FI81379B - Anvaendning av kluyveromyces-jaest saosom vaerd foer transformering och uttryckning av fraemmande gener. - Google Patents

Description

81379 KLUYVEROMYCES-hiivan käyttö isäntänä vieraiden aeenien transformoimiseksi ja ilmentämiseksi ··

AnvMndning av KLUYVEROMYCES-jSst säsorn värd för trans-formering och uttryckning av främmande gener

Keksintö koskee yhdistelmä-DNA-bioteknologiaa. Tarkemmin sanottuna kyse on yhdisteImä-DNA-bioteknologian käytöstä polypeptidien valmistamiseksi. Erityisesti keksintö koskee uusia yhdistelmä-DNA-kloonauksen välikappaleita ja niille sopivia Kluyveromyces-isäntäorganis-meja, joita voidaan käyttää suurien polypeptidimäärien, esim. entsyymien, kuten beta-galaktosidaasin (laktaasi) ja kymosiinin ja sen esiasteiden, tuottamiseksi.

Viime vuosina on havaittu, että mikro-organismit kykenevät tuottamaan niille vieraita peptidejä ja proteiineja, joita koodittavat vieraat, keinotekoisesti transfor-moinnin avulla siirretyt geenit, ja jotka ilmentyvät sää-telysekvenssien ohjaamina.

Joitakin tämän tekniikan perusmenetelmiä on selostettu esim. USA:n patenttijulkaisussa no. 4 237 224. Yhdistelmä-DNA-tekniikan päävälineet ovat: - haluttua ominaisuutta koodittava geeni, joka on varustettu isäntäorganismissa tapahtuvan ilmentämisen kannalta riittävillä ohjaussekvensseillä, - vektori, tavallisesti plasmidi, johon geeni voidaan sisällyttää, jotta stabiili replikoituminen tulee taatuksi ja mainittu geeni ilmentyy suurina määrinä, - sopiva isäntämikro-organismi, joka voidaan transformoida mainittua geeniä kantavalla vektorilla, ja solusystee-mi kykenee ilmentämään mainitun geenin informaation.

Nain saatuja tuotteita ovat esim. entsyymit, hormonit, antigeenit ja muut hyödylliset peptidit ja proteiinit .

Joitakin näistä tuotteista käytetään farmaseuttisina aineina, esim. kasvuhormonia ja interferonia, ja toisia 2 81379 apuaineina elintarviketeollisuudessa, esim. beta-galakto-sidaasi (laktaasi), kymosiini ja amyloglukosidaasi, ja eräitä biologisina katalyytteinä tiettyjen aineiden ntuun-tamistarkoituksessa.

Kaikki mahdolliset haitallisten mikro-organismien tai aineiden kontaminaatiot pitäisi välttää farmaseuttisissa aineissa ja elintarvikkeissa. Isäntäorganismien pitäisi myös olla vaarattomia henkilöille, jotka käsittelevät niitä kokeiden aikana tai suurimittakaa-vaisissa tuotantoprosesseissa. Näin ollen isäntäsolun sopivuuden edellytys on se, ettei se ole patogeeninen.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan soveltamisen alkuvuosina sovellettiin tiukkoja sääntöjä ja rajoituksia, jotta vältyttäisiin tai rajoitettaisiin haitalliset sivuvaikutukset, erityisesti patogeenisten mikro-organismien pääsy ympäristöön.

Vaikka huoli oletetuista riskeistä ilmeisesti olikin liiallinen, on kuitenkin jatkuvasti olemassa tarve löytää sellaisia isäntäorganismeja, joihin ei liity vaarallisia vaikutuksia.

Tähän asti plasmidien hyväksikäyttö geenitekniikassa eri tuotteiden valmistamiseksi on keskittynyt pitämään Escherichia colia isäntäorganismina. Pääsyy on se, että E. coli on historiallisesti parhaiten tutkittu organismi. Yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla tehdyissä ensimmäisissä keksinnöissä käytettiin E. colia isäntänä.

E. coli ei kuitenkaan ole kaikkein sopivin organismi farmaseuttisessa ja elintarviketeollisuudessa käytettyjen aineiden kaupalliseen tuottamiseen. Se saattaa jopa osoittautua sopimattomaksi isäntä-vektorisysteemiksi eräissä tilanteissa, koska sen käytön yhteydessä esiintyy lukuisia myrkyllisiä pyrogeenisiä tekijöitä. Näin ollen E. colilla on vain hyvin rajoitettu käyttö tuotanto-organismina käymisteollisuudessa. Myös E. coliin liittyvät proteolyyttiset aktiivisuudet voivat rajoittaa joi- 3 81379 denkin tuotteiden saantoja huomattavasti.

Nämä ja eräät muut näkökohdat ovat saaneet aikaan halun löytää vaihtoehtoisia isäntä-vektorisysteemejä. Mielenkiinto kohdistuu erityisesti eukaryoottisten systeemien käyttöön eukaryoottisten tuotteiden ollessa kyseessä. Jatkuvasti on olemassa tarve löytää uusia isäntäorganismeja, jotka ilman epäilyksiä soveltuvat kemiallisten aineiden, erityisesti elinturvikelaatua ja farmaseuttista laatua olevien aineiden, tuotanto-organismeiksi, ja jotka lisäksi soveltuvat suurimittakaavai-seen käymisteollisuuteen.

Monien turvallisten mikro-organismien nimet ovat ns. G-RAS-luettelossa (GRAS = Generally Recognized as Safe, yleisesti turvalliseksi tunnustettu). Kuitenkin tähän mennessä tunnetaan vain harvoja sellaisia geneettisiä menetelmiä, jotka kohdistuvat GRAS-organismien geenien kloonaukseen ja ilmentämiseen.

Kaupalliseen hyödyntämiseen soveltuvista eukaryoot-tisista organismeista hiivat ovat ehkä helpoimmin hallittavissa. Hiiva, erityisesti leivontahiiva, on suhteellisen halpaa, sitä on helppo kasvattaa suuria määriä ja sillä on erittäin kehittynyt geneettinen järjestelmä.

Termillä hiiva tarkoitetaan usein vain Saccharomyces cerevisiaeta tai leivontahiivaa, joka on yleisin ja tunnetuin laji. Huomattakoon, että tässä selityksessä hiivalla tarkoitetaan kaikkia sukuja, eikä siis rajoituta vain Saccharomyces cerevisiae-lajiin.

Äskettäin on raportoitu, että Saccharomyces cere-visiae-solut voidaan transformoida plasmideilla (A.

Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978),1929. Tässä hiivassa on onnistuttu kloonaamaan ja ilmentämään bakteeriperäiset ampisilliinin, kloramfenikolin ja ka-namysiinin suhteen vastustuskyvyn antavat geenit sekä eukaryoottiset geenit, kuten laktaasigeeni ja ovalbu-miinin ja leukosyytti-interferoni D:n heterologiset geenit ja Drosophila-geeni (vrt. C.P. Hollenbergin kat- 4 81379 sausta julkaisussa Current Topics in Microbiology and Immunology, 9J5 (1982) 1 1 9-144).

Tähän mennessä vain yhtä muuta hiivalajia on tutkittu hiivan ilmentämisvektorien isäntänä. Saccharo-myces cerevisiaen leusiinigeeni on onnistuneesti kloonattu ja ilmennetty Schizosaccharomyces pombessa (D.

Beach and P. Nurse, Nature 290 (1981) 140-142).

Hiivavektorit, joiden on kuvattu antavan onnistuneen transformaation, perustuvat luonnolliseen 2 ym-plasmidiin (2 mikronia), joka esiintyy monissa S. cere-visiae-kannoissa (ks. esim. J.D. Beggs, Nature 275 (1978), 104-109),ja autonomisesti renlikoituviin sekvensseihin (ARS = autonomously replicating sequence), jotka on johdettu hiivan kromosomaalisesta DNA:sta (ks. esim. K.

Struhl et ai., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 76^ (1979), 1035-1039), vastaavasti. Saccharomyces cerevisiae-vektoreita, joita voidaan käyttää transformointitarkoituksiin, on selostettu julkaisussa C.P. Hollenberg, Current Topics in Microbiology and Immunology, 9_6 (1982) 1 19-144.

Huonosti tunnettujen tai teollisten hiivalajien transformointia vaikeuttaa huomattavasti puute transfor-mointiolosuhteita ja sopivia vektoreita koskevasta tietämyksestä. Myöskään auksotrooppisia merkkejä ei ole usein saatavissa tai ne eivät ole toivottavia, jolloin ei voida suorittaa valintaa auksotrooppisen täydentämisen perusteella.

Nyt käsillä oleva keksintö tarjoaa Kluyveranyces-vektori-systeemin, joka kykenee ilmentämään siihen liitetyn polypeptidiä koodittavan sekvenssin.

Keksinnön mukaisesti voidaan geenitekniikan avulla valmistaa uusia Kluyveromyces-suvun hiivakantoja, jotka kykenevät vil jeltäessä tuottamaan polypeptidejä massatuotantoa varten.

Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet 5 81379

Kluyveromyces-suvun hiivakannat kykenevät viljeltäessä tuottamaan kymosiinia ja sen esiasteita massatuotantona.

Edelleen keksinnön mukaisesti valmistetut uudet Kluyveromyces-suvun hiivakannat kykenevät viljeltäessä tuottamaan laktaasia massatuotantona .

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmiä polypeptidien ja erityisesti entsyymien tuottamiseksi käyttämällä tuotanto-organismina yhdistelmä-DNA-tekniikalla keksinnön mukaisesti aikaansaatua Kluyveromyces-kantaa.

Keksintöä selostetaan seuraavassa tarkemmin.

Kluyveromyces-suvun hiivat ja erityisesti lajit K. lactis ja K. fragilis ovat bioteknologisesti tärkeitä ja kaupallisesti mielenkiintoisia. Esimerkiksi Kluyveromy-ces lactis- ja Kluyveromyces fragilis-kantoja käytetään laktaasientsyymin (beta-galaktosidaasi) kaupallisessa tuotannossa. Kluyveromyces organismit on merkitty GRAS-luetteloon.

Päinvastoin kuin useimmilla transformointikokeissa käytetyillä bakteeri lajeilla on hiivoilla soluseinä, jota plas-midit eivät pysty läpäisemään. Näin ollen hiivojen transformoinnin tavanomainen esivaihe on soluseinän poisto niin, että saadaan protoplasteja, jotka kykenevät ottamaan vastaan plasmideja. Sopivia soluseinää hajottavia entsyymejä ovat mm. beta-1,3-glukanaasit. Esimerkkinä voidaan mainita helikaasi, joka on Helix pomatia-etanan suolesta saatu epäpuhdas entsyymivalmiste.

On tunnettua, että soluseinä voidaan palauttaa myöhemmin sopivissa olosuhteissa tapahtuvalla inkuboinnilla.

6 81379

Kuitenkin vain osa protoplasteista regeneroituu ja Kluy-veromyces lactiksen kohdalla tämä prosessi on osoittautunut olevan jopa kaksikymmentä kertaa tehottomampi kuin Saccharomyces cerevisiaen kohdalla samoissa olosuhteissa .

Vaikka useat kirjoittajat ovatkin kuvanneet hiivojen transformointia protoplasteja käyttämällä, näyttää siltä, että jotkut hiivakannat ja erityisesti villihii-vakannat ja Kluyveromyces-lajit ovat hyvin vaikeita regeneroida.

Hollenberg (Current Topics in Microbiology and Immunology, 9<i (1982) 1 19-144) on selostanut, kuinka Saccharomyces cerevisiaen protoplastit voidaan myös regeneroida, jos tavallisesti osmoottisena stabiloijana käytetty sorbitoli korvataan 0,6M kaliumkloridilla. Nyt on yllättäen havaittu, että soveltamalla tätä menetelmää Kluy-veromyces-protoplasteihin nousee regeneroituneiden hiiva-solujen osuus jopa 3- - 5-kertaiseksi.

Äskettäin Ito et ai. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168) ovat selostaneet menetelmää, jossa protoplastien tilalla käytetään kokonaisia soluja, jolloin siis voidaan välttää regenerointivaihe. Tämän menetelmän on osoitettu olevan tehokas S. cerevisiaen kohdalla, kun käytetään tietyntyyppisiä plasmideja.

Nyt on havaittu, että tämä menetelmä on yllättäen tehokas Kluyveromyces-suvun kohdalla erityisesti, kun käytetään KARS-sekvenssejä (selostetaan jäljempänä) sisältäviä plasmideja.

Asiaan perehtyneet ymmärtävät, että sopivan vektorin saatavuus on erittäin tärkeätä. Etukäteen ei voida tietää, onko tietty isäntä-vektoriyhdistelmä onnistunut trans-formaatiosysteemi. Esimerkiksi S. Dasin ia C.P. Hol-lenbergin julkaisun (Current Genetics ^ (1982) 123-123 mukaan tiedetään, että plasmidi pMP81 voidaan siirtää transformoimalla Saccharomyces cerevisiae YT6-2-IL (cir°)-kantaan, mutta ei Kluyveromyces lactikseen. D.Beach ja 7 81379 P. Nurse ovat selostaneet julkaisussaan (Nature 290 (1981) 140-142), että plasmidilla pJDB219 on suuri kopiomäärä Saccharomyces cerevisiaessa, mutta se transformoi Schizosaccharomyces pomben hyvin pienellä taajuudella, joka on vain 2 transformanttia per mikrogramma DNA:ta.

