HU223206B1 - Actinomycetes-promóter - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát egy transzkripciós promoter új alakja képezi,amely a Streptomyces carbophilusban található P– 450-citokrómot kódológénnel asszociált. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmányszerinti promotert tartal- mazó vektorok, a vektorok alkalmazásafehérjék – elsősorban a P–450sca–2-protein – expresszáltatására, avektorokat tartalmazó gazdasejtek, a gazdasejteket tartalmazóexpressziós rendszerek, valamint a vektorok által expresszált fe-hérjék, továbbá az expressziós rendszerek alkalmazása. A találmánytárgyát képezi egy eljárás is, hasznos fehérjék nagyüzemi méretűelőállítására, a találmány szerinti pro- moter alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy transzkripciós promoter új alakja képezi, amely a Streptomyces carbophilusban található Ρ-450-citokrómot kódoló génnel asszociált. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti promotert tartalmazó vektorok, a vektorok alkalmazása fehérjék - elsősorban a P-450_sca_₂-protein expresszáltatására, a vektorokat tartalmazó gazdasejtek, a gazdasejteket tartalmazó expressziós rendszerek, valamint a vektorok által expresszált fehéijék, továbbá az expressziós rendszerek alkalmazása.

A találmány tárgyát képezi egy eljárás is, hasznos fehérjék nagyüzemi méretű előállítására, a találmány szerinti promoter alkalmazásával.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható prokarióta expressziós termékek nagy mennyiségben történő expresszálására. A találmány szerinti promoterek - megfelelő expressziós rendszerben - a kívánt protein jelentős szintű expresszióját teszik lehetővé anélkül, hogy a transzkripciót a protein szubsztrátjával kellene indukálni. A találmány szerinti expressziós rendszerek különösen olyan termékek expresszálására alkalmasak, amelyek normális esetben csak szubsztrátindukciót követően expresszálódnak. Az ilyen rendszerek felhasználhatók bizonyos anyagok - például antibiotikumok termelésére irányuló eljárásokban.

Az utóbbi időben a génsebészet fejlődése lehetővé tette az idegen gének különböző mikroorganizmusokba történő bevitelét, illetve a bevitt gének expresszálását. A fejlődés egyik legszembetűnőbb területe az Escherichia coli (E. coli) - rekombináns proteinek termelésére - gazdasejtként történő alkalmazása volt, s mára kialakult a kifejlesztett technológiák szokványos, nagyüzemi alkalmazása. Újabban jelentős haladást értek el az élesztők - az E. coli nagyüzemi alternatívájaként végzett - kutatásában.

Az Actinomycetales rendbe (és különösen a Streptomyces nemzetségbe) tartozó gombák olyan prokarióta mikroorganizmusok, melyeket széleskörűen alkalmaznak antibiotikumok előállítására. Az Actinomycetesgombákba a heterológ DNS bevitele rendszerint Hopwood és munkatársai által az 1980-as években kifejlesztett gazda-vektor rendszer alkalmazásával történik [Hopwood, D. A. és munkatársai: Methods in Enzymology 153, 116 (1987)]. Ez az eljárás az a Actinomyceto-gombákban az expressziós vektorrendszerek jelentős szintű kutatását és fejlesztését tette lehetővé. Az Actinomycetes expressziós vektorokban alkalmazható transzkripciós promoter egyik példája a „tipA”, amely a tiostrepton nevű antibiotikummal indukálható [Murakami, T. és munkatársai: J. Bacteriol. 171, 1459 (1989)].

A hiperlipidémia kezelésében alkalmazott pravastatin nátriumsója hasznos gyógyászati hatása, hogy csökkenti a vérszérum koleszterinszintjét (Arai és munkatársai: Ann. Rep. SankyoRes. Láb. 40, 1-38). A pravastatin nátriumsóját elsősorban a - Penicillium citrinum fonalas gomba által termelt - ML-236B-nátrium mikrobiális hidroxilezésével állítják elő. A hidroxilezést általában az Actinomycetales rendbe tartozó Streptomyces carbophilus jelenlétében végzik. Kimutatták, hogy a hidroxilezési aktivitásért egy P-450_sca típusú citokróm (a továbbiakban „P-450_sca”) a felelős [Serizawa és munkatársai: Biochimica et Biophysica

Acta 1084, 35 (1990)].

Matsuoka és munkatársai a Streptomyces carbophiZusból olyan P-450_sca-citokrómot tisztítottak, amely képes volt az ML-236B nátriumsóját 6-os helyzetben hidroxilezni. Ez a Ρ^δΟ,^ három alakban ^-450^.]. P-450_sca_₂ és P-450_sca_₃) fordul elő [Matsuoka és munkatársai: Eur. J. Biochem. 184, 707 (1989); és EP-A-0 281 245 számú szabadalmi leírás], de nem állapították meg, hogy e három alak három izotípust vagy különböző gének termékeit képviseli-e.

Serizawa és munkatársai Streptomyces carbophilusból származó (P-450_sca_₂-t kódoló) DNS-t klónoztak és expresszáltak [Hei 6-70780 („Kokai”) számú japán szabadalmi okirat; és Watanabe, I. és munkatársai: Gene 163, 81 (1995)]. A DNS-t - a P-450_sca_₂-gén 5’végi nemkódoló régiójának 1 kb hosszúságú részével együtt - a sokkópiás pIJ702-plazmidba klónozták, és Streptomyces lividans TK21-sejtek transzformálására alkalmazták. A transzformált Streptomyces lividans TK21 az ML-236B-t még gyorsabban alakította a pravastatin nátriumsójává, mint a S. carbophilus, bizonyítva ezzel, hogy az 1 kb-os fragmens erős promoteraktivitást hordoz. Az 1 kb-os 5’-végi nemkódoló régiót nem szekvenálták.

Ugyanakkor megállapították azt is, hogy a Ρ-ύόΟ^ expressziója a transzkripció szubsztrátindukciójának van alárendelve, vagyis azt találták, hogy az ML-236B és a fenobarbital - mintegy 30-szoros mértékben - fokozza a P-450 expresszióját. Ezt „Northem-blot”-analízissel állapították meg, melynek során ML-236B hiányában nem tapasztaltak transzkripciót, míg az ML-236B nátriumsója jelenlétében három transzkriptumot is megfigyeltek. Szubsztrát jelenlétében a transzkripció szintje hat órán belül maximális mértékűre emelkedett.

A P-450_sca_₂-t kódoló DNS 1233 bázispár hosszú, és a promoterrégió hosszúsága is majdnem ennyi (1013 bp), ami sokkal bonyolultabbá teszi a transzkripciót, mintha csak a nyitott leolvasási keretet (ORF) kellene felhasználni a transzformációhoz. Egy ilyen összetett, szubsztrát indukálta promoter hosszúságának csökkentése azonban nagy valószínűséggel használhatatlanná tenné a promotert. Ezenkívül, egy gazda - nyitott leolvasási keretet és 1 kb-os promoterrégiót egyaránt tartalmazó vektorral végzett - transzformálását korábban már sikerült megvalósítani, így a nyitott leolvasási keret vagy az 5’-végi nemkódoló régió lerövidítésének szükségességét nem ismerték fel.

A P-450 maximális szintű termelődéséhez szükséges hat óra azonban problémát okoz, mivel a nagyüzemi alkalmazások esetében ez a késlekedés okozza a legfőbb gondot.

Felismertük, hogy a P-450_sca_₂-t kódoló génnel kapcsolódó 5’-végi nemkódoló régió hosszúsága csökkentésének, meglepő módon, nemcsak az az előnye, hogy megszünteti az ML-236B-szubsztrát fokozó hatásának szükségességét, de fokozza a promoter hatékonyságát is.

HU 223 206 Bl

A találmány tárgyát képezi egy transzkripciós promoteraktivitású DNS, amely a Streptomyces carbophilus Ρ-450-et kódoló nyitott leolvasási keretével szomszédos, 1 kb-os 5’-végi nemkódoló régió egy részének (de nem egészének) megfelelő.

A találmány szerinti DNS - különösen előnyös esetben - legalább egy Streptomyces carbophilus törzsben és/vagy legalább egy Streptomyces lividans törzsben mutat transzkripciós promoteraktivitást.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy transzkripciós promoter, amely - Actinomycetales rendbe, előnyösen Streptomyces nemzetségbe tartozó gombában expresszálni kívánt - protein expresszálására alkalmas, és amely megfelelő expressziós rendszerben a protein jelentős szintű expresszióját teszi lehetővé anélkül, hogy a transzkripciót a protein szubsztrátjával kellene indukálni. Az ilyen expresszió előnyösen konstitutív.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti promoter egy részét vagy egészét tartalmazó DNS-szekvenciák; a találmány szerinti promoter aktivitásának egészét vagy részét hordozó DNS-ek; a találmány szerinti promotert tartalmazó vektor; az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek; valamint eljárások rekombináns protein - találmány szerinti gazdasejtek alkalmazásával történő - előállítására.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a pravastatin nátriumsójának előállítására, melynek során rekombináns Ρ-450-proteint expresszáló gazdasejtet alkalmazunk, amelyben a Ρ-450-proteint kódoló gén transzkripcióját a találmány szerinti promoter irányítja.

Felismertük, hogy a S. carbophilus Ρ-450-génjével

- különösen a P-450_sca_₂-génnel - kapcsolódó, 5’-végi nemkódoló régió méretének csökkentése csekély vagy semmilyen hatást nem gyakorol a transzkripciós promoter maximális mértékű működésére, ugyanakkor megszünteti a szubsztrátindukció szükségességét. A szubsztrátindukció pozitív hatás, így ennek megszüntetésétől azt várhatnánk, hogy a promoter aktivitását alapszintre csökkenti. Ezzel szemben, a lerövidített promoterrégiók

- az 1 kb-os promoter aktivitásának alapszintjénél - lényegesen nagyobb teljesítményt mutatnak. Még a mindössze 74 bp hosszúságú promoterrégió aktivitása is előnyösebb, mint az 1 kb-os promoteré.

Ezenkívül, a lerövidített promoterek transzkripciós szintje konstitutív, ezáltal azonnal nagy transzkripciós szint érhető el, nem úgy, mint az ML-226B-vel vagy más megfelelő szubsztráttal indukált transzkripció esetében, amikor a maximális szintű expresszió megjelenésére hat órát kell várni. Ez a nagyüzemi alkalmazás szempontjából különösen lényeges.

A transzkripciós aktivitást mutató - a P-450 nyitott leolvasási keretével közvetlenül szomszédos - 1 kb-os 5’-végi nemkódoló régiót 5’-promotemek is nevezzük. E promoterként előnyösen a S. carbophilus PaSO^-r génjével kapcsolódó promotert alkalmazzuk.

Bár az 5’-promoter hosszúságát 1 kb értékben adjuk meg, ez csupán a - nyitott leolvasási keret transzkripciós startrégiójától (tsr) 5’-irányban lévő - régió hozzávetőleges hossza. A tsr az 1. azonosító számú szekvencia körülbelül 384. helyén található, míg az ATG kezdőkodon közvetlenül a 428. hely után helyezkedik el. Az 5’-promotert tartalmazó régió végét a - nyitott leolvasási kerettől 1013 bp távolságra lévő - Sacl-hely képezi. A régió Sacl-helyét Watanabe és munkatársai írták le (ld. fentebb), de nem határozták meg az 5’-promoter hosszúságát. Az egyszerűség kedvéért az 5’-promoter hosszúságát 1 kb-nak említjük, és nem 1013 bp-nak, mivel ez a kerekítés elhanyagolható különbséget eredményez, és a találmány szerinti megoldás szempontjából nincs döntő jelentősége. A találmány szerinti promotereknek minden esetben rövidebbnek kell lenni az 5’promoter teljes, 1013 bp-os hosszúságánál.

A P-450_sca_₂-génnel szomszédos, 1 kb-os 5’-régió nem tartalmazza feltétlenül a gén teljes promoterrégióját, bár a régió mérete erre utal. Úgy tűnik, a promoter valójában nem foglal el meghatározott régiót - erre abból a megállapításunkból következtetünk, miszerint a mindössze 74 bp-os régió hasonló (vagy jobb) aktivitást mutatott, mint az eredeti, 1 kb-os 5’-promoter. A találmány szerinti promoterek lényegesen jobb promoteraktivitást mutatnak, ha hosszúságuk kb. 160 bp-t meghaladó, előnyösen 300 bp vagy több.

A találmány szerinti DNS-ek - melyeket a találmány szerinti promotereknek is nevezünk - megfelelnek az 1 kb-os 5’-promotemek, feltéve, hogy rövidebbek az 5’-promoter 1 kb-os hosszúságánál. A hosszúság csökkentése bármely alkalmas módon megvalósítható, például bizonyos szakaszok restrikciós endonukleázos eltávolításával; specifikus - de rövidebb - szekvenciák génsebészeti konstruálásával; a szekvencia 3’vagy 5’-végének emésztésével vagy e módszerek kombinációinak alkalmazásával.

Szakember számára kézenfekvő, hogy a találmány szerinti promotereknek - promoteraktivitásuk kifejtése érdekében - általában kétszálúnak kell lenni, bár az is nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti promotereket felépítő mindkét komplementer szál a találmány tárgyát képezi. Ezenkívül, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti promoterek részletei vagy az egyik vagy mindkét komplementer szál részletei, melyek végül is a találmány szerinti promoter előállításához alkalmazhatók.

Felismertük, hogy az 5’-emésztés kiváló eredményeket nyújt, és még a promoter - 3’-végén elhelyezkedő - 74 bp-os szakasza is igen nagy aktivitást mutat. Ennek megfelelően, a találmány egyik előnyös megvalósítási módja értelmében, a találmány szerinti DNS az - 5’->3’ irányban részlegesen emésztett - 5’-promoternek megfelelő. A promoter-DNS minimális hosszúságával szemben az az egyetlen feltétel, hogy a DNS szükséges promoteraktivitása fennmaradjon.

Bár - különösen a 3’-végen - 100 bp-nál kisebb promoterhosszúság esetében is jó promoteraktivitás figyelhető meg, 158 bp és 320 bp közötti hosszúságnál az aktivitás jelentős mértékű növekedését tapasztaltuk. A 320 bp-os fragmens promoteraktivitása körülbelül ötszöröse volt a 158 bp-os fragmensének (mindkét fragmens az 1 kb-os 5’-promoter 3’-terminális fragmense). A promoteraktivitás ilyen mértékű különbsége a találmány szerinti megoldás szempontjából nem kulcsfon3

HU 223 206 Bl tosságú, mivel a 158 bp-os és 320 bp-os fragmens hosszúsága közötti 152 bp különbség minimális hatást gyakorol a transzformációra, illetve expresszióra.

A promoter - kisebb, illetve nagyobb aktivitás közötti átmenetnek megfelelő - hosszúságának pontos meghatározásához szükséges eljárások szakember számára nyilvánvalók, azonban e hosszúság azonosítása nem jár semmilyen előnnyel, és a 158 bp-os vagy 320 bp-os promoterszekvencia alkalmazása között semmiféle gyakorlati különbség nem tapasztalható.

Nyilvánvaló, hogy a maximális szintű transzkripció elérése érdekében általában olyan promotert előnyösebb alkalmazni, amely lényegesen nagyobb aktivitást mutat. Előfordulhat azonban, hogy egy nagyobb aktivitású promoter alkalmazása esetén a transzkripció szintje előnytelenül magas, és a protein előállítása a gazdasejt erőfonásainak túl nagy részét veszi igénybe. Ilyen esetben egy kevésbé aktív promoter alkalmazása előnyös.

Megállapítottuk továbbá, hogy valahol a 428 bp-os és a teljes 1 kb-os hosszúság között található a promoter azon hosszúsága, amelynél a szubsztrátindukciótól való függőség megszűnik. Bár a 428 bp-os hosszúságot 5’terminális emésztéssel kaptuk, nagyon valószínű, hogy - a teljes 1 kb-os szekvencián belül - bármely 428 bpos szakasz hasonlóan eredményes promoter lehet.

