TW562858B - Actinomycete promoter - Google Patents

Description

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明係關於與新形式轉錄啟動子，其與編碼嗜碳鏈 徽菌（Streptomyces carbophilus)中 P-450 細胞色素之 基因相關連，含此啟動子之載體，如此載體在蛋白質， 特別是P-450 seay表現之使用，含如此載體之宿主细胞 ,包含如此细胞之表琨糸統及如此蛋白質與表琨系統之 用途。本發明又使用此啟動子達到有用性蛋白質之工業 規模生產。 發明背景 近年來，基因工程領域之進步已使送入及表琨外來基 因於各種微生物中成為可能。進步之特別領域係關於大 腸桿菌（Escherichia coli, E. coli)用作生產重組蛋 白質之宿主，及所得技術在業界已達商業上之使用。最 近，酵母菌作為大腸桿菌之工業上替代品之研究已有相 當之進步。 放線菌（Actinomycetes)(及特別是鏈黴菌靥）為常用 於抗生素生產之原核生物微生物。異質DHA通常使用由 Hopwood等人於1 98 0年所開發之宿主-載體系統送入放 線菌中[參照 Hopwood， D.A·,等人，（1987), "Methods in Enzyffl〇logyM , 153； 116-166, Academic Press, New York]。此技術使放線菌中表琨載體系統之大量研 究與發展得以進行。有效用於放線菌表現載體中之轉錄 啟動子之一例為tipA,由抗生素硫鏈絲菌肽 (thiostrepton)誘生之啟動子[參照Murakami, T♦，等人 一3 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) ，（ 1 989 )，J. Bacteriol ♦, 1 7 1 , 1 459 ] 0 用於治療高血脂之普拉斯坦錠鈉（Pravastatin sodium)具有能夠降低血清膽固醇之有用藥理效果[參 見 Arai,等人，（1989), Ann· Rep, Sankyo Res· Lab·， 40, 1-38]。普拉斯坦錠鈉主要由ML-236B納之微生物羥 基化作用生產，該ML-236B納為絲狀真菌橘青緻菌 (Penicillium citrinum)所生產之物質。經基化作用通 常在放線菌嗜碳鏈微菌之存在下進行。已證實具羥基化 活性之劑為P-450 sea型式之细胞色素（下文簡稱為 ” P - 4 5 0sca ”）[參見 Serizawa,等人，（1990〉，Biochimica e t Biophysica Acta, 1 084, 35-40 ] 〇 科31:^〇^等人自能夠催化>11^2 368鈉在6-位置上之羥 基化作用之嗜碳鏈徽菌（Streptomyces carbophilue)純 化出P-450sea細胞色素。雖然此P-45 0 sea未確立是否此 等代表同型或不同基因之產物，其特徵在於Μ三種型式 Ρ - 450 sca_i，P-450 sca-2 與 P —45〇sca_)存在[參見 Matsuoka，等人，（1989)， Eur, J· Biochem·, 184, 707-713與 EP-A-0 281 245] 〇 Serizawa等人選殖及表現編碼嗜碳鏈徽菌p-45〇sea_2 之DHA [參見日本特許公開案平6-70780與Watanabe, I·,等人，（1995), Gene， 163, 81-85]。該 DNA 與 P-4 5〇sea^基因5’-非編碼區之1 kbp部份一起被選殖於 多拷貝質體PIJ702中及用以將變鉛青鐽徽菌TK21 (Streptomyces lividans TK21)轉形。轉形之變鉛青鏈 一4 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 五、發明説明（6 ) 雖然5 ’啟動子被指為長1 kbp,但此僅為自ORF轉錄 起始區（t s r )延伸5 ’之區之大約長度。tsr位於S E Q . I D NO.1之大約位置384及ATG起始密子緊隨在位置428 。 含5’啟動子區之末端為位於0RF上游1013bp之SacI部位 。此區SacI部位為Watanbe等人所說明（如上述），其並 未測定5’啟動子之長度。為易於參考，5’啟動子在此被 指長1 kbp,而非1013bp,因此在實質上已非常正確且 不形成本發明之必要特徵，此在下文中更為清楚。無論 如何，本發明之啟動子必需較全長l〇13bp之5’啟動子為 短0 與P-45 0 se^2基因相鄰之1 kbp 5’區不必含有 之整個啟動子區，雖然建議該區域尺寸如此。事實上， 啟動子不佔據界定良好之區，因為事實上吾等已確立長 度小如74bp之區具有相當於或更佳於原1 kbp 5’啟動子 之活性。然而，當本發明之啟動子超過約160bp ,較佳 300bP或更長時，其具有相當好之啟動子活性。 本發明之DNA (於此亦稱為本發明之啟動子）對應至1 kbp 5’啟動子，前題為彼等較5’啟動子之1 kbp長度為 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

酶序 啟之部 切自 現子或 內由。顯動子 制藉合 Μ 啟動 限或組S)明啟 由 Η 之(d發明 藉加述股本發 如之前雙成本 段列括為形之 手序包需見份 當短段必預部 適較手常亦至 一 但該通明伸 任定，子發延 由特到動本又 藉行達啟解明 可進而之瞭發 少由解明然本 減藉水發雖 。 之，端本，股 度份5f解性補 長部或瞭活互 。除 3 可子一 短去列 動任 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（7 ) 份之任一互補股或二者，該互補股最終可用K建構本發 明之啟動子。 吾等已特別發現5’消化產生優異的結果，Μ致即使位 於啟動子序列3’端之74bp部份仍具有優異的活性。據此 ，於一較佳具體例中，本發明之DNA對應至K 5’->3’方 向部份消化之5 ’啟動子。只要DNA仍具有所需啟動子活 性。 雖然良好之啟動子活性見於少於lOObp之啟動子長度 ，特別是在3’端，顯然活性在介於158與320bp間之長 度有顯著的改善。320bp片斷具有較158bp約5倍大之 啟動子活性。片斷二者為1 kbp 5’啟動子之3’端片斷。 啟動子活性之此差異對本發明並不是關鍵性的，因為長 度152bp (二個長度間之相差）在轉形或表現具最小程度 之效果。 若熟諳此藝者希望確認產生較大與較小活性間過渡狀 態之啟動子之精確長度，則所需程序簡明且對技藝人士 是顯而易知的。然而，確認如此長度並無益處，因為使 用158bp與使用32 0b p作為啟動子序列，二者間並無差 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