Tähän mennessä Kluyveromyces-suvulle sopivia vektoreita ei ole ollut tiedossa.

Laajan tutkimuksen ja kokeilun tuloksena on löydetty vektoreita, jotka kykenevät transformoimaan Kluyvero-myces-isäntäorganismin, ja jotka lisäksi pystyvät replikoituinaan transformoituneessa solussa autonomisesti.

Uudet vektorit, jotka soveltuvat erittäin hyvin Kluyveromyces-suvulle ja erityisesti K. laciikselle ja K. fragilikselle, voidaan jakaa kahteen ryhmään niiden DNA-sekvenssien mukaan, jotka ohjaavat replikoitu-mista ja ylläpitoa esim. Kluyveromyces-lajeissa, nimittäin: 1. vektorit, jotka sisältävät autonomisesti replikoitu-via sekvenssejä (ARS), ja 2. vektorit, joissa ei ole autonomisesti replikoituvia sekvenssejä, mutta jotka sisältävät homologista Kluyvero-myces-DNA:ta, joka toimii yhtymäkohtana isännän kromosomin kanssa.

Sopivia ja edullisia ARS-vektoreita ovat Kluyvero-myces-peräiset, joista käytetään myös nimitystä KARS-vektorit. Mainittuja KARS-tyyppisiä vektoreita on edullista käyttää niiden suuren transformointitiheyden vuoksi. Toiseen ryhmään kuuluvat transformoivat tavallisesti pienellä frekvenssillä, mutta ne säilyvät isäntä-soluissa hyvin stabiilisti.

Ensimmäiseen ryhmään kuuluvia edullisia vektoreita ovat esim. K. lactis-lajista peräisin olevat KARS-vek-torit, joista pKARS12 ja pKARS2 ovat edullisimmat. pKARS12 ja pKARS2 ovat yhdistelmäplasmideja, joissa K. lactis-DNA-palanen, jossa on KARSI 2- ja KARS2-sekvenssi vastaavasti, on sisällytetty ennestään tun- s 81379 nettuun S. cerevisiae-plasmidiin YRp7.

Toiseen ryhmään kuuluva edullinen vektori on esim. pL4, joka on yhdistelmäplasmidi, joka koostuu ARS1:tä kantavasta plasmidista YRp7 ja LAC4-geeniä kantavasta K. lactiksen XhoI-DNA-palasesta.

Kluyveromyces-lajien transformointitarkoituksessa voidaan esimerkiksi seuraavia geenejä käyttää vektoreissa valintamerkkeinä: 1. S. cerevisiaesta johdettu tryptofaanigeeni (TRP1); 2. K. lactiksesta johdettu laktaasigeeni (LAC4); p 3. E. colista johdettu Kan -geeni, joka koodittaa vastustuskykyä antibioottisen G418:n suhteen, joka on sukua gentamysiinille.

Vektoreissa on sopivia restriktiokohtia, jotka mahdollistavat lisägeenien kloonauksen.

Transformoituneiden plasmidien stabiilisuutta voidaan parantaa huomattavasti, jos K. lactiksen tai S. cerevisiaen kromosomin sentromeerialue (CEN) sisällytetään vektoriin.

Myös Escherichia coli on sopiva isäntä, erityisesti kloonausta ja varastointia varten. Tässä tapauksessa £ ampisilliinin suhteen vastustuskyvyn antava geeni (Amp ) on myös sopiva merkki vektorissa. Plasmidit on edullista monistaa ja varastoida E. coli-soluissa, erityisesti DG75- tai JA221-kannassa. Transformoituneita kantoja viljellään selektiivisesti L-alustassa, jossa on: kanamysiiniä (20 pg/ml) E.coli-kantaa DG75 (PTY75-LAC4) varten ja ampisilliiniä (100 yg/ml) E. coli-kantaa DG75 (pL4) ja E. coli-kantaa JA221 (pKARS12) varten.

Mainitut transformoituneet kannat on taltioitu Euroopan patenttisopimuksen sääntöjen 28 ja 28a mukaan Hollantiin kokoelmaan Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, jossa niille on annettu numerot CBS 351.82 (=LMD 82.18), CBS 352.82 (=LMD 82.19) ja CBS 353.82 (=LMD 82.20) vastaavasti, taltiointipäivän ollessa 19. toukokuuta 1982. Plasmidit voidaan eristää soluista esim. menetelmällä L. Katz et ai., J. Bacteriol.

9 81379 114 (1973) 577.

Hiivaisännän protoplastit transformoidaan edellämainituilla vektoreilla tavallisessa inkubointiväliai-neessa, jossa on Trisiiä, kalsiumkloridia ja polyetylee-niglykolia, jonka molekyylipaino on välillä 2000 - 6000, mielellään 4000.

Prokaryoottiset transformantit voidaan helposti ha·'· vaita tunnetuilla, primääriseen valintaan tarkoitetuilla menetelmillä. Jos haluttua ominaisuutta ei voida tunnistaa transformantin fenotyypin perusteella, sisältää vektori kuitenkin tavallisesti yhden tai useampia geenejä, jotka koodittavat primäärisen valinnan perusteeksi soveltuvia ominaisuuksia, kuten vastustuskykyä antibiootin suhteen, tai geenejä, jotka koodittavat välttämättömiä kasvutekijöitä. Viimeksimainitussa tapauksessa pitäisi isännän vastaava auksotrooppinen mutantti olla saatavissa. Vaikka onkin saatavissa lukuisia auksotrooppisia prokaryootteja, on auksotrooppisten teollisten hiivojen lukumäärä melko vähäinen. Tuotantokannan geenissä tapahtunut mutaatio vaikuttaa usein epäedullisesti kyseisen kannan kasvuun ja tuotanto-ominaisuuksiin.

Keksinnönmukainen transformointi, jossa protoplastien tilalla käytetään Kluyveromyces-lajin kokonaisia soluja, on edullista suorittaa seuraavalla tavalla.

Keksinnönmukaisessa menetelmässä kasvatetaan Kluy-veromyces-soluja hiivan standardikasvualustassa ja solut otetaan talteen, kun ODg^onm on 1-25. Optimaaliset tulokset saavutetaan, kun on välillä 4 - 10.

Kluyveromyces-solut pestään ja esikäsitellään tiettyjen kaotrooppisten ionien, esim. Li+, Cs+, Rb+, kanssa.