Ahogy fentebb leírtuk, a szubsztrátindukció-függőség megszűnése igen előnyös, ugyanakkor lényegtelen, hogy ez pontosan mely promoterhosszúságnál következik be. Bebizonyítottuk, hogy a 428 bp-os promoter aktivitása azonos - vagy valamivel nagyobb -, mint az 1 kb-os 5’-promoter teljes aktivitása (legalábbis a szubsztrátindukció után egy óráig). Ilyenformán, az eredeti promoter hosszúságának felénél rövidebb promoter legalább olyan hatásosan működik, mint az eredeti promoter, azzal a különbséggel, hogy nincs szüksége szubsztrátindukcióra. Ez előnyösen érint minden olyan eljárást, amelyben az expresszió szintje lényeges tényező. A 428 bp-nál hosszabb promoterek egyre nehezebben kezelhetők, anélkül hogy alkalmazásuk előnnyel járna. Ezenfelül, a hosszabb promoterek - bizonyos hosszúságon felül - ismét szubsztrátindukció-függőkké válnak, ami hatástalanítja a találmány szerinti promoterek által biztosított előnyöket.

Ilyenformán, a találmány szerinti DNS előnyösen olyan hosszúságú, amely lényegében ugyanolyan vagy nagyobb promoteraktivitást mutat, mint az 5’-promoter 320 bp-os és/vagy 428 bp-os 3’-ffagmensei. Azt a promoterhosszúságot részesítjük előnyben, amelynél a szubsztrátindukció még nem jelentkezik.

A „szubsztrátindukció” kifejezés szakember számára jól ismert. Bizonyos expressziós termékekre a természetben csak akkor van szükség, ha jelen van egy bizonyos szubsztrát, amelyre az expressziós termék hatását kifejtheti. A szubsztrát hiányában a termék expresszálásával az organizmus pazarolná erőforrásait, így a természetben különböző rendszerek alakultak ki annak biztosítására, hogy a termék expressziója csak a szubsztrát jelenlétében történjen meg.

A P-450_sca_₂ esetében a szubsztrátindukciót egy olyan szubsztrát, például ML-236B alkalmazásával valósítják meg, amely az mRNS-transzkripció indukálása céljából a promoterre hat. Ez nem jelenti azt, hogy a P-450_sca-citokrómok számára az ML-236B a természetes szubsztrát. Létezhetnek egyéb szubsztrátok is (beleértve valamennyi alkalmazásra szánt - ML-236B-től eltérő - szubsztrátot), melyek képesek az 5’-promoter indukálására. Az ilyen promoterek egy másik példája a fentebb említett fenobarbital. Az 5’-promoter indukciójára képes szubsztrát természetének pontos ismerete a találmány szerinti megoldás szempontjából lényegtelen, ezért részletesebben nem is foglalkozunk vele.

Bár találmányunk nem köthető valamely elméleti magyarázathoz, valószínűnek látszik, hogy a P-450_sca_₂citokrómok expressziójának szubsztrátindukciója valamilyen módon megszünteti a transzkripció gátlását. Az 1 kb-os promoterrégió méretének - különösen 5’végének emésztésével végzett - csökkentése, úgy tűnik, a gátlás megszüntetését eredményezi. Emiatt úgy véljük, hogy a promotemek nincs olyan meghatározott hosszúsága, amelynél a szubsztrátindukció ismét megjelenik, ehelyett egy bizonyos pont után - a hosszúság növekedésével - csökken a promoteraktivitás, mivel a transzkripciós promoteraktivitás gátlása regenerálódik. A szubsztrátindukció a transzkripciós promoteraktivitás gátlásának regenerálódásával együtt kezd hatásossá válni, vagy más módon, csak egy bizonyos hosszúság elérése után válik lehetővé. Mindkét esetben azok a promoterek előnyösek, amelyek körülbelül 500 bp-nál rövidebbek, és aktivitásuk nem csökkent mértékű. Más szavakkal, a körülbelül 500 bp-nál, közelebbről, 428 bp-nál hosszabb promoterek, melyek aktivitása csökkent mértékű, nem előnyösek.

A találmány szerinti DNS az 5’-promoter egy részének vagy részeinek megfelelő. A „megfelelő” kifejezésen azt értjük, hogy a találmány szerinti DNS hasonló típusú promoteraktivitást mutat, mint az 5’-promoter, amennyiben képes egy P-450_sca-citokróm nyitott leolvasási kerete transzkripciójának elősegítésére. Az a szint, amelyen a transzkripciót elősegítő hatás bekövetkezik, a találmány szerinti megoldás szempontjából nem kulcsfontosságújellemző, és a találmány szerinti promoterek aktivitásának szintjeit a találmány leírásában ismertetjük. Az egyetlen feltétel, hogy a találmány szerinti promoterek olyan aktivitást mutassanak, amely erősebb - bizonyos esetben legalább olyan erős -, mint az 5’promoter aktivitása.

A találmány szerinti promoterek az 5’-promoter egy részének vagy részleteinek felelnek meg. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az 5’-promotert 5’-vége felől emésztjük, s az így kapott, találmány szerinti promoter szekvenciája megegyezik az 5’-promoter megmaradt 3’-részével. Ha az 5’-promotert az 5’-vég felől emésztjük, és - endonukleázos emésztés és ligálás alkalmazásával - egy belső részt is eltávolítunk, a kapott, találmány szerinti promoter az 5’-promoter két részének felel meg. Az e két példában kapott promoterek az 5’-promoter egy vagy több részletével azonos szekvenciát tartalmaznak.

A találmány szerinti promoter általában egy vagy több - az 5’-promoter szekvenciájához hasonló vagy

HU 223 206 Bl azzal azonos - szekvenciát tartalmaz. A találmány szerinti promoterek nukleotidszekvenciájának azonban nem feltétlenül kell megegyeznie az 5’-promoter szekvenciájával. Bár általában előnyös, a találmány szerinti promoterek jelentős mértékű szekvenciahomológiát mutatnak az 5’-promoter megfelelő szakaszaival, ez nem kritikus jelentőségű. Az egyetlen feltétel, hogy a szükséges promoteraktivitás megmaradjon.

A találmány szerinti promoterek a kívánt mértékben eltérhetnek az eredeti 5’-promotertől, feltéve, hogy az így kapott promoter még mindig képes kifejteni a szükséges promoterhatást. A szekvencia változtatásával általában kevés előny érhető el, és semmi nem garantálja, hogy a bázisszekvencia módosítása - a promoteraktivitás megszüntetésén vagy csökkentésén felül más eredménnyel is járna. Nem valószínű, hogy a bázisszekvencia bizonyos mértékű módosítása jelentős hatást eredményezne, különösen azért, mert a bázisszekvencia nem kódol proteint.

A bázisszekvencia módosításai rendszerint a transzformációs eljárás során következnek be, illetve valamilyen cél - például egy restrikciós hely bevitele - érdekében valósíthatók meg. Ilyenformán, a találmány tárgyát képezik azok a promoterek, amelyek - például deléciók, inverziók, inszerciók és szubsztitúciók következtében - eltérést mutatnak az 5’-promoter szekvenciájának azon részétől vagy részeitől, amelyeknek megfelelnek. A természetben előforduló 5’-promoter szekvenciájában a természetben is előfordulhatnak variációk, és az ilyen változatokon alapuló promoterek szintén a találmány tárgyát képezik.

A promoterszekvencia egyéb különbségei és változtatásai, valamint a megvalósításukhoz szükséges eljárások szakember számára kézenfekvők, s ezek szintén a találmány tárgyát képezik. A természetes variáción kívüli változtatásokon és módosításokon átesett, találmány szerinti promotereket mutánsoknak is nevezzük, így a mutánsok és változatok egyaránt a találmány tárgyát képezik. Nyilvánvaló azonban, hogy „a Streptomyces carbophilus - Ρ-450-et kódoló - nyitott leolvasási keretével szomszédos, 1 kb-os 5’-végi nemkódoló régió egy részének (de nem egészének) felel meg” kifejezés magában foglalja az ilyen mutánsokat és változatokat is.

Általánosan, az alkalmas mutánsok és változatok 6 χ SSC-oldatban, 60 °C-on képesek hibridizálni a szekvencialista 1. azonosító számú szekvenciájának 1-428. nukleotidjait tartalmazó DNS-sel. Az a DNS, amelyhez a mutánsok és változatok hibridizálódnak, egy önálló szekvencia vagy egy hosszabb szekvencia része lehet.

Ahogy azt korábban már említettük, a találmány szerinti promoterek az 1 kb-os 5’-promoteréhez képest kiváló aktivitást mutatnak. Ez nem jelenti szükségszerűen azt, hogy a nyitott leolvasási keret - találmány szerinti promoterrel elősegített - transzkripciójának szintje nagyobb, mint a - szubsztráttal indukált - 1 kb-os 5’-promoter által elősegített szint. Ehelyett gyakran az az eset fordul elő, hogy a találmány szerinti promoter konstitutív hatása azt biztosítja, hogy a protein aktivitási szintje - például egy óra elteltével - magasabb, mint az 5’-promoter alkalmazása esetén, egyórás szubsztrátindukció után kapott szint. Az ilyen konstitutív termelődés sokkal előnyösebb lehet, mint a lassú felépülés, amely később például a kívántnál vagy hasznosnál magasabb szintet ér el.

Bár a találmány szerinti DNS-ek a P-450_sca-citokrómok esetében alkalmazhatók előnyösen, nyilvánvaló, hogy bármilyen prokarióta gazdában bármilyen expresszálni kívánt, megfelelő szekvenciával együtt is alkalmazhatók. Közelebbről, a találmány szerinti promoterek megfelelő ricíinornyceíes-gazdákban, elsősorban S/repZozwyces-gazdákban alkalmazhatók előnyösen. A találmány szerinti promoterek egy S. carbophilusból származó promoter részének vagy részeinek felelnek meg, így a szükséges promoteraktivitást akkor mutatják, ha képesek elősegíteni egy P-450_sca-citokróm nyitott leolvasási keretének transzkripcióját.

A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy szintén a találmány tárgyát képezik a megfelelő nyitott leolvasási kerethez működőképesen kapcsolt - találmány szerinti promoterek is. Ilyenformán, szintén a találmány tárgyát képezik az olyan vektorok, például plazmidok, amelyek a találmány szerinti promotereket (különösen a nyitott leolvasási kerethez működőképesen kapcsolt promotereket) tartalmazzák, továbbá az ilyen vektorokat tartalmazó gazdasejtek.

A vektoroknak nem feltétlenül kell expressziós vektoroknak lenniük. Az ilyen egyéb vektorok a találmány szerinti promoterek sokszorosítására, valamint könnyen hozzáférhető könyvtár előállítására alkalmazhatók. A találmány szerinti megoldás szempontjából azonban az expressziós vektorok az előnyösek, és különösen előnyösek az olyan expressziós rendszerek, amelyek a találmány szerinti gazdasejteket és a találmány szerinti expressziós vektorokat tartalmazzák.

Amennyiben heterológ DNS-ből származó termékek expressziójához gazdasejtként Actinomyecetales rendbe tartozó gombát használunk, előnyösen S. lividanst alkalmazunk. A P-450_sca-citokrómok, különösen a P-450_sca2-citokrómok expresszálása esetén a 5. lividans expresszálja azt az elektronszállító rendszert is, amely ahhoz szükséges, hogy a citokróm részt vehessen az ML-236B hidroxilezésében. A találmány szerinti promotert tartalmazó expressziós rendszer alkalmazásával azonban bármilyen más, alkalmas protein vagy expressziós termék is expresszálható.

Általában nem előnyös eukarióta DNS-t prokariótákban, például S. lividansban expresszálni, mivel prokariótákban bizonyos - eukariótákban természetesen előforduló - poszttranszlációs események (mint például a glikoziláció) nem játszódnak le, azonban ez nem gátolja meg azt, hogy a találmány szerinti expressziós rendszerekben eukarióta géntermékeket expresszáljunk, feltéve, hogy elfogadjuk, hogy a kívánt - természetben előforduló - poszttranszlációs események nem történnek meg, hacsak azokról külön nem gondoskodunk.

A találmány szerinti expressziós rendszerek különösen alkalmasak prokarióta expressziós termékek nagy mennyiségben történő expresszálására. Az expressziós termékek még nagyobb mennyiségben állíthatók elő,

HU 223 206 Bl ha az expressziós rendszerben sokkópiás plazmidokat, például pIJ702-plazmidot alkalmazunk.

A találmány szerinti expressziós rendszerek különösen olyan termékek expresszálására alkalmasak, amelyek normális esetben csak szubsztrátindukciót követően expresszálódnak. Az ilyen rendszerek felhasználhatók bizonyos anyagok, például antibiotikumok termelésére irányuló eljárásokban. Az ilyen eljárások például olyan esetekben valósíthatók meg, amikor az expressziós termék kellő aktivitást mutat egy szubsztrát - végtermékké vagy egy későbbi stádiumnak megfelelő köztestermékké történő - átalakítására vagy a szubsztrát lebontására. Az ilyen eljárások során az expressziós rendszert a szubsztrátot termelő rendszerrel együtt tenyésztjük.

Olyan esetben, amikor a találmány szerinti expressziós rendszer terméke normális esetben szubsztrát által indukált, a szubsztráttermelő expessziós rendszerrel történő együttes tenyésztés normális esetben időveszteséggel jár, mivel meg kell várni, hogy az expressziós rendszer elégséges mennyiségű expressziós terméket termeljen. A találmány szerinti expressziós rendszerek alkalmazása esetén ez nem jelent problémát, mivel a terméket a rendszer automatikusan szintetizálja anélkül, hogy szubsztrátindukcióra lenne szükség, kiküszöbölve ezáltal az időveszteségi tényezőt.

A találmány szerinti expressziós rendszerek különösen alkalmasak a Ρ-450-citokrómok, előnyösen a P-450_sca-citokrómok, legelőnyösebben a P-450_sca_₂citokróm expresszálására. Ahogy azt fentebb leírtuk, a P-450_sca-t a S. carbophilus expresszálja, és a S. carbophilust a pravastatin nátriumsójának előállítása érdekében előnyösen Penicillium citrinummai tenyésztik együtt. Ebben a rendszerben a P-450_sca_₂ a Penicillium citrinum által expresszált ML-236B-szubsztrát hidroxilezését végzi, de csak bizonyos késés után, amíg az ML-236B indukálja a P-450_sca_₂ transzkripcióját. A találmány szerinti expressziós rendszer alkalmazásával a pravastatin nátriumsójának előállításában többé nincs szükség várakozási időszakra, ami a pravastatin nátriumsójának nagyüzemi előállítása terén nagy előnyt jelent.

Az alábbiakban a találmány néhány előnyös megvalósítási módját ismertetjük.

A találmány szerinti előnyös promoterek az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. vagy 1-320. nukleotidjait tartalmazó nukleotidszekvenciájú DNS-sel hibridizálódnak.

Azok a promoterek előnyösek, amelyek nukleotidszekvenciája az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjait tartalmazza. Szintén előnyösek azok a promoterek, amelyek nukleotidszekvenciája az 1. azonosító számú szekvencia 1-320. nukleotidjait tartalmazza. A találmány tárgyát képezik az ilyen promoterek mutánsai és változatai is.

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan DNSvektorok, amelyek a találmány szerinti promotereket tartalmazzák, különösen, ha az ilyen vektorok a promoter irányítása alatt egy - kívánt polipeptidet kódoló DNS-t is tartalmaznak, és amely vektorok megfelelő gazdasejtben képesek a polipeptid expresszálására. A találmány szerinti vektorok előnyösen P-450_sca_₂-citokróm expresszálására képesek.

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti vektorokkal transzformált gazdasejtek. Az előnyös gazdasejtek az Actinomycetales rendbe tartozó gombák, elsősorban a Streptomyces lividans. Különösen előnyös gazdasejt a Streptomyces lividans SANK-62795törzs (FERM BP-5299).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás kívánt (például a fentebb említett) polipeptid előállítására, melynek során egy találmány szerinti, transzformált gazdasejtet a polipeptid termelődését elősegítő körülmények között tenyésztünk, és kinyerjük a polipeptidet.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás pravastatin nátriumsójának előállítására, melynek során - egy találmány szerinti, P-450_sca_₂-citokrómot kódoló expressziós vektorral - transzformált, Streptomyces lividans TK21-törzsbe tartozó sejteket - a transzformáit sejtekben a P-450_sca_₂-citokróm termelődését és az ML-236B nátriumsójának (a sejtekben termelődött P-450_sea_₂-citokróm katalitikus hatásának következtében) pravastatin nátriumsójává történő átalakulását elősegítő körülmények között - tenyésztjük, majd a transzformáit sejtekből és/vagy a tápközegből kinyeqük a pravastatin nátriumsóját. Transzformált törzsként előnyösen a Streptomyces lividans SANK-62795-törzset (FERM BP-5299) alkalmazzuk. Szintén előnyös, ha az ML-236B-t - a Streptomyces-tarzzsei együtt tenyésztett - Penicillium citrinum termeli.