之高上性 性較造活 活用製小 低使質較 較 ，白用 比而蛋使 子然於望 動。能希 啟錄可 ， 之轉及下 高之高形 較大太情 著最能此 顯到可如 具達度。 用可速源 使而錄資 常因轉主 通 ，之宿 。到佳子之。 處解較動多子 益瞭子啟過動 或可動性盡啟 異啟活耗之 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 吾等亦確立啟動子長度介於428bp與完整1 kbp間時 喪失受質誘發之依序性。雖然此428bp之特地定長度藉 由5 ’端消化而取得，整個1 kbp序列內任一 428bp序列 或類似物可同等地作為啟動子亦是可能的。 如上述，喪失受質誘發之依存性具高優勢。然而，同 時，此發生時之精確長度是不重要的。吾等證實至少在 受質誘發1小時後，長度428 bp之啟動子之活性相當於 或稍高於1 kbp 5’啟動子之全活性。因此，少於原啟動 子長度一半之啟動子至少可如原啟動子般作用，但不需 受質誘發。此表示表現速度為一因素之任一方法立即具 優勢。長度大於428bp之難用度漸增，對使用者並無益 處。此外，某些時候，較長之啟動子亦再度變為易受受 質誘發，因而抵消任一由本發明較短之啟動子所產生之 優點。 據此，本發明之DN A較佳為顯琨啟動子活性實質上相 當於或大於5*啟動子之320bp及/或428bp 3’片斷之長 度，特定言之，吾等認為啟動子長度不應太長K致易受 受質誘發較佳。 ”受質誘發”一詞為業界所熟知。基本上，通常僅在特 受質存在時於彼等可作用時，特定表琨產物方為所需。 不存在該受質時，有機體因表現產物而浪費資源。據此 ,各種糸統本性*已發展至產物之表現僅在受質存在下發 生0 P-450 sea_2之情況下，此藉由受質如ML-236B作用在 一 10- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（9 ) 啟動子部位誘發《iRNA轉錄而達到。毫無疑問ML-236B為 卜450 scaffi胞色素然受胃0但可胃其{也€質， 任一可誘發5’啟動子之所計盡之受質（若此等不同於 ML-236B)。如上述，誘發5’啟動子之適當受質之例子 有苯巴比妥。然而，5’啟動子誘發物之天性對本發明並 不重要，而不作進一步討論。 雖然本發明不為理論所侷限，但令人驚異的是 卜 450 sca_2 素 H 由 誘 克服轉錄上之阻礙。1 k b p啟動子區尺寸之減小，特別 是藉由啟動子5’端之消化，似乎可用Μ去除該阻礙。因 此理由，吾等相信並無回復受質誘發之特定啟動子長度 ，反而在特定點後啟動子活性隨漸增之長度而降低，因 轉錄啟動阻礙再生。受質誘發可Μ與轉錄啟動阻礙再生 圼正比之方式開始其效用或僅在達到特定長度時方有可 能。任何情況下，因增加長度超過約500bp產生未降低 活性所之啟動子較佳。另言之，具長度超過約500bp之 啟動子，更特別是超過428 bp及顯現活性降低之啟動子 不被喜好。 本發明之DNA對應至V啟動子之一或多部份。”對應” 一詞表示本發明之DNA具有類似5’啟動子之啟動子活性 型式，在於其可用W啟動P-450sea細胞色素0RF之轉錄 。如此啟動發生時之程度並不是本發明之必要特徵及本 發明啟動子之啟動子活性程度說明於此。唯一之必要性 在於本發明之啟動子具有至少較5’啟動子為佳之活性， 一11 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 562858 A7 B7 五、發明説明（10) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 份本之切5f動 啟需彼 ，。要僅少之編 地動代產 部而份內至啟5f不與佳可只列減量霈 利啟取然。 多因部酸應得 於列子較即，序或定不 便51及自見 或 ，3!核對所 同序動似性化變壞特列 或化入可預 一 化餘由接，。栢酸啟類活變改破列序 ，變插亦被 之消剩藉直中列或甘之列子子，到序對 生見、化亦 子端子亦子者序似核明序動動常達對基 產預倒變子 動5!動份動二之類之發質啟啟通將基鹼 序明顛之動 啟自啟部啟之份個子本實要51。 列鹼當 程發、上啟 5f可51該得例部多動常有所原性序 ，是 形本除列之 至子於及所實多或啟通具出如活對而別 轉，刪序明 應動同化明等或一之然間現的子基然特 由此如子發 對啟相消發此一有明雖份顯能動鹼。 ， 經因由動本 接，5 有端本於之具發。部要可啟變形果 常。藉啟之 直，化5f則。子常本者關需儘要改情效 通位等5T體 可中消自，份動通，子相僅可所證一著 正部彼然異 子例具子除部啟子而動子。子琨保任顯 修制使天變 動體子動去二5f動然啟動的動表不之一 之限份。此 啟具動啟合之於啟 。^啟要啟仍且外有❶列入部性如 。 之之啟5f接關同之列至5!必之子點性能時序引多關於 述明單得若與相相明序應之非明動優活可質對如或相基 所發簡所。化子有發之對關並發啟許子不白基，一現及 此本在明列消動具本子接相此本得少動正蛋鹼得之顯 ， 如 。發序酶啟子 動直等但 所有啟修碼 製子而生 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（12 ) 現出必需之啟動子活性。 由上，可瞭解到當操作性地與適當ORF連結時，進一 步提供本發明之啟動子。特別當啟動子操作性地與OR F 相伴隨時，亦提供含有本發明啟動子之載體如質體及含 有如此載體之宿主。 載體不需為表現載體。如此之其他載體可用以增加本 發明之啟動子或提供可利用之基因庫。然而，表現載體 較佳且包含宿主與本發明表琨載體之表琨系統特別較佳。 當放線菌用作表琨異質DN A之產物之宿主時，目前Μ 使用變鉛青鐽撇菌較佳。在P-450sea細胞色素，特別是 P - 450sea_2之情況下，變鉛青鏈徽菌亦表琨允許细胞色 素參與ML _2 36 B羥基化所需之電子轉錄糸統。然而，任 一其他適當蛋白質或表現產物亦可經由含有本發明啟動 子之表現系統表現。 通常不喜好在原核生物中表琨真核生物之DNA ,因為 特定轉譯後作用並不發生在原核生物中，其在真核生物 中自然地發生，如醣化作用。然而，此並不防止真核生 物之產物於本發明之糸統中之表現，只要瞭解到任一非 自然發生於表現系統之所需轉譯後修飾除非特別顧及到 ,否則並不發生。 本發明之表現系統特別有效用於大量表琨原核生物之 表琨產物。若多拷貝質體如PIJ702用於表現系統中時， 表現產物甚至可K更大董之製造。 本發明之表現系統更有效用於通常僅在受質誘發後方 一 14- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（15 ) 表現之產物表現上。如此之系統可用於製造特定物質如 抗生素之方法。例如當表現產物具有將受質轉化為終產 物或後階段中間體或甚而降解受質之活性時，如此之方 法係可能的。若適當，如此之方法可包含表琨糸統與製 造待作用之受質之系統共培養。 本發明表琨系統之產物正常地為受質誘發時，則與製 造受質之表現系統共培養時易有時間延遲，因此必需等 待表現系統製造足夠之表現產物。使用本發明之表現糸 統時不再發生問題，因為產物由糸統自動地合成而不需 受質誘發，因此消弭時間延遲之因素。 可瞭解本發明之表現糸統特別可應用到P-450细胞色 素，特別是P-450sca细胞色素及最特別是P-450 sea_2细 胞色素之表現。如上述，P-450sca_2由嗜碳鏈徽菌表現 及嗜碳鏈微菌較佳於普拉斯坦錠納之製造中與橘青徽菌 曲培養。於此糸統，P-450sea_2用以將橘青黴菌表琨之 受質ML-236B羥基化，但僅在ML-236 B誘發P-45 0sca-2轉 錄後延遲發生。使用本發明之表現糸統時，於製造普拉 斯坦錠納中不再需要延遲時間，且此在產業上製造普拉 斯坦錠鈉中具優勢。 本發明之特定較佳具體例如下。 本發明之較佳啟動子與含有SEQ ID NO. 1核f酸序列 1至428或1至32 0之DN A雜交。 含有SEQ ID NO.1核甘酸序列1至428之啟動子較佳 。含有SEQ ID NO.1核甘酸序列1至320之啟動子亦較 -15- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（15 ) 合成之第一部份。因此，本發明之啟動子為轉錄啟動子 ，此功能稱為轉錄啟動子活性。5’啟動子K及含SEQ. ID. N0.1 428、320、158、101 與 74bp 序列之啟動子均 具有此活性。 可瞭解本發明之啟動子可含有一或多個呈縱排、上游 或下游連接之額外鹼基對。如此額外之序列僅限於無大 量受質誘發應再被引入時及有效量之啟動子活性應被保 留時。 在本發明啟動子控制下之多肽可如所述。可瞭解彼等 可含有任一胺基酸序列如新穎或已知蛋白質之天然、變 異體或聚合物形式；二或多種不同蛋白質之融合形式； 或新設計之多肽。如上所述，較佳之多肽為細胞色素 P ~ 4 5 0 sca-2 顒於載體，可瞭解待轉形之載體應為能夠在適當宿主 細胞内自我複製者。因此，載體應含有自我複製序列或 複製子。放線菌之情況下，較佳之如此載體為PIJ 702。 關於宿主，除了其適用於所選用之載體外並無特別限 制。通常可使用任一宿主細胞，如彼等採集自野外者或 藉由購買或轉移者。較佳之宿主细胞為放線菌，較佳為 嗜碳鏈撇菌或變鉛青鏈撇菌及最佳為變鉛青鏈緻菌菌株 TK21 〇 如上述，製造普拉斯坦錠鈉之方法包含在ML-2 3 6 B納 存在下培養變鉛青鏈撇菌之轉形株，所得普拉斯坦錠鈉 可藉由已知方法回收。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（I6 ) 在簡明之具體例中，本發明之啟動子可使用Watanabe 等人之方法[Gene, (1995), 163, 81-85]自嗜碳鐽徽菌 選殖DN A 。可選殖本發明啟動子之較佳嗜碳菌株為嗜碳 鏈徽菌 SANK 62585 (FERM BP-1145)。 本具體例中，基因組庫可使用如P(JC18(得自Takara Shuzo Ltd., Japan)作為選殖載體自嗜碳鏈黴菌之整個 基因組DNA製得。可理解如此之基因庫與載體形成本發 明之一部份。之後寡核甘酸探针可例如基於推測之 P - 450seay N-端胺基酸序列合成。此寡核甘酸探針隨後 可用以確認來自編碼至少一部份P-450seay之基因庫之 選殖體。若蛋白質N -端由0RF之5’端編碼，則可能任一 由此方法所確認之選殖體亦含有顯著量之5’未轉譯及非 編碼區，其為5’啟動子之位置。使用基因庫與寡核苜酸 探針之適當篩選方法為菌落雜交法[參見ManUtis, T. 等人，（1982), "Molecular Cloning - A Laboratory Manual”， Cold Spring Harbor Laboratory, New York -不由任一特定參考資料完成之此處所指任一方法通常 揭述於”Molecular Cloning - A Laboratory Manual”。 即使由此或任一其他方法確認之選殖體僅含部分本發 明啟動子，完整選殖體仍可取得。經標記之探針可製自 僅含部份所要DNA之選殖體。此經標記之探針隨後可用 作進一步篩選基因組庫之模板以確認及單離選殖體，其 含有至少所需之盡量多之5’啟動子。 可理解本發明預見包含完整5’啟動子或部份5’啟動子 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（17 ) 之選殖體之單離。若完整序列取得，則此可進一步如藉 由次選殖加工Μ取得本發明之啟動子。若取得部份序列 ,則此亦可如使用完整序列般進一步加工或可夠用作本 發明之啟動子而不需在序列上作任一實質上之改變。 進一步可瞭解上述所建議選殖與製備本發明啟動子之 方法並不是唯一可使用之方法且其他適當方法對彼等熟 諳此藝者為顯而易知。可改變任一步驟或甚至整個方法 。例如，與其使用對應至P-450 sea_2 Ν-端序列之探針， 可使用製自5’啟動子3’端之探針。載體不作特別限制， 而可使用任一適當之選殖載體如可自市面上取得之載體 ，包括 PBR322 。 根據本發明，亦可瞭解本發明之啟動子可K化學方法 合成，其使用SEQ, ID. NO.1所示之資訊。若本發明之 啟動子為Μ化學法合成時，則其可例如藉由亞磷酸三酯 方法完成[參見 Hiinkapillar, Μ·,等人，（1984), N a t u r e , 3 1 0 , 1 0 5 - 1 1 1 ]。亦可能使用半合成，例如使 用選殖技術與使用所示資訊之工程之組合。如此半合成 之適當方法為業界所熟知。 回至原來所述藉由篩選基因庫取得本發明之啟動子之 方法，啟動子DNA可藉由彼等熟諸此藝者熟知之方法自 含有所要序列之選殖體取得[參見Man ί at is, T.等人， ( 1 982 ),上述]。例如，質體DNA部份可被單離及啟動 子DNA可自質體DNA單離出，如藉由使用一或多個限制 酶。 一 19- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（19 ) 根據本發明之較佳具體例，含有序列表SEQ ID NO.1 核苜酸序列1至42 8之轉錄啟動子藉由培養變鉛青鏈黴 菌 SANK 62795,接著自細胞回收 PSCA1013-Λ( 1 0 1 3/428 ) 及Μ限制酶消化質體。 若需要，任一經選殖之DHA之核甘酸序列可藉由如 Maxam-Gilbert化學修飾方法[參見Maxam，Α· Μ.，與 Gilbert, W · , (1980), Methods in Enzyraology, 65, 499-599]或使用M13嗜菌體及二去氧基鏈終止方法決定 [參見 Messing， J·，與 Vieira, J·, (1982), Gene, 19 ,269-276] 〇 若希望確立是否特定DNA序列與含有序列表SEQ. ID NO.1核甘酸序列1-428全部或部份之DHA雜交，則此可 依下述決定。 特定言之，待試驗之DN A首先視需要在瓊脂糖凝膠上 進行電泳。隨後將DNA點漬在硝基纖維素或尼龍薄膜上 ，接著藉由熱處理或紫外線照射將吸附之DN A固定在薄 膜上。之後使用探針。探针含有SEQ. ID NO.1核苜酸序 列1至428之所要長度且Μ例如放射活性同位素如32 P 、生物素、毛地黃毒甘配基（digoxigenin)或酶標定， 及典型地根據隨機引子方法[參見Feinberg, A.P.,等 人，（1983), Anal. Biochem., 132, 6-13]或刻痕轉譯 方法[參見Maniatis, T,，等人，（1982),如上述]製備。 硝基纖維素或尼龍薄膜浸漬於含有探針之雜交溶液中 ，隨後在適當之預定溫度如60 1C下培育。培育後，清洗 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