LiCl ja Li2S04 ovat edullisia lopullisten väkevyyksien ollessa noin 20 mM - 0,2 M, mielellään n. 0,1 M, laskettuna yksivalenssisten ionien perusteella.

Kluyveromyces-soluja inkuboidaan mainittujen yksivalenssisten ionien kanssa noin 5-120 minuuttia, tavallisesti noin 60 minuuttia, 30°C:ssa, ja sen jälkeen inkuboidaan DNA:n kanssa. Transformoitumista voidaan edesaut- 10 81 379 taa, jos myöhemmin lisätään polyetyleeniglykolia. Yleensä käytetään yhtä suuri tilavuus 70% polyetyleeniglykoli 7000:a. Kluyveromyces-solujen transformoitumista voidaan vielä parantaa, jos soluille suoritetaan lämpökäsittely. Esimerkiksi käsiteltäessä noin 5 minuuttia noin 42°C:ssa, tapahtuu noin 20-kertainen paraneminen.

Tämä keksinnönmukainen toimenpide selostetaan yksityiskohtaisesti esimerkeissä siten, että Kluvveromyces lactis SD11, Kluvveranyces fragilis leu 24 ja Kluyvero-myces fragilis C21 ovat vastaavia isäntäorganismeja.

Päinvastoin kuin prokarvooteilla on antibiooteille vastustuskyvyn antavien geenien käyttö hiivoilla erittäin vaikeaa. Vain pieni määrä antibiootteja on aktiivisia hiivojen suhteen. Lisäksi ovat vastustuskykytekijät pääasiassa peräisin bakteereista, eikä ole lainkaan itsestään selvää, voidaanko niitä ilmentää hiivasoluissa ja käyttää selektiivisinä merkkeinä.

Kanamysiinin ja aminoglykosidi G418:n, joka on sukua gentamysiinille, on osoitettu olevan myrkyllisiä villi-hiivakannoille.

Lisäksi Hollenbergin julkaisusta Extrachromosomal DNA, ICN-UCLA Symp. (1979) 15:325-338 , Acad. Press, New

York, tiedetään, että siirrettävissä oleva vastustus-kykyelementti Tn601 (läsnä bakteeriplasmidissa pCR1) sisältää geenin, joka antaa vastustuskyvyn kanamysiinin suhteen Saccharomyces cerevisiae-transformanteille. A. Jimenez ja J. Davis, Nature 287 (1980) 869-871, osoittivat myöhemmin, että kanamysiinin vastustuskykygeeni voi myös antaa S. cerevisiae-transformanteille vastustuskyvyn G418-antibioottia vastaan, joka on voimakas hiivan kasvun estäjä.

Plasmidi PTY75-LAC4, joka on osa tätä keksintöä ja rakenteeltaan yhdistelmäplasmidi, joka koostuu plasmi-dista pCR1, S. cerevisiaen 2 ym-plasmidista ja plasmidin pK16 Sali-palasesta, jossa on K.laktiksen LAC4-geeni, 11 81379 sisältää saman vastustuskykygeenin. Nyt on havaittu, että tämä geeni ilmentyy myös Kluyveromyces laktiksessa siten, että kanta kykenee inaktivoimaan kasvualustasta ottamansa G418:n, joten tämä tarjoaa keinon Kluyveromyces lactis-transformanttien primäärisen valinnan suorittamiseen .

Vaikka plasmidi PTY75-LAC4 ei sisällä mitään Kluy-veromyces-solujen autonomisesti replikoituvaa sekvenssiä, havaittiin yllättäen, että plasmidit, jotka sisältävät S. cerevisiaen 2 ym-plasmidin, kuten PTY75-LAC4, replikoituvat autonomisesti Kluyveromyces-lajeissa.

PTY75-LAC4:llä transformoituneiden, G418:n suhteen vastustuskykyisten hiivasolujen valinta suoritettiin regenerointilevyillä, joissa oli glukoosia, sorbitolia ja 0,2 mg/ml G418. KC1 ei sovi tässä, koska suuren suo-laväkevyyden vuoksi Kluyveromyces lactis-solut eivät ole sensitiivisiä G418:lle edes niin suurissa väkevyyksissä kuin 0,8 mg/ml.

Vastustuskykyiset pesäkkeet ilmestyvät esiin 5-6 vuorokauden kuluessa PTY75-LAC4:llä tapahtuneesta trans-formoinnista. Oikeat transformantit voidaan erottaa sellaisista pesäkkeistä, jotka ovat tulleet vastustuskykyisiksi spontaanilla mutaatiolla, suorittamalla PTY75-LAC4-DNA:n läsnäolon tarkistus käyttämällä radioaktii-visesti merkityllä pCR1-DNA:lla tapahtuvaa pesäkehybri-disaatiota tai käytettäessä isäntäsoluna K.lactis lac4-mutanttia tarkistamalla kyky kasvaa minimikasvualustas-sa (hiivan perustyppialusta, yeast nitrogen base, Difco), jossa on laktoosi ainoana hiili lähteenä. Keskimäärin 5% vastustuskykyisistä pesäkkeistä havaittiin sisältävän PTY75-LAC4-DNA:ta tai olevan Lac+. Tällä valintamenetelmällä saatiin noin 4 transformanttia per mikrogramma plasmidi-DNA:ta.

Kun K. lactis SD69 lac 4-kannalle suoritettiin suora valinta LAC4-geenin suhteen käyttämällä levyjä, jois- 12 81 379 sa oli laktoosi ainoana hiililähteenä ja 0,6 M KC1 osmoottisena stabiloijana, saatiin 20 Lac+-transformanttia, kun oli inkuboitu 4-5 vuorokautta 30°C:ssa. DNA:ta sisältämättömillä vertailulevyillä ei havaittu Lac+-pesäk-keitä mainitun ajan kuluessa. Suorassa valinnassa löytyneiden Lac+-pesäkkeiden osoitettiin, olevan transfor-mantteja eikä spontaanin muutoksen tuloksia, koska Kan -merkin läsnäolo G418-levyillä voitiin osoittaa edelläkuvatulla tavalla.

Kun käytetään pL4- (vrt. esimerkki 3) tai KARS-tyyppiä olevia plasmideja, voidaan valinta suorittaa myös transforman- teissa olevan tryptofaaniprototrofian perusteella. Plasmidiin PTY75-LAC4 verrattuna aiheutti plasmidi pL4 huomattavan nousun transformoitumistehossa: havaittiin 30 transformanttia per mikrogramma DNA:ta. Kuitenkin KARS-tyypin plasmidit, 3 4 joilla on 10 -10 transformanttia per mikrogramma DNA:ta, vaikuttavat selvästi parhailta tässä suhteessa.