Az 5’-promoter egyik ismert - akár Actinomycetesből, akár más forrásból származó - promoterrel sem homológ. Más promoterekhez hasonlóan, a találmány szerinti promoterek egy - proteint vagy polipeptidet kódoló - DNS mRNS-sé történő transzkripciójának iniciálását eredményezik. Ez a folyamat képezi a proteinek vagy polipeptidek (mely kifejezéseket a leírásban egymással felcserélhetőknek tekintjük) intracelluláris bioszintézisének első részét. Ilyenformán, a találmány szerinti promoterek transzkripciós promoterek, és funkciójukat transzkripciós promoteraktivitásnak nevezzük. Az 5’-promoter, továbbá az 1. azonosító számú szekvencia 428, 320, 158, 101 és 74 bp-os részszekvenciáit tartalmazó promoterek egyaránt mutatnak ilyen aktivitást.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti promoterek - 5’ és/vagy 3’ irányban - tartalmazhatnak egy vagy több - tandemkapcsolódású - további bázispárt is. Az ilyen további szekvenciák jelenlétének csak az szab határt, hogy ne jelenjen meg újra jelentős mértékű szubsztrátindukció, illetve, hogy a szükséges promoteraktivitás fennmaradjon.

Azok a polipeptidek, amelyek expressziója a találmány szerinti promoterek irányítása alatt áll, bármilyen aminosavszekvenciát tartalmazhatnak; például lehetnek egy új vagy ismert protein természetes változatai vagy polimerei; két vagy több különböző protein fuzionált alakjai; továbbá lehetnek újonnan tervezett polipeptidek. Ahogy fentebb említettük, az előnyös polipeptid a P-450_sca_₂-citokróm.

A vektorokat illetően; kézenfekvő, hogy a transzformálni kívánt vektornak olyannak kell lenni, amely megfe6

HU 223 206 Bl lelő gazdasejtben önreplikációra képes. Ennek megfelelően, a vektornak önreplikációs szekvenciát vagy replikont kell tartalmaznia. Actinomycetes-gazda. esetében ilyen vektorként a pIJ702 előnyös.

A gazdát illetően, azonkívül, hogy a kiválasztott vektorhoz alkalmasnak kell lennie, nincs különösebb korlátozás. Általánosan, bármely (például a természetből gyűjtött vagy kereskedelmi úton beszerzett) gazdasejt alkalmazható. Gazdasejtként előnyösen Actinomycetales rendbe tartozó gombákat, előnyösen Streptomyces carbophilust vagy Streptomyces lividanst, legelőnyösebben Streptomyces lividans TK21-törzset alkalmazunk.

A pravastatin nátriumsójának találmány szerinti előállítási eljárásában - melynek során transzformált Streptomyces lividans törzset az ML-236B nátriumsója jelenlétében tenyésztünk - a pravastatin képződött nátriumsóját ismert eljárásokkal nyerhetjük ki.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti promotereket a Streptomyces carbophilusból származó DNS klónozásával kapjuk, amihez a Watanabe és munkatársai által leírt eljárást alkalmazzuk [Gene 163, 81 (1995)]. A találmány szerinti promotereket előnyösen a Streptomyces carbophilus SANK.-62585-törzs (FERM BP-1145) DNS-éből klónozzuk.

A találmány e megvalósítási módja értelmében a Streptomyces carbophilus teljes genomiális DNS-éből - például klónozóvektorként pUC18-plazmid (Takara Shuzo Ltd., Japán) alkalmazásával - genomkönyvtárat készítünk. Az ilyen könyvtárak és vektorok természetesen szintén a találmány tárgyát képezik. Ezután, például a P-450_sca_₂-citokróm leszármaztatott N-terminális aminosavszekvenciája alapján, oligonukleotidpróbát szintetizálhatunk, melyet a könyvtár egy - a P-450_sca_₂ legalább részét kódoló - kiónjának azonosításához alkalmazhatunk. Mivel a protein N-terminálisát a nyitott leolvasási keret 5’-vége kódolja, valószínű, hogy az e módszenei azonosított valamennyi klón jelentős nagyságú 5’-transzlálatlan és nemkódoló régiót tartalmaz (ahol az 5’-promoter található). Egy - a könyvtár és az oligonukleotidpróba alkalmazásával végzett - alkalmas szkrínelési eljárás a telephibridizációs eljárás [Maniatis, T. és munkatársai: ,,Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982); melyben a találmány leírásában említett valamennyi - külön hivatkozással el nem látott - eljárás általános leírása megtalálható].

Még akkor is kaphatunk teljes kiónt, ha a fenti vagy bármilyen más - eljárással azonosított klón csak egy részét tartalmazza a találmány szerinti promoternek. A kívánt DNS egy részét tartalmazó klónból jelölt próbát készíthetünk, és ezt templátként alkalmazhatjuk a genomkönyvtár további szkríneléséhez, hogy az 5’promoter legalább kívánt hosszúságú szakaszát tartalmazó kiónt azonosítsuk és izoláljuk.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki a teljes 5’-promotert vagy annak csak egy részét tartalmazó klón izolálását is. Amennyiben a teljes szekvenciát sikerül megkapni, ezt a találmány szerinti promoter előállítása érdekében - például szubklónozással - feldolgozzuk. Amennyiben részszekvenciát kapunk, azt - a teljes szekvenciához hasonlóan - további feldolgozásnak vethetjük alá, más esetekben azonban a részszekvencia a találmány szerinti promoterhez elégséges hosszúságú lehet, anélkül hogy szekvenciáját lényeges változtatásnak kellene alávetni.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti promoter klónozása és előállítása céljára fentebb javasolt eljáráson kívül más, megfelelő eljárások is alkalmazhatók. Az eljárás lépéseinek bármelyike - vagy maga az egész eljárás is - megváltoztatható(k). Például, a P-450_sca_₂ N-terminális szekvenciájának megfelelő próba helyett az 5’-promoter 3’-végéből előállított próba is alkalmazható. A vektorokat illetően nincs különösebb korlátozás, így bármely alkalmas klónozóvektor alkalmazható, mint például a kereskedelmi forgalomban beszerezhető vektorok (például a pBR322).

A találmány szerinti megoldás értelmében nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti promoterek - az 1. azonosító számú szekvenciához megadott tudnivalók alapján - kémiai úton is előállíthatok. Amennyiben a találmány szerinti promotereket kémiai úton kívánjuk előállítani, ennek megvalósítását például a foszfit-triésztereljárással [Hunkapillar, M. és munkatársai: Natúré 310, 105 (1984)] végezhetjük. Félszintézises eljárást is alkalmazhatunk, például klónozási technikák és a szintézises eljárás kombinálásával. Az ilyen félszintézis alkalmas eljárásai a szakirodalomból jól ismertek.

A találmány szerinti promoter előállításának eredetileg leírt - könyvtárszkrínelési - eljárásához visszatérve, a promoter-DNS-t - szakember számára jól ismert eljárásokkal [Maniatis, T. és munkatársai (1982), ld. fentebb] - a kívánt szekvenciát tartalmazó klónból nyerhetjük. Például, plazmid-DNS-ffakciót izolálhatunk, majd a plazmid-DNS-ből - például egy vagy több restrikciós enzim alkalmazásával - promoter-DNS izolálható.

Az 5’-promoter forrásaként szolgáló törzsként előnyösen a Streptomyces lividans SANK-62795-törzset alkalmazzuk. Ezt a törzset a Budapest Szerződés értelmében, 1995. november 21-én, „FERM BP-5299” deponálási számon a „National Institute of Bioscience and Humán Technology Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél helyeztük letétbe. A Streptomyces lividans SANK-62795-törzs az Actinomycetales rendbe tartozik, és a pSCA1013-A(1013/428) rekombináns DNS-vektort tartalmazza, mely vektor transzkripciós promoteraktivitással bíró DNS-t tartalmaz, és amely - a szekvencialista 1. azonosító számú szekvenciájának 1-428. nukleotidjait tartalmazó - nukleotidszekvenciából és a P-450_sca_₂-citokrómot kódoló DNSből áll, és a plazmid - a 428 bp-os promoter aktivitásának köszönhetően - Actinomycetes-sejtekben képes a protein termelésére.

A szekvencialistában az 1. azonosító számú szekvencia forrásaként a S. carbophilus SANK-62585törzset (FERM BP-1145) adtuk meg. Ez a törzs volt az 1 kb-os 5’-promoter (amelynek a találmány szerinti rövidebb promoterek megfelelnek) eredeti forrása. Ezt a törzset a Budapest Szerződés értelmében, 1995. szep7

HU 223 206 Bl tember 5-én a „National Institute of Bioscience and Humán Technology Agency of Industrial Science and Technology” intézetnél helyeztük letétbe.

A S. lividans SANK-62795- és a S. carbophilus SANK-62585-törzs a 5. lividans,, illetve a S. carbophilus faj tipikus képviselői, melyek Hopwood, D. A. és munkatársai leírása szerint tenyészthetők [„Generic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Egyesült Királyság (1985); amelyben e törzsek jellemző fizikai sajátságait is leírják]. E két törzs tiostreptonrezisztenciára szelektálható.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint - az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó transzkripciós promoter izolálása érdekében Streptomyces lividans SANK-62795-törzset tenyésztünk, majd a sejtekből kinyerjük a rekombináns pSCA1013A(1013/428)-plazmidot, melyet azután restrikciós enzimekkel emésztünk.

Kívánt esetben - például a Maxam-Gilbert-féle kémiai módosítási eljárás [Maxam, A. M. és Gilbert, W.: Methods in Enzymology 65, 499 (1980)] vagy az M13fágot felhasználó didezoxi-láncterminációs eljárás [Messing, J. és Vieira, J.: Gene 19, 269 (1982)] alkalmazásával - bármelyik klónozott DNS nukleotidszekvenciáját meghatározhatjuk.

Amennyiben szükség van arra, hogy meghatározzuk, vajon - az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjaiból álló szekvencia részét vagy egészét tartalmazó - DNS-sel specifikus DNS-szekvencia hibridizál-e, a meghatározást a következők szerint végezzük.

A tesztelni kívánt DNS-t először, szükség szerint, agarózgélen elektroforizáljuk. A DNS-t ezután nitro-cellulóz- vagy nejlonfilmre másoljuk, majd a filmre adszorbeált DNS-t hőkezeléssel vagy ultraibolya sugárzással fixáljuk. Ezt követően - az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjait tartalmazó nukleotidszekvenciának megfelelő - kívánt hosszúságú próbát alkalmazunk, melyet például radioaktív izotóppal (például ³²Pizotóppal), biotinnal, digoxigeninnel vagy egy enzimmel jelölünk. A próbát rendszerint „random-primer”eljárással [Feinberg, A. P. és munkatársai: Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983)] vagy „nicktranszlációs” eljárással [Maniatis, T. és munkatársai (1982), ld. fentebb] állítjuk elő.

A nitro-cellulóz- vagy nejlonfilmet - a próbát tartalmazó - hibridizációs oldatba merítjük, majd megfelelő, előre meghatározott hőmérsékleten (például 60 °C-on) inkubáljuk. Az inkubálást követően a filmet lemossuk, és a próbát az alkalmazott jelölőanyaghoz megfelelő eljárással detektáljuk.

A hibridizációs oldat rendszerint SSC-oldatot tartalmaz (nátrium-klorid/nátrium-citrát oldata; 1 χ SSC - ioncserélt vízben - 0,15 M nátrium-kloridot és 15 mM nátrium-citrátot tartalmaz). A hibridizációs oldatban az SSC koncentrációja előnyösen 4-8 χ SSC, előnyösebben 6 χ SSC. Az inkubálást előnyösen 30-70 °C-on, előnyösebben 60 °C-on végezzük.

Az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvencia részét vagy egészét tartalmazó DNS-sel hibridizáló DNS-t a leírt eljárással különböző genomkönyvtárakból klónozhatjuk. A találmány szerinti promoterek közül több inkább a 428 nukleotidos szekvenciát - és nem a 320 nukleotidos vagy rövidebb szekvenciát - tartalmazó DNS-sel hibridizál, de a hibridizációs kísérletekhez kiválasztott szekvenciahosszúság - a leírásban megadott tudnivalók alapján - könnyen meghatározható.

Ahogy korábban említettük, az így nyert DNS - jól ismert eljárásokkal, például megfelelő helyen egy vagy több nukleotid szubsztitúciójával, deléciójával vagy inszerciójával, például helyspecifikus mutagenezissel [Mark, D. F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662 (1984)] - mesterségesen módosítható. Nyilvánvaló, hogy az ilyen DNS-ek, amennyiben megfelelő transzkripciós promoteraktivitást mutatnak, szintén a találmány tárgyát képezik.

Annak igazolása érdekében, hogy a fentiek szerint kapott DNS transzkripciós promoteraktivitással bír, olyan vektort állítunk elő, amely a DNS-t egy nyitott leolvasási kerethez „tandem” módon kapcsolva tartalmazza, és ezt a vektort megfelelő gazdasejtben expresszáljuk. Először (i) egy rekombináns DNS-vektort állítunk elő, melynek során a megfelelő proteint kódoló DNS-t - működőképesen - a feltételezett promoter-DNS-hez ligáljuk, és megfelelő vektorba, például pIJ702 Actinomycetes-plazmidba [Katz, E. és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 129, 2703 (1983)] inszertáljuk; majd (ii) a vektorral egy megfelelő - a vektor stabil replikációját elősegítő gazdasejtet (a pIJ702-plazmidból kialakított vektor alkalmazása esetén például Streptomyces lividanst) transzformálunk, majd megállapítjuk a kódoló DNS által kódolt protein expressziós szintjét.

A fenti eljárásban - amennyiben gazdasejtként például Streptomyces nemzetségbe tartozó gombát alkalmazunk - a transzformációt Hopwood és munkatársai eljárása szerint [ld. Hopwood, D. A. és munkatársai: „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Egyesült Királyság (1985)] végezhetjük. A promoteraktivitás vizsgálatához csak olyan gént alkalmazhatunk, amely a gazdasejtben - a transzformációt megelőzően - nincs jelen, illetve nem expresszálódik.

A transzkripció szintje „Northem-blot”-eljárással könnyen megállapítható. A „Northem-blof’- vagy „Northem-hibridizációs” eljárás (ld. Maniatis, T. és munkatársai, ld. fentebb) során a gazdasejtet transzformálása után tenyésztjük, majd kivonjuk belőle az RNS-t, tisztítjuk, agarózgél-elektroforézist végzünk, majd az RNS-t például nitro-cellulóz- vagy nejlonfilmre másoljuk. Radioaktív izotóppal (például ³²P-izotóppal), biotinnal, digoxigeninnel vagy - a proteint kódoló gént specifikusan kimutató - enzimmel jelölt próbát készítünk, majd ezt a próbát a génről átíródott mRNS hibridizációs kimutatásához alkalmazzuk.

A transzkripció szintje RNS-PCR-eljárással [Innis, M. A. és munkatársai: „PCR PROTOCOLS” Academic Press, New York (1990)] szintén könnyen meghatá8

HU 223 206 Bl rozható. Ennek során először - a „Northem-hibridizáció” esetében leírtakhoz hasonlóan - RNS-t állítunk elő, majd az mRNS-ről, reverztranszkriptáz alkalmazásával, cDNS-t szintetizálunk (amely majd a polimerázláncreakció templátjaként szolgál). A reverztranszkripcióhoz láncindítóként („primer”) oligo(dT)-t (amely kevésbé specifikus) vagy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelynek szekvenciája homológ az expresszálni kívánt proteint kódoló gén egy részével. A kapott cDNS-t templátként alkalmazva polimeráz-láncreakciót végzünk, amihez két láncindító oligonukleotidot használunk. A láncindítók a nyitott leolvasási keret ellenkező szálaival komplementerek, és azok a helyek, amelyekkel komplementerek, a gén eltérő helyein találhatók, így a polimeráz-láncreakcióval kapott szálak képesek egymással hibridizálódni. Az adott ideig zajló reakciót követően kapott kétszálú DNS-t elektroforézisnek vetjük alá, és - például, a várt hosszúságú sáv jelenléte vagy hiánya alapján a kívánt DNS transzkripciója szintjének meghatározása érdekében - nitro-cellulózon detektáljuk.