經濟部中央檩準局員工消費合作社印製 562858 A7 五、發明説明（20 ) 而探針可使用適於所使用之標記之方法測得。 雜交溶液通常含有SSC (食鹽水-檸檬酸納；1XSSC含 有0」5料氯化納與15«^檸檬酸鈉於去離子水中）。$5(：於 雜交溶液中之濃度較佳為4-8XSSC,更佳為6XSSC。培 育溫度較佳自30至7〇υ,及更佳為601C。 輿含有序列表SEQ ID Ν0.1之核甘酸序列1至428全 @或部份之DNA雜交之DNA可藉由所述方法自各種基因 組庫壤殖。可瞭解本發明之多個啟動子優先與含有42 8 序列之DNA雜交，而非320或其他較短之序列，但雜交 寶驗所選用之序列長度可容易地由彼等熟諸此藝人士使 用在此所給予之資訊選擇。 如上述，K此方式取得之DNA可藉由業界熟知之方法 @藉由取代、刪除或在所要部位藉由如特定部位突變插 入〜或多個核甘酸人為地修飾[參見Mark, D· F·,等人， (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666] 。可瞭解本發明延伸至如此之DNA ,只要其擁K有所需 之轉錄啟動子活性即可。 為確認如上述取得之DN Α具有本發明啟動子活性，建 構含有縱排連接至ORF之DNA之載體及於適當宿主中表 _。為起始，（i)建構重組DNA載體，其中編碼適當蛋 白質之DNA操作性地與公認之啟動子DNA連結及插入適 當載體如放線菌質體PIJ702中[參見Katz, E·,等人， (1 9 8 3 ) , J , G e η ♦ M i c r 〇 b i ο 1 · , 1 2 9 , 2 7 0 3 - 2 7 1 4 ]，及 之後（Π)在建構自PIJ702之載體情況下，允許載體安定 一 22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（22 ) 。引子與OR F之相對股互補及與彼等互補之部位在基因 內有分別之位置，因而由PCR產生之股能與彼此雜交。 反應進行特定時間後，所得dsDN A進行電泳及在硝基纖 維素上被偵測K例如基於所要長度帶之存在或不存在而 測得所要D N A之轉錄程度。 產物表現之程度可藉由測定所得蛋白質之生理活性而 確立。因此，例如，重組DNA載體可被製得，其中編碼 含已知活性之蛋白質如酶之D N A被操作性地連結至公認 啟動子之3 端。連接至公認啟動子之0 R F表琨程度隨 後可以適用於表規產物之方法測定。 質體編碼細胞色素P-45 0 sea.2及質體與變鉛青鐽徽菌 栢容時，質體可送入不製造P-45 0sea_2之變鉛青鐽黴菌 菌株中且轉形體可隨後於ML-2 36 B鈉存在下培養。所製 得普拉斯坦錠之量隨後作為如公認啟動子啟動之 p-45〇sca~2 ^ m 〇 可瞭解分析表琨產物之方法可依相關產物專一性地製 作◦例如，公認之啟動子可操作性地與抗藥性基因如氯 黴素乙醯基轉移酶基因連結[參見Gorman, C.M.,等人， ( 1 9 8 2 ), Mol. Cell, Biol·, 2, 1 044-1 05 1 ]或與可 Μ 業界熟知之方法偵測之蟲螢光素酶基因連結[參見de Wet ，J.R·,等人，（1987), Mol· Cell. Biol., 7, 725- 737]。其他經由表現產物之活性分析表現之方法亦可使 用。 測量表琨之另一方法例如係藉由使用適當抗體確認產 一 24- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 562858 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（23 ) 物。再一次，製備含有與ORF操作性連結之公認啟動子 之表現載體及轉形於適當宿主中並在表規之適當條件下 培養。培養基或轉形細胞之均質物暴露於抗體中及測量 抗原-抗體複合體之量。適當測量技術包括放射免疫分 析法[參見 Berson, R.S.，等人，（1973), "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology”， V o 1 2 A , 2 B, North-Hoi land Publishing Go., Amsterdam] ,酶免疫分析法[參見 Engvall, E·, (1980), Methods in Enzymology, 70(A), 419-439]西方點漬法[參見 Harlow, Ε·,等人，（1988), "Antibodies - A Laboratory Manual”， P.471, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]與免疫沉殺法[參見 Kessler， S.W·,等人，（1981), "Methods in Enzymology”， 73(B), 442-459 ],視希望如何測量相互反應及是否抗 體或抗原以任何方式標記而定。任何情形下，可瞭解此 等技術之本討論並非無遺漏的及其他方法對彼等熟諳此 藝者係顯而易知的。 亦可瞭解許多其他決定本發明公認或實際的啟動子活 性之方法對彼等熟諳此藝者是容易取得且顯而易知的及 本發明包含所有如此之方法。例如，待表現之蛋白質具 有活性或抗原性Μ外之特徵性質時，藉由如此性質決定 之方法亦可用Μ直接或間接測定如此之活性。 一旦確立欲用作本發明之啟動子之DNA具有如啟動子 所需之活性時，其可用以建構任一適當、所要蛋白質之 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 表現載體。任一適當宿主可用於此目的及該宿主可相同 或不相同於用Μ確認是否DNA確實具有啟動子活性之宿 主。蛋白質不侷限其序列及可具任一胺基酸序列。如上 逑，如此序列可選自，但不限於：新穎或已知蛋白質 (或肽）之天然、變異體或聚合物形式；二或多種不同蛋 白質（或！fe )之融合型；或新設計之多肽。亦如上所述， 細胞色素P-450sea_2為較佳之表現產物，適當載體為 pSCA1013-A (1013/428),該載體自變鉛青鏈黴菌SANK 62795 (FERM BP-5299 )單離出。 可瞭解術語”表現產物”、”蛋白質”與”多肽”通常可互 換且以如此之意義用於此。特定情況下，轉譯自原DN A 之多肽並非終產物，但為終產物之中間體型，需轉譯後 修飾Μ取得所需產物。P-450 sea_2之情況下，鐵需要送 入蛋白質中之血色素環內K產生終表琨產物。因此，當 術語”表現產物”、”蛋白質”與”多肽”以同義用於此時， 彼等術語間之差異可由彼等熟諳此藝者於栢關上下文中 確認。 放線菌外，本發明啟動子之適當宿主例包括原核生物 如大腸桿菌（Escherichia coli)與祜草桿菌（Bacillus s u b t ί 1 is) ° 非放線菌用作宿主時或選用之放線菌菌株不適於載體 類型時，可瞭解載體應包含適用於所考盧菌株之複製子 ,如源自與宿主相容之種類。需要含有複製起始點及適 於宿主之調節序列之質體載體。即使在其他適當控制序 一 26 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（25 ) 列存在下，本發明之啟動子不在特定宿主中作用且不容 易由熟諳此藝者修飾Μ作用時，如此之情況可能為限制 用途者。例如，如此情況可有用於增加啟動子。可瞭解 如此修飾及/或適當控制序列為彼等熟諳此藝者容易取 得及/或確認時，如此之情況為本發明所包含。 本發明之表規載體不需特定宿主中所需Μ外之進一步 特黴時，可瞭解固定之選擇標準可為有用的。如此標準 包括質體藉此賦予宿主性質如表現與轉形之選擇性者， 因而表規型被修飾。 適用於放線菌之轉形方法包含使用溶菌酶使放線菌培 養物形成球狀原生質體。含有重組DNA載體與聚乙二醇 之緩衝液隨後加人W藉由例如使用Thompson或Hop wood 方法之一[參見 Thompson, C.J·,等人，（982 ), J· Bacteriol·， 151, 668-677或 Hopwood, D.A·，等人， (1985), "Genetic Manipulation of Streptomyces * A Laboratory Manual”， The John Innes Foundation, Norwich]將載體送入宿主细胞。抗硫鏈絲菌Ife基因常用 作轉形質體中之選擇標記[參見Hopwood, D.A.,等人， (1987), "Methods in Enzymology” 153, 116，Academic Press, New York],但本發明不侷限於此。 若希望使大腸桿菌轉形Μ在本發明之啟動子控制下表 琨產物，通常適當方法為將相關重組DNA載體加入勝任 细胞（competent cells)中者。勝任細胞通常在鹽如氯 化鈣、氯化鎂與氯化铷存在下製備[參見Hanahan, D., (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（21〇Χ297公釐） 562858 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2〇 (1983), J. Mol, Biol. 166, 557-580]。另一方法包 含電穿剌，其包含將高電壓脈衝施至包含宿主大腸桿菌 與表琨載體之懸浮液中，因此使載體送入细胞中[參見 Electroporation: Dower, 等人，（1988), Nucleic Acid Res·, 16， 6127與 Calvin， N.M，，等人， (1988), J, Bacteriol·, 170, 2796]。 適當之選擇標記，亦即彼等賦予宿主特別之表琨型者 ,包括抗藥性標記基因如彼等賦予安比西林或四環素抗 性者。然而，遷有許多是熟諳此藝者顯而易知者，而本 發明，如提供特定例之所有之其他例子，並不因此而受 限〇 祜草桿菌欲用作宿主時，適當方法為使用溶菌酶將宿 主綑胞製成原生質體者。隨後將含有重組DHA載體與聚 乙二醇之緩衝溶液加入原生質體中，接著藉由電穿剌將 載體送入宿主细胞中（如上）[參見Cheng, S·,等人， (1979), Mol. Gen· Genet·, 168, 111]。較佳具體例 中，使用抗藥性標記如對氯徽素具抗性者作為轉形细胞 株之選擇標記，但可瞭解可使用許多其他之選擇標記。 無關宿主，所要轉形體可使用彼等熟諳技藝者熟知之 方法培養，而所要多肽藉由培養物Μ细胞内或细胞外或 二者之方式產生。用於培養物之培養基可適當地選自常 用於相關宿主細胞之各種類型之培養基。通常，特定宿 主所接受正常之培養條件亦可用Κ表琨所要多肽，其例 如進行多肽性質所需之任一修飾。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（27 ) 例如，典型放線菌營養物包括葡萄糖、蔗糖、澱粉、 甘油、澱粉糖漿、糖蜜與大豆油作為碳源。大豆粉、小 麥胚芽、肉萃取物、腺、玉米浸液、乾酵母與硫酸銨用 作氮源為適當的。除上述外，無機鹽如氯化鈉、氯化鉀 、碳酸鈣或磷酸鈣與輔助微生物生長或促進所要多肽產 生之添加劑亦可視需要適當地組合使用。 再次，通常適用於所用宿主之培養技術亦可應用於轉 形微生物上，包括如適用於工業規模生產之液體培養與 深槽培養（deep coulturing)。 除非為禁忌或在此特別聲明，吾等喜好培養條件包含 溫度介於20與371C間，較佳介於26與28¾間。 在本發明之啟動子控制下之表琨產物通常以细胞内、 细胞外及有時兩者之方式產生。產物可藉由各種方法單 離、純化與回收，如彼等為熟諳此藝者熟知者，特別是 彼等視多肽物理或化學性質而定之程序。多肽K外部表 現時，多肽可藉由將培養基離心去除细胞而自所得上清 液單離、純化與回收。 為單離與純化累積於细胞内之多！fe，首先將细胞懸浮 於含有蛋白酶抑制劑之溶液中及隨後使用手段如彼等熟 諳此藝者熟之者如超音波均質器均質化。 雖然一般不需說明本發明，可瞭解單離、純人與收集 所要多肽之特定方法之實例包括如蛋白質沉澱、超過濾 、分子篩選層析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交換層析 、親和性層析、各種適當類型之液相層析（包括高性能 -29- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _________B7_五、發明説明（28 ) 液相曆析（HPLC))、透析等技術與其組合。 住一情形下可瞭解所要多肽可使用本發明容易地Μ工 業規模製造，同時具高產量與高純度。 亦可瞭解可能使用未純化或部份純化之製備樣本分析 本發明轉形之宿主细胞所製造之多肽活性。Ρ-45 0 sca-2 可Μ上述方法自變鉛青鏈微菌娵得自直接用於如普拉斯 坦錠鈉之生產上。所需之電子傳輸糸統存在於變鉛青鐽 撇菌内，因而相對容易地取得轉形之宿主微生物，其催 化ML-2 36 Β納在位置6之羥基化反應。 本具體例中，典型地使用啟動子助益表琨細胞色素， 但此可隨後用於例如普拉斯坦錠之製造上。任一由本方 法所製得之普拉斯坦錠可隨後藉由Serisawa,等人之方 法回收[參見 Serizawa, N.,等人，（ 1 983 ), J· Antibiotics, 36, 608]。變鉛青鏈撇菌 SANK 62795 (FERM BP-5229)(CCRC 910067)可 W 如此方式使用。 琨在本發明以下述實例作進一步之說明。實例為說明 性的，而非用Μ侷限本發明。任一不特別指明之方法、 製備、溶液等可於”Molecular Cloning - A Laboratory Handbood”（如上）中發現。所有溶液為水性的，除非特 別指明。 於下述實例中，吾等證實可使用本發明之啟動子於宿 主微生物中製造所要之多肽。 實例1 P-450 sea_2啟動子之單離與用於表現细胞色素P — 450sca_2 一 30- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、11-