Plasmidin PTY75-LAC4 ja KARS:n sisältävien plasmidien havaittiin esiintyvän autonomisesti replikoituvina transformoituneissa soluissa. Tämä osoitettiin DNA-analyysin avulla. Transformanttien hajottamattomat minilysaatit analysoitiin Southernin pistemenetelmällä suorittamalla 32 hybridisaatio P:llä merkityllä pCR1:llä, joka on plasmidin PTY75-LAC4 bakteeriperäinen komponentti, tai radio-aktiivisesti merkityllä pBR322:lla, joka on pKARS-plas-midien bakteeriosa.

Vertailuelektroforeesi, joka suoritetaan Kluyveromyces lactis lac4-trpl-mutantin minilysaatille, joka ei ole transformoitu, ja puhdistetuille plasmidivalmisteille, osoittaa, että vain transformanteissa on läsnä sellaisia hybridisoituvia kaistoja, joiden elektroforeettinen liikkuvuus vastaa transformoinnissa käytetyn plasmidin moninkertaisesti kiertyneitä muotoja ja avorengasmuotoja.

Plasmidin läsnäolo transformoituneissa soluissa varmistettiin lisäksi transformoimalla E. coli hiivatransformanteista saadulla DNA-valmisteella ja eris- 13 81379 tämällä samat plasmidit muodostuneista E. coli-transfor-manteista.

Tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa Kluyveromyces lactis-lajiin kuuluviin isäntäkantoihin sekä Kluyveromyces fragilis-lajiin kuuluviin isäntäkantoihin. Molemmat lajit ovat turvallisia organismeja, jotka esiintyvät GRAS-luettelossa.

Erittäin hyödyllisiä isäntiä ovat Kluyveromyces lactis-mutantit SD11 lac4 trp1 ja SD69 lac4, jotka on johdettu villityyppiä olevasta CBS 2360-kannasta ja taltioitu Euroopan patenttisopimuksen sääntöjen 28 ja 28a mukaan 19. toukokuuta 1982 Hollantiin kokoelmiin Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, jossa niille on annettu numerot CBS 8092 ja CBS 8093 vastaavasti.

Transformoivat plasmidit pysyvät tavallisesti isäntä-solun sisällä erillisinä yksiköinä, jotka voivat replikoitua ja ilmentyä autonomisesti. Voidaan kuitenkin menetellä niin, että plasmideihin sisällyttämisen jälkeen geenit (replikoitumissekvenssien kanssa tai ilman) vielä integroidaan solun kromosomaaliseen DNA:hän.

Tämä ns. integroiva transformaatio näyttää tapahtuneen stabiileissa K. lactis SD11 trp1 Lac+-trans-formanteissa plasmidilla pL4 tapahtuneen transformaation jälkeen. Tässä tapauksessa transformantit eivät sisällä vapaata plasmidi-DNA:ta.

LAC4-geenin integroituminen voidaan osoittaa suorittamalla Southernin pisteanalyysi solun koko DNA:lie, joka on hajotettu restriktioentsyymeillä, ja jossa pL4- plas-midi toimii radioaktiivisesti merkittynä hybridisaatio-koettimena.

Jotta plasmidit saataisiin säilymään hiivatrans-formanteissa, voidaan käyttää esim. seuraavia selektiivisiä alustoja: hiivan perustyppialustaa (DIFCO), jossa on 2% laktoosia glukoosin tilalla, K. lactis SD69 lac4 (PTY75-LAC4)-kantaa ja K. lactis SD69 lac4 (pL4)-kantaa varten ja hiivan perustyppialustaa (DIFCO), jossa on 2% 14 81379 glukoosia, K. lactis SD11 lac4 trpl (pKARSl2)-kantaa varten .

On rakennettu yhdistelmäplasmidit, joissa on KARSI 2-LAC4- ja KARSI2-2 ym DNA-LAC4-sekvenssit.

Kun tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja uusia mikro-organismeja käytetään suurimittakaavaisessa tuotannossa, on edullista, jos kaikki bakteeriperäiset DNA-sekvenssit poistetaan vektoriplasmideista.

Soluun siirtämisen jälkeen geenit voivat pysyä autonomisesti replikoituvissa plasmideissa tai ne voivat olla intergoituneina isäntäsolun kromosomaaliseen DNA:han.

Keksintöä voidaan käyttää sekä prokaryoottisten että eukaryoottisten geenien kloonaukseen ja ilmentämiseen käyttämällä Kluyveromyces-organismia isäntänä ja käyttämällä erityisesti jotakin edelläkuvatuista plasmi-divektorityypeistä. Sopivia keksinnönmukaisesti käytettäviä prokaryoottisia geenejä ovat esim. laktaasia, alfa-amylaasia, amyloglukosidaasia ja beta-laktamaasia kooditta-vat geenit. Sopivia keksinnön mukaisesti käytettäviä eukary-oottisia geenejä ovat esim. laktaasia, kymosiinia, invertaa-sia ja interferonia koodittavat geenit. Näitä tuotteita koo-dittavien geenien liittämistä varten on sopivat restriktio-kohdat edelläkuvatuissa vektoreissa.

Tämän keksinnön mukaisesti voidaan käyttää sekä homologisia että heterologisia prokaryoottisia ja eu-karyoottisia geenejä. Keksintö soveltuu hyvin käytettäväksi kemiallisten aineiden, erityisesti polypeptidien, tuottamiseen suurina määrinä. Tämän keksinnön edullinen toteutustapa on maitoa juoksettavan entsyymin, ky-mosiinin, tuottamisessa.

Vektorin ja säätelevien tekijöiden valinta voi tietysti vaihdella tapauksen mukaan, kun geenejä kloonataan ja ilmennetään Kluyveromyces-soluissa.

Myös kyseeseen tuleva Kluyveromyces-isäntäkanta ja optimaaliset prosessiolosuhteet voivat vaihdella mm. valitun geenin ja vektorin mukaisesti. Optimaalinen valinta ja prosessiolosuhteet voidaan löytää rutiinikokeil- 15 81379 la. Kaikki nämä muunnokset kuuluvat tämän keksinnön kattamaan alaan.

Keksintöä valaistaan tarkemmin esimerkeillä, joissa kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavien geenien kloonaus ja ilmentäminen: a. homologinen beta-galaktosidaasigeeni (laktaasi) K. laetis-soluissa; b. heterologinen, prokaryoottinen Kan -geeni K. lactis-ja K. fragilis-soluissa; c. heterologinen, eukaryoottinen TRP1-geeni K. lactis-soluissa; d. heterologinen, eukaryoottinen LEU2-geeni K. fragilis-soluissa; e. heterologinen, eukaryoottinen geeni, joka koodittaa preprokymosiinia ja sen kypsymismuotoja, K. lactis-soluissa; ja f. heterologinen, eukaryoottinen geeni, joka koodittaa preprotaumatiinia ja sen kypsymismuotoja, K. lactis-soluissa.