A termék expressziójának szintjét a termelődött protein fiziológiai aktivitásának meghatározásával állapíthatjuk meg. Ennek megfelelően, rekombináns DNSvektort állíthatunk elő, amelyben egy adott aktivitású proteint (például enzimet) kódoló DNS-t működőképesen - például ligálással - a feltételezett promoter 3’végéhez kapcsolunk. Ezután a feltételezett promoterhez kapcsolt nyitott leolvasási keret expresszióját az expressziós termékhez alkalmas módon vizsgálhatjuk.

Olyan esetben, amikor az ilyen plazmid P-450_sca__₂citokrómot kódol, és a plazmid kompatibilis a S. lividansszal, a plazmidot olyan Streptomyces lividans törzsbe vihetjük be, amely nem termel P-450_sca_₂-citokrómot, majd a transzformánst az ML-236B nátriumsója jelenlétében tenyészthetjük. A pravastatin nátriumsójának mennyiségéből a P-450_sca_₂-citokróm - feltételezett promoter által elősegített - expressziójának szintjére következtethetünk.

Az expressziós termékek vizsgálati eljárásai az adott termékekhez megfelelően alakíthatók. Például, a feltételezett promotert működőképesen drogrezisztencia-génhez, például klóramfenikol-acetil-transzferáz-génhez [Gorman, C. M. és munkatársai: Mól, Cell. Bioi. 2, 1044 (1982)] kapcsolhatjuk, amelyet jól ismert eljárásokkal detektálhatunk. Az expresszió egyéb - az expressziós termékek aktivitása segítségével végzett vizsgálati eljárásai szintén alkalmazhatók.

Az expresszió mérésének egy másik eljárása például a termék megfelelő antitest alkalmazásával végzett kimutatása. Ennek során is egy olyan expressziós vektort állítunk elő, amely a feltételezett promotert egy nyitott leolvasási kerethez működőképesen kapcsolva tartalmazza, és ezt a vektort megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk, majd a sejtet az expresszió céljára alkalmas körülmények között tenyésztjük. A tenyésztő tápközeget - vagy a transzformált sejtek homogenátumát - érintkezésbe hozzuk az antitesttel, és megmérjük az antigén-antitest komplex mennyiségét. Az alkalmas mérési technikák közé tartozik a radioimmunvizsgálat (RIA) [Berson, R. S. és munkatársai: „Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology”, 2A és 2B fejezet, North-Holland Publishing Co., Amsterdam (1973)], az enzimes immunvizsgálat [Engvall, E.: Methods in Enzymology 70(A), 419 (1980)], a „Westemblot”-analízis [Harlow, E. és munkatársai: Antibodies - A Laboratory Manual”, 471. old., Cold Spring Harbour Laboratory, New York (1988)] és az immunprecipitáció [Kessler, S. W. és munkatársai: Methods in Enzymology 73(B), 442 (1981)], attól függően, hogy a kölcsönhatást milyen módon kívánjuk mérni, illetve, hogy az antitest vagy az antigén jelölve volt-e. Szakember számára nyilvánvaló, hogy az alkalmazható technikák felsorolása nem teljes, és más eljárások is alkalmazhatók.

A találmány szerinti, feltételezett és tényleges promoterek transzkripciós promoteraktivitásának meghatározására számos szakember számára hozzáférhető egyéb eljárás is alkalmazható, az ilyen eljárások szintén a találmány tárgyát képezik. Például, ha az expresszálni kívánt protein - aktivitásán vagy antigénhatásán kívül - más jellegzetes tulajdonsággal bír, az e tulajdonság által meghatározott eljárások szintén alkalmazhatók a protein - közvetlen vagy közvetett - kimutatására.

Miután meghatároztuk, hogy a DNS, melyet a találmány szerinti promoterként kívánunk alkalmazni, megfelelő promoteraktivitással bír, ezt a DNS-t bármilyen alkalmas, kívánt protein expresszálásához alkalmazható expressziós vektor előállítására alkalmazzuk. Erre a célra bármilyen megfelelő gazdasejt alkalmazható, amely a DNS promoteraktivitásának megállapításához alkalmazott gazdasejttel azonos vagy attól eltérő egyaránt lehet. Az expresszálni kívánt protein bármilyen aminosavszekvenciát tartalmazhat. Ahogy fentebb említettük, az ilyen szekvenciák lehetnek többek között egy új vagy ismert protein (vagy peptid) természetes változatai vagy polimerei; két vagy három típusba tartozó, különböző proteinek (vagy peptidek) fuzionált alakjai; illetve újonnan tervezett polipeptidek. Ahogy korábban szintén említettük, expressziós termékként előnyösen a P-450_{sca 2}-citokrómot, vektorként pedig előnyösen a pSCA1013-Á(1013/428)-vektort alkalmazzuk, mely vektor a Streptomyces lividans SANK-62795-törzsből (FERM BP-5299) izolálható.

Az „expressziós tennék”, „protein” és „polipeptid” kifejezések általában egymással felcserélhetők, s ezeket a találmány leírásában ilyen értelemben alkalmazzuk. Bizonyos esetekben az eredeti DNS-ről transzlálódó polipeptid nem a végtermék, hanem a végtermék köztesterméke; ilyenkor ahhoz, hogy a kívánt terméket kapjuk, poszttranszlációs módosításokra van szükség. A P-450_sca_₂ esetében, a végtermék kialakulása érdekében, a proteinben lévő hemcsoportba vasatomnak kell beépülnie. Ennek megfelelően, bár az „expressziós termék”, „protein” és „polipeptid” kifejezéseket a találmány leírásában egymás szinonimáiként használjuk, a kifejezések - adott szövegösszefüggésnek megfelelő különbségei szakember számára nyilvánvalók.

A találmány szerinti promoterek alkalmas gazdasejtjeiként - az Actinomycetales rendbe tartozó törzseken

HU 223 206 Bl kívül - prokarióták, mint például az Escherichia coli vagy Bacillus subtilis is alkalmazhatók.

Amennyiben gazdasejtként nem Actinomycetestörzset alkalmazunk, vagy ha a kiválasztott Actinomyceíes-törzs nem felel meg az alkalmazott vektor típusának, a vektornak tartalmaznia kell egy - a szóban forgó gazdatörzshöz alkalmas - replikont, amely például a gazdatörzzsel kompatibilis fajból származik. Olyan plazmidvektor alkalmazására van szükség, amely a gazdának megfelelő replikációs kezdőhelyet és regulátorszekvenciákat tartalmaz. Amennyiben a találmány szerinti promoter egy bizonyos gazdában nem működik, és működőképessége szakember számára kézenfekvő módszerekkel végzett módosításokkal - még más, alkalmas szabályozószekvenciák jelenlétében - sem biztosítható, az ilyen expressziós rendszer alkalmazási lehetősége korlátozott (például a promoter sokszorosítására alkalmazható). Nyilvánvaló, hogy ha a módosítások és/vagy az alkalmas szabályozószekvenciák rendelkezésre állnak és/vagy szakember számára kézenfekvők, az ilyen expressziós rendszerek szintén a találmány tárgyát képezik.

Míg a találmány szerinti expressziós vektorokkal szemben - egy adott gazdasejtben történő expresszióhoz szükséges jellemzőkön kívül - nincsenek speciális elvárások, beépített szelekciós tényezők jelenléte hasznos lehet. Az ilyen tényezők közé tartoznak azok, amelyek révén a plazmid a gazdasejt számára olyan tulajdonságokat biztosít, mint az expressziós szelektivitás és a transzformáció, amelyek következtében módosul a sejt fenotípusa.

Actinomycetes-gazázseit alkalmazása esetén egy előnyös transzformációs eljárás során az Actinomycetestenyészetet - lizozim alkalmazásával - szferoplasztokba foglaljuk, majd - a vektor gazdasejtekbe történő bevitele érdekében - rekombináns DNS-vektorokat és polietilénglikolt tartalmazó pufferoldatot adunk hozzájuk. Az ilyen transzformációt például Thompson vagy Hopwood eljárásának alkalmazásával végezzük [Thompson, C. J. és munkatársai: J. Bacteriol. 151, 668 (1982); Hopwood, D. A. és munkatársai: „Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual”, The John Innes Foundation, Norwich, Egyesült Királyság (1985)]. A transzformációs plazmidban szelektálható markerként gyakran tiostreptonrezisztencia-gént alkalmazunk [Hopwood, D. A. és munkatársai: Methods in Enzymology 153, 116 (1987), Academic Press, New York], de a találmány szerinti megoldás nem csupán erre korlátozódik.

Ha egy termék - találmány szerinti promoter irányítása alatti - expressziója érdekében E. colit kívánunk transzformálni, előnyösen alkalmazható az az általános eljárás, amely során a megfelelő rekombináns DNSvektort a kompetens sejtekhez adjuk. A kompetens sejteket rendszerint sók - például kalcium-klorid, magnézium-klorid és rubídium-klorid - jelenlétében állítjuk elő [Hanahan, D.: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)]. Egy másik eljárás az elektroporációt foglalja magában, melynek során az E. coli gazdasejtet és az expressziós vektort tartalmazó szuszpenziót nagyfeszültségű impulzusokkal kezeljük, miáltal a vektor a sejtekbe kerül [Dower, W. J. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 16, 6127 (1988); Calvin, N. M. és munkatársai: J. Bacteriol. 170, 2796 (1988)].

Az előnyös szelektálható (vagyis a gazdasejt adott fenotípusát eredményező) markerek közé tartoznak az olyan drogrezisztencia-markergének, amelyek ampicillinnel vagy tetraciklinnel szemben rezisztenciát biztosítanak. Az ilyen markereken kívül sok egyéb marker is alkalmazható, és az igényelt oltalmi kör - csakúgy, mint az összes többi konkrét kiviteli példa esetében nem korlátozódik csupán az itt említett markerekre.

Abban az esetben, ha gazdasejtként B. subtilist kívánunk alkalmazni, a transzformációhoz olyan eljárást kell alkalmazni, melynek során a gazdasejtekből - lizozim alkalmazásával - protoplasztokat állítunk elő. Ezt követően, a protoplasztokhoz - rekombináns DNS-vektorokat és polietilénglikolt tartalmazó - pufferoldatot adunk, és a vektort elektroporációval bevisszük a gazdasejtekbe [Cheng, S. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 168, 111 (1979)]. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a transzformált sejtvonal szelektálható markereként drogrezisztencia-markert (például klóramfenikolrezisztencia-markert) alkalmazunk, de nyilvánvaló, hogy számos egyéb szelektálható marker is alkalmazható.

A kívánt transzformánst - függetlenül a gazdasejttől - szakember számára kézenfekvő eljárások alkalmazásával (a tenyészetben intracellulárisan és/vagy extracellulárisan termelődő polipeptiddel együtt) tenyészthetjük. A tenyésztéshez az adott gazdasejtekhez alkalmas típusú tápközeget alkalmazhatunk. Általában azok a tenyésztési feltételek, amelyek az adott gazda esetében elfogadottak, a kívánt polipeptid expresszálásához is alkalmazhatók, például a polipeptid tulajdonságai miatt szükséges módosításokkal.

Az Actinomycetales rendbe tartozó gombák jellemző tápanyagai közé tartozik - szénhidrogénforrásként - a glükóz, szacharóz, keményítő, glicerin, keményítőszirup, melasz és szójababolaj. Nitrogénforrásként szójababpor, búzacsíra, húskivonat, pepton, gabonaszem-áztatólé („com steep liquor”), száraz élesztő és ammónium-szulfát alkalmazható. A fentieken kívül szervetlen sók, például nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-karbonát vagy -foszfát, valamint a mikroorganizmusok növekedését vagy a kívánt polipeptid termelődését elősegítő adalék anyagok - szükség szerinti kombinációban - szintén alkalmazhatók.

Még egyszer: a kérdéses gazdasejt számára általánosan alkalmas tenyésztési technikák a transzformált mikroorganizmus számára is alkalmasak. Az alkalmazható eljárások közé tartozik a folyadéktenyésztés és a mélytenyésztés, melyek nagyüzemi méretű termeléshez is alkalmasak.

A tenyésztést - hacsak másképpen nem jelezzük 20 °C és 37 °C közötti, előnyösen 26 °C és 28 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

A találmány szerinti promoter irányítása alatt expresszálódó termék rendszerint intracellulárisan vagy extracellulárisan - és esetenként mindkét módon - termelődik. A termék különböző, szakember számára jól

HU 223 206 Bl ismert eljárásokkal izolálható, tisztítható és nyerhető ki. Ilyen célra különösen azok az eljárások alkalmasak, amelyek a polipeptid fizikai vagy kémiai tulajdonságain alapulnak. Amennyiben a polipeptid extracellulárisan expresszálódik, izolálását, tisztítását és kinyerését

- a sejtek eltávolítása érdekében végzett - centrifugálással kapott felülúszókból végezzük.

A sejteken belül felhalmozódott polipeptid izolálása és tisztítása érdekében a sejteket először proteázinhibitort tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, majd - szakember számára ismert - eljárásokkal, például ultrahangos homogenizálóberendezés alkalmazásával homogenizáljuk.

A kívánt polipeptidek izolálására, tisztítására és összegyűjtésére alkalmazható eljárások közé tartozik a proteinkicsapás, ultrafiltrálás, molekulaszűrős kromatográfia (gélfiltráció), adszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, affinitáskromatográfia, a folyadékkromatográfia különböző típusai - beleértve a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) -, dialízis és ezek kombinációi.

Szakember számára kézenfekvő, hogy a találmány szerinti megoldás alkalmazásával a kívánt polipeptid nagyüzemi méretekben - nagy hozammal és nagy tisztasággal - könnyen előállítható.

Nyilvánvaló továbbá, hogy a találmány szerinti, transzformált gazdasejtek által termelt polipeptid aktivitásának vizsgálatára is van lehetőség. Az ilyen vizsgálathoz a polipeptid tisztítatlan vagy részlegesen tisztított mintáját alkalmazhatjuk. A P-450_sca_₂-citokróm a fentebb leírt eljárással nyerhető a Streptomyces lividansböl, és közvetlenül, például pravastatin nátriumsójának előállításához alkalmazható. A szükséges elektronszállító rendszer jelen van a S. lividans sejtekben, így viszonylag egyszerűen juthatunk olyan transzformált gazdamikroorganizmushoz, amely katalizálja az ML-236B nátriumsójának 6-os helyzetű hidroxilezését.

E megvalósítási mód szerint a promotert jellemzően a citokróm expresszálásának elősegítésére alkalmazzuk, s a termelődött citokróm később például pravastatin nátriumsójának előállítására alkalmazható. Az eljárással termelt bármely pravastatin nátriumsójának Serizawa és munkatársai eljárásával nyerhető ki [Serizawa, N. és munkatársai: J. Antibiotics 36, 608 (1983)].

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban bemutatott példákon keresztül mutatjuk be részletesebben. A példákat csak jellemzésként, és nem a találmány oltalmi körének korlátozásaként ismertetjük. A példákban említett valamennyi, közelebbről meg nem határozott eljárás, készítmény, oldat stb. leírása megtalálható: Maniatis, T. és munkatársai: „Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). A kísérletek során

- hacsak másképpen nem jelezzük - vizes oldatokat alkalmaztunk.

A példákban az 1-5. ábrákra vonatkozó hivatkozások találhatók. A következőkben röviden ismertetjük az ábrák tartalmát.

Az 1. ábrán a pSCA1013-Á(1013/428)-plazmid (amely a P-450_sca_₂-gén 5’-nemkódoló régióját tartalmazza) kialakításának menetét mutatjuk be.

