoru, kteiý obsahuje testovanou DNA tandemově připojenou k ORF, a jeho expresí ve vhodném hostiteli. Nejprve se provede (i) konstrukce rekombinantního vektoru, který obsahuje inzertovanou DNA kódující vhodný protein, operativně připojenou k předpokládanému promotoru DNA. Vhodným vektorem je například aktinomycetový plazmid pIJ702 [viz Katz, E., a kol., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714]. Dále (ii) se provede transformace vhodné hostitelské buňky připraveným vektorem. Vhodná hostitelská buňka umožňující stabilní replikaci vektoru, je např. Streptomyces lividans v případě vektoru pIJ702.. Nakonec se stanoví hladina exprese proteinu kódovaného kódující DNA.

Je-li transformovanou buňkou například streptomyceta, lze transformaci provést dle Hopwooda [viz Hopwood, D. A., a kol., (1985), „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual“, The John Innes Foundation, Norwich, UK]. Je vhodné, aby gen zvolený k testování promotorové aktivity nebyl před transformací v hostitelské buňce přítomen nebo exprimován.

Hladiny transkripce lze snadno stanovit např. northemovým blotingem. Při northemovém blotinku, nebo northemové hybridizaci [viz Maniatis T., a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] se hostitelská buňka kultivuje po transformaci. Poté se z buněk extrahuje RNA, provede purifikace, elektroforéza na agarózovém gelu a bloting RNA na film, např. nitrocelulózový nebo nylonový. Dále se označí proba, (DNA, RNA nebo syntetický oligonukleotid) radioizotopicky, např. ³²P, nebo biotinem, digoxigeninem nebo enzymem specificky detekujícím gen pro protein. Tato proba pak hybridizaci detekuje mRNA transkribovanou z genu.

Hladiny transkripce lze rovněž snadno stanovit postupem RNA-PCR [polymerázová řetězová reakce, viz Innis, M. A., a kol., (1990, „PCR PROTOCOLS“, Academie Press, New York], Nejprve se připraví RNA podobným postupem jako při northemové hybridizaci. S využitím reverzní transkriptázy se na templátu mRNA syntetizuje cDNA. Při reverzní transkripci lze jako primer použít jak oligo (dT), který je spíše nespecifický, tak oligonukleotid s homologickou sekvencí k části genu kódujícího expresní protein. Na templátu připravené cDNA se pak provede polymerázová řetězová reakce se dvěma oligonukleotidickými primery. Tyto primery musí být komplementární k opačným řetězcům ORF, přičemž komplementární místa jsou v rámci genu umístěna tak, že řetězce generované polymerázovou řetězovou reakcí vzájemně hybridizují. Po uplynutí plánované reakční doby se provede elektroforéza výsledné dsDNA a její detekce např.

-10CZ 291991 B6 na nitrocelulóze. Hladina transkripce sledované DNA se zjistí z přítomnosti nebo nepřítomnosti proužků očekávané délky.

Hladiny exprese produktu lze stanovit z fyziologické aktivity získaného proteinu. Například se připraví rekombinantní vektor, který obsahuje DNA kódující protein o určité aktivitě, např. enzymatické, operativně připojenou, např. ligací, ke 3' konci předpokládaného promotoru. Hladinu exprese ORF, připojené k testovanému promotoru, lze pak stanovit na základě vlastností expresního produktu.

Například se použije plazmid kompatibilní s 5. lividans, kódující cytochrom P-450_sc^₂· Tento plazmid se zavede do kmene S. lividans, který běžně cytochrom P-450_sca_₂ neprodukuje. Transformované buňky se pak kultivují v přítomnosti sodné soli ML-236B a množství vyprodukovaného pravastatinu sodného je pak úměrné hladině exprese P-450_sca_₂, jak ji reguloval testovaný promotor.

Je vhodné, aby byla volba postupů testování expresních produktů specificky přizpůsobena vlastnostem konkrétních produktů. Například se předpokládaný promotor operativně připojí ke genu zodpovědnému za rezistenci k určitému léčivu, například gen kódující chloramfenikol acetyl transferázu [viz Gorman, C. M., a kol., (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051] nebo luciferázu [viz Wet, J. R., a kol., (1987), Mol. Cell. Biol., 7, 725-737]. Rezistenci lze detekovat známými postupy v oblasti techniky. Hladinu exprese lze stanovit i jinými postupy vycházejícími rovněž z aktivity exprimovaných produktů.

Jiný způsob měření exprese vychází např. ze stanovení produktu pomocí protilátky. Opět se připraví expresní vektor obsahující předpokládaný promotor operativně připojený k ORF, zavede se do vhodných hostitelských buněk a tyto buňky se kultivují v podmínkách vhodných pro expresi. Kultivační médium, nebo homogenát transformovaných buněk se pak vystaví působení protilátek a stanoví se množství vzniklého komplexu antigen-protilátka. Mezi vhodné postupy stanovení patří radioimunoesej [viz Berson, R. S., a kol., (1973), Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology“, Vol. 2A, 2B, North-Holland Publishing Co., Amsterdam], enzymová imunoesej [viz Engvall, E., (19870), Methods in Enzymology, 70(A), 419-439] westernový bloting [viz Harlow, E., a kol., (1988), „Antibodies - A Laboratory Manual“, p. 471, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] a imunoprecipitace [viz Kessler, S. W., a kol., (1981), „Methods in Enzymology“, 73(B), 442-459]. Volba konkrétního postupu závisí na zvoleném postupu měření interakce, nebo na způsobu značení protilátky nebo antigenů. V každém případě není nutné se těmito postupy podrobně zabývat, protože jsou v oblasti techniky známé.

Je vhodné poznamenat, že v oblasti techniky existují i další způsoby stanovení transkripční aktivity, použitelné pro testování promotorů předkládaného vynálezu i předkládaných promotorů, že tyto postupy jsou odborníkům v oboru zřejmé a spadají do rámce předkládaného vynálezu. Například v případech, kdy exprimovaný protein má nějakou výraznou vlastnost jinou než aktivitu nebo antigenicitu, existují postupy pro stanovení promotorové aktivity využívající přímo či nepřímo i tuto vlastnost.

Jakmile jednou bylo prokázáno, že předpokládaný promotor předkládaného vynálezu má požadovanou promotorovou aktivitu, lze tuto DNA použít při konstrukci expresního vektoru pro libovolný vhodný požadovaný protein. Pro tento účel lze použít libovolnou vhodnou hostitelskou buňku, přičemž tato buňka může i nemusí být shodná s buňkou použitou při stanovení promotorové aktivity předpokládaného promotoru. Aminokyselinová sekvence proteinu není ničím omezena. Jak již bylo uvedeno výše, sekvence aminokyselin mohou pocházet, ne výhradně, například z následujících proteinů: přírodní forma, variace nebo polymer nového nebo známého proteinu (nebo peptidu), protein vzniklý sloučením dvou nebo několika různých proteinů (nebo peptidů); nebo polypeptid nové sekvence. Jak bylo rovněž uvedeno výše, výhodný

-11 CZ 291991 B6 expresní produkt je cytochrom P-450_sca_₂, výhodný vektor je pSCA1013-A (1013/428) izolovatelný ze Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Je vhodné poznamenat, že výrazy „expresní produkt“, „protein“ a „polypeptid“ mají v předkládaném textu stejný význam a jsou používány záměně. V některých případech není polypeptid přeložený z původní DNA konečným produktem, pouze intermediátem, a pro získání konečného produktu je nutno provést post-translační modifikace. V případě P-450_sca_2 je při přípravě konečného produktu nutno do haemového kruhu proteinu inkorporovat železo. Ačkoliv výrazy „expresní produkt“, „protein“ a „polypeptid“ jsou zde používány jako synonyma, odborníkovi v oboru jsou v patřičném kontextu zřejmé určité rozdíly mezi nimi.

Vhodnými hostiteli pro promotory předkládaného vynálezu jsou, kromě aktinomycet, prokaryontní buňky jako Escherichia coli a Bacillus subtilis.

Pro případ, kdy je jako hostitel použit jiný kmen než aktinomycetový, nebo se zvolený aktinomycetový kmen nehodí ktypu vektoru, by měl vektor obsahovat replikon vyhovující zvolenému kmenu, například pocházející z buněčného druhu kompatibilního s hostitelem. Vhodné jsou plazmidové vektory obsahující replikované počáteční a regulační sekvence vyhovující hostiteli. V případě že předkládaný promotor v hostitelské buňce nepracuje a odborník v oboru jej nedokáže modifikovat tak, aby začal pracovat, dokonce obsahuje-li i další příslušné regulační sekvence, pak taková situace má jen omezené využití. Transformovanou buňku lze využít například k multiplikaci promotoru. Situace, kdy jsou podobné modifikace a/nebo příslušné regulační sekvence snadno dostupné a/nebo kde je odborník v oboru rozpozná, spadají rovněž do rámce předkládaného vynálezu.

Ačkoli expresní vektory předkládaného vynálezu nemusí mít žádné jiné další vlastnosti než vlastnosti nutné pro expresi v daném hostiteli, lze jen ocenit pokud případně vnesou do hostitele užitečná selekční kritéria. Například může plazmid udělit hostiteli takovou vlastnost, jako je selektivita exprese a transformace, čímž modifikuje jeho fenotyp.