Seuraavat esimerkit valaisevat eräitä tämän keksinnön to teutustapoja.

Esimerkki 1

Yhdistelmäplasmidi PTY75-LAC4 0,5 yg plasmidia pK16, jota R. Dickson on selostanut (Gene (1980) 347-356), ja 0,5 yg plasmidia PTY75, jota C.P. Hollenberg et ai. ovat selostaneet (Gene (1976) 33-47), hajotettiin restriktioentsyymillä Sali. Molemmat hajotustuotteet sekoitettiin keskenään ja restriktio-entsyymin inaktivoinnin jälkeen entsyymiliuosta inkuboi-tiin T4-ligaasin kanssa niin, että saatiin yhdistelmä-DNA:n liuos.

Tällä liitännäisseoksella transformoitiin E. coli- kanta DG75 (hsdS1 leu-6 ara-14 galK2 xyl-5 mt-1 rpsL20 thi-1 supE44-X -lac4z 39) käyttämällä R.C. Dickson et al:n menetelmää (Cell 1_5 (1978) 123-130), jolloin saatiin tu-

R R

loksena vastustuskyky kanamysiinin suhteen (Kan ). Kan - 16 81 379 pesäkkeille suoritettiin jatkovalinta Lac+-pesäkkeiden suhteen täydennettyä minimialustaa sisältävillä levyillä, jotka sisälsivät laktoosia ainoana hiililähteenä. Plas- R + midi PTY75-LAC4 eristettiin yhdestä Kan tae -transforman-tista käyttämällä L. Katz et al:n menetelmää, J. Bacteriol. 114 (1973) 577-591.

pKARS-yhdistelmäplasmidit 5 ug plasmidia YRp7 (Struhl et ai., Proc.Natl.Acad. Sei.,76^ ( 1 979) 1 035-39) hajotettiin restriktioentsyymil-lä Sali. 14 yg vi1likannasta K. lactis CBS 2360 saatua DNA:ta hajotettiin Xhol-entsyymillä. Plasmidin ja K. lactis-DNA:n palaset sekoitettiin keskenään suhteessa 1:3. Kun restriktioentsyymit oli inaktivoitu, liuoksen DNA-väkevyys säädettiin arvoon 25 vig/ml ja inkuboitiin T4-ligaasin kanssa standardiolosuhteissa (Boehringer).

Kun E. coli DG75 transformoitiin liitännäisseoksel- la tavallisissa olosuhteissa, saatiin seos, jossa oli 5 R 3 4,5x10 Amp -transformanttia, joista 9x10 sisälsi K.

lactis-liitännäisiä, joka voidaan päätellä niiden herkkyydestä tetrasykliinin suhteen. Tetrasykliinille herkkien solujen osuus voidaan lisätä 85 prosenttiin syklo-seriinikäsittelyllä, ks. F. Bolivar ja K. Backman, Enzymology 68 (1979) 245-267. Katz et al:n menetelmällä (ks. esimerkki 1) eristettiin 14 erilaista plasmidia, joille annettiin nimet 1-14. Kaikki kykenivät transformoimaan K. lactis SD11 lac4 trp1-kannan Trp+- 3 4 fenotyyppiseksi taajuudella 10 -10 per mikrogramma DNA:ta. Plasmidilla pKARS12 oli suurin transformointi- 4 taajuus (3x10 per mikrogramma DNA:ta), mutta plasmidi pKARS2 osoittautui edullisemmaksi jatkokäsittelyssä.

Saadut yhdistelmäplasmidit voitiin myös siirtää E. coli-kantaan JA221 (Λtrp E5, leu B6, lac y, rec A, hsdM+, hsdR ).

17 81379

Esimerkki 3

Yhdistelmäplasmidi pL4 YRp7- ja K. lactis-DNA-palasten seos valmistettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. E. coli DG75 transformoitiin liitännäisseoksella ja sen jälkeen viljeltiin levyillä minimaalisessa M9-agarissa, joka sisälsi laktoosia ainoana hiililähteenä, ja johon oli lisätty leusiinia. Lac+-pesäkkeet ilmestyivät, kun oli inkuboitu 8 vuorokautta 30°C:ssa. Plasmidi pL4 eristettiin yhdestä tällaisesta Lac+-pesäkkeestä käyttämällä Katz et al:n kuvaamaa menetelmää (ks. esimerkki 1).

Esimerkki 4

Kluyveromyces lactis SD69 lac 4 transformoitui G4l8RLac4+: ksi plasmidilla PTY75-LAC4

Kluyveromyces lactis-mutantin SD691ac4 solut suspen-doitiin kasvualustaan (pH 6,8), jossa oli 1% hiivauutet-ta, 2% peptonia ja 2% glukoosia. Kasvatusta jatkettiin, 7 kunnes saavutettiin eksponenttivaihe (3-5x10 solua per ml) .

Hiivasolut sentrifugoitiin talteen, pestiin vedellä ja suspendoitiin uudestaan liuokseen (pH 8,0), jossa oli 1.2 M sorbitolia, 25 mM EDTA ja 0,2 M tuoretta merkapto-etanolia. Kun oli inkuboitu 10 min 30°C:ssa, solut sentrifugoitiin, pestiin kahdesti 1,2 M sorbitoliliuoksella ja suspendoitiin uudestaan liuokseen (pH 5,8, 20 ml) . iossa oli 1.2 M sorbitolia, 10 mM EDTA, 0,1 M natriumsitraattia ja 10 mg helikaasia.

15-20 minuutin kuluessa muodostuneet protoplastit sentrifugoitiin, pestiin kolme kertaa 1,2 M sorbitolilla ja suspendoitiin uudestaan väkevyyteen noin 5x10^° solua per ml 0,1 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mM CaCl2 ja 1,2 M sorbitolia.

Seokseen lisättiin 10 Mg pTY75-LAC4-plasmidia ja in-kuboitiin 15 minuuttia 25°C:ssa. Sen jälkeen lisättiin 0,5 ml liuosta (pH 7,5), jossa oli 10 mM Tris, 10 mM CaCl2 ja 20 % (paino/tilavuus) polyetyleeniglykolia 4000, is 81379 ja inkuboitiin 20 minuuttia.

Protoplastit sentrifugoitiin erilleen ja suspendoi-tiin sen jälkeen väkevyyteen 5x10 ^ protoplastia per ml liuokseen (pH 6,8), jossa oli 7 mM CaC^, 1,2 M sorbitolia, 9,5 mg/ml hiivauutetta, 1 mg/ml peptonia ja 2 mg/ml glukoosia.