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29 ) 之質體載體之建構 (1-1)質體 PSCA101 與 PSCA108 之建構 質體PSCA101與PSCA108藉由將含有P-45〇sea_2基因與 啟動子之不同區域片斷選殖而建構，此等片斷根據 Watanabe與其同仁所述之方法自嗜碳鏈徽菌之基因組 DNA衍生而來[參見Watanabe, I·，等人，（1995)， Gene, 163, 81-85與日本專利公開案平6-70780]。第4 圖為質體PSCA101之圖譜。此質體藉由將衍生自嗜碳鍵 撇菌基因組D N A之1 · 7 k b p P v u 11片斷連接至B R 3 2 2 (得自 日本Takara Shuzo Ltd·)之PvuII部位而建構。此Ukbp DNA片斷含有整個卜450 。基因之5’啟動子與編碼基 sca-2 因51端之DNA 。質體PSCA108藉由將衍生自嗜碳鏈撇菌 基因組DNA之2.0kbp SacI片斷連接至UC18(得自日本 Takara Shuzo Ltd.)之SacI部位而建構。此2.0kbp片斷 含有整個细胞色素P-450sea_2基因之編碼區。 上述技術之细節說明如下。 (1 - 2) PSCA106之建構 使用100單位PvuII使10微克PSCA101 DHA在3710下消 化 3小時。消化在補充有酶（Ta k a r a S h u ζ 〇 )之限制媛 衝液中進行。特定言之，所用之鍰衝液為H媛衝液，如 由日本Takara Shuzo所供應。下述實例中，限制酶如此 使用，但來源及/或緩衝液不作限定，隨後酶由Takara Shuzo供應及根據供應商建構使用，而媛衝液為Η 、K 或L緩衝液，如適當，亦由Takara Shuao所供應。 一 31 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 Α7 Β7 五、發明説明（55) 由1-3所得之pSCAIII DNA, 10微克DNA以各100單 位Xbal與PstI在3710下消化3小時。所得經消化之DNA Μ酚-氯仿處理及DNA藉由乙醇沉澱自水相回收及在減 壓下乾燥。 下一步，含於PSCA111之P-45 0 sea_2基因上游區如 Henikoff 所述依 5’-->3’方向刪除[參見 Henikoff, S·, (1984), Gene, 28，351-359]。第 200 單位核酸外切酶 I (Takara Shuzo)加人 10微克乾 pSCAIII DNA於 100 微 升核酸外切酶媛衝液（50rnM Tris-HCl, 5mM氯化鎂，10 in Μ 2-氫硫基乙醇，pH8 . 0 ,於蒸餾水中製成）中及使反 應在371C下進行5分鐘。之後，反應藉由在651C下加熱 5分鐘而中止，隨後反應溶液Μ酚-氯仿處理。隨後,D N A 藉由乙醇沉澱自水相回收及在減壓下乾燥。 所得乾DNA以50單位綠豆核酸酶（Takara Shuzo)於40 微升30mM醋酸鹽緩衝液（pH5.0)(含有ΙΟΟιηΜ氯化鈉，lmM 醋酸鋅與5¾(體積/體積）甘油）中在37 °C下處理30分鐘。 再一次，D N A K酚-氯仿處理及藉由乙醇沉澱自水相回 收並在減壓下乾燥。 沉澱之DNA似5單位T4 DNA聚合酶（Takara Shuzo)於 10微升T4 DNA聚合酶媛衝液[33πιΜ Tris-HCl, 66mM醋酸 鉀，10mM醋酸鎂，0.5mM二硫赤蘚糖醇，0,1毫克/毫 升牛血清白蛋白（Takara Shuzo), pH7.9,於水中製成] 中在37 t下處理5分鐘。如此處理之DNA隨後K酚-氯 仿處理，藉由乙醇沉澱萃取及在減壓下乾燥。 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（54 ) 以綠g核甘酸與T4 DNA聚合酶之合併處理確保DNA片 斷不具黏狀5’或3’末端。 隨後DNA M10單位鹼性磷酸酶於體積400微米鹼性鱗 酸酶媛衝=液（50ibM Tris-HCl，IdiM氯化鎂，ρΗ9·0，於蒸 餾水中製成）中及3710下處理30分鐘°隨後反應產物以 sa-胃仿處理，藉由乙醇沈澱萃取及在減壓下乾燥。 所得DNA與毫克鱗酸化Xbal聯結子（Takara Shuzo) 於含有1 800單位T4 DNA接合酶2 &自胃衝-液混# 终 體積50微升），接合反應在16 C下進行2小時。勝任之 大腸稈菌菌株HB101细胞依類Μ (1-2)段落所ϋ之方法 Κ部份接合反應轉形，取得pSCA212° (1-5)質體PSCA301之建構 10微克多拷貝質體pIJ7 02 [參見Katz, E•，等人， (1983), J· Gen· Microbiol·, 129, 2703-2714]在 37 C下M100單位SacI與100單位SphI於Η緩衝液中消化 3小時。消化產物在1 »：重量/體積瓊脂糖凝膠上進行電 泳，而對應5.4kbp帶之DNA片斷自凝膠上切下。 作為部份之選殖程序，必須製備含有内部Hindlll與 EcoRI斷裂部位以及適於接合至SacI與SphI部位之DNA 末端之雙股寡核甘酸。如此之雙股寡核甘酸藉由連接下 述之二個單股寡核甘酸而建構。寡核甘酸二者藉由類核 甘酸（Phosphoramidite)方法使用DMA合成器（Model 380, Applied Biosystem)合成[參見 Beaucage, S.L,等 人，（1981)， Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862] -36- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 ,ιτ

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（55 ) 。序列為： SEQ ID NO. 2 5 1 -GATCTAAGCTTGAATTCGCATG-3 1 SEQ ID NO· 3 5 1 -CGAATTCAAGCTTA-3 1 各14微莫耳寡核甘酸於TE緩衝液中混合在一起，終體 積400微升。混合物加熱至loot達5分鐘，隨後徐徐 冷卻至251。雙股核苜酸在二個互補之單股寡核甘酸間 形成。 100毫微克所得之雙股寡核苜酸與1微克PIJ702之 5,4kbpli斷（預先MSacI與SphI於含有1800單位T4 DNA 接合酶之接含酶媛衝液中消化，終體積100微升）混合， 使接合反應在161C下進行2小時。部份接合反應轉形入 製自變鉛青鏈黴菌菌株TK21之球狀原生質體中。所得轉 形體在硫鏈絲菌肱存在下培養·^選出含有質體之細胞。 使用變鉛青鏈黴菌菌株TK21之程序揭述於下述方法[1] 。隨後質體DNA根據下述方法[2]自抗硫_絲菌轉形 體單離出。 方法[1 ] 變鉛青鏈徽菌菌株TK21之轉形 變鉛青鏈撇菌菌株ΤΚ21之轉形根據ThofflPsson之方法 進行[參見 Thompson， C.J·， （1982)， J· Bacteriol·, 1 5 1, 668 -67 7 ]。所用溶液之明细於此計盡尾端列示。 將一脈（streak)變鉛青鏈徽菌菌株TK 21 [參見 Hopwood, D.A♦，等人，（1983)，J· Gen· Microbiol·, 129, 2257-2 269]接種於20毫升液態GPY培養基中及在 一37 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（％ ) 28υ下培養3天，伴隨在12〇rpm下搖晃。之後，於此液 態預培養基内之細胞使用質器再懸浮及5毫 升液態培養基稀釋為110毫升S-GGCY培養基，隨後细胞 在281C下於Sakaguchi燒瓶中再生長24小時，同時伴隨 在120rpm下搖晃。之後，培養基中之細胞藉由離心（10 分鐘，4t, 1600Xg)而採集。所得细胞粒KP緩衝液 清洗並再次離心（10分鐘，41C，1600Xg)取得細胞粒及 再進行二次清洗步驟。 1克經清洗之细胞粒再懸浮於10毫升P媛衝液中，隨 後將含有20毫克/毫升溶菌酶之等體積P緩衝液加入細 胞懸浮液中，整個在3 0 υ及1 2 0 r p m下伴以溫和搖晃而培 養達1 . 5小時。此造成變鉛青鏈黴菌TK21球狀原生質體 之形成。 隨後將球狀原生質體之懸浮液各通過8 Η滤網過濾二 次，隨後在410與l,600Xg下離心10分鐘取得细胞粒。 成粒之球狀自生質體隨後如上KP緩衝液清洗二次及藉 由在4t：與l,600Xg下離心10分鐘而採集。細胞粒再懸 浮於0.8毫升P緩衝液中及在冰上靜置。隨後將20微升 接合反應加入100微升球狀原生質體懸浮液中及使之再 於冰上靜置2分鐘，之後將500微升含有10¾(重量/體 積）聚乙二醇1 540之P媛衝液加入懸浮液中。隨後再將 懸浮液留置在冰上2小時，再將5毫升P鍰衝液加入。 再將100微升之此懸浮液溫和地在10毫升含2¾(重量/ 體積）菌瓊脂（bactoagar)之再生培養基板（plate)上成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（57 ) 層及细胞在28t!下於此固態培養基上生長約20小時。將 5毫升含有0.7¾(重量/體積）菌瓊脂與75微克/毫升硫 鏈絲菌肽之液態再生培養基溫熱至451C,及倒在瓊脂板 上。該皮隨後在281C下培育及在3至5天後單離出抗硫 鏈絲菌肽菌株。 用於上述轉形程序中之培養基與緩衝液組成物列示於 下。所有例子中使用蒸餾水作為溶劑。 a ) G P Y培養基 葡萄糖 20克/升（重量/體積） 多膝（polypepton) 10克/升（重量/體積） 酵母萃取物 1克/升（重量/體積） (PH7 . 0-7 . 2) b)S-GGCY培養基 溶 液 A ： 蔗 椐 340克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 甘 油 4 克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 甘 胺 酸 1 克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 賂 蛋 白 胺 基酸 4 克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 酵 母 萃 取 物 4 克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 硫 酸 鎂 -7 水合物 1 克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 氯 化 鈣 - 1 水合物 0 . 1克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 痕 量 金 屬 鹽溶液θ 4 毫 升 / 升（ 重 量 / 體 積） 溶 液 B ： 二 氫 磷 酸 鉀 20克 / 升 (重 量 / 體 積 ) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