Postup transformace vhodný pro aktinomycety zahrnuje přetvoření aktinomycetové kultury na sféroplasty s pomocí lysozymu, dále přidání pufrovaného roztoku obsahujícího vektoiy rekombinantní DNA a polyethylenglykolu, kvůli vnesení vektoru do hostitelských buněk. Tyto kroky jsou shodné pro postup podle Thompsona i podle Hopwooda [viz Thompson, C. J., a kol., (1982), J. Bacteriol., 151, 668-677, nebo Hopwood, D. A., a kol., (1985), „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual“, The John Innes Foundation, Norwich], Jako selektivní markér v transformačním plazmidu se běžně používá gen pro thiostreptonovou rezistenci [viz Hopwood, D. A., a kol., (1987), „Methods in Enzymology“, 153, 116, Academie Press, New York], Předkládaný vynález však není omezen jen na tento konkrétní postup.

Pokud je žádoucí transformovat E. coli, aby exprimovaly produkt za regulace předkládaným promotorem, pak vhodný obecný postup transformace spočívá ve vnesení relevantního vektoru rekombinantní DNA do kompetentních buněk. Kompetentní buňky se běžně připravují v přítomnosti solí jako je chlorid vápenatý, chlorid hořečnatý a chlorid rubidný [viz Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol. 166, 557-580]. Alternativním postupem je elektroporace, při níž působí vysokonapěťové pulzy na suspenzi obsahující hostitelské E. coli a expresní vektor, čímž dochází k inkorporaci vektoru do buněk [viz Electroporation: Dower, W. J., et al., (1988), Nucleic Acid Res. 16, 6727, a Calvin, N. M., et al., (1988), J. Bacteriol., 170, 2796].

Vhodnými selektivními markéry, tj. měnícími fenotyp hostitele, jsou markerové geny pro rezistenci vůči léčivu, jako je například rezistence na ampicilin nebo tetracyklin. Odborníkovi v oboru jsou zřejmé i další možnosti, které rovněž spadají do rámce předkládaného vynálezu, stejně jako ostatní případy přinášející konkrétní příklady, které v žádném směru neomezují rozsah vynálezu.

-12CZ 291991 B6

V případě B. substilis jako hostitelské buňky, vhodný postup transformace spočívá v převedení hostitelských buněk na protoplasty pomocí lysozymů a v přidání pufrovaného roztoku obsahujícího vektory rekombinantní DNA a polyethylenglykolu. Vektory se do hostitelských buněk inkorporují elektroporací (viz výše) [viz Cheng, S., a kol., (1979), Mol. Gen. Genet., 168, 111]. Podle výhodného provedení vynález lze jako markér transformované buněčné linie použít markér pro rezistentní vůči léčivu, například vůči chloramfenikolu, ale lze použít i jiné selektivní markéry.

Bez ohledu na typ hostitele se transformované buňky kultivují známými postupy oblasti techniky. Žádaný polypeptid je kulturou produkován intracelulámě, extracelulámě nebo oběma způsoby. Vhodná kultivační média lze vybrat z různých typů médií běžně používaných pro relevantní hostitelské buňky. Všeobecně platí, že kultivační podmínky přijatelné pro konkrétní hostitelské buňky, lze použít pro expresi žádaného polypeptidu a případně modifikovat s ohledem na vlastnosti polypeptidu.

Například typickými zdroji uhlíku pro aktinomycety jsou glukóza, sacharóza, škrob, glycerol, škrobový sirup, melasa a sojový olej. Zdrojem dusíku je sojový prach, obilné klíčky, masový extrakt, pepton, obilný výluh, sušené droždí a síran amonný. K výše uvedeným živinám lze přidat anorganické soli jako chlorid sodný, chlorid draselný, uhličitan vápenatý a fosforečnan vápenatý a vhodné je přidat i přísady napomáhající růstu mikroorganismů nebo podporující produkci požadovaného polypeptidu.

Kultivační techniky obecně vhodné pro hostitelské buňky jsou opět aplikovatelné na transformované mikroorganismy, včetně postupů jako jsou kultivace v kapalném prostředí a hloubková kultivace, vhodné pro produkci v průmyslovém měřítku.

Pro předkládaný vynález je vhodná kultivace při 20 až 37 °C, výhodně 26 až 28 °C, pokud není specifikováno jinak, nebo obecně nejde o protichůdné podmínky.

Obecně je produkt exprese regulované předkládaným promotorem produkován intracelulámě nebo extracelulámě a příležitostně oběma způsoby. Produkt lze izolovat, purifikovat a odebírat různými postupy, které jsou odborníkům v oboru známé, zejména postupy využívajícími fyzikální nebo chemické vlastnosti polypeptidu. V případě externí exprese je vhodné polypeptid izolovat, purifikovat a odebírat z výsledného supematantu např. po odstranění buněk z kultivačního média centrifugací.

V případě izolace a purifikace polypeptidu akumulovaného uvnitř buněk se nejprve buňky suspendují v roztoku s proteázou a homogenizují známými prostředky v oblasti techniky např. v ultrasonickém homogenizátoru.

Ačkoliv není z hlediska objasnění předkládaného vynálezu nutné zabývat se purifikací a izolací polypeptidů, je vhodné uvést alespoň příklady konkrétních postupů. Vhodné izolační, purifikační a koncentrační postupy jsou: proteinová precipitace, ultrafiltrace, chromatografie na molekulových sítech (gelová filtrace), adsorpční chromatografie, iontoměničová chromatografie, afinitní chromatografie, různé vhodné typy kapalinové chromatografie včetně HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie), dialýza a kombinace uvedených postupů.

V každém případě je výhodné, lze-li protein produkovat podle předkládaného vynálezu snadno v průmyslovém měřítku, jak s vysokým výtěžkem, tak s vysokou čistotou.

Rovněž je výhodné, pokud lze testovat aktivitu peptidu produkovaného podle předkládaného vynálezu transformovanými hostitelskými buňkami, na nepurifikovaném, nebo jen částečně purifikovaném preparačním vzorku. Například Ρ-450_Κ3_₂ lze získat ze Streptomyces lividans postupem uvedeným výše, a použít přímo pro produkci pravastatinu sodného. Buňky S. lividans obsahují nezbytný elektron transferový systém, takže je relativně jednoduché získat

- 13CZ 291991 B6 transformované hostitelské mikroorganismy katalyzující hydroxylaci v poloze 6- sodné soli

ML-236B.

Podle předkládaného provedení promotor reguluje expresi cytochromu využitelného dále například při produkci pravastatinu sodného. Veškerý vyprodukovaný pravastatin sodný lze izolovat známým postupem [viz Serizawa, N., a kol., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. V uvedeném postupu jsou použity Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Předkládaný vynález je dále podrobněji vysvětlen na následujících příkladech. Příklady slouží jen jako ilustrace a v žádném případě nejsou vymezením vynálezu. Všechny postupy, přípravy, roztoky a podobně, které nejsou blíže specifikovány, lze nalézt vManiatis T., a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratoiy Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. Všechny roztoky jsou vodné, pokud není stanoveno jinak.

Následující příklady se odkazují na obrázky 1 až 5:

Obr. 1 je schéma konstrukce plazmidů pSCA1013-A (1013/428) obsahujícího 428 bp z 5'-nekódující oblasti genu P-450_sca_2;

Obr. 2 je schéma konstrukce plazmidů s vektory 320, 158, 101 a 74 bp předkládaného vynálezu, pSCA1013-A (1013/320), pSCA1013-A (1013/158), pSCA1013-A (1013/101) a pSCA1013-A (1013/74), respektive s vektoiy získanými z 3' konce 5'-nekódující oblasti genu Ρ-450_Μ3_2;

Obr. 3 je restrikční mapa plazmidů pSCA1013-A (1013/428), získaného podle Obr. 1;

Obr. 4 je restrikční mapa plazmidů pSCAlOl obsahující část genu P-450_sca_₂ spolu s 5' promotorem 1 kbp; a

Obr. 5 je schéma konstrukce plazmidů pSCA102, který obsahuje 5' promotor 1 kbp a ORF genu Ρ-450^₂.

Příklady dokládají, že lze produkovat požadovaný polypeptid v hostitelském mikroorganismu s využitím předkládaných promotorů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace promotoru P-450_sca-2 a konstrukce plazmidového vektoru pro expresi cytochromu P-450^2 (1-1) Konstrukce plazmidů pSCAlOl a pSCA108

Plazmidy pSCAlOl a pSCA108 byly konstruovány klonováním různých fragmentů z oblasti obsahující gen a promotor P-450sca 2, tyto fragmenty byly odvozeny zgenomové DNA ze Streptomyces carbophilus podle známého postupu [viz Watanabe, I., a kol., (1995), Gene, 163, 81-85 a japonský patent Kokai č. Hei 6-70780]. Mapa plazmidů pSCAlOl je na obr. 4. Tento plazmid byl konstruován ligací fragmentu PvuII 1,7 kbp, odvozeného zgenomové DNA ze Streptomyces carbophilus, do PvuII místa pBR322 (získaného od Takara Shuzo Ltd., Japonsko). Tento fragment DNA 1,7 kbp obsahuje celý 5'promotor genu Ρ-450_Κ3_2 a DNA kódující 5'konec genu. Plazmid pSCA108 byl konstruován ligací fragmentu ^c/2,0 kbp, odvozeného genomové DNA ze Streptomyces carbophilus, do Sací místa pUC18 (získaného od Takara Shuzo

-14CZ 291991 B6

Ltd., Japonsko). Tento fragment 2,0 kbp obsahuje celou kódující oblast genu cytochromu

P~450_sca-2.