Kun oli inkuboitu 60 minuuttia 30°C:ssa, protoplastit sentrifugoitiin, pestiin 0,6 M KCl-liuoksella ja suspendoitiin uudestaan 0,6 M KCl-liuokseen.

Jotta voitaisiin valita G418:n suhteen vastustus- 9 kykyiset transformantit, 1x10 protoplastia kasvatettiin 3-prosenttisessa agarissa, joka oli levitetty 2-prosenttisten minimiagarlevyjen päälle, joissa oli 2 % glukoosia, 1,2 M sorbitolia ja 0,2 mg/ml G418-antibioot-tia. Jotta voitaisiin samanaikaisesti valita Lac+-

Q

transformantit, 5x10° protoplastia viljeltiin 3-prosenttisessa agarissa, joka oli levitetty 2-prosenttisten minimiagarlevy jen , DIFCO hiivan perustyppialusta, jossa oli 2% laktoosia ainoana hiililähteenä ja 0,6 M KC1 1,2 M sorbitolin tilalla.

Pesäkkeet ilmestyivät 4-5 vuorokauden kuluessa. Sor-bitolilevyillä, joissa ei ollut G418:aa, oli protoplas-tien regeneroituminen tavallisesti 0,2 - 0,5 %, kun taas 0,6 M KCl-levyillä, joissa glukoosi oli hiililähteenä, tämä prosentti oli noussut välille 0,5 - 1,5.

Kun valinnassa käytettiin G418:aa, saatiin yksi 7 transformantti per 10 regeneroitunutta protoplastia. Samanaikainen valinta laktoosilevyillä antoi 10 trans- 7 formanttia per 10 regeneroitunutta protoplastia tai 20 transformanttia per mikrogramma plasmidi-DNA:ta.

PTY75-LAC4-plasmidin läsnäolo hiivasoluissa voitiin osoittaa Southernin hybridisaatiomenetelmällä käyttä-32 . . mällä P:llä merkittyä pCR1:tä.

DNA-valmisteet tehtiin Struhl et ai:n menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. 7_6. (1979) 1035-1039).

19 81 379

Esimerkki 5

Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1 transformoitiin Trp+: ksi plasmidilla pKARS12 K. lactis-kannan SD11 lac4 trp1 transformoitiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla 10 ug:lla pKARS12-DNA:ta. Transformantit valittiin 2% minimiagarlevyillä, 4 joissa oli 2% glukoosia ja 0,6 M KC1. Saatiin 3,4 x10 Trp+-transformanttia per mikrogramma pKARSI2-DNA:ta.

Esimerkki 6

Kluyveromyces lactis SD69 lac4 transformoitiin Lac+:ksi plasmidilla pL4 K. lactis-kanta SD69 lac4 transformoitiin plasmidilla pL4 käyttämällä esimerkissä 4 plasmidin PTY75-LAC4 kohdalla kuvattua menetelmää. Transformantit valittiin hiivan perustyppialustalla (DIFCO), jossa on 2% laktoosia. Transformoitunasirekvenssi oli 20 trans-formanttia per mikrogramma plasmidi-DNA:ta.

Esimerkit 7-13

Kluyveromyces lactis-‘kannat, jotka transformoitiin plasmidilla pPTY75-LAC4 tai KARS-tyypin plasmideilla.

Transformointikokeet suoritettiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla muilla KARS-tyypin plasmideilla. Seu-raavassa taulukossa on esitetty tulosten yhteenveto. Vertailun vuoksi on mainittu myös esimerkissä 4 suoritetun kokeen tulos.

2o 81379

Esim. Kanta Genotyyppi Plasmidi Transformantteja KARS-pa- per mikrogramma lasten DNA:ta koko (kb) 4. SD6 9 lac4 PTY75-LAC4 20 7. SD11 lac4 trpl pKARSI 1.5x103 2.24 8. SD11 lac4 trpl pKARS2 5x103 1.24 9. SD11 lac4 trpl pKARS7 103 2.3 10. SD11 lac4 trpl pKARS8 5x103 1.85 4 11. SD11 lac4 trpl pKARSI0 2.4x10 3.15 5. SD11 lac4 trpl pKARSI2 3.4x104 5.0 12. SD11 lac4 trpl pKARS13 1.5x104 2.0 13. SD11 lac4 trpl pKARSI4 1.8x104 2.15 pKARS-plasmidien molekyylipainot määritettiin suorittamalla hajotus endonukleaaseilla EcoRI ja Hindlll ja käyttämällä 0,8 % agaroosigeeliä ja tavallisia molekyylipainon merkkiaineita.

Esimerkki 14

Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trpl transformoitiin Trp+: ksi KARS-2-sekvenssin sisältävillä plasmideilla käyttämällä transformoinnissa kokonaisia soluja K. lactis SD11 transformoinnissa käytettiin plasmi-dia pEK2-7. Tämä plasmidi sisältää tunnetun plasmidin YRp7, johon on liitetty 1,2 kb:n palanen, jossa on KARS-2: . sta johdettu autonomisesti replikoituva sekvenssi (kuva 2).

K. lactis SD11-kantaa kasvatettiin yön yli 30°:ssa alustassa, jossa oli 1 % hiivauutetta, 2 % peptonia ja 2 % glukoosia (pH 5,3). Kun optinen tiheys 0DgiQnm 4-®' so^ut otettiin talteen sentrifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 1000 x g. Solut pestiin TE-puskurilla (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ja pelletti suspendoitiin TE-puskuriin g väkevyyteen 2 x 10 solua per ml. Tämä suspensio laimennettiin yhdellä tilavuudella 0,2 M LiCl ja ravisteltiin 2i 81379 60 minuuttia 30°C:ssa.

Plasmidi-pEK2-7-DNA (10 yg) lisättiin 0,1 mitään litiumilla käsiteltyjä soluja ja inkubointia jatkettiin 30 minuuttia 30°C:ssa. Lisättiin yksi tilavuus 70 % polyetyleeniglykolia 7000 ja seosta inkuboitiin vielä 60 minuuttia 30°C:ssa. Seosta lämpökäsiteltiin 5 minuuttia 42°C:ssa ja solut pestiin steriilillä, demi-neralisoidulla vedellä. Soluja viljeltiin agarminimi-alustalla, jossa oli 2 % glukoosia ja 0,67 % hiivan perustyppialustaa.

Transformantit havaittiin, kun oli kasvatettu 36-48 tuntia 30°C:ssa.