562858 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（58 ) 氫磷酸二鉀-12水合物 溶液A與B分別滅菌及 c ) P緩衝液 蔗糖 硫酸鉀 氯化鎂-6水合物 痕量金屬鹽溶液 二氫磷酸鉀 氯化鈣-1水合物 TES (pH7 · 2) d )再生培養基 80克/升（重量/體積） 將100毫升A與10毫升B混合 102克/升（重量/體積） 0.248克/升（重量/體積） 2·00克/升（重量/體積） 1 . 98毫升/升（體積/體積） 49·5克/升（重量/體積） 3.64克/升（重量/體積） 5·67克/升（重量/體積） 蔗 糖 1 00克 / 升 (重 量 / 體 槙） 葡 萄 糖 9 . 69克 / 升 (重 量 / 體 積） 賂 蛋 白 胺 基酸 96 .9毫 克 / 升（ 重 量 / 體積） 酵 母 萃 取 物 1 . 94克 / 升 (重 量 / 體 fJJJL 積） 麥 芽 萃 取 物 4. 84克 / 升 (重 量 / 體 積） 硫 酸 鉀 243毫克/升（重量/體積） 氯 化 鎂 - 6 水合物 9 , 84克 / 升 (重 量 / 體 積） 二 氫 磷 酸 鉀 48 .4毫 克 / 升( 重 量 / 體積） 氯 化 鈣 - 2 水合物 2 . 85克 / 升 (重 量 / 體 積） TES ( ΡΗ7 · 2) 5 · 56克 / 升 (重 量 / 體 積） 痕 量 金 屬 鹽溶液 1 . 94毫 升 / 升（ 體 積 / 體積） 氫 氧 化 納 0 . 00484Ν L - 脯 胺 酸 2 . 91克 / 升 (重 量 / 體 積） -40 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（59 ) DL-正白胺酸 48.4毫克/升（重量/體積） L-賂胺酸 0·969克/升（重量/體積） e)痕量金屬鹽溶液 氯化鋅 40毫克/升（重量/體積） 氯化鐵U )-6水合物 200毫克/升（重量/體積） 氯化銅U)-2水合物 10毫克/升（重量/體積） 氯化錳（E )-4水合物 10毫克/升（重量/體積） 硼酸鈉-10水合物 10毫克/升（重量/體積） 鉬酸銨-4水合物 10毫克/升（重量/體積） 方法[2 ] 來自放線菌之質體DNA的製備 上述方法[1]中所得抗硫鏈絲菌肽菌株在28 °C與 200rpm下於摇晃之培育器（日本Tokyp Dennetsu Keiso Co. Ltd.)中100毫升含有25微克/毫升硫鏈絲菌肽之 GPY培養基内生長。隨後將培養基中之細胞藉由在 40 00 X g與4 °C下離心10分鐘而成粒。所得細胞粒再懸浮 於4毫升含有10毫克/毫升溶菌酶（Sigma)、50ιπΜ葡萄 糖與10mM EDTA之25mM Tris-HC1媛衝液（ρΗ8·0)中及在 3 0 1C下培育1小時。之後，細胞懸浮液與8毫升含有 0.2Μ氫氧化納之1¾(重量/體積）十二基硫酸納溶液混合 。所得混合物經搅拌及冰上靜置10分鐘。之後，將6毫 升3M醋酸納之水性溶液（pH4.8)加入預混合之混合物中， 隨後在ll,00Xg與41C下離心15分鐘。 將全部所得上清液施至Qiagen chips 500管柱 -41- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明U〇 ) (Funakoshi)上，其預先M10毫升吸附鑀衝液[50mM3 -(N-嗎福啉基）丙烷磺酸（"MOPS”），750ιπΜ氯化鈉，15¾ (體積/體積）乙醇，0.15¾(體積/體積）Triton X-100 ,(ρΗ7·0),於水中製成]使之平衡。隨後管柱K30毫升 清洗緩衝液[50inMM0PS, 1Μ氯化鈉，15¾(體積/體積） 乙醇，pH 7.0,於水中製成]清洗，隨後質體DNA使用15 毫升溶離緩衝液[50mM Tr*is-HCl, 1.25M氯化鈉，15¾ (體積/體積）乙醇，PH8.5,於水中製成]自管柱溶雛出 將10·5毫升異丙醇加入所得溶離液中及此混合物經雛 心15分鐘（ll,〇〇〇xg, 41C)使DNA沉澱。將沉澱之DNA 再懸浮於400微升TE緩衝液中，再將5微升2毫克/毫 升核糖核酸酶（Sigma)加入K去除任一污染RNA,使反應 在37 °C下進行30分鐘。之後，DNA Μ酚-氯仿處理及藉 由Μ乙醇處理水層而沉澱。沉澱之質體DNA在減壓下乾 燥。 (1-6) pSCA1013-A (1013/428)之建構 10微克於上述1-5所取得之PSCA301在37t：下 單位EcoRI與100單位Hindlll緩衝液中消化3小時°戶斤 得消化產物Μ酚-氯仿處理，而D N A藉由乙醇沈澱自水 相萃取出。沉澱之DNA在減壓下乾燥。 同樣地，1 0微克p S C A 2 1 2在3 7 t下Μ 1 〇 〇單位E c 〇 R I與 1 0 0單位H i n d I I I於Η緩衝液中消化3小時。消化產物 在1¾重量/體積瓊脂糖凝膠上進行電泳，而編碼細胞 素P-45 0sea_2基因之2.2kbp DNA片斷自凝膠上切下。 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ _B7 五、發明説明（春5) 將200毫微克所取得之2,2kbp PSCA212 DNA片斷加入 100微升含有1 800單位T4 DNA接合酶之接合酶緩衝液中 ，接合反應在161C下進行2小時。之後，將接合反應中 之DNA如上述方法[1]所述轉形於變鉛青鏈徽菌中，而 將藉由此方法取得之抗硫鏈絲菌肽變鉛青鏈撇菌菌株命 名為SANK 62795。質體藉由上述方法[2]自此菌株取得 ，並將此質體命名為PSCA1013-/^(1013/428)0 此段落之方法描逑於第1圖中，而所得質體之圖譜列 示於第3圖。所得pSCA-Δ (1013/428)質體能夠於放線 菌中複製。其含有約0.4kbp衍生自細胞色素P-4 5 0_。。 基因5’啟動子之DNA及包括所有p_450 seae>2編碼序列。 (1 - 7) PSCA205 之建構 10微克於上述實例1-3所取得之pSCAIII在3710下以 100單位Hind III於Η緩衝液中消化5小時，之後反應 溶液Μ酚-氯仿處理，及Μ乙醇沉澱，沉澱之DHA在減 壓下乾燥。PSCA111之Hindlll末端使用DNA鈍化套組 (Takara Shuzo)使之鈍化（blunted)。純化部份K齡-氯 仿處理，及DNA Μ乙醇沈澱並在減壓下乾燥。 將所得DNA溶於200微升ΤΕ緩衝液中，並將4單位鹼 性磷酸酶（Toyobo)加人溶液中。隨後將此溶液在371C下 培育30分鐘Μ使鈍端去磷酸化。隨後，去磷酸化之片斷 Μ酚-氯仿處理，藉由乙醇沉澱自水相回收，及在減壓 下乾燥。 再將16.5毫微克SacI聯結子加入100毫微克去磷酸化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（42 ) 且鈍化之PSCA111中，及片斷使用DNA接合組套（Takara Shuzo)環化形成質體PSCA112,其中pSCAUI之Hindlll 部位由SacI部位取代（參見第5圖）。 為了自含有結構P-450sea_2基因與其啟動子之PSCA112 取得2.8kbp SaclH斷，PSCA112如下MSacI部份消化。 2 2 . 1微克p S C A 1 1 2在3 7 1C下Μ 1 2 5 0單位S a c I於L鍰衝液 中處理22小時。所得片斷在1¾重量/體積瓊脂糖凝膠上 進行電泳，而將2.8kbp片斷切下。將此片斷轉移至透析 管中及在150伏特下對1 X TBE緩衝液溶離1 . 5小時K取 得2.8kbp SaclH斷。含有SaclH斷之溶液Μ酚-氯仿處 理及DNA Μ乙醇沉澱並在減壓下乾燥。 將全部所得之D Ν Α溶於含有1克/毫升氯化絶之ΤΕ緩 衝液中，接著添加達0.1毫克/毫升之溴化乙基啶。所 得溶液在120,000”111(650,000><8)與151〇下離心2小時 Μ單離出2.8kbp SacI片斷。隨後细胞粒Μ異丙醇（M氯 化鈉飽和及含有50mM Tris-HCl緩衝液（ΡΗ8.0)萃取三次 K去除溴化乙基啶。接著在4t：下於TE鍰衝液中透析過 夜。所得部份以乙醇沉澱，隨後K 70¾體積/體積乙醇 之水性溶液清洗及在減壓下乾燥產生76微克部份純化之 SacI 片斷（2.8kbp)。 此部份純化之S a c I片斷被原衍生自P U C 1 1 9之3 . 2 k b p DN A Η斷污染。為去除此片斷，75微克部份純化之SacI 片斷（2.8kbp)在37C下M205單位Pvul於K緩衝液中處 理12小時。隨後反應產物在U重量/體積瓊脂糖凝膠上 一 44 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