Následuje podrobný popis výše uvedených postupů.

(1-2) Konstrukce pSCA106

DNA pSCAlOl (10 pg) byla štěpena restrikčním enzymem ΡνιιΙΙ (100 jednotek) při 37 °C 3 h. Štěpení bylo provedeno v restrikčním pufru s obsahem enzymu (Takara Shuzo). Konkrétně byl použit H pufr (Takara Shuzo). Podobně jako v tomto příkladu i v následujících příkladech, kde jsou použity pufry a restrikční enzymy, jejichž zdroj není blíže specifikován, jde o látky dodávané Takara Shuzo a použité v souladu s doporučením dodavatele, pufry jsou voleny podle potřeby z pufrů Η, K nebo L, též od Takara Shuzo.

Produkty štěpení byly rozděleny elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu. Agarózový gel byl umístěn v elektroforetickém tanku typu „ponorka“, který obsahoval vodný roztok (90 mmol.f¹ Tris-HCl pufr, 90 mmol.f¹ kys. boritá a 2,5 mmol.f¹ EDTA (pH 8,3)). Elektroforéza byla provedena při napětí 100 V, 3 h.

Po skončení elektroforézy byl gel třepán ve vodném roztoku ethidium bromidu (0,5 pg/ml), 20 min, k obarvení DNA. Z agarózy byl ostrým břitem vyříznut pruh obsahující hledaný fragment 1,7 kbp. Obarvené fragmenty DNA byla identifikovány dlouhovlnným UV světlem. Vyříznutý fragment 1,7 kbp byl přenesen do dialyzační trubice (limit propustnosti: 12 000-14000 Da, Gibco) a trubice byla uzavřena. Uzavřená trubice byla dále umístěna do elektroforetického tanku typu „ponorka“, který obsahoval vodný roztok (90 mmol.f¹ Tris-HCl pufr (pH 8,3), 90 mmol.f¹ kys. boritá a 2,5 mmol.f¹ kys. ethylendiamintetraoctová (EDTA)).

DNA fragment byl eluován z proužku agarózového gelu při 100 V 2 h. Výsledný roztok v dialyzační trubici byl dále extrahován směsí fenolu a chloroformu 50:50 (obj./obj.) k odstranění všech kontaminujících proteinů. Tento postup je rutinní a odborníkům v oboru známý. DNA byla získána z vodné fáze standardním srážením ethanolem a sušena za sníženého tlaku [viz Maniatis T., a kol., (1982), „Molecular Cloning - A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. Tento postup izolace DNA z agarózy je zde souhrnně označován jako „vyříznutí“.

DNA pUCl 19(10 pg) (Takara Shuzo) byla štěpena restrikčním enzymem Smál (10 jednotek) při 37 °C, 3 h. Rozštěpená DNA byla extrahována směsí fenolu a chloroformu 50:50 (obj./obj.) (stručně fenol-chloroformem), vysrážena ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Rozštěpené konce Iinearizovaného plazmidů byly defosforylovány alkalickou fosfatázou (4 jednotky) (Toyobo). Defosforylace byla provedena při 37 °C, 30 min vTE pufru (200 pl, 10 mmol.f ⁺ Tris-HCl, 1 mmol.!'¹ EDTA, pH 8,0, destilovaná voda). Poté byl roztok extrahován fenol-chloroformem, defosforylovaná DNA vysrážena z vody ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

PvuII fragment 1,7 kbp (50 ng) získaný výše, byl přidán k defosforylované Smál pUCl 19 DNA (100 ng) v ligázovém pufru (50 pl, 6,6 mmol-Γ¹ chlorid hořečnatý, 10 mmol.f¹ dithiothreitol, 0,1 mmol.f¹ ATP a 66 mmol.f¹ Tris-HCl, pH 7,6, destilovaná voda) obsahujícím T4 DNA ligázu (1800 jednotek) (Takara Shuzo). Ligace probíhala 2 h. Kompetentní buňky E. coli kmene HB101 byly transformovány částí ligačního reakčního roztoku známým postupem [viz Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol. 166, 557-580]. Transformované buňky byly kultivovány v L médiu (10 g/l trypton, 5 g/l extrakt z droždí a 5 g/l chlorid sodný, destilovaná voda) s obsahem ampicillinu (100 pg/ml).

-15CZ 291991 B6

Nakultivované buňky v L médiu byly dále naneseny na plotny L média při 37 °C a odebrány kolonie rezistentní k ampicilinu. Takto vyselektované kolonie byly namnoženy na plotnách pevného L média a z vybraných transformovaných buněk byla připravena plazmidová DNA. Plazmidová DNA z každé transformované buňky byla štěpena vhodnými restrikčními enzymy a provedena elektroforéza výsledné DNA na agarózovém gelu, potvrzující přítomnost očekávaného plazmidu v transformované buňce. Plazmid konstruovaný touto cestou byl nazván pSCAÍOó.

(1-3) Konstrukce pSCAl 11

Plazmid pSCAl 11 obsahuje 5'promotorovou oblast genu P-450_sca_2 z plazmidu pSCAÍOó, ligovanou do strukturního genu Ρ-^δΟ^^ odvozeného od pSCAl08. Protokol následuje.

DNA pSCAl08 (10 pg) připravená výše, byla štěpena restrikčním enzymem Sací {100 jednotek) při 37 °C, 5 h, v pufru dodávaném s kitem (Takara Shuzo). Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu a vyříznut DNA.fragment Sací 2,0 kbp.

Současně byla štěpena DNA pSCAÍOó (10 pg) připravená výše, restrikčním enzymem Sací (100 jednotek) při 37 °C, 5 h, v pufru dodaném s kitem. Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmotn./obj.) agarózovém gelu a vyříznut fragment Sací 4 kbp.

Konce takto připraveného fragmentu Sací 4 kbp byly defosforylovány postupem, jak je uvedeno pod bodem (1-2). Po defosforylaci byl roztok extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážena z vody ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Defosforylovaný fragment Sací 4 kbp (100 ng) a DNA fragment Sací 2,0 kbp (50 ng), získaný v první části tohoto oddílu a obsahující strukturní gen P-450_{sca 2}, byly smíchány v ligázovém pufru obsahujícím T4 DNA ligázu (1 800 jednotek) na konečný objem 50 pl. Ligace byla prováděna 2 h při 16 °C. Kompetentní buňky E. coli kmene HB101 byly transformovány částí ligačního reakčního roztoku podle postupu uvedeného v oddíle (1-2) za vzniku pSCAl 11.

(1-4) Konstrukce pSCA212

DNA pSCAl 11 (10 pg), získaná v oddíle (1-3), byla štěpena restrikčními enzymy Xbal (100 jednotek) a Pstl (100 jednotek) při 37 °C, 3 h. Výsledný roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Dále, oblast v protisměru genu P-450_sca_₂ obsahující pSCAl 11 byla deletována v 5'—>3' směru známým postupem [viz Henikoff, S., (1984), Gene, 28, 351-359]. K vysušené DNA pSCAl 11 (10 pg) byla přidána exonukleáza III (200 jednotek) (Takara Shuzo) v exonukleázovém pufru (100 pl, 50 mmol.T¹ Tris-HCl, 5 mmol.T¹ chlorid hořečnatý, lOmmol.T¹ 2-merkaptoethanol, pH 8,0, destilovaná voda) a reakce byla prováděna 5 min při 37 °C. Reakce byla zastavena zahřátím na 65 °C, 5 min a reakční roztok extrahován fenol-chloroformem. DNA byla vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Výsledná vysušená DNA byla štěpena nukleázou zmung beán (50 jednotek) (Takara Shuzo) v acetátovém pufru (40 pl) obsahujícím chlorid sodný 100 mmoLl’¹, octan zinečnatý 1 πμποΙ.Γ¹ a glycerol (5 % obj./obj.), při 37 °C, 30 min. Reakční roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA byla vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Vysrážená DNA se nechala reagovat s T4 DNA polymerázou (5 jednotek) (Takara Shuzo) v T4 DNA polymerázovém pufru [10 pl, 33 mmol.l’¹ Tris-HCl, 66 mmol.T¹ octan draselný, lOmmol.T¹ octan hořečnatý, 0,5 mmol.T¹ dithiothreitol, 0,1 mg/ml hovězí sérum albumin (Takara Shuzo), pH 7,9, destilovaná voda] při 37 °C, 5 min. Reakční roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA byla vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

-16CZ 291991 B6

Kombinace nukleázy mung beán a T4 DNA polymerázy zajišťuje, aby fragment DNA neměl lepivé 5' ani 3' konce.

DNA byla dále štěpena alkalickou fosfatázou (10 jednotek) v pufru pro alkalickou fosfatázu (celkový objem 400 μΐ, 50 mmol-Γ¹ Tris-HCl, 1 mmol.l^-1 chlorid hořečnatý, pH 9,0, destilovaná voda) při 37 °C, 30 min. Reakční roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA byla vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Výsledná DNA byla smíchána s fosfoiylovaným linkerem Xbal (100 ng) (Takara Shuzo) v ligázovém pufru obsahujícím T4 DNA ligázu (1 800 jednotek) na konečný objem 50 μΐ. Ligace byla prováděna 2 h při 16 °C. Kompetentní buňky E. coli kmene HB101 byly transformovány částí ligačního reakčního roztoku podle postupu uvedeného v oddíle (1-2) za vzniku pSCA212.

