KR970027314A - 악티노마이세트 프로모터 - Google Patents

악티노마이세트 프로모터 Download PDF

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KR970027314A
KR970027314A KR1019960059988A KR19960059988A KR970027314A KR 970027314 A KR970027314 A KR 970027314A KR 1019960059988 A KR1019960059988 A KR 1019960059988A KR 19960059988 A KR19960059988 A KR 19960059988A KR 970027314 A KR970027314 A KR 970027314A
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노부후사 세리자와
이찌로 와따나베
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가와무라 요시부미
상꾜 가부시끼가이샤
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Abstract

악티노마이세트 스트렙토마이세스 카르보필러스(Actinomycete Streptomyces Carbophilus)에서 치토크롬 P-450sca-2을 코드하는 유전자의 1kbp 길이인 5'-비코드 영역을 기질 유도 가능한 전사 프로모터 활성을 갖는다. 1kbp 영역이 짧아지는 경우, 전사 활성은 구성성이 되고, 짧아진 프로모터는, 특히 프라바스타틴 나트륨을 생성하는 ML-236B의 존재하에서 P-450sca-2을 발현하는, 발현 시스템에 유리하게 사용될 수 있다.

Description

악티노마이세트 프로모터
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 P-450sca-2유전자의 5'-비코드 영역의 428 bp를 함유하는, 플라스미드 pSCA1013-△(1013/428)의 구축도이다.
제2도는 P-450sca-2유전자의 5'-비코드 영역의 3' 말단으로 수득된 본 발명의 320, 158, 101 및 74bp 프로모터[각각, pSCA1013-△(1013/320), pSCA1013-△(1013/158), pSCA1013-△(1013/101) 및 pSCA1013-△(1013/74)]를 함유하는 플라스미드의 구축도이다.
제3도는 제1도에서 수득한, 플라스미드 pSCA1013-△(1013/428)의 제한효소 지도이다.
제4도는 1kbp 5' 프로모터와 함께 P-450sca-2유전자의 일부분을 함유하는 플라스미드 pSCA101의 제한효소 지도이다.
제5도는 1kbp 5' 프로모터 및 P-450sca-2를 함유하는 플라스미드 pSCA205의 구축도이다.

Claims (95)