-、1T

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43 ) 進行電泳取得2.8kbp SacI片斷。使此切下之凝膠片斷 如上述透析，但此時僅進行1小時K將DNA片斷溶離出 。經透析之溶液K酚-氯仿處理及使DNA沉澱，在減壓 下乾燥。 將乾DHA溶於含有1克/毫升氯化絶之TE緩衝液中， 接著添加達0 . 1毫克/毫升之溴化乙基啶。所得溶液在 120,000rpm(650,000Xg)與15C下離心2小時Μ單離出 2.8kbp SacI片斷。隨後單離物以異丙醇（Μ氯化鈉鉋和 及含有50mM Tris-HC1緩衝液（PH8.0))萃取三次Μ去除 溴化乙基啶。此清洗後，片斷在4它下於ΤΕ媛衝液中透 析過夜。此經透析之DNA隨後Μ乙醇沉澱，以70¾體積 /體積乙醇之水性溶液清洗及在減壓下乾燥。將乾DN A 溶於20微升TE媛衝液中。終產量為9.8微克含有結構 P - 450 。基因與其啟動子之SacI片斷（2.8kbp)。 sca-2 同樣地，200微克PIJ702在37°C下以300單位SacI於 L媛衝液中處理2 0小時。溶液K酚-氯仿處理使D N A沉 澱，沉澱之DNA在減壓下乾燥。將乾DNA溶於800微升 TE緩衝液中，隨後將80單位鹼性磷酸酶加人反應介質中 及保持在371下達30分鐘。之後，溶液再K酚-氯仿處 理及水層Μ乙醇處理使DNA沉澱及沉澱之DNA在減壓下 乾燥。將乾DNA溶於含有1克/毫升氯化絶之ΤΕ緩衝液 中，接著添加達0.1毫克/毫升之溴化乙基啶。所得溶 液在120,000”《1(650,000乂8)與151〇下離心2小時以單 離出經SacI處理之PIJ702。 一45 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（44 ) 所得綑胞粒Μ異丙醇（以氯化鈉飽和及含有50mM Tris - HC1緩衝液（ρΗ8·〇))萃取三次K去除溴化乙基啶。此清 洗後，片斷隨後在410下於ΤΕ緩衝液中透析過夜。此經 透析之DNA隨後Κ乙醇沉澱，以70S:體積/體積乙醇之 水性溶液清洗及在減壓下乾燥。上述方法產生37微克經 SacI與鹼性磷酸酶處理之PiJ7〇2。 將2·4微克製自PSCA112之28kbp SacI片斷加人TE緩 衝液中之經SacI與鹼性磷酸酶處理之PIJ702。二片斷Μ DNA接合套組（Takara Shuzo)接合。變鉛青鏈徽菌ΤΚ21 Μ所得質體轉形，而質體藉由Hopwood之方法（Hopwood 等人，”Genetic Manipulation of Streptomyces ~ A Laboratory Manual”： John Innes Institute, Norwich, 1985)自轉形體純化取得。將此質體命名為PSCA205。 實例2 核苜酸定序 如實例1所取得之質體DNA使用Zhang之方法[參見 Zhang, H·，等人，（1988), Nucleic Acids Res·, 16， 1220]藉由鹼性變性作用製備Μ為定序用。變性作用藉 由將5微克質體DNA在371C下於20微升含有0.2mM EDTA 與〇·2Μ氫氧化鈉之l〇mM Tris-HCl緩衝液（ΡΗ8.0)中培育 5分鐘。DNA藉由乙醇沉澱自此溶液回收。沉澱之DNA W70S：(體積/體積）乙醇之水性溶液清洗及在減壓下乾 燥。所得DNA用作核甘酸定序之模板。 DNA定序使用7-脫氮序列酶（7-deazasequenase)套組 一 4 6 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（45 ) 第二版（Toyobo)進行。结果指出存在於質體PSCA1013 -△ (1013/428)內細胞色素P_45 0sca-2基因之5’區長428bp 。此序列再琨如SEQ ID NO.1核甘酸號碼1-428。 實例3 普拉斯坦錠鈉之生產與測量 將變鉛青鏈黴菌菌株SANK 62795、變鉛青鏈嫌菌TK21 /PSCA205與TK21各單菌落自固態培養基接種於各別之 500毫升三角燒瓶中，各含有100毫升含有20微克/毫 升硫鏈絲菌肽之酵母培養基[2¾(重量/體積）葡萄糖， U(重量/體積）臃，0.U(重量/體積）酵母萃取物 (Difco), pH7.0,於蒸餾水中製成]。培養物在28¾與 200rpin下伴Μ搖晃而生長。將5毫升各培養基接種於 100毫升含有20微克/毫升硫鐽絲菌肽之各批次酵母培 養基中，各進一步於28£〇與200”111下培養24小時。之後 ，將ML-236Β加人，終濃度500微克/毫升[參見Endo, Α·,等人，（1976), J· Antibiotics， 29, 1346與 Serizawa, Ν·,等人，（1983), J· Antibiotics, Vol XXXVI，No.7, 887-891)]及繼續在 28TC 與 200rpm下伴 Μ 搖晃而培養1小時。之後，取出部份之各液態培養物經 及用以測量普拉斯坦錠鈉之生產。各樣本在下列操作條 件下藉由高效能液相曆析分析： 管柱：幅射狀填充彈C18(Waters) 溶劑：0,1¾重量/體積含有30¾重量/體積乙腈與0.1¾ 重量/體積三乙胺之磷酸鹽媛衝液，PH3.2。 -47- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（46 ) ^速；1毫升/分鐘 姨_波長：2 3 7 n m 斯坦錠鈉停留時間：11.9分鐘 ®桁亦可在已知量之普拉斯坦錠鈉相同於彼等上述之 &件下進行Μ用作標準參考值[參見Serizawa, N，，等 人，（1983), J. Antibiotics, 36, 608]。自不同變紹^ __徽菌菌株產生之普拉斯坦錠鈉的量藉由比較偵測圖 ^普拉斯坦錠尖峰之面積與已知量普拉斯坦錠標準物之 胃拉斯坦錠尖峰之面積而計算得到。 變鉛青鏈徵菌菌株SANK 62795產生51微克/毫升普拉 斯坦錠納，變鉛青鏈徽菌TK21/ PSCA205產生11微克普 拉斯坦錠鈉，而變鉛青鏈徽菌菌株TK21未產生任一可測 得之普拉斯坦錠鈉。此清楚地證明本發明啟動子之優點。 實例4 質體 pSCA1013-A (1013/320) 、 pSCA1013-A (1013/158) 、PSCA1013-A (1013/101)與 PSCA1013-A (1013/74之建構 為了將P-450 sea_2基因之啟動子區作更佳之特徵描述 ，許多質體被建構，其含有連接至P-45 0sea_2結構基因 之5’啟動子的不同Μ斷。之後，術語”P-450 sea_2 ”用从 指稱編碼完整P-450sea_2胺基酸序列之結構基因。 此實例之質體，亦即 pSCA1013_A (1013/320 )、pSCA 1013-Δ (1013/158) 、 pSCA1013-A (1013/101)與 PSCA1013 -△ (1013/74)依下述建構（建構細節W圖示說明於第2 中）。各質體具有含有依5’-->3’方向消化之5’啟動子的 -48 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（47 ) 崁入子，其依實例1-4所述之類似方式製備。因為經消 化之片斷的長度無法在使用核酸外切酶消化後準備確地 預測，各質體含有不同長度之啟動子。 1) pSCA1013-A (1013/320)之建構 PSCA213藉由類似實例1-4所述之程序自PSCA111 DNA衍生而來（參見第2圖）epSCA213 DNAMEcoRI與 Hindlll消化，及消化產物在U重量/體積瓊脂糖凝膠 上進行電泳，含有P-450 。基因與5’啟動子區之約 sea-2 2.1kbj>的EcoRI-Hindlll DNAH斷自凝膠上切下。切下 之DNA Μ酚-氯仿處理及使用乙醇沉澱自水層回收，沉 澱之DNA在減壓下乾燥。 100毫微克pSCA301MEcoRI與Hindlll消化，及依，實 例1_6所述製備。將此DNA加入約200毫微克由上取得 之 2.1KBP EcoRI-Hindlll 片斷於含有 1 800 單位 T4 DNA 接 合酶之接合酶緩衝液中，終體積100微升，使反應在16 °C下進行2小時。之後，將接合之D N A轉形於變鉛青鐽 徽菌中，如上述方法[1]所述。將藉由此程序所取得所 抗硫鏈絲菌肽變鉛青鏈徽菌菌株命名為TK21/PSCA1013 - △ (1013/320)。質體DNA藉由上述法[2]自此菌株取 得，將此質體命名為PSCA1013-Δ( 1 0 1 3 /320 )。 2) pSCA1013-A (1013/158)之建構 PSCA214藉由類似實例1-4所述之程序自PSCA111 DNA衍生而來（參見第2圖）。依類似上述1)之方法將 PSCA214 以 EcoRI 與 Hindlll消化取得含有 P-450sea_2 基 -49- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（48) 因與5’啟動子區之約1.93kbp長度的EcoRI-Hindlll DNA 片斷。此片斷用Μ使PSCA301轉形，如上述1)所述。 將所取得之抗硫鏈絲菌肽變鉛青鏈徽菌菌株命名為 TK21/pSCA1013-A (1013/158)。質體 DNA 藉由上述方 法[2]自此菌株取得，將此質體命名為pSCA1013-A (1013/158) 〇 3) pSCA1013-A (1013/101)之建構 PSCA215藉由類似實例1-4所述之程序自pSCAIII DNA衍生而來（參見第2圖）。依類似上述1)之方法將 pSCA215MEcoRI 與 Hindlll 消化取得含有 P-45 〇seae>2 基因與5’啟動子區之約1.87kbp長度的EcoRI-Hindlll DNA片斷。此片斷用K使PSCA301轉形，如上述1)所 述0 將所取得之抗硫鏈絲菌肽變鉛青鏈黴菌菌株命名為 TK21/pSCA1013-A (1013/101)。質體 DNA 藉由上述方 法[2]自此菌株取得，將此質體命名為pSCA1013-A (1013/101) 〇 4) pSCA1013-A (1013/74)之建構 PSCA216藉由類似實例1-4所述之程序自pSCAIII DNA衍生而來（參見第2圖）。依類似上述1)之方法將 以(：/\216以£(：〇1?1與11丨以111消化取得含有？-4 503(^_2 基因與5’啟動子區之約1.85kbp長度的EcoRI-Hindlll DNA片斷。此片斷用W使PSCA301轉形，如上述1)所 述。 一 5 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） ----,---„----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