(1-5) Konstrukce plazmidu pSCA301

DNA plazmidu pIJ702 (10 pg) vyskytujícího se v mnoha kopiích [viz Katz, E., a kol., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714] byla štěpena restrikčním enzymem Sací (100 jednotek) v H pufru při 37 °C, 3 h. Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu a vyříznut DNA fragment odpovídající pruhu 5,4 kbp.

Jako součást postupu klonování bylo nutné připravit dvouvláknový oligonukleotid obsahující vnitřní štěpná místa pro HindlII a EcoRI a konce DNA umožňující ligaci do míst pro Sací a SphI. Žádaný oligonukleotid byl konstruován spojením dvou oligonukleotidických řetězců, uvedených níže. Tyto oligonukleotidy byly syntetizovány fosfoamiditovým postupem na syntetizátoru DNA (model 380, Applied Biosystems), [viz Beaucage, S. L., a kol., (1981), Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862],

Sekvence oligonukleotidů:

SEQ ID č. 2 5'-GATCTAAGCTTGAATTCGCATG-3'

SEQ ID č. 35'-CGAATTCAAGCTTA-3'

Oba oligonukleotidy (po 14 pmol) byly smíchány v TE pufru na konečný objem 400 μΐ. Směs byla ohřátá na 100 °C, 5 min a ponechána postupně zchladnout na 25 °C. Ze dvou komplementárních oligonukleotidických řetězců vznikl dvouvláknový oligonukleotid.

Připravený dvouvláknový oligonukleotid (100 ng) byl smíchán spIJ702 fragmentem 5,4 kbp (1 pg), štěpeným SacIaSphl, v ligázovém pufru obsahujícím T4 DNA ligázu (1 800 jednotek) na konečný objem 100 μΐ. Ligace byla prováděna 2 h při 16 °C. Část ligační reakční směsi byla použita k transformaci sféroplastů připravených ze Streptomyces lividans kmen TK21. Transformované buňky byly kultivovány v přítomnosti thiostreptonu, čímž byly vyselektovány buňky obsahující plazmid. Postup pracující s kmenem Streptomyces lividans TK21 je uveden v bodě [1] níže. Plazmidová DNA byla izolována z transformovaných buněk rezistentních vůči thiostreptonu podle postupu uvedeného níže v bodě [2].

Postup [1]

Transformace Streptomyces lividans kmene TK21

Transformace Streptomyces lividans kmene TK21 byla provedena podle Thompsona [viz Thompson, C. J., a kol., (1982), J. Bacteriol., 151, 668-677]. Složení roztoků je uvedeno na konci tohoto protokolu.

- 17CZ 291991 B6

Pruh Streptomyces lividcms kmene TK.21 byl [viz Hopwood, D. A., a kol., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2257-2269] naočkován do kapalného média GPY (20 ml) a buňky byly kultivovány 3 dny při 28 °C, za stálého třepání při 120 ot/min. Poté byly buňky v tomto předkultivačním médiu resuspendovány na homogenizátoru Teflon® a 5 ml kapalného média bylo zředěno médiem S-GGC’ na 110 ml. Buňky byly pěstovány dalších 24 h v Sakaguchiho nádobě při 28 °C za stálého třepání při 120 ot/min. Po této době byly buňky centrifugovány (10 min, °C, 1600 x g) a odebrány. Buněčná peleta byla dvakrát promyta. Část promyté buněčné pelety (1 g) byla resuspendována v P pufru (10 ml) a k suspenzi přidán stejný objem P pufru obsahující lysozym (20 mg/ml). Směs byla kultivována za jemného promíchávání 1,5 h při 30 °C a 120 ot/min. Tímto postupem byly připraveny sféroplasty Streptomyces lividans TK21.

Suspenze sféroplastů byla dále dvakrát filtrována, pokaždé přes osm vrstev gázy a centrifugována 10 min při 4°C a 1600 x g. Peleta sféroplastů byla dvakrát promyta P pufrem, a suspenze centrifugována 10 min při 4 °C a 1600 x g. Peleta byla resuspendována v 0,8 ml P pufru a ponechána stát na ledu. Do suspenze sféroplastů (100 μΐ) byla přidána ligační reakční směs (20 μΐ) a suspenze byla ponechána další 2 min na ledu. Poté byl přidán P pufr (500 μΐ) obsahující 20 % (hmot./obj.) polyethylenglykolu 1540. Suspenze byla ponechána další 2 min na ledu a přidán ještě P pufr (5 ml). Část této suspenze (100 μΐ) byla jemně navrstvena na plotnu s 10 ml regeneračního média obsahujícího 2 % (hmot./obj.) baktoagaru a buňky byly kultivovány na tomto pevném médiu při 28 °C, 20 h. Kapalné regenerační médium (5 ml) obsahující 0,7 % (hmot./obj.) baktoagaru a 75 pg/ml thiostreptonu, bylo ohřáto na 45 °C a vlito na agarové plotny. Plotny byly pak inkubovány při 28 °C a kmeny rezistentní k thiostreptonu izolovány po 3 až dnech.

Složení médií a pufrů použitých ve výše uvedených transformačních postupech (jako rozpouštědlo je vždy použita destilovaná voda):

a) Medium GPY

Glukóza

Polypepton

Extrakt z droždí

b) Medium S-GGC^Y

Roztok A:

Sacharóza

Glycerol

Glycin

Kyselina casaminová Extrakt z droždí

Síran hořečnatý heptahydrát Chlorid vápenatý dihydrát

Roztok stopových kovů^e)

Roztok B:

Dihydrogenfosforečnan draselný

Hydrogenfosforečnan draselný dodekahydrát g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.) (pH 7,0-7,2)

340 g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot/obj.) g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.)

0,1 g/1 (hmot./obj.) ml/1 (obj ./obj.) g/1 (hmot./obj.) g/1 (hmot./obj.)

-18CZ 291991 B6

Roztoky A a B byly sterilizovány odděleně a 100 ml A bylo smícháno s 10 ml B.

c) Pufr P Sacharóza Síran draselný Chlorid hořečnatý Roztok stopových kovů^e) Dihydrogenfosforečnan draselný

Chlorid vápenatý monohydrát TES (pH 7,2)

d) Regenerační médium Sacharóza Glukóza Kyselina casaminová Extrakt z droždí Sladový extrakt Síran draselný Chlorid hořečnatý hexahydrát Dihydrogenfosforečnan draselný

Chlorid vápenatý dihydrát TES (pH 7,2) Roztok stopových kovů^e> Hydroxid sodný L-prolin DL-norleucin L-tyrosin

e) Roztok stopových kovů Chlorid zinečnatý Chlorid železnatý hexahydrát

Chlorid měďnatý dihydrát Chlorid manganatý tetrahydrát Boritan sodný dekahydrát Molybdenan amonný tetrahydrát

102 g/1 (hmot./obj.)

0,248 g/1 (hmot./obj.)

2,00 g/1 (hmot./obj.)

1,98 ml/1 (obj./obj.)

49,5 g/1 (hmot./obj.)

3,64 g/1 (hmot./obj.)

5,67 g/1 (hmot./obj.)

100 g/1 (hmot./obj.)

9,69 g/1 (hmot./obj.)

96,9 mg/1 (hmot./obj.)

1,94 g/1 (hmot/obj.)

4.84 g/1 (hmot/obj.)

243 mg/1 (hmot./obj.)

9.84 g/1 (hmot./obj.)

48,4 mg/1 (hmot./obj.)

2.85 g/1 (hmot./obj.)

5,56 g/1 (hmot/obj.)

1,94 ml/1 (obj./obj.) 0,00484 N

2,91 g/1 (hmot./obj.)

48,4 mg/1 (hmot./obj.)

0,969 g/1 (hmot./obj.) mg/1 (hmot./obj.)

200 mg/1 (hmot./obj.) mg/1 (hmot./obj.) mg/1 (hmot/obj.) mg/1 (hmot./obj.) mg/1 (hmot/obj.)

- 19CZ 291991 B6

Postup [2]

Příprava plazmidové DNA z aktinomycet

Thiostrepton-rezistentní kmeny získané postupem [1] byly kultivovány 3 dny při 28 °C a 200 ot/min v inkubátoru za stálého míchání (Tokyo Dennetsu Keiso Co. Ltd., Japonsko) ve lOOml média GPY obsahujícího 25 pg/ml thiostreptonu. Poté byly buňky z média peletovány centrifugací při 4000 x g, 4°C, 10 min. Vzniklá peleta byla resuspendována v 25 mmol.l^-1 Tris-HCl (4 ml, pH 8,0) obsahujícím 10 mg/ml lysozymu (Sigma) 50mmol.r* glukózy 10 a 10 mmol.l^-1 EDTA při 30 °C, 1 h. Poté byla buněčná suspenze smíchána s 1% roztokem dodecylsulfátu sodného (8 ml) s obsahem 0,2 mol.l^-1 hydroxidu sodného. Vzniklá směs byla zamíchána a ponechána stát 10 min na ledu. Dále byl ke směsi přidán vodný 3 mol.l^-1 roztok octanu sodného (6 ml, pH 4,8)), směs zamíchána a centrifugována při 11 000 x g, 4 °C, 15 min.