A 2. ábrán a találmány szerinti - a 450_sca_₂-gén 5’-nemkódoló régiójának 3’-végéből származó - 320 bp-os, 158 bp-os, 101 bp-os és 74 bp-os promotereket tartalmazó plazmidok [pSCA1013A(1013/320), pSCA1013-Á(1013/158), pSCA1013-A(1013/101), illetve pSCA1013-A(1013/74)] kialakításának menetét mutatjuk be.

A 3. ábrán az 1. ábrán bemutatott módon előállított pSCA1013-A(1013/428)-plazmid restrikciós térképét mutatjuk be.

A 4. ábrán - a P-450_sca_₂-gént az 1 kb-os 5’-promoterrel együtt tartalmazó - pSCAlOlplazmid restrikciós térképét mutatjuk be.

Az 5. ábrán az 1 kb-os 5’-promotert és az P-450_sca_₂ nyitott leolvasási keretet tartalmazó pSCA205-plazmid kialakításának menetét mutatjuk be.

A példákban bemutatjuk, hogy a találmány szerinti promoter alkalmazásával - gazdamikroorganizmusban - kívánt polipeptidet állíthatunk elő.

7. példa

A P-450_sca__rpromoter izolálása és a P-450_sca_₂citokróm expresszálására alkalmas plazmidvektor előállítása (1-1) A pSCAlOl- éspSCA108-plazmid előállítása

A pSCAlOl- és pSCA108-plazmidot - a Streptomyces carbophilus genomiális DNS-éből származó, P^SO^-j-gént és -promotert tartalmazó - különböző fragmensek - Watanabe és munkatársai által leírt [Watanabe, I. és munkatársai: Gene 163, 81 (1995); és Hei 6-70780 („Kukái”) számú japán szabadalmi irat] klónozásával állítottuk elő. A 4. ábrán a pSCAlOl-plazmid térképe látható. A plazmid előállítása során a Streptomyces carbophilus genomiális DNS-éből származó, 1,7 kb-os PvuII-fragmenst a pBR322-plazmid (Takara Shuzo Ltd. Japán) PvuII-helyére ligáltuk. Ez az 1,7 kbos fragmens a P-450_sca^₂-gén 5’-promoterének teljes egészét, valamint a gén 5’-végét kitevő DNS-t tartalmazza. A pSCA108-plazmid előállítása céljából a Streptomyces carbophilus genomiális DNS-éből származó, 2,0 kb-os Sacl-fragmenst a pUC18-plazmid (Takara Shuzo Ltd., Japán) Sacl-helyére ligáltuk. Ez a 2,0 kb-os fragmens a P-450_sca_ ₂-gén teljes kódolórégióját tartalmazza.

A fenti eljárások részleteit a következőkben újuk le. (1-2) A pSCA106-plazmid előállítása °C-on három órán át, 100 egység PvuII alkalmazásával, 10 pg pSCAlOl-DNS-t emésztettünk. Az emésztést az enzimmel kiegészített restrikciós pufferben - közelebbről, H-pufferben (Takara Shuzo Ltd., Japán) - végeztük. Ebben és a következő példákban, amelyekben restrikciós enzimeket alkalmazunk, ha az enzim forrását és/vagy a puffért nem adjuk meg, úgy az enzimet a Takara Shuzo Ltd.-tői szereztük be, és a forgalmazó útmutatásai szerint alkalmaztuk, pufferként pe11

HU 223 206 Bl dig Η-, K- vagy L-puffert alkalmaztunk, melyet szintén a Takara Shuzo Ltd. forgalmaz.

Az emésztési reakció termékeit 1 vegyes%-os agarózgélen, agarózgél-elektroforézissel választottuk el, melynek során az agarózgélt - 90 mM Tris-HCl-puffert, 90 mM bórsavat és 2,5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) (pH=8,3) tartalmazó - „submarine” típusú elektroforizálótartályba helyeztük, és az elektroforézist 100 V feszültséggel három órán át végeztük.

Az elektroforézis után a gélt - a DNS megfestése érdekében - etídium-bromid vizes oldatában (0,5 pg/ml) 20 percig kevertük. A megfelelő 1,7 kb-os fragmenst tartalmazó gélszeletet borotvapengével kivágtuk a gélből (a megfestett DNS-fragmensek azonosítására hosszúhullámú UV-sugárzást alkalmaztunk). A kivágott, 1,7 kb-os fragmenst dializálócsőbe (átengedési határ: 12 000-14 000 D; Gibco) tettük, a csövet lezártuk, majd - 90 mM Tris-HCl-puffert (pH=8,3), 90 mM bórsavat és 2,5 mM EDTA-t tartalmazó - „submarine” típusú elektroforizálótartályba helyeztük.

A DNS-fragmenst 100 V feszültséggel, két óra alatt kimostuk az agarózgélszeletből. A dializálócsőben kapott oldatot fenol és kloroform 50:50 térfogatarányú elegyével kezeltük, hogy a szennyező proteineket kivonjuk a szerves fázisba. Ez az eljárás szakember számára ismert. A DNS-t ezután - hagyományos etanolos kicsapással - kinyertük a vizes fázisból, és csökkentett nyomáson szárítottuk [Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, ld. fentebb]. A DNS agarózgélből történő kinyerésének fentebb leírt eljárását nevezzük „kivágásnak”.

°C-on 3 órán át - 10 egység Smal restrikciós enzimmel - 10 pgpUC119-DNS-t (Takara Shuzo) emésztettünk. Az emésztett DNS-t fenol/kloroform 50:50 térfogatarányú elegyével (a továbbiakban fenol/kloroform elegy) kezeltük, majd a fentebb leírtakhoz hasonlóan, etanolos kicsapással kinyertük, és az így kapott DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk.

A linearizált plazmid hasított végeit 4 egység alkalikus foszfatáz (Toyobo) alkalmazásával defoszforiláltuk. A defoszforilálási reakciót 200 pl TE-pufferben (desztillált vízben 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH=8,0) 37 °C-on 30 percig végeztük. Ezután az oldatot fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a defoszforilált DNS-t kinyertük a vizes fázisból, és csökkentett nyomáson szárítottuk.

A fentebb kapott, 1,7 kb-os PvuII-fragmens 50 pgját - 1800 egység T4-DNS-ligázt tartalmazó 50 pl ligázpufferben (6,6 mM magnézium-klorid, 10 mM ditio-treitol, 0,1 mM ATP és 66 mM Tris-HCl; pH=7,6) - a pUC119-DNS defoszforilált Smal-fragmensének 100 ng-jához adtuk, és a ligálási reakciót két órán keresztül végeztük. A kompetens E. coli HB101törzs sejtjeit Hanahan eljárásával [Hanahan, D. : J. Mól. Bioi. 166, 557 (1980)] a ligálási reakcióelegy egy részével transzformáltuk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-tápközegben (desztillált vízben 10 g/1 tripton, 5 g/1 élesztőkivonat és 5 g/1 nátrium-klorid) növesztettük.

Az L-tápközegben növesztett sejteket 37 °C-on szilárd L-táptalajra szélesztettük, és ampicillinrezisztens telepeket szelektáltunk. Az így kiválasztott telepeket Ltáptalajon tovább szaporítottuk, és meghatározott számú transzformánsból plazmid-DNS-t készítettünk. Az egyes transzformánsokból származó plazmid-DNS-eket megfelelő restrikciós enzimekkel emésztettük, és a kapott DNS-eket agarózgél-elektroforézissel vizsgáltuk, hogy azonosítsuk a várt plazmidot tartalmazó transzformánst. Az így előállított plazmidot pSCAl 06-nak neveztük el.

(1-3) A pSCAl 11 -plazmid előállítása

A pSCAl 11-plazmid a P-450_sca_₂-gén - pSCAlOóplazmidból származó - 5’-promoterrégióját a (pSCA108-plazmidból származó P-450_sca_₂ strukturális génhez ligáivá) tartalmazza. A plazmidot a következő eljárás szerint állítottuk elő.

A fentebb kapott pSCA108-DNS 10 pg-ját - a reagenskészlet (Takara Shuzo) részét képező pufferben 37 °C-on öt óra hosszat 100 egység Sacl-gyel emésztettük. A kapott emésztési termékeket 1 vegyes%-os agarózgélen végzett elektroforézissel elválasztottuk, és a gélből egy 2,0 kb-os Sacl-fragmenst vágtunk ki.

Ugyanakkor, a fentebb leírtak szerint kapott pSCA106-DNS 10 pg-ját - a reagenskészlet (Takara Shuzo) részét képező pufferben - 37 °C-on öt óra hosszat 100 egység Sacl-gyel emésztettük. A kapott emésztési termékeket 1 vegyes%-os agarózgélen végzett elektroforézissel elválasztottuk, és a gélből egy kb-os Sacl-fragmenst vágtunk ki.

Az így kapott, 4 kb-os Sacl-fragmens végeit az (1-2) részben leírtakhoz hasonló módon defoszforiláltuk. A defoszforilálás után az oldatot fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t etanolos kicsapással kinyertük a vizes fázisból, és csökkentett nyomáson szárítottuk.

A defoszforilált 4 kb-os Sacl-fragmens 100 ng-ját és a pSCA108-DNS-ből kapott - a P-450_sca_₂ strukturális gént tartalmazó - 2,0 kb-os Sacl-fragmens 50 ngját 1800 egység T4-DNS-ligázt tartalmazó ligázpufferben 5 pl végtérfogatban elegyítettük, és a ligálási reakciót 16 °C-on két óra hosszat végeztük. A kompetens E. coli HBlOl-törzs sejtjeit - az (1-2) részben leírtak szerint - a ligálási reakcióelegy egy részével transzformáltuk, miáltal a pSCAl 11-plazmidot kaptuk.

(1-4) A pSCA212-plazmid előállítása

Az előző részben kapott pSCAl 11-DNS 10 pg-ját 37 °C-on, 3 óra hosszat 100 egység Xbal-gyel és Pstlgyel emésztettük. Az emésztett DNS-t fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a vizes fázisból a DNS-t etanolos kicsapással kinyertük, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

Ezután a pSCAl 11-plazmidban lévő P-450_sca_₂géntől 5’-irányban lévő régiót - Henikoff leírása szerint [ld. Henikoff, S.: Gene 28, 351 (1984)] - 5’->3’ irányban, delécióval eltávolítottuk. A szárított pSCAl 11DNS 10 pg-jához 100 pl exonukleázpufferben (desztillált vízben 50 mM Tris-HCl, 5 mM magnézium-klorid, 10 mM 2-merkapto-etanol; pH=8,0) 200 egység exonukleáz-III-at (Takara Shuzo) adtunk, és a reakciót 37 °C-on 5 percig végeztük. Ezután a reakciót 65 °C-on perces melegítéssel leállítottuk, és a reakcióelegyet fenol/kloroform eleggyel kezeltük. A DNS-t a vizes fázis12

HU 223 206 Bl ból etanolos kicsapással nyertük ki, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A szárított DNS-t - 100 mM nátrium-kloridot, 1 mM cink-acetátot és 5 térfogat% glicerint tartalmazó 40 μΐ 30 mM acetátpufferben (pH=5,0), 37 °C-on 30 percig 50 egység ,jnung bean” nukleázzal (Takara Shuzo) kezeltük. A reakcióelegyet ismét fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t a vizes fázisból etanolos kicsapással kinyertük, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A kicsapott DNS-t 10 μΐ T4-DNS-polimeráz-pufferben [vízben 33 mM Tris-HCl, 66 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát, 0,5 mM ditio-treitol, 0,1 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumin (Takara Shuzo); pH=7,9] 37 °C-on 5 percig 5 egység T4-DNSpolimerázzal (Takara Shuzo) kezeltük. Az így kezelt DNS-t fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a vizes fázisból etanolos kicsapással kinyertük, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A „mung bean” nukleázzal és a T4-DNS-polimerázzal végzett kezelés kombinációja biztosította, hogy a DNS-fragmens ne tartalmazzon 5’ vagy 3’ ragadós végeket.

A DNS-t ezután 400 μΐ végtérfogatú alkalikus foszfatáz pufferben (desztillált vízben 50 mM Tris-HCl, 1 mM magnézium-klorid; pH=9,0), 37 °C-on 30 percig 10 egység alkalikus foszfatázzal kezeltük. A reakcióterméket fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t etanolos kicsapással kinyertük, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A kapott DNS-t - 1800 T4-DNS-ligázt tartalmazó - ligázpufferben, 50 μΐ végtérfogatban, 100 ng foszforilált Xbal-kapcsolószekvenciával („linker”) (Takara Shuzo) elegyítettük, és a ligálást 16 °C-on két órán át végeztük. Kompetens E. coli HBlOl-törzs sejtjeit - az (1-2) részben leírtakhoz hasonlóan - a ligálási reakcióelegy egy részével transzformáltuk, és a pSCA212plazmidot kaptuk.

(1-5) A pSCA301-plazmid előállítása

A sokkópiás pIJ702-plazmid [Katz, E. és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 129, 2703 (1983)] 10 pg-ját 37 °C-on 3 óra hosszat H-pufferben 100 egység Saclgyel és 100 egység SphI-gyel emésztettük. Az emésztési termékeket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, és az 5,4 kb-os sávnak megfelelő DNS-fragmenst kivágtuk a gélből.

A klónozási eljárás részeként - belső HindlII- és EcoRI-helyet tartalmazó - kétszálú oligonukleotidot kellett készíteni, amely SacI- és SphI-helyre történő ligáláshoz megfelelő véget tartalmaz. Ilyen kétszálú oligonukleotidot az alábbi két egyszálú oligonukleotid hibridizálásával állítottunk elő. Mindkét oligonukleotidot a foszforamidites eljárással szintetizáltuk, amihez DNSszintetizáló készüléket (,,Model 380”, Applied Biosystems) alkalmaztunk [Beaucage, S. L. és munkatársai: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)]. Az egyszálú oligonukleotidok szekvenciája a következő volt:

1. azonosító számú szekvencia: 5’-GATCTAAGCTTGAATCGCATG-3’

2. azonosító számú szekvencia: 5’-CGAATTCAAGCTTA-3’

A két oligonukleotid 14-14 pmol-ját TE-pufferben, 400 μΐ végtérfogatban elegyítettük. Az elegyet 5 percig 100 °C-on melegítettük, majd fokozatosan 25 °C-ra hűtöttük. A kétszálú oligonukleotid a két komplementer, egyszálú oligonukleotidból képződött.

Az így kapott kétszálú oligonukleotid 100 ng-ját 1800 egység T4-DNS-ligázt tartalmazó ligázpufferben, 100 μΐ végtérfogatban - az előzetesen Sacl-gyel és SphI-gyel emésztett - pIJ702-plazmid 5,4 kb-os fragmensének 1 pg-jával elegyítettük, és a ligálási reakciót 16 °C-on két óra hosszat végeztük. A ligálási reakcióelegy egy részét Streptomyces lividans TK21-törzsből készített szferoplasztokba transzformáltuk. A kapott transzformánsokat - a plazmidot tartalmazó sejtek szelektálása érdekében - tiostrepton jelenlétében tenyésztettük. A Streptomyces lividans TK21-törzs alkalmazásával végzett eljárást az alábbi 1. eljárásban ismertetjük. A tiostreptonrezisztens transzformánsokból - az alábbi 2. eljárás szerint - plazmid-DNS-t izoláltunk.

I. eljárás

A Streptomyces lividans TK21-törzs transzformálása

A Streptomyces lividans TK21-törzs transzformálását Thompson eljárása szerint végeztük [Thompson, C.

J. és munkatársai: J. Bacteriol. 151, 668 (1982)]. Az alkalmazott oldatok összetételét az eljárás leírásának végén adjuk meg.

Streptomyces lividans TK21-törzs szélesztett tenyészetét [Hopwood, D. A. és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 129, 2257 (1983)] 20 ml folyékony GPYY-tápközegbe oltottuk, és percenként 120-as fordulattal rázatva, 28 °C-on három napig tenyésztettük. Ezután a folyékony előtenyésztő tápközegben lévő sejteket Teflon®homogenizátor alkalmazásával újraszuszpendáltuk, és a folyékony tápközeg 5 ml-ét 110 ml S-GGCY-tápközeggel hígítottuk, majd a sejteket további 24 óra hosszat, 28 °C-on - percenként 120-as fordulatszámmal végzett rázatás mellett - Sakaguchi-lombikban növesztettük. Ezután a sejteket (4 °C-on, 1600 χ g-vel, tíz percig végzett) centrifugálással betakarítottuk. A kapott üledéket P-pufferrel mostuk, majd ismét centrifugáltuk (4 °C-on, 1600 χ g-vel, tíz percig), és a kapott üledéket kétszer mostuk.