562858 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（轉） 將所取得抗硫鐽絲菌肽之變鉛青鐽黴菌菌株命名為 TK21/pSCA1013-A (1013/74)。質體 DNA 藉由上述方法 [2]自此菌株取得，將此質體命名為pSCA1013-A(1013 /74)〇 存在於各質體 pSCA1013-A (1013/320) 、 pSCA1013-A (1013/158) 、 pSCA1013-A (1013/101)與 pSCA1013-A (1 0 1 3 / 7 4 )依實例2所述方法決定。 於質體 PSCA1013-Δ(1013/320)中，顯示 DNA 5’至 Ρ - 450 se^2編碼區之長度為320bp,對應至SEQ ID Ν0.1 之核甘酸號碼109-428 。 於質體 pSCA1013-A(1013/158)中，顯示 DNA 5’至 P - 450 %&_2編碼區之長度為158bp,對應至SEQ ID N0.1 之核甘酸號碼273-428 。 於質體 PSCA1013-^(1013/101)中，顯示 DNA 5’至 p_450〇編碼區之長度為101bP，對應至SEQ ID N0 · 1 SC cl*· iL 之核苜酸號碼328-428 。 於質體 pSCA1013-A(1013/74)中，顯示 DNA 5’至 P - 450sca-2編碼區之長度為74bp,對應至SEQ ID ΝΟ,Ι 之核W酸號碼355-428 。 6)普拉斯坦錠鈉之質體傳介生產 普拉斯坦錠納之生產依據實例3所述方法針對下列菌 株測量；變鉛青鏈徽菌TK21/PSCA1013-A (1013/320) 、變鉛青鏈撇菌 TK21/pSCA1013-A (1013/158)、變鉛 青鏈微菌TK21/pSCA1013-A (1013/101)與變鉛青鏈撇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •β等 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（BOX297公釐） 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5〇) 菌TK21/pSCA1013-A (1013/74)。變鉛青鏈黴菌菌株 TK21作為對照組。結果列示於表1 。 表1 變鉛青鏈黴菌菌株 普拉斯坦錠納 (微克/毫升） TK21/ PSCA1013-A (1013/320) 52 TK21/ pSCA1013-△ (1013/158) 12 TK21/ PSCA1013-△ (1013/101 ) 17 TK21/ pSCA1013-△ (1013/74) 16 TK21 0 因此，可觀察到所有於此實例中所述之5’啟動子的質 體顯琨有效的啟動子活性。 實例5 如北方點漬法所測得藉由ML-236B之轉錄誘發 i )全部R N A之製備 將下列變鉛青鏈黴菌菌株，亦即變鉛青鏈黴菌TK21/ PSCA 1 0205、TK21/ pSCAIOU-Δ ( 1 0 1 3 /428 )、TK21/ PSCA1013-△ (1013/320)、變船青鏈撇菌 TK21/PSCA1013 - △ (1013/158)、變鉛青鏈徽菌 TK21/pSCA1013-A (1013 /101)與變鉛青鏈黴菌 TK21/pSCA1013-A (1013/74)依 類似實例3所述方法培養。

如實例3中，將ML-236 B加入培養物中（終濃度500 微克/毫升）作為試驗實驗用。對照組或負實驗依相同 方式製備，但不添加ML-236B 。在此階段，添加ML-236 B 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（51 ) 至試驗實驗後，於28°C與200rpro下繼鑛培養1小時。之 後，培養基在4Ό與4,000 Xg下離心及立即將綑胞粒冷 凍於液態氮中及保持溫度低於-80 1C下。 將各3克之冷凍細胞粒於預先在乾冰上冷卻之研缽中 磨成粉狀。隨後將此粉末置於填充有15毫升胍-硫氰酸 酯溶液[4M胍-硫氟酸酯（Pluka), U(重量/體積） Sarcosyl (Sigma)，0.1¾(重量 / 體積）Antiform A(Sigma) ,20mM EDTA ·納，4πιΜ 2-氫硫基乙醇與25biM檸檬酸3 納（F> Η 7 . 0 )]之離心管中及劇烈攪拌。隨後細胞殘屑使用 多穩元件-均質器進行均質化30方分鐘。此均質物隨後 在9,000rpffl(10,000Xg)與41C下離心15分鐘。所得上清 液再於9,000「？《!(10,000><8)與41〇下離心15分鐘。各7 毫升所得之上清液份再於3毫升含有0.1M EDTA·鈉之 5.7M氯化絶溶液[預先置於超離心管（13PA:Hitachi Koki CO·, Ltd)]中並在 41C 與 30,000(40000Xg)下離心 15分鐘。之後，將所得綑胞粒溶於0·3毫升含有ImM EDTA · 2鈉之Tris-HCl鍰衝液（”TE緩衝液”）中，再將30 毫升3M醋酸/醋酸納緩衝液（PH5.2)與1毫升乙醇加入 所得製備物中。此製備物隨後在14,50〇rpin(i8,〇〇〇Xg) 與41C下離心5分鐘。減壓下將細胞粒乾燥及溶於40微 升TE緩衝液中用作後績階段之全部RNA樣本。 i i )探針之製備 10微克PSCA205在371C下M100單位PvuHMH鍰衝 液中消化3小時及在1¾重量/體積瓊脂糖凝膠上進行電 一 53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（52 ) 泳而切下0.49kbp PvuII片斷。所得DNA片斷Μ酚-氯仿 純化，DNA Μ乙醇沉澱，及在減壓下乾燥。將此DNA片 斷500毫微克使用刻痕轉譯套組（AmershanOM32?-dCTP (60000Ci/毫莫耳）標記。所得PvuII標記片斷（〇.49kbi>) 9K乙醇沉澱二次K去除任一未反應之32 P-dCTP。將所 得探針溶於400毫升te緩衝液中並保持低於-2 ου下。 i i i )北方雜交法 各10微各之全部RNA在1.2¾重量/體積瓊脂糖凝膠上 ，於 20mM 含有 0.92M 甲醛、8πιΜ 醋酸鈉與 lroM EDTA(pH7.0) 之MOPS媛衝液（Sigma)中於100伏特下進行電泳4小時 。之後，凝膠於0.1 Μ醋酸銨中溫和搖晃。隨後凝膠於50 πιΜ含有1Μ醋酸銨之Tris-HCl緩衝液（f>H8.0)中搖晃。將 全部 RNA 轉移至尼龍膜（PALL IHtrafiltration Corp.) 上及藉由標準方法固定。隨後將尼龍膜置於30毫升含有 50：ϋ體積/體積甲醯胺、2.5xDerihart溶液[0.2克/升 牛血清白蛋白，0,2克/升Ficol 400 (Pharraacia)與0.2 克/升聚乙烯吡咯酮]與100微克/毫升鮭魚精子DNA之 5xSSPE(180mM 氯化鈉，O.lmM EDTA· 2 納，18·6ιηΜ 二 氪磷酸鈉· 2Η2 〇與lOlmM氫磷酸二鈉· 12Η2 0)於421C 下4小時。隨後尼龍膜與1 0 0微升如上製備編碼部份 P 一 450 sca-2之經標記的DNA片斷（0.49kbp)在42C下於 30毫升含有50¾體積/體積甲醯胺、lxDenhart溶液、 100微克/毫升鮭魚精子DNA與0.1¾體積/體積SDS之 5XSSPE中反應過夜。此程序後，尼龍膜再於含有0.1¾ -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

M-236B - 不存在 存在 1.0 26 31 32 36 31 4.8 8.9 7.6 15 1 · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（53 ) 體積/體積SDS之2XSSPE中，室溫下清洗5分鐘兩次， 隨後於含有0.1¾體積/體積SDS之1XSSPE中，5510下 清洗10分鐘，最後於含有0.1¾體積/體積SDS之0.1X SSPE中，55C下清洗15分鐘。隨後將膜乾燥及使用 Image-Analyzer BA 100(Fuji film)測量轉錄自 Ρ-450 基因之1.8kbp mRNA之比較性生產。自變鉛青鏈黴菌 TK21/ PSCA205之負對照組取得之值定義為1 ,其他結 果之值據此評估。結果列示於下表2 。 表2 變鉛青鏈撇菌TK21/ PSCA205 變鉛青鐽撇菌 TK21/ pSCAI 013-Λ (1013/428) 變鉛青鏈黴菌 TK21/ pSCAI 013-△ (1013/320) 變鉛青鏈撇菌 TK21/ pSCAI 01 3-Δ (1013/158) 變鉛青鏈撇菌 TK21/ pSCAI01 3-Λ (1013/101) 變鉛青鏈徽菌 TK21/pSCA1013-A (1013/74) 由上述，清楚可見完整5’非編碼區（1 kbp)之啟動子 活性視ML-236B納誘發（變鉛青鏈徽菌TK21/PSCA205)而 定。相反地，本發明之啟動子不需如此之誘發。亦可瞭 解本實例測定轉錄程度，轉錄後必需延遲之表琨程度。 一 55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

562858 A7 B7 五、發明説明（54 ) 序列表 序列 I D N 0 . : 1 序列長度：428 序列型式：核酸 股性：雙股 拓蹼學：線型 分子型式：基因組DNA 假設：無 反義（Antisense):無 原來源 有機體：嗜碳鏈黴菌 菌株：S A N K 6 2 5 8 5 ( F E R Μ B P - 1 1 4 5 ) 序列 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) CAGCAGGACC N^CSJTCGC CGOSCAGITC GCCOCTATOG GGGAGGTCGA (XTCGGAGAT 60 OTCTCCAAC 03GCAGGCCT OSACCAOSAG TB30GCCXI3G CKQGCX^CC TG03CTAGAC 120 arCGCCTIT (XXCTGCGGG CXXQGACC33C CACTCGCrCC ATQCTGAG03 AGGCCTAACC 180 CACCTCGCCG AGCTOCTCCA AACTCECCAG CAGAATGGCG OTTa^GIT CXTCECC33CG 240 ACGACGCGGG CCnTGCGCT GCTCAAGGQG TGGITCECTG GCCGGITCCG TGGCmJCTC 300 GGOOCTTG OGCACCCCIG CCTCCCCTCT CIGICmilA GQGGCCCTrG CGITCTICCE 360 GCTGGACAGC CTAGCCTCCA ACTTAGAGAA CAGTCCGTrC TTIAACCTCr GAGCTITCGA 420 QGGnTCG 428 序列 I D N 0 , : 2 序列長度：2 2 序列型式：核酸 一 56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（55 ) 股性：單股 拓蹼學：線型 分子型式：其他核酸（合成之DNA) 假設：無 反義（Antisense):無 序列 GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG 序列 I D N 0 . : 3 序列長度：1 4 序列型式：核酸 股性：單股 拓蹼學：線型 分子型式：其他核酸（合成之DNA) 假設：無 反義（Antisense):無 序列