Celé množství supematantu bylo naneseno na kolonu Qiagen chips,500 (Funakoshi), která byla pre-ekvilibrována 10 ml adsorpčního pufru [50 mmol.l^-1 3-(N-morfolino)propansulfonová kyselina „MOPS“, 750 mmol.l^-1 chlorid sodný, 15 % (obj./obj.) ethanol, 0,15 % (obj./obj.) triton X-100 (pH 7,0), destilovaná voda]. Kolona byla dále promyta promývacím pufrem (30 ml) [50 mmol.l^-' MOPS, 1 mol.l^-1 chlorid sodný, 15 % (obj./obj.) ethanol, pH 7,0, destilovaná voda] 20 a plazmidová DNA eluována elučním pufrem (15 ml) [50 mmol.l^-1 Tris-HCl, 1,25 mol.l^-1 chlorid sodný, 15 % (obj./obj.) ethanol, pH 8,5, destilovaná voda].

DNA byla z eluátu vysrážena izopropanolem (10,5 ml) a vzniklá směs centrifugována 15 min při 11 000 x g, 4 °C. Sraženina DNA byla resuspendována v TE pufru (400 μΐ) a k suspenzi byla 25 přidána 2 mg/ml ribonukleáza A (5 μΐ, Sigma) k odstranění kontaminující RNA. Štěpení bylo prováděno 30 min při 37 °C. Poté byla reakční směs extrahována fenol-chloroformem, DNA vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

(1-6) Konstrukce pSCA1013-A (1013/428)

DNA zPSCA301 (10 pg) získaná v oddíle (1-5) byla štěpena restrikčními enzymy EcoRl (100 jednotek) a HindlII (100 jednotek) 3 h při 37 °C vH pufru. Reakční roztok po štěpení byl extrahován fenol-chloroformem, DNA byla vysrážena z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Současně byla štěpena DNA pSCA212 (10 pg) restrikčními enzymy EcoRl (100 jednotek) aHindlII (100jednotek) 3 h při 37 °C vH pufru. Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu a vyříznut DNA fragment 2,2 kbp kódující gen pro cytochrom P-450_sca-2·

Připravený pSCA212 DNA fragment 2,2 kbp (100 ng) byl smíchán spSCA301 DNA fragmentem štěpeným EcoRl-HindlII v ligázovém pufru (100 μΙ) obsahujícím T4 DNA ligázu (1800 jednotek). Ligace byla prováděna 2 h při 16 °C. Ligační reakční směs byla použita k transformaci Streptomyces lividans podle postupu [1]. Thiostrepton-rezistentní buňky kmene 45 Streptomyces lividans připravené tímto postupem byly nazvány SANK 62795. Z kmene SANK 62795 byla získána plazmidová DNA postupem [2] a odpovídající plazmid byl nazván pSCA1013-A (1013/428).

Uvedený postup je znázorněn na obr. 2 a obr. 3 a dokumentuje mapu vzniklého plazmidu.

Plazmid pSCA1013-A (1013/428) je schopný replikace v druzích Actinomyces. Obsahuje přibližně 0,4 kbp DNA odvozené od 5' promotoru genu pro cytochrom P-450_sca_₂ a zahrnuje všechny sekvence kódující Ρ-450_Κ3_₂.

-20CZ 291991 B6 (1-7) Konstrukce pSCA205

Fragment pSCAlll (10 pg), připravený postupem (1-3), byl štěpen HindlII při 37 °C, 5h v H pufru. Reakční roztok po štěpení byl extrahován fenol-chloroformem, DNA byla vysrážená z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku. HindlII konce pSCAlll byly zarovnány s použitím DNA zarovnávacího kitu (Takara Shuzo). Zarovnaná frakce byla extrahována fenol-chloroformem, DNA byla vysrážená z vodné fáze ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Výsledná DNA byla rozpuštěna ve TE pufru (200 μΐ) a zarovnané konce defosforylovány alkalickou fosfatázou (4 jednotky) (Toyobo). Defosforylace byla provedena při 37 °C, 30 min. Poté byl roztok extrahován fenol-chloroformem, defosforylovaný fragment vysrážen z vody ethanolem a sušen za sníženého tlaku.

K defosforylovanému a zarovnanému fragmentu pSCSAlll (100 ng) byl přidán Sací linker (16,5 ng) a fragment byl cirkularizován s použitím DNA ligačního kitu (Takara Shuzo) za vzniku plazmidu pSCA112, v němž bylo místo pro HindlII plazmidu pSCAlll nahrazeno místem pro Sací (viz obr. 5).

Fragment 2,8 kbp Sací zpSCA112 obsahující strukturní gen P-450_sca_₂ a jeho promotor byl získán částečným štěpením pSCA112 restriktázou Sací. Plazmid pSCA112 (22,1 pg) byl štěpen Sací (1250 jednotek) při 37 °C, 22 h vL pufru. Vzniklé fragmenty byly separovány elektroforézou na 1% (hmotn./obj.) agarózovém gelu a vyříznut fragment 2,8 kbp. Vyříznutý fragment 2,8 kbp byl přenesen do dialyzační trubice a dialyzován proti 1 x TBE pufru při 150 V, 1,5 h. Roztok obsahující Sací fragment byl extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážená ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Veškerá výsledná DNA byla rozpuštěna vTE pufru obsahujícím 1 g/ml chloridu cezného a přidán ethidium bromid na koncentraci 0,1 mg/ml. Sací fragment byl z roztoku izolován centrifugací při 120 000 ot/min (650 000 x g), 15 °C, 2 h. Ethidium bromid byl z pelety odstraněn trojnásobnou extrakcí izopropanolem nasyceným chloridem sodným a obsahujícím 50 mmol.f¹ Tris-HCl pufr (pH 8,0). Po extrakci následovala dialýza přes noc v TE pufru při 4 °C. Výsledná frakce byla vysrážená 70% (obj./obj.) ethanolem a vysušena za sníženého tlaku s výtěžkem 76 pg částečně purifikovaného fragmentu Sací (2,8 kbp).

Tento částečně purifikovaný fragment Sací (2,8 kbp) byl kontaminován DNA fragmentem 3,2 kbp původně odvozeným od pUC119. Kvůli odstranění tohoto kontaminujícího fragmentu byl částečně purifikovaný fragment Sací (2,8 kbp) štěpen restriktázou Pvul při 37 °C, 12 h v K pufru. Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmotn./obj.) agarózovém gelu a vyříznut Sací fragment 2,8 kbp. Vyříznutý fragment 2,8 kbp byl dialyzován jako v předcházejícím stupni, 1 h. Dialyzační roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážená ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Vysušená DNA byla dále rozpuštěna v TE pufru (2 ml) obsahujícím 1 g/ml chloridu cezného, přidán ethidium bromid na koncentraci 0,1 mg/ml. Sací fragment byl z roztoku izolován centrifugací při 120 000 ot/min (650 000 x g), 15 °C, 2 h. Ethidium bromid byl z pelety odstraněn trojnásobnou extrakcí izopropanolem nasyceným chloridem sodným a obsahujícím 50 mmol.r¹ Tris-HCl pufr (pH 8,0). Po extrakci následovala dialýza přes noc v TE pufru při 4 °C. Dialyzovaná DNA byla vysrážená 70% (obj./obj.) ethanolem a vysušena za sníženého tlaku. Vysušená DNA byla rozpuštěna v TE pufru (20 pl). Konečný výtěžek fragmentu Sací (2,8 kbp) obsahujícího strukturní gen pro cytochrom P-450_sca_₂ a jeho promotor byl 9,8 pg.

Paralelně byl štěpen pIJ702 (200 pg) restriktázou Sací (300 jednotek), 37 °C, 20 h, v L pufru. Roztok byl extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážená ethanolem a sušena za sníženého tlaku. Vysušená DNA byla rozpuštěna v TE pufru (800 pl) a provedeno štěpení alkalickou

-21 CZ 291991 B6 fosfatázou (80 jednotek), 37 °C. 30 min. Poté byl roztok opět extrahován fenol-chloroformem,

DNA vysrážena ethanolem a sušena za sníženého tlaku. Vysušená DNA byla rozpuštěna v TE pufru obsahujícím 1 g/ml chloridu cezného a přidán ethidium bromid na koncentraci 0,1 mg/ml.

Plazmid pIJ702 štěpený restriktázou Sací byl z roztoku izolován centrifugám' při 120 000 ot/min (650 000 x g), 15 °C, 2 h.

Ethidium bromid byl z pelety odstraněn trojnásobnou extrakcí izopropanolem nasyceným chloridem sodným a obsahujícím 50 mmol.r¹ Tris-HCl (pH 8,0). Po extrakci byla provedena dialýza přes noc vTE pufru při 4°C. Dialyzovaná DNA byla vysrážena 70% (obj./obj.) ethanolem a vysušena za sníženého tlaku. Tímto postupem byl připraven pIJ702 štěpený restriktázou Sacla alkalickou fosfatázou s výtěžkem 37 pg.

K pIJ702 štěpenému restriktázou Sací a alkalickou fosfatázou byl v TE pufru přidán Sací fragment 2,8 kbp (2,4 pg) získaný zpSCA112. Tyto dva fragmenty byly ligovány s použitím DNA ligačního kitu (Takara Shuzo). Výsledným plazmidem byly transformovány buňky Streptomyces lividans TK21 a z transformovaných buněk puntíkován plazmid známým postupem [Hopwood a kol., „Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual“: John Innes Institute, Norwich, 1985). Tento plazmid byl pojmenován pSCA205.