A mosott sejtüledék 1 g-ját 10 ml P-pufferben újraszuszpendáltuk, majd a sejtszuszpenzióhoz azonos térfogatú - 20 mg/ml lizozimot tartalmazó - P-puffert adtunk, és az egészet 30 °C-on, óvatos rázatással (120 rpm) 1,5 órán át tenyésztettük, miáltal Streptomyces lividans TK21-szferoplasztok képződtek.

A szferoplasztok szuszpenzióját kétszer leszűrtük (mindegyik alkalommal nyolc gézdarabon keresztül), majd 4 °C-on 1600 χ g-vel tíz percig centrifugáltuk. A szferoplasztüledéket a fentiek szerint, P-pufferrel kétszer mostuk, és 4 °C-on 1600 χ g-vel tíz percig végzett centrifugálással betakarítottuk. Az üledéket 0,8 ml Ppufferben újraszuszpendáltuk, és jégen állni hagytuk. Ezután a ligálási reakcióelegy 20 μΐ-ét a szferoplasztszuszpenzió 100 μΐ-hez adtuk, a szuszpenziót további két percre jégre tettük, majd - 20 vegyes% polietilénglikol-1540-et tartalmazó - 500 μΐ P-puffert adtunk hozzá. A szuszpenziót újabb két percig jégen állni hagy13

HU 223 206 Bl tűk, majd 5 ml P-puffert adtunk hozzá. Az így kapott szuszpenzió 100 μΐ-ét óvatosan - 2 vegyes% bactoagart tartalmazó - 10 ml regeneráló táptalajlemezre rétegeztük, és a sejteket ezen a szilárd tápközegen, 28 °C-on, hozzávetőleg 20 óra hosszat növesztettük. 0,7 vegyes% bactoagart és 75 pg/ml tiostreptont tartalmazó 5 ml folyékony regeneráló tápközeget 45 °C-ra melegítettünk, és az agarlemezre öntöttük. A lemezt 28 °C-on inkubáltuk, és 3-5 nap múlva tiostreptonrezisztens törzset izoláltunk.

A transzformációs eljárásban alkalmazott tápközegek és pufferek összetétele a következő volt (oldószerként valamennyi esetben desztillált vizet alkalmaztunk), a) GPY-tápközeg

Glükóz	20 g/1
Polipepton	10 g/1
Élesztőkivonat	1 g/1
(pH=7,0-7,2)
b) S-GGCY-tápközeg
„A” oldat: Szacharóz	340 g/1
Glicerin	4 g/1
Glicin	ig/1
Casaminosav	4 g/1
Élesztőkivonat	lg/1
MgSO4-heptahidrát	lg/1
CaCl2-dihidrát	0,1 g/1
Nyomfémsóoldate>	4 ml/1
„B” oldat: KH2PO4	20 g/1
K2HPO4-dodekahidrát	80 g/1
Az „A” és „B” oldatot külön-külön sterilizáltuk, és
az „A” oldat 100 ml-ét 10 ml „B” oldattal elegyítettük.
c) P-puffer
Szacharóz	102 g/1
k2so4	0,248 g/1
MgCl2-hexahidrát	2,00 g/1
Nyomfémsóoldat15)	1,98 ml/1
KH2PO4	49,5 g/1
CaCl2-hidrát	3,64 g/1
TES (pH=7,2)	5,67 g/1
c) Regeneráló tápközeg:
Szacharóz	100 g/1
Glükóz	9,69 g/1
Casaminosav	96,9 mg/1
Élesztőkivonat	1,94 g/1
Malátakivonat	4,84 g/1
Kálium-szulfát	243 mg/1
MgCl2-hexahidrát	9,84 g/1
KH2PO4	48,4 mg/1
CaCl2-dihidrát	2,85 g/1
TES (pH=7,2)	5,56 g/1
Nyomfémsóoldatri	1,94 ml/1
NaOH	0,00484 N
L-prolin	2,91 g/1
DL-norleucin	48,4 mg/1
L-tirozin	0,969 g/1
e) Nyomfémsóoldat
Cink-klorid	40 mg/1
F e(II)Cl2-hexahidrát	200 mg/1
Cu(III)Cl3-dihidrát	10 mg/1
Mn(II)Cl2-tetrahidrát	10 mg/1

Nátrium-borát-dekahidrát 10 mg/1

Ammónium-molibdát-tetrahidrát 10 mg/1

2. eljárás

Plazmid-DNS előállítása Actinomycesből

Az 1. eljárásban kapott, tiostreptonrezisztens törzset rázatóinkubátorban (Tokyo Dennetsu Keiso Co. Ltd., Japán) percenként 200-as fordulatszámmal, három napig 28 °C-on - 25 pg/ml tiostreptont tartalmazó

- 100 ml GPY-tápközegben növesztettük. Ezután a tenyésztő tápközegben lévő sejteket - 4 °C-on 4000 xgvel 10 percig végzett centrifügálással - leülepítettük. A kapott üledéket - 10 mg/ml lizozimot (Sigma), 50 mM glükózt és 10 mM EDTA-t tartalmazó - 4 ml 25 mM Tris-HCl-pufferben (pH=8,0) újraszuszpendáltuk, és 30 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk. Ezután a sejtszuszpenziót - 0,2 M nátrium-hidroxidot tartalmazó - 8 ml 1 vegyes%-os nátrium-dodecil-szulfát-oldattal elegyítettük. A kapott elegyet megkevertük, és 10 percig jégen állni hagytuk. Az elegyhez ezután 3 M nátrium-acetát (pH=4,8) 6 ml vizes oldatát adtuk, elkevertük, majd 4 °C-on 15 percig 11 000 xg-vei centrifugáltuk.

A kapott felülúszót teljes egészében - előzetesen 10 ml adszorpciós pufferrel [vízben 50 mM 3-(N-morfolino)-propánszulfonsav („MOPS”); 750 mM nátrium-klorid; 15 térfogat% etanol; 0,15 térfogat% Triton-X-100 (pH=7,0)] ekvilibrált - „Qiagen chips 500” oszlopra (Funakoshi) töltöttük. Az oszlopot ezután 30 ml mosópufferrel mostuk [vízben 50 mM MOPS, 1 M nátrium-klorid, 15 térfogat% etanol (pH=7,0)], majd a plazmid-DNS-t 15 ml eluálópufferrel [vízben 50 mM Tris-HCl, 1,25 mM nátrium-klorid, 15 térfogat% etanol (pH=8,5)] eluáltuk.

A kapott eluátumhoz 10,5 ml izopropanolt adtunk, és ezt az elegyet 4 °C-on, 11 000 χ g-vel 15 percig centrifugáltuk, hogy kicsapjuk a DNS-t. A kicsapott DNS-t 400 μΐ ΤΕ-pufferben újraszuszpendáltuk, amihez később - a szennyező RNS eltávolítása érdekében - 5 μΐ 2 mg/ml koncentrációjú ribonukleáz-A-oldatot (Sigma) adtunk (a reakciót 37 °C-on 30 percig végeztük). Ezt követően a DNS-t fenol/kloroform eleggyel kezeltük, és a vizes fázis etanolos kezelésével kicsaptuk. A kicsapódott plazmid-DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk. (1-6) A pSCA1013-A(1013/428)-plazmid előállítása

Az (1-5) részben kapott pSCA301-DNS 10 pg-ját

- H-pufferben, 37 °C-on három órán át - 100 egység EcoRI-gyel és 100 egység Hindlll-mal emésztettük. Az emésztett terméket fenol/kloroform eleggyel kezeltük, és a DNS-t etanolos kicsapással vontuk ki a vizes fázisból. A kicsapott DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk.

Ezzel párhuzamosan, a pSCA212-DNS 10 pg-ját H-pufferben, 37 °C-on három órán át - 100 egység EcoRI-gyel és 100 egység Hindlll-mal emésztettük. Az emésztett termékeket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, és a - P-450_sca_₂-citokrómot kódoló gént tartalmazó - 2,2 kb-os DNS-fragmenst kivágtuk a gélből.

A 2,2 kb-os pSCA212-DNS-fragmens 200 ng-ját

- 1800 egység T4-DNS-ligázt tartalmazó - 100 pl ligázpufferben apSCA301-DNS EcoRI-HindlII-fragmensének 100 ng-jához adtuk, és a ligálást 16 °C-on két óra

HU 223 206 Bl hosszat végeztük. Ezután a ligálási reakcióból származó DNS-t - az 1. eljárásban leírtak szerint - Streptomyces lividans sejtekbe transzformáltuk, és az így kapott, tiostreptonrezisztens Streptomyces lividans törzset SANK-62795-nek neveztük el. Ebből a törzsből a 2. eljárásban leírtak szerint plazmid-DNS-t nyertünk ki, és a plazmidot pSCA1013-A(1013/428)-nak neveztük el.

Az e pontban leírt eljárás lépéseit az 1. ábrán mutatjuk be. A kapott plazmid térképe a 3. ábrán látható. A pSCA1013-Á(1013/428)-plazmid Actinomyces fajokban képes replikálódni. Ez a plazmid a P-450_sca,₂-citokróm génje 5’-promoterének hozzávetőleg 0,4 kb-os szakaszát tartalmazza, és magában foglalja a teljes P-450_sca_₂-kódolószekvenciát.

(1-7) A pSCA205-plazmid előállítása

Az (1-3) pontban kapott pSCAl 11-plazmid 10 pg-ját - H-pufferben, 37 °C-on öt óra hosszat - HindlII-mal kezeltük, majd a reakcióelegyhez fenol/kloroform elegyet adtunk, a DNS-t etanollal kicsaptuk, és a kicsapott DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk. A pSCAlllplazmid HindlII-végeit „DNA blunting kit” reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával tompa végűvé alakítottuk. A tompa végű fragmenseket fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t etanollal kicsaptuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A kapott DNS-t 200 μΐ ΤΕ-pufferben feloldottuk, és az oldathoz 4 egység alkalikus foszfatázt (Toyobo) adtunk. A reakcióelegyet - a tompa végek defoszforilálása érdekében - 37 °C-on 30 percig inkubáltuk. A defoszforilált fragmenst fenol/kloroform eleggyel kezeltük, etanolos kicsapással kinyertük, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A defoszforilált, tompa végű pSCAlll-DNS 100 ngjához 16,5 ng Sacl-kapcsolószekvenciát adtunk, és a fragmenst DNS-ligáló reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával gyűrűvé zártuk, miáltal a pSCA112-plazmidot kaptuk, amelyben a pSCAlll HindlII-helyét Saclhely helyettesíti (ld. 5. ábra).

A pSCA112-plazmidból a - strukturális P-450_sca_₂-gént és promoterét tartalmazó - 2,8 kb-os Sacl-fragmens kinyerése érdekében a pSCA112-plazmidot részlegesen Sacl-gyel emésztettük, a következők szerint. 22,1 pg pSCA112-plazmidot - L-pufferben, 37 °C-on, 22 óra hosszat - 1250 egység Sacl-gyel kezeltük. A kapott fragmenseket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, és a gélből kivágtunk egy 2,8 kb-os fragmenst, melyet dializálócsőbe helyeztünk, és 150 V feszültséggel, 1,5 óra hosszat 1 χΤΒΕ-pufferrel szemben dializáltuk, miáltal a 2,8 kb-os Sacl-fragmenst kaptuk. A Sacl-fragmenst tartalmazó oldatot fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t etanollal kicsaptuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A kapott DNS egészét - 1 g/ml cézium-kloridot tartalmazó - TE-pufferben feloldottuk, majd az oldathoz (0,1 mg/ml végkoncentrációban) etidium-bromidot adtunk. Az így kapott oldatot - a 2,8 kb-os Sacl-fragmens izolálása érdekében - 15 °C-on, két órán át, percenként 120 000-es fordulattal (650 000 xg) centrifugáltuk. A kapott üledéket - nátrium-kloriddal telített és 50 mM Tris-HCl-puffert (pH=8,0) tartalmazó - izopropanollal háromszor extraháltuk, hogy eltávolítsuk az etídium-bromidot. A mosás után, 4 °C-on egy éjszakán át TE-pufferrel dialízist végeztünk. A kapott frakciót etanollal kicsaptuk, majd 70 térfogat%-os etanollal mostuk és csökkentett nyomáson szárítottuk, miáltal a részlegesen tisztított, 2,8 kb-os Sacl-fragmens 76 pg-ját kaptuk.

Ez a részlegesen tisztított Sacl-fragmens szennyezésként - a pUC119-plazmidból származó - 3,2 kb-os DNS-fragmenst tartalmazott, melynek eltávolítása céljából a részlegesen tisztított Sacl-fragmens 75 pg-ját K-pufferben, 37 °C-on 12 óra hosszat - 205 egység Pvul-gyel kezeltük. A reakcióterméket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, miáltal a 2,8 kb-os Saclfragmenst kaptuk. A gél kivágott fragmensét a fentiek szerint - de csak egy órán át - dializáltuk. A dializált oldatot fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t kicsaptuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk.

A szárított DNS-t - 1 g/ml cézium-kloridot tartalmazó - 2 ml TE-pufferben oldottuk, majd (0,1 mg/ml végkoncentrációban) etidium-bromidot adtunk hozzá. A reakcióelegyet - a 2,8 kb-os Sacl-fragmens izolálása érdekében - 15 °C-on, percenként 120 000-es fordulatszámmal (650 000xg) két óra hosszat centrifugáltuk. Az izolátumot - nátrium-kloriddal telített és 50 mM Tris-HCl-puffert (pH=8,0) tartalmazó - izopropanollal háromszor extraháltuk, hogy eltávolítsuk az etidiumbromidot. A mosás után a fragmenst 4 °C-on egy éjszakán át TE-pufferrel dializáltuk. A dializált DNS-t etanollal kicsaptuk, majd 70 térfogat%-os etanollal mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított DNS-t 20 pl TE-pufferben feloldottuk. Végeredményként 9,8 pg (a strukturális P-450_sca_₂-gént és promoterét tartalmazó) 2,8 kb-os Sacl-fragmenst kaptunk.

Ezzel párhuzamosan, 200 pg pIJ702-plazmidot L-pufferben, 37 °C-on, 20 órán át - 300 egység Saclgyel kezeltünk. Az oldatot fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, a vizes fázist - a DNS kicsapása érdekében etanollal kezeltük, és a kicsapott DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított DNS-t 800 pl TE-pufferben feloldottuk, majd 80 egység alkalikus foszfatázt adtunk hozzá, és az oldatot 30 percig 37 °C-on tartottuk. Ezután az oldatot ismét fenol/kloroform eleggyel extraháltuk, a vizes fázist - a DNS kicsapása érdekében - etanollal kezeltük, és a kicsapott DNS-t csökkentett nyomáson szárítottuk. A szárított DNS-t - 1 g/ml cézium-kloridot tartalmazó - 2 ml TE-pufferben oldottuk, majd (0,1 mg/ml végkoncentrációban) etídium-bromidot adtunk hozzá. A kapott oldatot - a Sacl-gyel kezelt pIJ702-DNS izolálása érdekében - 15 °C-on, percenként 120 000-es fordulatszámmal (650 000xg) két óra hosszat centrifugáltuk.

A kapott üledéket - nátrium-kloriddal telített és 50 mM Tris-HCl-puffert (pH=8,0) tartalmazó - izopropanollal háromszor extraháltuk, hogy eltávolítsuk az etídium-bromidot. A fragmenst ezután 4 °C-on egy éjszakán át TE-pufferrel dializáltuk. A dializált DNS-t etanollal kicsaptuk, majd 70 térfogat%-os etanollal mostuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk. Ezzel az eljárással 37 pg - Sacl-gyel és alkalikus foszfatázzal kezelt - pIJ702-DNS-t kaptunk.