  1. 스트렙토마이세스 카르보필러스(Steptomyces Carbophilus)의 오픈 리딩 프레임에 바로 인접한 1kbp 5'-비코드 영역의 전체가 아닌 일부분에 해당하고, 상기 오픈 리딩 프레임이 P-450 치토크롬을 코드하는, 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 스트렙토마이세스 카르보필러스의 하나 이상의 균주에서 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA.
  3. 제1항에 있어서, 스트렙토마이세스 리비단스의 하나 이상의 균주에서 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA.
  4. 제1항에 있어서, 상기 P-450 치토크롬이 P-450sca-2치토크롬인 것을 특징으로 하는 DNA.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로모터 활성이 구성성인 것을 특징으로 하는 DNA.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 74bp 이상의 길이인 것을 특징으로 하는 DNA.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA가 300bp 이상의 길이인 것을 특징으로 하는 DNA.
  8. 제1항에 있어서, 100bp 이하의 길이인 것을 특징으로 하는 DNA.
  9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 염기쌍을 제거시킨 상기 1kbp 5'-비코드 영역에 직접적으로 상응하는 DNA.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 염기쌍을, 제한효소, 엔지니어링, 상기 5'-비코드 영역의 말단으로부터의 절단 및 그의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 수단에 의해서 제거하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. 제1항에 있어서, 5'→3' 방향으로 부분 절단된 1kbp 5'-비코드 영역에 직접적으로 상응하는 DNA.
  12. 제1항에 있어서, 이중 가닥인 DNA.
  13. 제12항의 DNA 중 단일 가닥인 DNA.
  14. 제1항의 프로모터의 구축에 유용한 제12항의 DNA중 일부분인 DNA.
  15. 제1항의 프로모터의 구축에 유용한 제13항의 DNA 가닥 중 일부분인 DNA.
  16. 제1항에 있어서, SEQ. ID. No. 1의 서열중 지속적인 서열로 구성되고, 428로 시작하여 전체 또는 일부분이 염기 번호 1에 계속되는 DNA.
  17. 제1항에 있어서, 각각의 플라스미드 pSCA1013-△(1013/428) 및 pSCA1013-△(1013/320)의 320 및 428bp DNA 삽입물로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 삽입물의 프로모터 활성과 적어도 실질적으로 동등한 프로모터 활성을 나타낼 수 있는 충분한 길이를 갖는 DNA.
  18. 제1항에 있어서, 상당한 수준의 기질 유도를 수행하지 못하는 충분히 짧은 DNA.
  19. 제1항에 있어서, 상기 DNA에 해당하는 1kbp 5'-비코드 영역의 서열과 실질적으로 동일한 전체 서열을 갖는 DNA.
  20. 제1항에 있어서, 상기 DNA에 해당하는 1kbp 5'-비코드 영역의 하나 이상의 염기 서열과 상당한 서열 유사성을 공유하는 전체 서열을 갖는 DNA.
  21. 제1항에 있어서, 6×SSC 중 60℃에서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼428로 구성된 DNA와 혼성화되는 DNA.
  22. 제1항에 있어서, 6×SSC 중 60℃에서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼320으로 구성된 DNA와 혼성화되는 DNA.
  23. 제1항에 있어서, 1시간의 기질 유도를 수행하여 1kbp 5'-비코드 영역으로 수득되는 발현의 전체 수준과 비교하여, 1시간의 기간 후 발현의 전체 수준을 더 높일 수 있는 충분한 프로모터 활성을 나타낼 수 있는 DNA.
  24. 제1항에 있어서, 하나 이상의 부가적인 염기쌍을 하나 이상의 말단에 세로로 연결시킨 DNA.
  25. 제1항에 있어서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼428을 갖는 DNA.
  26. 제1항에 있어서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼320을 갖는 DNA.
  27. 제1항에 있어서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼158을 갖는 DNA.
  28. 제1항에 있어서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼101을 갖는 DNA.
  29. 제1항에 있어서, SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼74을 갖는 DNA.
  30. 제23항에 있어서, DNA의 변이체 및 변종.
  31. 제24항에 있어서, DNA의 변이체 및 변종.
  32. 제25항에 있어서, DNA의 변이체 및 변종.
  33. 제26항에 있어서, DNA의 변이체 및 변종.
  34. 제27항에 있어서, DNA의 변이체 및 변종.
  35. 제1항에 있어서, 수탁번호 FERM BP-5299인 스트렙토마이세스 리비단스 SANK 62795로부터 수득된 DNA.
  36. 제1항에 있어서, 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인 DNA.
  37. 5'-비코드 영역의 완전한 버전이 상기 서열을 함유하지 않으면서, 제1항의 DNA로 구성된 DNA 서열.
  38. 스트렙토마이세스 카르보필러스의 오픈 리딩 프레임에 바로 인접한 1kbp 5' 비코드 영역의 전체가 아닌 일부분에 해당하고, 상기 오픈 리딩 프레임이 P-450 치토크롬을 코드하는, 적어도 스트렙토마이세스 카르보필러스에서 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA를 함유하는 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 DNA가 오픈 리딩 프레임에 연결된 작용 전사 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  40. 제38항에 있어서, 적절한 숙주세포내에서 상기 오픈 리딩 프레임에 의해 코드되는 단백질을 발현할 수 있는 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 상기 단백질이 치토크롬 P-450sca-2인 벡터.
  42. 제38항에 있어서, 숙주에 선택 가능한 표현현을 제공하는 벡터.
  43. 스트렙토마이세스 카르보필러스의 오픈 리딩 프레임에 바로 인접한 1kbp 5' 비코드 영역의 전체가 아닌 일부분에 해당하고, 상기 오픈 리딩 프레임이 P-450 치토크롬을 코드하고, 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 적어도 스트렙토마이세스 카르보필러스에서 전사 프로모터 활성을 갖는 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  44. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제4항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  45. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제5항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  46. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제7항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  47. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제16항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  48. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제17항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  49. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제25항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  50. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제26항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  51. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제30항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  52. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제31항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  53. 오픈 리딩 프레임과 연결된 작용 전사 프로모터인, 제35항의 DNA를 함유하는 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  54. 숙주세포가 단백질의 발현에 적합한 조건하에서 배양되는 경우, 오픈 리딩 프레임에 의해 코드되는 단백질을 발현하는, 제43항의 숙주세포로 구성된 발현 시스템.
  55. 제54항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 숙주인 것을 특징으로 한 발현 시스템.
  56. 제54항에 있어서, 숙주세포를 에쉐리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스 및 스트렙토마이세스 spp.로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  57. 제54항에 있어서, 숙주세포가 악티노마이세트숙주세포인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  58. 제54항에 있어서, 숙주세포가 스트렙토마이세트 숙주세포인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  59. 제54항에 있어서, 숙주세포가 스트렙토마이세트 리비단스인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  60. 제54항에 있어서, 숙주세포가 스트렙토마이세트 리비단스 균주 TK21인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  61. 제54항에 있어서, 숙주세포가 S. 리비단스의 형질 전환 균주이고, 오픈 리딩 프레임이 이종 DNA인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  62. 제54항에 있어서, 원핵생물 단백질을 발현하는 발현 시스템.
  63. 제54항에 있어서, 발현 벡터가 다수 복제 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  64. 제63항에 있어서, 상기 다수 복제 플라스미드가 PIJ702인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  65. 제54항에 있어서, 기질 유도 후 자연적으로만 발현되는 생성물의 발현을 위한 발현 시스템.
  66. 제54항에 있어서, 항생물질의 생성을 위한 발현 시스템.
  67. 제54항에 있어서, 상기 발현 생성물을 위해 기질 생성 시스템과 공생배양시키는 발현 시스템.
  68. 제54항에 있어서, P-450 치토크롬이 상기 발현 생성물인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  69. 제54항에 있어서, P-450sca치토크롬이 상기 발현 생성물인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  70. 제54항에 있어서, P-450sca-2치토크롬이 상기 발현 생성물인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  71. 제54항에 있어서, 발현되는 단백질이 P-450sca치토크롬이고, 숙주세포가, 상기 치토크롬이 시스템에 존재하는 임의 ML-236B의 히드록실화에 관여할 수 있도록 하는 전자전달계를 발현하는 S. 리비단스의 균주인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  72. 제71항에 있어서, 치토크롬이 P-450sca-2인 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  73. 발현되는 단백질이 P-450sca-2치토크롬이고, 숙주가, 치토크롬이 ML-236B 나트륨을 히드록실화시킬 수 있는 전자전달계를 발현하는 S. 리비단스 균주 TK21이고, 치토크롬 P-450sca-2을 생성할 수 있고, ML-236B 나트륨을 상기 치토크롬 P-450sca-2의 촉매 작용에 의해 프라바스타틴 나트륨으로 전환시킬 수 있으며, 이어서 배양액으로부터 프라바스타틴 나트륨을 회수하는 조건하에서 배양시키는 것을 특징으로 하는, ML-236B를 함유하는 배지중 제54항의 발현 시스템을 배양시키는 것을 특징으로 하는 프라바스티탄 나트륨의 생성 방법.
  74. 제73항에 있어서, 숙주세포가 수탁번호 FERM BP-5299인 스트렙토마이세스 리비단스 SANK 62795인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제73항에 있어서, ML-236B가 상기 숙주와 공생 배양되는 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum)에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 단백질을 생성하기 위해 상기 단백질의 생성을 수행하여, 단백질을 회수하는 조건하에서 제43항의 형질전환된 숙주세포를 배양시키는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 생성방법.
  77. 제54항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 임의 적합한 아미노산 서열을 코드하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  78. 제77항에 있어서, 아미노산 서열이, 신규 단백질의 천연, 변종 또는 중합체 형태; 공지된 단백질의 천연, 변종 또는 중합체 형태; 2개 이상의 상이한 단백질의 융합된 형태; 신규한 도안된 단백질; 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  79. 수탁번호 FERM BP-5299인 스트렙토마이세스 리비단스 SANK 62795.
  80. 플라스미드 pSCA1013-△(1013/428).
  81. 플라스미드 pSCA1013-△(1013/320).
  82. 플라스미드 pSCA1013-△(1013/158).
  83. 플라스미드 pSCA1013-△(1013/101).
  84. 플라스미드 pSCA1013-△(1013/74).
  85. 스트렙토마이세스 리비단스 TK 21/pSCA1013-△(1013/428).
  86. 스트렙토마이세스 리비단스 TK 21/pSCA1013-△(1013/320).
  87. 스트렙토마이세스 리비단스 TK 21/pSCA1013-△(1013/158).
  88. 스트렙토마이세스 리비단스 TK 21/pSCA1013-△(1013/101).
  89. 스트렙토마이세스 리비단스 TK 21/pSCA1013-△(1013/74).
  90. 기탁번호 FERM BP-5299인 스트렙토마이세스 리비단스 SANK 62795을 배양하고, 세포로부터 pSCA1013-△(1013-428)을 회수하여 플라스미드를 제한 효소로 절단시키므로서 수득된 SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열 1∼428을 갖는 전사 프로모터.
  91. 제54항의 발현 시스템의 발현 생성물.
  92. P-450s6a-2인 제54항의 발현 시스템의 발현 생성물.
  93. 제73항의 방법에 의해 생성되는 프라바스타틴 나트륨.
  94. 제74항의 방법에 의해 생성되는 프라바스타틴 나트륨.
  95. 제75항의 방법에 의해 생성되는 프라바스타틴 나트륨.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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