Příklad 2

Sekvenování DNA

Plazmidová DNA získaná v příkladu 1 byla připravena pro sekvenaci alkalickou denaturaci dle Zhange [viz Zhang, H., a kol., (1988), Nucleic Acid Res., 16,1120]. Denaturace byla provedena inkubací plazmidové DNA (5 pg) v 10 mmol.r¹ Tris-HCl pufru (20 pl, pH 8,0) obsahujícím 0,2 mmol.r¹ EDTA a 0,2 mol.r¹ hydroxid sodný, při 37 °C, 5 min. DNA byla z tohoto roztoku vysrážena ethanolem. Sraženina DNA byla promyta 70% (obj./obj.) ethanolem a vysušena za sníženého tlaku. Výsledná DNA posloužila jako templát pro sekvenování.

Sekvenování bylo provedeno s použitím 7-deazasekvenačního kitu, verze 2,0 (Toyobo). Z výsledků vyplývá, že 5' oblast genu pro cytochrom P-450_sca_2 obsažená vpSCA1013-A (1013/428) je dlouhá 428 bp. Konkrétní sekvence je uvedena pod označením SEQ ID č. 1, nukleotidy 1-428.

Příklad 3

Stanovení produkce pravastatinu sodného

Kolonie každého z kmenů Streptomyces lividans SANK 62795, S. lividans TK21/pSCA205 aTK21 byly jednotlivě přeočkovány zpěvného média do 500 ml Erlenmayerových baněk obsahujících lOOml drožďového média [2% (hmot./obj.) glukóza, 1% (hmot./obj.) pepton, 0,1% (hmot/obj.) drožďový extrakt (Difco), pH 7,0, destilovaná voda] a 20 pg/ml thiostreptonu. Kultury byly kultivovány 3 dny za stálého míchání při 200 ot/min, 28 °C. Z každého kultivačního média bylo odebráno 5 ml a jednotlivě přeočkováno do 100 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 100 ml drožďového média a 20 pg/ml thiostreptonu. Kultury byly dále kultivovány 24 h při 200 ot/min a 28 °C. Poté byla přidána sodná sůl ML-236B na konečnou koncentraci 500 pg/ml [viz Endo, A., a kol., (1976), J. Antibiotics, 29, 1346 a Serizawa, N. a kol., (1983), J. Antibiotics, Vol. XXXVI, No. 7, 887-891] a kultivace pokračovala za míchání při 200 ot/min, 28 °C další hodinu. Poté byl z každého kultivačního média odebrán vzorek a stanovena produkce pravastatinu sodného. Každý vzorek byl analyzován na HPLC za následujících podmínek:

-22CZ 291991 B6

Kolona: Radial pack cartrige Cl8 (Waters)

Rozpouštědlo: 0,1% (hmot./obj.) fosfátový pufr obsahující 30 % (obj./obj.) acetonitrilu a 0,1 % (obj./obj.) triethylaminu, pH 3,2

Průtok: 1 ml/min

Detekce při vlnové délce: 237 nm

Retenční čas pravastatinu sodného: 11,9 min

Rovněž byla provedena chromatografie známého množství pravastatinu sodného ve výše uvedených podmínkách a použita jako referenční standard [viz Serizawa, N. a kol., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. Množství pravastatinu sodného vyprodukované různými kmeny 15 S. lividans bylo vypočteno z porovnání ploch píků pravastatinu sodného z chromatografických záznamů testovaného a známého množství.

Streptomyces lividans kmen SANK 62795 vyprodukoval 51 pg/ml pravastatinu sodného, S. lividans TK21/pSCA205 vyprodukoval 11 μg/ml pravastatinu sodného a Streptomyces lividans 20 kmen TK21 nevyprodukoval detekovatelné množství pravastatinu sodného, což jasně potvrzuje výhody předkládaných promotorů.

Příklad 4

Konstrukce plazmidů pSCA1013-A (1013/320), pSCA1013-A (1013/158), pSCA1013-A (1013/101) a pSCA1013-A (1013/74)

Pro lepší charakterizaci promotorové oblasti genu P-450_sca_2 bylo konstruováno několik plazmidů 30 obsahujících různé fragmenty 5' promotorové oblasti přidružené ke strukturnímu genu P-450_sca_₂.

Symbol „P-450_sca_2“ označuje strukturní gen kódující intaktní aminokyselinovou sekvenci P-450_sca_2·

Plazmidy tohoto příkladu, tj. pSCA1013-A (1013/320), pSCA1013-A (1013/158), pSCA1013-A 35 (1013/101) a pSCA1013-A (1013/74) byly konstruovány následujícím postupem (podrobně je konstrukce ilustrována diagramem na obr. 2). Každý plazmid obsahuje inzert z 5' promotoru štěpeného v 5'—>3' směru, připravený postupem podle příkladu 1-4. Protože délku štěpeného fragmentu nelze při štěpení exonukleázou III přesně předpovědět, obsahuje každý plazmid promotor jiné délky.

1) Konstrukce pSCA1013-A (1013/320)

Plazmid pSCA213 byl odvozen od pSCAlll postupem podle příkladu 1-4 (viz obr. 2). DNA pSCA213 byla štěpena endonukleázami EcoRI a HindlII. Produkty štěpení byly separovány 45 elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu a vyříznut EcoRI!HindlII fragment DNA

2,1 kbp obsahující gen P-450_sca_2 a oblast 5'promotoru. Roztok sDNA fragmentem byl extrahován fenol-chloroformem, DNA vysrážena ethanolem a sušena za sníženého tlaku.

Plazmid pSCA301 (100 ng) byl štěpen EcoRI a HindlII a zpracován podle příkladu 1-6. Tato 50 DNA byla přidána k EcoRI/HindlII fragmentu 2,1 kbp, připravenému výše, v ligázovém pufru obsahujícím T4 DNA ligázu (1800 jednotek) na konečný objem 100 μΐ a ligace byla prováděna 2 h při 16 °C. Poté byla ligovaná DNA použita na transformaci Streptomyces lividans postupem popsaným výše v oddíle [1], Získaný thiostrepton-rezistentní kmen Streptomyces lividans byl

-23CZ 291991 B6 nazván TK21/pSCA1013-A (1013/320). Plazmidová DNA byla z tohoto kmene připravena postupem popsaným výše v oddíle [2] a plazmid byl nazván pSCA1013-A (1013/320).

2) Konstrukce pSCA1013-A (1013/158)

Plazmid pSCA214 byl odvozen od pSCAlll postupem podle příkladu 1-4 (viz obr. 2) DNA pSCA214 byla štěpena obdobným postupem jako v bodě 1) endonukleázami EcoRI a HindlII za vzniku EcoRI/HindlII fragmentu DNA 1,93 kbp obsahujícího gen P-450_sca-2 a oblast 5' promotoru. Tento fragment byl použit na transformaci Streptomyces lividans postupem podle bodu 1).

Získaný thiostrepton-rezistentní kmen Streptomyces lividans byl nazván TK21/pSCA1013-A (1013/158). Plazmidová DNA byla ztohoto kmene připravena postupem popsaným výše v oddíle [2] a plazmid byl nazván pSCA1013-A (1013/158).

3) Konstrukce pSCA1013-A (1013/101)

Plazmid pSCA215 byl odvozen od pSCAlll postupem podle příkladu 1-4 (viz obr. 2). DNA pSCA215 byla štěpena obdobným postupem jako v bodě 1) endonukleázami EcoRI a HindlII za vzniku EcoRI/HindlII fragmentu DNA 1,87 kbp obsahujícího gen P—450_5ca_₂ a oblast 5' promotoru. Tento fragment byl použit na transformaci Streptomyces lividans postupem podle bodu 1).

Získaný thiostrepton-rezistentní kmen Streptomyces lividans byl nazván TK21/pSCA1013-A (1013/101). Plazmidová DNA byla z tohoto kmene připravena postupem popsaným výše v oddíle [2] a plazmid byl nazván pSCA1013-A (1013/101).

4) Konstrukce pSCA1013-A (1013/74)

Plazmid pSCA216 byl odvozen od pSCAlll postupem podle příkladu 1-4 (viz obr. 2). DNA pSCA216 byla štěpena obdobným postupem jako v bodě 1) endonukleázami EcoRI a HindlII za vzniku EcoRI/HindlII fragmentu DNA 1,85 kbp obsahujícího gen P-450_sca_₂ a oblast 5' promotoru. Tento fragment byl použit na transformaci Streptomyces lividans postupem podle bodu 1).

Získaný thiostrepton-rezistentní kmen Streptomyces lividans byl nazván TK21/pSCA1013-A (1013/74). Plazmidová DNA byla z tohoto kmene připravena postupem popsaným výše v oddíle [2] a plazmid byl nazván pSCA1013-A (1013/74).

5) Stanovení délky a nukleotidové sekvence promotorových fragmentů

Délka 5' promotorových fragmentů v každém z plazmidů pSCA1013-A (1013/320), pSCA1013-A (1013/158), pSCA1013-A (1013/101) a pSCA1013-A (1013/74) byla stanovena postupem podle příkladu 2.