HU 223 206 ΒΙ

A pSCA112-plazmidból előállított 2,8 kb-os Saclffagmenst TE-pufferben a Sacl-gyel és alkalikus foszfatázzal kezelt pIJ702-fragmenshez adtuk. A két fragmenst DNS-ligáló reagenskészlet (Takara Shuzo) alkalmazásával ligáltuk. A kapott plazmiddal Streptomyces lividans TK21-törzset transzformáltunk, és a transzformánsokból a plazmidot Hopwood eljárásával [Hopwood és munkatársai: „Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual” John Innes Institute, Norwich (1985)] tisztítottuk. A kapott plazmidot pSCA205-nek neveztük el.

2. példa

Nukleotidszekvenálás

Az 1. példában kapott plazmid-DNS-t - Zhang eljárásával [Zhang, H. és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 16, 1220] végzett - lúgos denaturációval készítettük elő a szekvenálásra. A denaturáláshoz 5 pg plazmidDNS-t - 0,2 mM EDTA-t és 0,2 M nátrium-hidroxidot tartalmazó - 20 pl 10 mM Tris-Cl-pufferben (pH=8,0) 37 °C-on öt percig inkubáltunk. A DNS-t az oldatból etanolos kicsapással nyertük ki. A kicsapott DNS-t 70 térfogat%-os etanollal mostuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk. A kapott DNS-t a nukleotidszekvenáláshoz templátként használtuk.

A DNS-szekvenálást a „7-dazasequenase kit, version 2.0” reagenskészlet (Toyobo) alkalmazásával végeztük. Az eredmények azt mutatják, hogy a P-450_sca_₂citokróm-gén - pSCA1013-A(1013/428)-plazmidban lévő - 5’-régiója 428 bp hosszúságú. Ezt a szekvenciát a szekvencialista 1. azonosító számú szekvenciájaként (1 -428. nukleotid) mutatjuk be.

3. példa

A pravastatin nátriumsójának előállítása és mérése

A Streptomyces lividans SANK-62795-törzs, S. lividans TK21/pSCA205-törzs és a S. lividans TK21törzs egy telepét szilárd táptalajról, külön-külön 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba oltottuk {a lombikok mindegyike - 20 pg/ml tiostreptont tartalmazó 100 ml élesztőkivonatot [desztillált vízben 2 vegyes% glükóz, 1 vegyes% pepton, 0,1 vegyes% élesztőkivonat (Difco); pH=7,0] tartalmazott}. A tenyészeteket - percenként 200-as fordulatszámmal végzett rázatás mellett - 28 °C-on három napig növesztettük. Az egyes tenyésztő tápközegek 5 ml-ét külön-külön - 20 pg/ml tiostreptont tartalmazó - 100 ml élesztőkivonathoz adtuk, és (percenként 200-as fordulatszámmal végzett rázatás mellett) 28 °C-on 24 órás tenyésztést végeztünk. A tenyészethez ezután 500 pg/ml végkoncentrációban ML236B-nátriumsót adtunk [Endo, A. és munkatársai: J. Antibiotics 29, 1346 (1976); Serizawa, N. és munkatársai: J. Antibiotics 36(7), 887 (1983)], és a tenyésztést (percenként 200-as fordulatszámmal végzett rázatás mellett) 28 °C-on négy órán át folytattuk. A tenyésztés befejezése után a folyadéktenyészetek egy-egy részét kivettük, és vizsgáltuk a pravastatin nátriumsójának termelődését. Mindegyik mintát nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával analizáltuk, a következő működési feltételekkel:

Oszlop: „Radial pack cartridge C18” (Waters);

Oldószer : 30 térfogat% acetonitrilt és 0,1 térfogat% trietil-amint tartalmazó 0,1 vegyes%-os foszfátpuffer (pH=3,2);

Átfolyási sebesség: 1 ml/perc;

Detektálási hullámhossz : 237 nm;

A pravastatin nátriumsójának retencióideje: 11,9 perc.

A kromatográfiát - a fenti feltételekkel - a pravastatin ismert mennyiségű nátriumsóját tartalmazó mintával is elvégeztük, hogy standard adatokat kapjunk [Serizaqa, N. és munkatársai: J. Antibiotics 36, 608 (1983)]. A különböző S. lividans törzsek által termelt pravastatin-nátriumsó mennyiségének kiszámításához a kimutatási görbe pravastatincsúcsának területét összehasonlítottuk az ismert mennyiségű pravastatinstandard pravastatincsúcsának területével.

A Streptomyces lividans SANK-62795-törzs 51 pg/ml pravastatin-nátriumsót, a 5. lividans TK21/pSCA205-törzs pedig 11 pg/ml pravastatin-nátriumsót termelt, a Streptomyces lividans TK21-törzs azonban nem termelt detektálható pravastatin-nátriumsót. Ez az eredmény egyértelműen bizonyítja a találmány szerinti promoterek alkalmazásának előnyét.

4. példa

A pSCA1013-A(1013/320)-, pSCA1013S(l 013/158)-, pSCA1013-A(1013/101)- és pSCA1013-A(l 013/74)-plazmid előállítása A P-450_sca_₂-gén promoterrégiójának részletesebb karakterizálása érdekében több plazmidot állítottunk elő, amelyek a strukturális P-450_sca_₂-génhez kapcsolódva az 5’-promoter különböző hosszúságú ffagmenseit tartalmazták. A következőkben a „P-450_sca_₂” kifejezést a P-450_sca_₂-citokróm teljes aminosavszekvenciáját kódoló strukturális gén jelölésére használjuk.

A pSCA1013-A(1013/320)-, pSCA1013Δ(1013/158)-, pSCA1013-A(1013/101)- és pSCA1013A(1013/74)-plazmidot a következők szerint állítottuk elő (az eljárás lépéseit a 2. ábrán vázlatszerűen mutatjuk be). A plazmidok mindegyike - az 1. példa (1-4) pontjában leírtakhoz hasonlóan előállított - 5’->3’ irányban emésztett 5’-promotereket hordozó inszerteket tartalmaz. Mivel az emésztett ífagmens hosszúsága az exonukleáz-III-mal végzett emésztés után nem jósolható meg pontosan, mindegyik plazmid különböző hosszúságú promotert tartalmaz.

(1) A pSCA1013-A(1013/320)-plazmid előállítása

A pSCA213-plazmidot - az 1. példa (1-4) pontjában leírthoz hasonló eljárással - pSCAl 1 l-DNS-ből állítottuk elő (ld. 2. ábra). A pSCA213-DNS-t EcoRIgyel és HindlII-mal emésztettük, az így kapott termékeket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, és a gélből egy - a P-450_{sca 2}-gént és az 5’-promoter egy régióját tartalmazó -, hozzávetőleg 2,1 kb-os EcoRIHindlII-fragmenst vágtunk ki. A kivágott DNS-t fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a vizes fázisból etanollal kicsaptuk, és csökkentett nyomáson szárítottuk.

A pSCA301 -plazmid 100 ng-ját EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük, és az 1. példa (1-6) pontjában

HU 223 206 Bl leírtak szerint kezeltük. A kapott DNS-t - 1800 egység T4-DNS-ligázt tartalmazó ligázpufferben - a fenti, 2,1 kb-os EcoRI-HindlII-fragmens hozzávetőleg 200 ng-jához adtuk, és a reakciót 16 °C-on két óra hosszat végeztük. Ezután a ligáit DNS-t - az 1. eljárásban leírtak szerinti Streptomyces lividans sejtekbe transzformáltuk. Az így kapott, tiostreptonrezisztens Streptomyces lividans törzset TK21/pSCA1013-A(1013/320)nak neveztük el. Ebből a törzsből - a 2. eljárás alkalmazásával - plazmid-DNS-t készítettünk, melyet pSCA1013-A(1013/320)-nak neveztünk el.

(2) A pSCA1013-A(1013/158)-plazmid előállítása

A pSCA214-plazmidot - az 1. példa (1-4) pontjában leírthoz hasonló eljárással - a pSCAlll-DNS-ből állítottuk elő (ld. 2. ábra). Az előző, (1) pontban leírthoz hasonló módon, a pSCA214-plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük, miáltal - a P-450_sca_₂gént és az 5’-promoter egy régióját tartalmazó - hozzávetőleg 1,93 kb hosszúságú EcoRI-HindlII-fragmenst kaptunk. Ezt a fragmenst a fenti (1) pontban leírtak szerint pSCA301-plazmid transzformálására alkalmaztuk.

A kapott, tiostreptonrezisztens Streptomyces lividans törzset TK21/pSCA1013-A(1013/158)-nak neveztük el. Ebből a törzsből - az 1. példában leírt 2. eljárással - plazmid-DNS-t kaptunk, és ezt a plazmidot pSCA1013-A(1013/158)-nak neveztük el.

(3) A pSCA1013-A(1013/101)-plazmid előállítása

A pSCA215-plazmidot - az 1. példa (1-4) pontjában leírthoz hasonló eljárással - a pSCAlll-DNS-ből állítottuk elő (ld. 2. ábra). A fenti (1) pontban leírthoz hasonló módon, a pSCA215-plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük, miáltal - a P-450_sca_₂-gént és az 5’-promoter egy régióját tartalmazó - hozzávetőleg 1,87 kb hosszúságú EcoRI-HindlII-fragmenst kaptunk. Ezt a fragmenst a fenti (1) pontban leírtak szerint pSCA301 -plazmid transzformálására alkalmaztuk.

A kapott, tiostreptonrezisztens Streptomyces lividans törzset TK21/pSCA1013-A(1013/101)-nek neveztük el. Ebből a törzsből - az 1. példában leírt 2. eljárással - plazmid-DNS-t kaptunk, és ezt a plazmidot pSCA1013-A(1013/101)-nek neveztük el.

(4) A pSCA1013-A(1013/74)-plazmid előállítása

A pSCA216-plazmidot - az 1. példa (1-4) pontjában leírthoz hasonló eljárással - a pSCAlll-DNS-ből állítottuk elő (ld. 2. ábra). A fenti (1) pontban leírthoz hasonló módon, a pSCA216-plazmidot EcoRI-gyel és HindlII-mal emésztettük, miáltal - a P-450_sca_₂-gént és az 5’-promoter egy régióját tartalmazó - hozzávetőleg 1,85 kb hosszúságú EcoRI-HindlII-fragmenst kaptunk. Ezt a fragmenst a fenti (1) pontban leírtak szerint pSCA301 -plazmid transzformálására alkalmaztuk.

A kapott, tiostreptonrezisztens Streptomyces lividans törzset TK21/pSCA1013-A(1013/74)-nek neveztük el. Ebből a törzsből - az 1. példában leírt 2. eljárással - plazmid-DNS-t kaptunk, és ezt a plazmidot pSCA1013-A(1013/74)-nek neveztük el.

(5) A nukleotidszekvencia és a promoterfragmensek méretének meghatározása

A pSCA1013-A(1013/320)-, pSCA1013A(1013/158)-, pSCA1013-A(1013/101)- és pSCA1013A(1013/74)-plazmidban lévő 5’-promoter-fragmensek hosszúságát a 2. példában leírt eljárás szerint határoztuk meg.

A pSCA1013-A(1013/320)-plazmidban a

- P-450_sca_₂ kódolórégiójától 5’-irányban lévő - DNS hosszúsága 320 bp-nak bizonyult, ami az 1. azonosító számú szekvencia 109-428. nukleotidjainak felel meg.

A pSCA1013-A(1013/158)-plazmidban a

- P-450_sca_₂ kódolórégiójától 5’-irányban lévő - DNS hosszúsága 158 bp-nak bizonyult, ami az 1. azonosító számú szekvencia 271-428. nukleotidjainak felel meg. A pSCA1013-A(1013/101)-plazmidban a

- P-450_sca_₂ kódolórégiójától 5’-irányban lévő - DNS hosszúsága 101 bp-nak bizonyult, ami az 1. azonosító számú szekvencia 328-428. nukleotidjainak felel meg. A pSCA1013-A(1013/74)-plazmidban a

- P-450_sca_₂ kódolórégiójától 5’-irányban lévő - DNS hosszúsága 74 bp-nak bizonyult, ami az 1. azonosító számú szekvencia 355-428. nukleotidjainak felel meg.

(6) A pravastatin nátriumsójának plazmid közvetítette előállítása

A pravastatin nátriumsójának termelődését a 3. példában leírt eljárás szerint, az alábbi törzsekben mértük: Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A(1013/320),

Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A(1013/158), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A(1013/101) és Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-A(1013/74). Kontrollként a Streptomyces lividans TK21-törzset alkalmaztuk. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat ik

S. lividans törzs	Pravastatin nátriumsója (pg/ml)
| TK21/pSCA1013-A(1013/320)	52
TK21/pSCA1013-A(1013/158)	12
TK21/pSCA1013-A(1013/101)	17
TK21/pSCA1013-A(1013/74)	16
TK21 t —	0

Látható, hogy az ebben a példában előállított valamennyi plazmidban lévő 5’-promoterek hasznos promo45 teraktivitást mutattak.

5. példa

Az ML-236B transzkripciós indukciója („Northem-blot”-analízissel mérve)

1- Teljes RNS előállítása

A Streptomyces lividans TK21/pSCA1013A(1013/320), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013A(1013/158), Streptomyces lividans TK21/pSCA1013A(1013/101) és Streptomyces lividans TK21/pSCA101355 A(1013/74) törzset a 3. példában leírthoz hasonló módon tenyésztettük.

A tenyészetekhez - a tesztkísérletek elvégzése céljából - 500 pg/ml végkoncentrációban az ML-236B nátriumsóját adtuk. A kontroll- (vagy negatív) kísérlete60 két azonos módon végeztük, azzal a különbséggel,

HU 223 206 Bl hogy a tenyészethez nem adtunk ML-236B-nátriumsót. A tesztkísérletekben az ML-236B tenyészetekhez történő hozzáadása után a tenyésztést - 28 °C-on, percenként 200-as fordulatszámmal történő rázatás mellett - egy óráig végeztük. A tenyésztő tápközeget 4 °C-on 4000 χ g-vel 10 percig centrifugáltuk, az üledéket folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztottuk, és -80 °C alatti hőmérsékleten tartottuk.

Az egyes fagyasztott üledékek három-három grammját jéggel lehűtött mozsárban porrá törtük, majd a port 15 ml guanidin-tiocianát-oldatot [4M guanidin-tiocianát (Fluka); 4 vegyes% „Sarcosyl” (Sigma); 0,1 vegyes% „Antifoam A” (Sigma); 20 mM EDTA.Na₂; 4 mM 2merkapto-etanol; és 25 mM trinátrium-citrát (pH=7,0)] tartalmazó centrifugálócsőbe helyeztük, és alaposan összekevertük. A sejttörmeléket „polytron”-homogenizátor alkalmazásával 30 percig homogenizáltuk. A kapott homogenátumot 4 °C-on, percenként 9000-es fordulatszámmal (10 000 xg) 15 percig centrifugáltuk, s a felülúszót 4 °C-on, percenként 9000-es fordulatszámmal (10 000xg) újabb 15 percig centrifugáltuk. A kapott felülúszó-frakció 7 ml-ét ultracentrifugáló csőben (13 PA; Hitachi Koki Co., Ltd.) óvatosan - 0,1 M EDTA.Na₂-ot tartalmazó - 3 ml 5,7 M cézium-klorid-oldatra rétegeztük, és 4 °C-on 40 000 χ g-vel 15 óra hosszat centrifugáltuk. Ezután az üledéket - 1 mM EDTA.Na₂-ot tartalmazó - 0,3 mM Tris-HCl-pufferben (pH=8,0) („TE”puffer) oldottuk, majd az oldathoz 30 ml 3 M ecetsav/nátrium-acetát-puffert (pH=5,2) és 1 ml etanolt adtunk. A kapott elegyet 4 °C-on, 14 500-as percenkénti fordulatszámmal (18 000xg) 5 percig centrifugáltuk. Az üledéket csökkentett nyomáson szárítottuk, majd 40 μί TE-pufferben feloldottuk, és a későbbi lépésekben ezt az oldatot alkalmaztuk teljes RNS-mintaként.