CGAATTCAAG CTTA 序列表 ⑴一般資訊： (i) 申請人： (A) 名稱：Sankyo Company, Limited (B) 街名：5 -1, Nihonbashi Honcho 3 - c h o m e , C h u o - k u (C) 城市名：Tokyo 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（56 ) (E) 國名：Japan (F) 郵遞區域（Z IP) : 103 (G) 電話：81-3-5255-7111 (ii) 發明名稱：放線菌啟動子 (i i i )序列數目：3 (i v ) 電腦可讀取型式F 0 R Μ : (Α)介質型式：軟 (Β )電腦：I Β Μ P C相容 (C)操作条統：PC-D0S/MS - DOS (D )軟體：Patent I n Re 1 ease #1 · 0，Versiο η «1.30 (EPO) (vi) 先前申請數據： (A) 申請號碼：JP Hei 7-310247 (B) 申請人：29-N0V-1995 ⑵SEQ ID N0:1之資訊： (i ) 序列特徵： (A)長度：428鹼基對 (Β)類型：核酸， (C )股性：雙股 (D )拓蹼學：線型 (i i ) 分子類型：D N A (基因組） (i i i)假設：無 (i v ) 反意義：無 (v i ) 原來源： 一 5 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

562858 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（57) (A) 有機體：嗜碳鏈徽菌 (B) 菌株：SANK 62585(X i )序列描述：S E Q I D N Ο : 1 : CAGCAGGACC AGGACCTOGC CECGCAGITC GCCQCTATCG GGGAQCTCGA CCTCGGAGAT 60 CITCCCCAAC CGGCAGGCCT CGACCACEAG TTGGGCCCGG CTCDGCCACC TGCQCTAGAC 120 CGCCGCCTET CCCCTGaSQG CCCGGACCGC C^CCCGCrCC ATGCTGAGOG AGGCCTAACC 180 CACCTCECCE AGCTCETCCA AACTCECCAG CAQAATOGCG CnTCCAGIT CCTCECCECG 240 ACGACGCOGG CCTITGCGGr GCTCAAGGQG TQGITaSCTG GCCGGTrCCG TGGCaGGITC 300 GGCACTCrTTG GGCACCCCIG CCTCOUICT CICTOGCATA GGQGCCCTIG CGTTCITCCG 360 GCTQGACAGC CEAGCCTCCA ACTIAGAGAA CAGTCCGITC TnAACGTCT GAGGnTCGA 420 QQCTTTCG 428 ⑵SEQIDH0:2之資訊： (i ) 序列特徵：(A) 長度：22鹼基對(B) 類型：核酸， (C) 股性··單股(D )拓蹼學：線型(i i ) 分子類型：其他核酸 (A)說明：/ desc = ”合成之DNA”(i i i )假設：無(ί v) 反意義··無 (x ί )序列描述：SEQ ID Ν0:2: GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG (2) S E Q I D N 0 : 3 之資訊：一 59- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 『裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 562858 A7 B7 五、發明説明（58 ) (i ) 序列特徵： (A) 長度：14鹼基對 (B) 類型：核酸， (C) 股性：單股 (D )拓蹼學：線型 (i i ) 分子類型：其他核酸

(A)說明：/ desc = ”合成之DNA (i i i )假設：無 (i v ) 反意義：無 (X i )序列描述：S E Q I D N 0 : 3 : CGAATTCAAG CTTA 一60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 56(18^15 年 ？！曰 修正 公告氺 六、申請專利範圍 第85 1 14701號「放線菌啓動子」專利案 (92年8月15日修正） 六申請專利範圍： 1 . 一種具有轉錄啓動子活性之DNA ,該DNA係選自由 至少包括SEQ ID NO. 1核苷酸序列3 55至428之 7 4bp序列之DNA所組成之群，對應至1至428 bps 而非全部之緊鄰嗜碳鏈黴菌（心以以⑽ 以）開放編閱架構之丨kbp 5、非編碼 區’該開放編閱架構編碼P- 450sea_2細胞色素，且 該DNA使p-450sea.2細胞色素基因的轉錄活性成爲 持續性的（cons t i t u t i ve )，該DNA序列如下列SEQ ID NO: 1 所示：

   GGCACTCTIG GGCA.(XCCD3 GGTOG^CAGC CrAGCCTCX^ ACTIAGAGAA G^GTCCmTC •如申請專利範圍第1項之DNA，其具有轉錄啓動子 活性於至少一嗜碳鏈黴菌菌株中。 .如申請專利範圍第1項之DNA，其具有轉錄啓動子 562858 六、申請專利範圍 活性於至少一變鉛青鏈黴菌（67/77 / / K y心7? «5·)菌株中。 4 ·如申請專利範圍第1項之DNA ’其中該啓動子活性 爲持續性的。 5 ·如申請專利範圍第1項之DNA，其中該DNA長至 少 74bp 。 6 .如申請專利範圍第1項之DNA，其中該DNA長至 少 300bp 。 7.如申請專利範圍第1項之DNA，其長度少於lOObp。 8 .如申請專利範圍第1項之DNA，其直接對等於已去 除至少一鹼基對之該1 k bp 5非編碼區。 9 .如申請專利範圔第8項之DNA，其中該至少一鹼基 對藉由選自限制核酸內切酶、工程、該5 ’ -非編碼 區一端之消化的手段與其組合而去除。 1 〇 ·如申請專利範圍第1項之DNA，其直接對等於已以 53 ’方向部份消化之該1 kbp 5 ’ -非編碼區。 1 1 .如申請專利範圍第1項之DNA，其爲雙股。 1 2 .如申請專利範圍第1項之DNA，其係爲SEQ . ID . NO . 1序列之連續序列，其起自4 2 8及延續所有或 部份路線至鹼基對號碼1。 1 3 .如申請專利範圍第1項之DNA，其具有足以顯現 至少實質上對等於分別選自質體PSCA1013-A ( 1 0 1 3 / 428 )與 pSCA1013-A(l〇13/ 3 20 )之 320 與 562858 六、申請專利範圍 428bp DNA崁入段之啓動子活性的長度。 1 4 ·如申請專利範圍第1項之DNA，其足夠短而不受 顯著程度受質誘發。 15 .如申請專利範圍第1項之DNA，其具有SEQ ID NO . 1核苷酸序列1至428 。 16 ·如申請專利範圍第1項之DNA，其具有SEQ ID NO. 1核苷酸序列109至428。 1 7 .如申請專利範圍第1項之DNA，其具有SEQ ID NO . 1核苷酸序列271至428。 1 8 .如申請專利範圍第1項之DNA，其具有SEQ ID NO. 1核苷酸序列328至428。 19.如申請專利範圍第1項之DNA，其具有SEQ ID NO. 1核苷酸序列355至428。 2〇 .如申請專利範圍第1項之DNA，其取自臺灣食品 工業發展硏究所寄存號碼CCRC9 1 0067之變鉛青鏈 黴菌 SANK 6279 5 (57re〆⑽SANK 6 2 7 9 5 )(日本寄存號碼FERM BP - 5299之變鉛青鏈黴 菌 SANK 6 2 79 5 ) 〇 2 1 .如申請專利範圍第1項之DNA，其與開放編閱架 構呈操作性轉錄啓動子連接。 2 2 .如申請專利範圍第1項之DN A，其爲對應已去除 至少一驗基對之該1 k b p 5 1 -非編碼區。 23 . —種DNA股，其爲如申請專利範圍第η項之DNA 562858 六、申請專利範圍 的單股，而該DNA序列如下： SEQ ID NO:1 CAGCAGGACX： AGGAO^rCGC CGCGC^GTTC GCXGCTATCG GGGAGGTCGA CXITCGGAG^T 60 CTTCCCC^AC 033CAGG0〇r CGACC?VCGAG TTGGGCCD3G CTOSGCCACX： TGCGGIAG?VC 120 CGCOXOTT CCCUIO03GG CCCGQACaX! CMTCGCTCC ATGGTGAG03 AGQCCTAACC 180 CACCTOSCOS AGCTOoTCXA A^CTCGCTAG CAGAATOGCG aTrCGAGIT CCT0〇C03CG 240 # ACGACGCGGG CCmGCGCT GCTCAAGOGG TGGITCGCT3 GCOSCTTCCG TGGC03GITC 300 GGCACIGIT3 GGOICCCCTC CCTCCCCTCT CICTCGCMA GQ03CGCTTG OGTTCTTCGS 360 GCTGG^CAGC CIAGCCTCOV ACTIAGAGAA CACTCCCTTC.TTrAACKTCT GAQCTITCGA 420 GGGTITCG 428 〇 24. —種製造普拉斯坦錠鈉（pravastatin sodium)之 方法，其包含在含有ML-23 6B之培養基中培養之表 現系統，該表現系統之宿主含有如申請專利範圍第 1項之具轉錄啓動子活性之DNA的載體，該DNA 存於寄存微生物的質體中，其係選自由至少包括 SEQ ID N0.1核苷酸序列355至428之74bp序列 之DNA所組成之群，對應至部份但非全部之緊鄰嗜 碳鏈黴菌開放編閱架構之1 k b P 5 1 -非編碼區，該 開放編閱架構編碼Ρ-45〇〃3·2細胞色素’該DNA 係與另一開放編閱架構呈操作性轉錄啓動子連接， 當該宿主於表現該蛋白質之條件下培養時’表現系 統表現經由該另一開放編閱架構所編碼之蛋白質； 其中待表現之蛋白質爲P- 450sea.2細胞色素，且宿 562858 六、申請專利範圍 主爲變鉛青鏈黴菌SANK 5 2 7 9 5 (CCRC 9 1 0067 )，其 亦表現能使該細胞色素參與任一存在於系統內之 ML- 23 6B的羥基化作用之電子轉移系統，該培養 係於能使細胞色素P- 450sea.2產生、能使該ML-2 3 6B鈉藉由該細胞色素P- 45 0sea.2之催化作用轉化 爲普拉斯坦錠鈉、及能自該培養物回收普拉斯坦錠 鈉之條件下進行。 25 .如申請專利範圍第24項之方法，其中該ML- 2 3 6B 由與該宿主共培養之橘青黴菌77 k//7/謂 c i t r i n uw) M 。 26. —種製造所要蛋白質之方法，該方法包含於目的 爲製造蛋白質之情況下製造該蛋白質，且回收該蛋 白質之條件下，培養含有如申請專利範圍第1項之 具轉錄啓動子活性的DNA之載體的轉形宿主，其中 該宿主爲變鉛青鏈黴菌SANK 62795 (CCRC 910067)。 27. —種轉錄啓動子，其具有SEQ ID N0.1核苷酸序列1 至428，藉由培養寄存編碼FERM BP-5299(CCRC 9 1 0067)之變鉛青鏈黴菌SANK 62795、自細胞回收 ?3匚人1013-八（1 0 1 3/428)及以限制酶消化該質體而取得