Bylo stanoveno, že plazmid pSCA1013-A (1013/320) obsahuje 5' oblast DNA kódující P-450_sca-2 o délce 320 kbp s nukleotidovou sekvencí odpovídající nukleotidům č. 109-428 ze SEQ ID č. 1.

Bylo stanoveno, že plazmid pSCA1013-A (1013/158) obsahuje 5'oblast DNA kódující P-450_sca_₂ o délce 158 kbp s nukleotidovou sekvencí odpovídající nukleotidům č. 271-428 ze SEQ ID č. 1.

-24CZ 291991 B6

Bylo stanoveno, že plazmid pSCA1013-A (1013/74) obsahuje 5' oblast DNA kódující P-450_sca_₂ o délce 74 kbp s nukleotidovou sekvencí odpovídající nukleotidům č. 355-428 ze SEQ ID č. 1.

6) Produkce pravastatinu sodného regulovaná plazmidem

Produkce pravastatinu sodného byla stanovena postupem podle příkladu 3 u následujících kmenů: Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A (1013/320), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A (1013/158), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A (1013/101), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A (1013/74). Kmen Streptomyces lividans TK21 byl použit jako kontrola. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Kmen S. lividans	pravastatin sodný (pg/ml)
TK21/pSCA1013-A (1013/320) TK21/pSCA1013-A (1013/158) TK21/pSCA1013-A (1013/101) TK21/pSCA1013-A (1013/74) TK21	52 12 17 16 0

Všechny 5' promotory plazmidů připravených v tomto příkladu vykazují využitelnou promotorovou aktivitu.

Příklad 5

Transkripce indukovaná ML-236B stanovená pomocí northemového blotingu

i) Příprava celkové RNA

Následující kmeny S. lividans, tj. 5. lividans TK21/pSCA205, 5. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/428), S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/320), S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/158), S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/101) a S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/74), byly kultivovány postupem podle příkladu 3.

Jako v příkladu 3 byl k testovaným kulturám přidán ML-236B na konečnou koncentraci 500 pg/ml. Kontrolní nebo negativní testy byly provedeny analogicky, pouze bez přítomnosti ML-236B. Po přidání ML-236B k testovaným vzorkům pokračovala kultivace při 28 °C a 200 ot/min, 1 h. Poté byla kultivační média centrifugována při 4 °C, 4000 x g, 10 min a pelety okamžitě zmrazený kapalným dusíkem pod -80 °C.

Z každé zmražené pelety byl odebrán vzorek (3 g) a rozemlet na prach v moždíři vychlazeném suchým ledem. Připravený prášek byl vnesen do centrifugačních zkumavek naplněných guanidin-thiokyanátovým roztokem (15 ml) [4 M guanidin-thiokyanát (Fluka), 4 % (hmot./obj.) Sarcosyl (Sigma), 0,1 % (hmot./obj.) Antifoam A (Sigma), 20 mmol.T¹ EDTA disodná sůl, 4 mmol.r¹ merkaptoethanol, 25 mmol.T¹ trisodná sůl kys. citrónové (pH 7,0)] a obsah zkumavek pečlivě promíchán. Buňky byly poté homogenizovány 30 min na polytronovém homogenizátoru. Homogenát byl dále centrifugován při 9000 ot/min (10 000 x g), 4°C, 15 min. Získaný supematant byl znovu centrifugován při 9000 ot/min (10 000 x g), 4 °C, 15 min. Z každého výsledného supematantu bylo odebráno po 7 ml a tyto vzorky byly opatrně navrstveny do ultracentrifugačních zkumavek (13 Pa: Hitachi Koki Co., Ltd) obsahujících 3 ml 5,7 mol.T¹ roztoku chloridu cezného s obsahem 0,1 mokl¹ EDTA disodné soli a centrifugovány při 30 000 ot/min (40 000 x g), 4 °C, 15 h. Vzniklé pelety byly rozpuštěny v 0,3 ml 10 mmol.T¹

-25CZ 291991 B6

Tris-HCl (pH 8,0) s obsahem 0,1 mohl^-1 EDTA disodné soli („TE pufr“) a v 30 ml pufru mol.F¹ kyselina octová/octan sodný (pH 5,2) a k výslednému roztoku byl přidán ethanol (1 ml).

Vzniklé směsi byly centrifugovány při 14 500 ot/min (18 000 x g), 4°C, 5 min. Pelety byly vysušeny za sníženého tlaku, rozpuštěny v TE pufru (40 μΐ) a použity jako vzorky celkové RNA pro následující stupně.

ii) Příprava proby

Plazmid pSCA205 (10 pg) byl štěpen Pvull (100 jednotek) při 37 °C, 3 h v H pufru. Produkty štěpení byly separovány elektroforézou na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu a vyříznut Pvull fragment DNA 0,49 kbp. Výsledný DNA fragment byl purifikován fenol-chloroformem, DNA vysrážena ethanolem a sušena za sníženého tlaku, 500 ng DNA fragmentu bylo označeno ³²P-dCTP (6 000 Ci/mmol) s využitím nick translačního kitu (Amersham). Výsledný značený fragment (0,49 kbp) byl dvakrát přesrážen ethanolem k odstranění nezreagovaného ^í2P-dCTP. Výsledná proba byla rozpuštěna v 400 ml TE pufru a uchovávána při teplotě pod -20 °C iii) Northemová hybridizace pg z každé celkové RNA bylo elektroforézováno na 1% (hmot./obj.) agarózovém gelu při 100 V, 4 h v 20 mmol.r¹ MOPS pufru (Sigma) obsahujícím 0,92 mol.F¹ formaldehyd, 8 mmol.F¹ octan sodný a 1 mmol.F¹ EDTA (pH 7,0). Poté byl gel jemně třepán v 0,1 mol.F¹ octanu amonném. Dále byl gel třepán 1 h v 50 mmol.T¹ Tris-HCl pufru (pH 8,0) obsahujícím 1 mol.F¹ octanu amonného. Celková RNA byla přenesena na nylonovou membránu (PALL Ultrafíltration Corp.) a zafixována standardním postupem. Nylonová membrána byla poté dána při 42 °C, 4 h, do 30 ml pufru 5x SSPE (180 mmol.F¹ chlorid sodný, 0,1 mmol.Γ* EDTA disodná sůl, 18,6 mmol.r¹ dihydrofosforečnan sodný dihydrát a 101 mmol.T¹ hydrofosforečnan sodný dodekahydrát) obsahujícím 50 % (obj./obj.) formamidu, 2,5 x Denhartova roztoku [0,2 g/1 hovězí sérum albumin, 0,2 g/1 Ficol 500 (Pharmacia) a 0,2 g/1 polyvinylpyrrolidon] a 100 pg/ml DNA z lososího sperma. Nylonová membrána se poté nechala reagovat s výše připravenou značenou probou (0,49 kbp) (100 μΐ) kódující část P-450_sca.₂, při 42 °C, přes noc, ve 30 ml pufru 5 x SSPE obsahujícím 50 % (obj./obj.) formamidu, 1 x Denhartova roztoku, 100 pg/ml DNA z lososího sperma a 0,1 % (obj./obj.) dodecylsulfátu sodného (SDS). Po této operaci byla nylonová membrána dvakrát promyta 2 x SSPE obsahujícím 0,1 % (obj./obj.) SDS, 5 min při laboratorní teplotě a poté ještě jednou 1 x SSPE obsahujícím 0,1 % (obj./obj.) SDS, 10 min při 55 °C a nakonec 0,1 x SSPE obsahujícím 0,1 % (obj./obj.) SDS, 15 min při 55 °C. Membrána byla vysušena a stanoveny hladiny produkce fragmentu 1,8 kbp mRNA transkribovaného z genu P-450s<;_a_₂ s využitím Image-Analyser BA 100 (Fuji film). Hodnota negativní kontroly pro

5. lividans TK/pSCA205 byla definována jako 1 a k ní byly vztaženy hodnoty pro ostatní kmeny. Přehled výsledků je uveden níže v tabulce 2.

Tabulka 2

ML-236B sodná sůl nepřítomna přítomna

S. lividans TK21/pSCA205	1,0	26
5. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/428)	31	32
S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/320)	36	31
S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/158)	4,8	8,9
S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/101)	7,6	15
S. lividans TK21/pSCA1013-A (1013/74)	2,2	1,3

Z výše uvedeného jasně vyplývá, že promotorová aktivita intaktní 5'-nekódující oblasti 1 kbp závisí na indukci sodnou solí ML-236B (S. lividans TK21/pSCA205). Předkládané promotory

-26CZ 291991 B6 naopak indukci nevyžadují. V příkladech jsou uvedeny hladiny transkripce, hladiny exprese přirozeně zaostávají.