2. A próba előállítása pg pSCA205-plazmidot - H-pufferben, 37 °Con, három órán át - 100 egység PvuII-vel emésztettük, az emésztett terméket 1 vegyes%-os agarózgélen elektroforizáltuk, és a gélből kivágtunk egy 0,49 kb-os PvuII-fragmenst. Ezt a DNS-fragmenst fenol/kloroform eleggyel kezeltük, a DNS-t etanollal kicsaptuk, majd csökkentett nyomáson szárítottuk. A kapott DNSfragmens 500 ng-ját - „nick-transzlációs” reagenskészlet (Amersham) alkalmazásával - ³²P-dCTP-vel (6000 Ci/mmol) jelöltük. A jelölt PvuII-fragmenst (0,49 kb) - a reakcióba nem lépett ³²P-dCTP eltávolítása érdekében - etanollal kétszer kicsaptuk. A kapott próbát 400 ml TE-pufferben feloldottuk, és -20 °C alatti hőmérsékleten tartottuk.

3. „Northern -hibridizáció

A különböző törzsekből származó teljes RNSminták 10 pg-ját - 0,92 M formaldehidet, 8 mM nátrium-acetátot és 1 mM EDTA-t (pH—7,0) tartalmazó 20 mM MOPS-pufferben (Sigma) 1,2 vegyes%-os agarózgélen, 100 V feszültséggel 4 óra hosszat elektroforizáltuk. Ezután a gélt óvatosan 0,1 M ammónium-acetátban, majd egy órán át - 1 M ammónium-acetátot tartalmazó - 50 mM Tris-HCl-pufferben (pH=8,0) rázattuk. A teljes RNS-t, hagyományos eljárással „NylonMembrane”-ra (PÁLL Ultrafiltration Corp.) vittük.

A nejlonmembránt - 50 térfogat% formamidot, 2,5 x „Denhart”-oldatot [0,2 g/1 szarvasmarhaszérumalbumin, 0,2 g/1 „Ficol 400” (Pharmacia) és 0,2 g/1 poli(vinil-pirrolidon)] és 100 pg/ml lazacspermaDNS-t tartalmazó - 30 ml 5 χ SSPE-oldatba (180 mM nátrium-klorid, 0,1 mM EDTA.Na₂, 18,6 mM nátriumdihidrogén-foszfát.2H₂O és 101 mM dinátrium-hidrogén-foszfát.l2H₂O) helyeztük. A nejlonmembránt ezután - 50 térfogat% formamidot, 1 χ, ,Denhart”-oldatot, 100 pg/ml lazacsperma-DNS-t és 0,1 térfogat% nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) tartalmazó - 30 ml 5 χ SSPE-oldatban, 42 °C-on, egy éjszakán át a fentebb előállított - a P-450_sca_₂ egy részét tartalmazó, jelölt DNS-fragmens (0,49 kb) 100 pl-ével reagáltattuk. A reakció után a nejlonmembránt - 0,1 vegyes% SDS-t tartalmazó - 2 χ SSPE-oldatban, szobahőmérsékleten kétszer öt percig, majd - 0,1 térfogat% SDS-t tartalmazó - 1 χ SSPE-oldatban, 55 °C-on 10 percig, végül 0,1 térfogat% SDS-t tartalmazó - 0,1 χ SSPE-oldatban, 55 °C-on 15 percig mostuk. A membránt megszárítottuk, és a P-450_sca_₂-génről átíródott 1,9 kb-os mRNS relatív termelődését „Image-Analyser BA 100” készülék (Fuji film) alkalmazásával mértük. A 5. lividans TK21/pSCA205-törzs negatív kontroll eredménye esetében kapott értékeket 1-nek tekintettük, és a többi törzs esetében kapott eredményeket ehhez viszonyítottuk. Az eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat

I 5. lividans törzs	ML-236B nátriumsója
hiányában	jelenlétében
S. lividans TK21/pSCA205	1,0	26
5. lividans TK21/pSCA1013- Δ(1013/428)	31	32
S. lividans TK21/pSCA1013- Δ(1013/320)	36	31
S. lividans TK21/pSCA1013- 1 Δ(1013/158)	4,8	8,9
S. lividans TK21/pSCA1013- | Δ(1013/101)	1,6	15
S. lividans TK21/pSCA1013- Δ(1013/74)	2,2	1,3

A fentiek alapján egyértelműen látható, hogy a teljes (1 kb-os) 5’-végi nemkódoló régió promoteraktivitása az ML-236B nátriumsójának indukciójától függ (ld. S. lividans TK21/pSCA205-törzs). Ezzel szemben, a találmány szerinti promoterek nem igényelnek ilyen indukciót. Nyilvánvaló továbbá, hogy ebben a példában a transzkripció szintjét vizsgáltuk; az expresszió szintje szükségszerűen elmarad a transzkripció szintjétől.

HU 223 206 Bl

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 428

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Streptomyces carbophilus

TÖRZS : SANK-62585 (FERM BP-1145)

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGCAGGACC AGGACGTCGC CGCGCAGTTC GCCGGTATCG GGGAGGTCGA CCTCGGAGAT CTTCCCCAAC CGGCAGGCGT CGACCACGAG TTGGGCCCGG CTCGGCCACC TGCGGTAGAC CGCCGCCTTT CCCGTGCGGG CCCGGACCGC CACCCGCTCC ATGGTGAGCG AGGCGTAACC CACCTCGCCG AGCTCGTCCA AAGTCGCCAG CAGAATGGCG CTTTCCAGTT CCTCGCCGCG ACGACGCGGG CCTTTGCGGT GGTCAAGGGG TGGTTCGGTG GCCGGTTCCG TGGCCGGTTC GGCACTGTTG GGCACCCCTG CCTCCCGTGT CTGTCGCATA GGGGCCGTTG CGTTCTTCCG GGTGGACAGC CTAGCCTCCA ACTTAGAGAA CAGTCCGTTC TTTAACGTCT GAGGTTTCGA GGGTTTCG

120

180

240

300

360

420

428

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: más nukleinsav (szintetikus DNS)

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG 22

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: más nukleinsav (szintetikus DNS)

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGAATTCAAG CTTA 14

Claims (68)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Transzkripciós promoteraktivitású izolált DNS, amely:

   (i) a Streptomyces carbophilus P-450_sca_₂-citokrómot kódoló nyitott leolvasási keretével közvetlenül szomszédos, 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régió egy részének, de nem egészének megfelelő, vagy (ii) az (i) pont szerinti DNS mutánsának vagy variánsának megfelelő, és amely DNS szekvenciája tartalmazza legalább az

   1. azonosító számú szekvencia 355-428. nukleotidjainak 74 bp-os szekvenciáját, és amely DNS promoteraktivitása nagyobb, mint az említett 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régió promoteraktivitása, és a transzkripció kiváltásához szubsztrátindukciót nem igényel.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS, amely legalább egy Streptomyces carbophilus törzsben transzkripciós promoteraktivitású.

   HU 223 206 Bl
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS, amely legalább egy Streptomyces lividans törzsben transzkripciós promoteraktivitású.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely konstitutív promoteraktivitású.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely legalább 74 bp hosszúságú.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely legalább 300 bp hosszúságú.
7. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely 100 bp-nál kisebb hosszúságú.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régióval azonos, azzal az eltéréssel, hogy belőle több bázispár restrikciós endonukleázos emésztéssel, génsebészeti módszerekkel, az 5’-végi nemkódoló régió egyik végén megkezdett emésztéssel vagy ezek kombinációinak alkalmazásával lett eltávolítva.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régióval azonos, azzal az eltéréssel, hogy 5’->3’ irányban részlegesen emésztetve lett.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely kétszálú.
11. 11. Izolált DNS-szál, amely az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti DNS egyik szála.
12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti DNS, melynek szekvenciája az 1. azonosító számú szekvencia 428. nukleotidjától - folyamatosan - legfeljebb az 1. nukleotidjáig teljed.
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amelynek hosszúsága elégséges ahhoz, hogy az 1. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/428)-plazmid vagy a 2. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/320)plazmid 428 bp-os, illetve 320 bp-os DNS-inszertjének promoteraktivitásával lényegében azonos promoteraktivitást mutasson.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amelynek teljes szekvenciája lényegében azonos az 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régió azon szekvenciájával, amelynek a DNS megfelel.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amelynek teljes szekvenciája jelentős mértékű szekvenciahomológiát mutat az 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régió legalább egy olyan szekvenciarészletével, amelynek a DNS megfelel.
16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely 6 χ SSC-oldatban, 60 °C-on hibridizálódik az 1. azonosító számú szekvencia 109-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-sel.
17. 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely 6 χ SSC-oldatban, 60 °C-on hibridizálódik az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-sel.
18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely olyan promoteraktivitású, mely aktivitás egy óra elteltével olyan szintű expressziét eredményez, mely expressziós szint magasabb, mint az 1013 bp-os 5’-végi nemkódoló régióval - egyórás szubsztrátindukciót követően - kapott expresszió teljes szintje.
19. 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely legalább egyik végén tandem módon kapcsolódó, egy vagy több további bázispárt tartalmaz.
20. 20. Az 1-6. vagy 8-19. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.
21. 21. Az 1-6. vagy 8-19. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1. azonosító számú szekvencia 109-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.
22. 22. Az 1-5. vagy 8-19. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1. azonosító számú szekvencia 271-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.
23. 23. Az 1-5. vagy 8-19. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1. azonosító számú szekvencia 328-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.
24. 24. Az 1-5. és 7-19. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely az 1. azonosító számú szekvencia 355-428. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza.
25. 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely a FERM BP-5299 deponálási számon letétbe helyezett Streptomyces lividans SANK-62795törzsből lett kinyerve.
26. 26. Az 1-25. igénypontok bármelyike szerinti DNS, amely transzkripciós promoterként működőképesen kapcsolódik egy nyitott leolvasási kerethez.
27. 27. Izolált DNS-fragmens, amely 1-26. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmaz, azzal a kikötéssel, hogy a DNS-fragmens nem az 1013 bp-os 5’végi nemkódoló régió teljes változatát magában foglaló DNS-t tartalmazza.
28. 28. Vektor, amely az 1-27. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmazza.
29. 29. A 28. igénypont szerinti vektor, amely megfelelő gazdasejtben alkalmas olyan protein expresszálására, amelyet a DNS-sel működőképesen kapcsolt nyitott leolvasási keret kódol.
30. 30. A 29. igénypont szerinti vektor, amely P-450_sca_₂-citokróm expresszálására képes.
31. 31. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti vektor, amely a gazdasejt számára szelektálható fenotípust biztosít.
32. 32. Gazdasejt, amely a 28-31. igénypontok bármelyike szerinti vektorral van transzformálva, mely vektorban a transzkripciós promoteraktivitású DNS egy további nyitott leolvasási kerettel is működőképes, transzkripciós promoterkapcsolatban áll.
33. 33. Expressziós rendszer, amely 32. igénypont szerinti gazdasejtet tartalmaz, és amely a további nyitott leolvasási keret által kódolt proteint expresszálja, amennyiben a gazdaszervezet a protein expresszálódásához megfelelő körülmények között van tenyésztve.
34. 34. A 33. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként prokariota gazdasejtet tartalmaz.
35. 35. A 34. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként Escherichia colit, Bacillus subti20

    HU 223 206 Bl list vagy Streptomyces nemzetségbe tartozó gazdasejtet tartalmaz.
36. 36. A 34. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként Actinomycetales rendbe tartozó gazdasejtet tartalmaz.
37. 37. A 34. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként Streptomyces nemzetségbe tartozó gazdasejtet tartalmaz.
38. 38. A 34. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként Streptomyces lividanst tartalmaz.
39. 39. A 38. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként Streptomyces lividans TK21-törzset tartalmaz.
40. 40. A 33-39. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely gazdasejtként transzformált Streptomyces lividans törzset, nyitott leolvasási keretként pedig heterológ DNS-t tartalmaz.
41. 41. A 33-40. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, prokarióta proteinek expresszálására.
42. 42. A 33-41. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely vektorként nagy kópiaszámú expressziós vektort tartalmaz.
43. 43. A 42. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely nagy kópiaszámú vektorként pIJ702-vektort tartalmaz.
44. 44. A 33-43. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, a természetben csak szubsztrátindukciót követően expresszálódó termékek expresszálására.
45. 45. A 33-44. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely antibiotikumhatású fehérje expresszálására alkalmas.
46. 46. A 33-45. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely az expressziós termék szubsztrátját termelő rendszerrel együtt van tenyésztve.
47. 47. A 33-46. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely expressziós termékként Ρ-450-citokrómot expresszál.
48. 48. A 47. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely P-450_sca-citokrómot expresszál.
49. 49. A 48. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely P-450_sca_₂-citokrómot expresszál.
50. 50. A 33-49. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely P-450_sca-citokrómot expresszál, és olyan Streptomyces lividans törzsbe tartozó gazdaszervezetet tartalmaz, amely expresszál egy olyan elektronszállító rendszert is, amely lehetővé teszi, hogy az expresszált citokróm részt vegyen a rendszerben jelen lévő bármilyen ML-236B hidroxilezésében.
51. 51. Eljárás pravastatin nátriumsójának előállítására, azzal jellemezve, hogy az 50. igénypont szerinti expressziós rendszert - amely gazdaként előnyösen Streptomyces lividans TK.21-törzset tartalmaz - az ML-236B nátriumsója jelenlétében, olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a citokróm termelődését, és elősegítik, hogy az ML-236B nátriumsója - a P-450_sca_₂-citokróm katalizátorhatása következtében - a pravastatin nátriumsójává alakuljon; majd a tenyészetből kinyerjük a pravastatin nátriumsóját.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként a FERM BP-5299 deponálási számú Streptomyces lividans SANK-62795törzset vagy egy Streptomyces lividans TK21-törzset alkalmazunk.
53. 53. Az 51. vagy 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ML-236B-t - a gazdasejtekkel együtt tenyésztett - Penicillium citrinum termeli.
54. 54. Eljárás kívánt protein előállítására, azzal jellemezve, hogy a 32. igénypont szerinti, transzformált gazdasejteket a protein termelődését elősegítő körülmények között tenyésztjük, majd a proteint kinyerjük.
55. 55. A 33-50. igénypontok bármelyike szerinti expressziós rendszer, amely nyitott leolvasási keretként bármilyen alkalmas aminosavszekvenciát kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz.
56. 56. Az 55. igénypont szerinti expressziós rendszer, amely nyitott leolvasási keretként egy protein természetes változatát vagy polimer alakját; két vagy több különböző protein fuzionált alakját vagy ezek kombinációját kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz.
57. 57. A Streptomyces lividans SANK.-62795-törzs, melynek deponálási száma: FERM BP-5299.
58. 58. Az 1. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/428)plazmid, melynek szekvenciája tartalmazza az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotidjainak szekvenciáját.
59. 59. A 2. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/320)plazmid, melynek szekvenciája tartalmazza az 1. azonosító számú szekvencia 109-428. nukleotidjainak szekvenciáját.
60. 60. A 2. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/158)plazmid, melynek szekvenciája tartalmazza az 1. azonosító számú szekvencia 271-428. nukleotidjainak szekvenciáját.
61. 61. A 2. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/101)plazmid, melynek szekvenciája tartalmazza az 1. azonosító számú szekvencia 328-428. nukleotidjainak szekvenciáját.
62. 62. A 2. ábrán bemutatott pSCA1013-A(1013/74)plazmid, melynek szekvenciája tartalmazza az 1. azonosító számú szekvencia 355-428. nukleotidjainak szekvenciáját.
63. 63. Streptomyces lividans TK21-törzs, amely tartalmazza az 58. igénypont szerinti plazmidot.
64. 64. Streptomyces lividans TK21-törzs, amely tartalmazza az 59. igénypont szerinti plazmidot.
65. 65. Streptomyces lividans TK21-törzs, amely tartalmazza a 60. igénypont szerinti plazmidot.
66. 66. Streptomyces lividans TK21-törzs, amely tartalmazza a 61. igénypont szerinti plazmidot.
67. 67. Streptomyces lividans TK21-törzs, amely tartalmazza a 62. igénypont szerinti plazmidot.
68. 68. Transzkripciós promoter, amely az 1. azonosító számú szekvencia 1-428. nukleotid)aiból álló nukleotidszekvenciát tartalmazza, és amely a Streptomyces lividans SANK.-62795-törzs (deponálási száma: FERM BP-5299) tenyésztése; a pSCA1013-A(1013/428)-plazmid sejtekből történő kinyerése; és a plazmid restrikciós enzimekkel történő emésztése útján lett előállítva.