Seznam sekvencí

Sekvence ID č.: 1

Délka Sekvence: 428

Typ sekvence: nukleová kyselina Uspořádání řetězců: dvouvláknové Topologie: lineární

Typ molekuly: genomová DNA

Hypotetická: ne

Antisenze: ne

Původní zdroj

Organismus: Streptomyces carbophilus

Kmen: SANK 62585 (FERM BP-1145) Sekvence

CAGCAGGACC AGGACGTCGC CGCGCAGTTC GCCGGTATCG GGGAGGTCGA CCTCGGAGAT60

CTTCCCCAAC CGGCAGGCGT CGACCACGAG TTGGGCCCGG CTCGGCCACC TGCGGTAGAC120

CGCCGCCTTT CCCGTGCGGG CCCGGACCGC CACCCGCTCC ATGGTGAGCG AGGCGTAACC180

CACCTCGCCG AGCTCGTCCA AAGTCGCCAG CAGAATGGCG CTTTCCAGTT CCTCGCCGCG240

ACGACGCGGG CCTTTGCGGT GGTCAAGGGG TGGTTCGGTG GCCGGTTCCG TGGCCGGTTC300

GGCACTGTTG GGCACCCCTG CCTCCCGTGT CTGTCGCATA GGGGCCGTTG CGTTCTTCCG360

GGTGGACAGC CTAGCCTCCA ACTTAGAGAA CAGTCCGTTC TTTAACGTCT GAGGTTTCGA420

GGGTTTCG

428

Sekvence ID č.: 2

Délka Sekvence: 22

Typ sekvence: nukleová kyselina

Uspořádání řetězců: jednovláknové

Topologie: lineární

Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (syntetická DNA)

Hypotetická: ne

Antisenze: ne

Sekvence

GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG 22

Sekvence ID č.: 3

Délka Sekvence: 14

Typ sekvence: nukleová kyselina

Uspořádání řetězců: jednovláknové

Topologie: lineární

Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (syntetická DNA)

Hypotetická: ne

Antisenze: ne

Sekvence

CGAATTCAAG CTTA 14

-27CZ 291991 B6

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález umožňuje průmyslovou produkci proteinů s využitím nových promotorů, vektorů, které tyto promotory obsahují, nebo celého expresního systému, který zahrnuje hostitelské buňky transformované předkládanými vektory.

Claims (64)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. DNA s transkripční promotorovou aktivitou, která je částí, ale ne celou, 5'-nekódující oblasti 1 kbp přímo přiléhající k otevřenému čtecímu rámci ze Streptomyces carbophilus, přičemž tento rámec kóduje cytochrom P-450.
2. 2. DNA podle nároku 1, která má transkripční promotorovou aktivitu alespoň v jednom kmeni Streptomyces carbophilus.
3. 3. DNA podle nároku 1 nebo 2, která má transkripční promotorovou aktivitu alespoň v jednom kmeni Streptomyces lividans.
4. 4. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde cytochromem P-450 je cytochrom P—450sca-2·
5. 5. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků s konstitutivní promotorovou aktivitou.
6. 6. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků o délce nejméně 74 bp.
7. 7. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků o délce nejméně 300 bp.
8. 8. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 6 o délce menší než 100 bp.
9. 9. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků z níž byl odstraněn alespoň jeden pár bází.
10. 10. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, která byla částečně štěpena v 5'->3' směru.
11. 11. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, která je dvouvláknová DNA.
12. 12. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 10, která je jednovláknová DNA.
13. 13. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků obsahující celou nebo částečnou kontinuální sekvenci ze sekvence SEQ ID č. 1 počínaje bází č. 428 směrem k bázi č. 1.
14. 14. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků dostatečně dlouhá, aby vykazovala promotorovou aktivitu nejméně ekvivalentní s aktivitou inzertů DNA ze skupiny zahrnující inzerty DNA 320 bp a 428 bp zplazmidů pSCA1013-Á(1013/320) respektive pSCA1013-A(1013/428).
15. 15. DNA jejíž celá sekvence je homologní s DNA nukleotidovou sekvencí odpovídající 5'-nekódující oblasti 1 kbp.

    -28CZ 291991 B6
16. 16. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků hybridizující při 60 °C v 6 x SSC s DNA o nukleotidové sekvenci 109 až 428 ze SEQ ID č. 1.
17. 17. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků hybridizující při 60 °C v 6 x SSC s DNA o nukleotidové sekvenci 1 až 428 ze SEQ ID č. 1.
18. 18. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků mající transkripční promotorovou aktivitu, která zajišťuje vyšší celkovou hladinu exprese po jedné hodině, při porovnání s celkovou hladinou exprese regulované 5'-nekódující oblastí po jedné hodině substrátové indukce substrátem pro produkci cytochromu P-450.
19. 19. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 7 a 9 až 18 o nukleotidové sekvenci 1 až 428 ze SEQ ID č. 1.
20. 20. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků Iaž7a9ažl8o nukleotidové sekvenci 109 až 428 ze SEQ IDč. 1.
21. 21. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 6 a 9 až 18 o nukleotidové sekvenci 271 až428 ze SEQIDč. 1.
22. 22. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků Iaž6a9ažl8o nukleotidové sekvenci 328 až428ze SEQIDč. 1.
23. 23. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků Iaž6a8ažl8o nukleotidové sekvenci 355 až428ze SEQIDč. 1.
24. 24. DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků v operativní transkripční promotorové vazbě s otevřeným čtecím rámcem.
25. 25. DNA sekvence obsahující DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků za podmínky, že tato DNA nezahrnuje celou sekvenci 5'-nekódující oblasti.
26. 26. Vektor obsahující DNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
27. 27. Vektor podle nároku 26 schopný exprimovat protein v příslušné hostitelské buňce, přičemž tento protein je kódován otevřeným čtecím rámcem operativně připojeným kDNA podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
28. 28. Vektor podle nároku 27, kde proteinem je cytochrom P-450_sca_2.
29. 29. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28 udělující hostitelské buňce volitelný fenotyp.
30. 30. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle kteréhokoliv z nároků 26 až 28, kde DNA s transkripční promotorovou aktivitou je v operativní transkripční promotorové vazbě s otevřeným čtecím rámcem.
31. 31. Expresní systém, který obsahuje hostitelské buňky podle nároku 30.
32. 32. Expresní systém podle nároku 31, kde uvedená buňka je prokaryontní hostitelská buňka.
33. 33. Expresní systém podle nároku 32, kde hostitelské buňky jsou zvoleny ze skupiny zahrnující Escherichia coli, Bacillus subtilis a Streptomyces spp.
34. 34. Expresní systém podle nároku 32, kde uvedená buňka je aktinomycetová hostitelská buňka.

    -29CZ 291991 B6
35. 35. Expresní systém podle nároku 32, který obsahuje streptomycetové hostitelské buňky.
36. 36. Expresní systém podle nároku 32, kde hostitelské buňky jsou Streptomyces lividans.
37. 37. Expresní systém podle nároku 36, kde jeho hostitelské buňky jsou Streptomyces lividans kmene TK21.
38. 38. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 37, kteiý obsahuje transformované hostitelské buňky kmene S. lividans a otevřený čtecí rámec je tvořen heterologní DNA.
39. 39. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 38, pro expresi prokaryontních proteinů.
40. 40. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 39, který obsahuje hostitelskou buňku transformovanou vektorem podle kteréhokoliv z nároků 26 až 29, kde vektor je expresní vektor v mnoha kopiích.
41. 41. Expresní systém podle nároku 40, kde jeho expresní vektor vyskytující se v mnoha kopiích je pIJ702.
42. 42. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 41, pro expresi produktu, který je v přírodních podmínkách exprimován pouze po substrátové indukci.
43. 43. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 42 pro expresi proteinu, kde proteinem je antibiotikum.
44. 44. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 43 dodatečně obsahující systém produkující substrát pro expresi produktu.
45. 45. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 44, kde produktem exprese je cytochrom P-450.
46. 46. Expresní systém podle nároku 45, kde produktem exprese je cytochrom Ρ-450_Κ3.
47. 47. Expresní systém podle nároku 46, kde produktem exprese je cytochrom Ρ-450_Κ8_₂.
48. 48. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 47, kde exprimovaným proteinem je cytochrom P-450s(;_a a hostitelem je kmen S. lividans, který rovněž exprimuje elektron transferový systém umožňující účast cytochromu na hydroxylaci veškerého ML-236B.
49. 49. Použití expresního systému podle nároku 48, kde hostitelem je S. lividans kmen TK21 pro výrobu pravastatinu sodného.
50. 50. Použití podle nároku 49, kde hostitelem je Streptomyces lividans SANK 62795 s přírůstkovým číslem FERM BP-5299.
51. 51. Použití expresního systému podle nároku 32 ve výrobě žádaného proteinu.
52. 52. Expresní systém podle kteréhokoliv z nároků 31 až 48, kde otevřený čtecí rámec kóduje jakoukoliv vhodnou sekvenci aminokyselin.
53. 53. Streptomyces lividans SANK 62795 s přírůstkovým číslem FERM BP5299.
54. 54. Plazmid pSCA 1013-Δ(1013/428).
55. 55. Plazmid pSCA1013-A(1013/320).

    -30CZ 291991 B6
56. 56. Plazmid pSCAl013-Δ(1013/158).
57. 57. Plazmid pSCA1013-A( 1013/101).
58. 58. Plazmid pSCAl 013-Δ(1013/74).)
59. 59. Streptomyces lividans TK21/pSCAl013—Δ(1013/428).
60. 60. Streptomyces lividans TK.21/pSCA1013-A(1013/320).
61. 61. Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A(1013/158).
62. 62. Streptomyces lividans TK21 /pSCA 1013-Δ( 1013/101).
63. 63. Streptomyces lividans TK21 /pSCA 1013-Δ( 1013/74).
64. 64. DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a 10 až 25 s transkripční promotorovou aktivitou, která odpovídá 5'-nekódující oblasti 1 kbp, z níž byl odstraněn alespoň jeden pár bází.

    4 výkresy

    -31 CZ 291991 B6

    FIG.