Esimerkki 15

Kluyveromyces fragilis transformoitiin KARS-2-sekvenssin sisältävillä plasmideilla K. fragiliksen transformoimassa käytettiin kahta plasmidityyppiä. Ensimmäinen plasmidi pGB 180 rakennettiin kloonaamalla plasmidista pEK2-7 saatu 3,5 kb:n Bglll-palanen (kuva 2), jossa on K. lactiksen autonomisesti replikoituva KARS-2-sekvenssi ja S. cerevisiaen TRP1-geeni, plasmidin pJDB207 BamHl ^-kohtaan (J.D. Beggs,

Alfred Benzon Symposium ^6 (1981) 383).

Noin 36 K. fragilis leu-mutanttia, jotka oli saatu käsittelemällä K. fragilis UV-valolla, transformoitiin pGB:180:llakäyttämällä esimerkissä 14 kuvattua Li+-menetel-mää. Yksi mutantti, K. fragilis leu 24, transformoitui Leu+:ksi taajuudella noin 10^ tran sformanttia per yg plasmidi-DNA:ta.

Toinen plasmidi, pGL 2, rakennettiin kloonaamalla edelläkuvattu pEK2-7:stä saatu 3,5 kb:n palanen BamH1-kohtaan tunnetussa plasmidissa pACYCl77, Chang et ai., J. Bacteriol. 134 (1978) 1141-1156, joka sisältää trans-posonin Tn601, joka antaa vastustuskyvyn kanamysiinin ja gentamysiinijohdannaisen G418 suhteen.

K. fragilis C21-kanta transformoitiin plasmidilla pGL 2 esimerkissä 14 kuvatulla Li+-raenetelmällä. Trans 22 81 379 formoituja soluja kasvatettiin YNPD-agarlevyillä, joissa oli 50 yg G418 per ml. Transformantit havaittiin, kun oli inkuboitu 48 tuntia 30°C:ssa, kun taas spontaanisti vastustuskykyiset mutantit havaittiin vasta 6 vuorokauden kuluttua. DNA uutettiin K. fragilis-transformanteista ja siirrettiin transformoimalla sopiviin E. coli DG 75-soluihin. Kanamysiinin suhteen vastustuskykyisistä E. coli-soluista uutetusta DNArsta löydettiin plasmidi pGL2.

Nämä kokeet osoittavat, että K. fragilis-kannat voidaan transformoida KARS-sekvenssin sisältävillä plasmi-deilla, ja että nämä plasmidit replikoituvat autonomisesti K. fragiliksessa.

Esimerkki 16

Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1, joka ilmentää preprokymosiinia ja sen eri kypsymisasteita, kun on suoritettu transformointi plasmideilla, joissa on KARS-2-sekvenssi, preprokymosiinia ja sen eri kypsymismuotoja koodittavat rakennegeenit ja mainittujen rakennegeenien ilmentymistä ohjaavat promoottorit.

Tämä esimerkki koostuu useista vaiheista, joista oleellisimmat ovat: 1. Lisätään Sall-sidoksenmuodostajät kloonattujen rakennegeenien eteen, jotka koodittavat preprokymosiinia, prokymosiinia, pseudokymosiinia ja kymosiinia.

2. Liitetään edelläsaatuihin plasmideihin DNA-pa-lanen, jossa on autonomisesti replikoituva KARS-2-sek-venssi, joka on peräisin K. lactiksesta, ja TRP1-geeni, joka on peräisin S. cerevisiaesta.

3. Edelläsaatuihin plasmideihin liitetään eri promoottorit ohjaamaan preprokymosiinin eri kypsyysasteiden synteesiä.

Lähtöaineina naudan preprokymosiinin ja sen eri kyp-symisasteiden ilmentymiselle K. lactiksessa olivat seuraa-vat kloonatut rakennegeenit: 23 81379 - metionyyli-pseudokymosiini, symboli pUR 1531 - metionyyli-kymosiini, symboli pUR 1522 - metionyyli-prokymosiini, symboli pUR 1523 - metionyyli-preprokymosiini, symboli pUR 1524 Näiden plasmidien rakentaminen ja rakenne on selostettu yksityiskohtaisesti eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 82201272.0, joka on julkaistu 20. huhtikuuta 1983 numerolla 0077109. Geenit eristettiin ja nämä plasmidit rakennettiin mainitun selostuksen mukaisesti .

A. Sall-sidoksenmuodostajien liittäminen plasmideihin pUR1531, pUR 1522, pUR 1523 ja pUR 1524 (kuva 1)

Plasmidit pUR 1531, pUR 1522, pUR 1523 ja pUR 1524 sisältävät Eco R -katkaisukohdan juuri ATG-aloituskodo-nin edessä. Koska kymosiinigeenissä on läsnä toinen Eco R1-kohta, haluttiin Sall-sidoksenmuodostajamolekyyli liittää aivan ensimmäisen EcoR -kohdan eteen, jotta saataisiin liitetyksi erilaiset praroottorisekvsnssit, jotka ohjaavat liitoskohdasta etäämpänä o levien rakennegeenien ilmentymistä.

Noin 50 yg DNA:ta inkuboitiin 50 yksikön kanssa endo- nukleaasia EcoRI 60 minuuttia 37°C:ssa 125 yg/ml-.n etidium-bromidia läsnäollessa, kasvualustassa, jossa oli 10 mM Tris.HCl, 50 mM NaCl, 6 mM beta-merkaptoetanolia, 10 mM MgC^ ja 100 yg/ml naudan seerumialbumiinia, pH 7,5. Plasmidi-DNA muuttui näissä olosuhteissa pääasiassa lineaarisiksi ja avorenkaisiksi molekyyleiksi. DNA uutettiin yhdellä tilavuudella fenolia ja yhdellä tilavuudella kloroformia ja saostettiin yhdellä tilavuudella propanoli-2:ta.

DNA liuotettiin TE-puskuriin ja hajotettiin täysin endonukleaasilla Sali. Noin 1800 bp sisältävä DNA-pa-lanen eristettiin agaroosigeelistä elektroeluutiolla.

Palaset uutettiin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin propanoli-2:11a. Sakka liuotettiin TE-puskuriin.

Kohesiiviset päät täytettiin DNA-polymeraasin avulla seuraavalla tavalla: 24 81 379 15 yl:aan liuosta, jossa oli 1800 bp:n DNA-palanen (noin 1-2 ug) lisättiin 1 μΐ liuosta, jossa oli dATP, dGTP, dCTP ja dTTP 2 mM kutakin, 6,5 μΐ 4x lovipuskuria, jossa oli 0,2 M Tris.HCl (pH 7,2), 40 mM MgSO^, 4 mM ditiotreitolia ja 200 mg/ml naudan seerumialbumiinia, ja 2,5 μΐ vettä. Lisättiin 2 yksikköä DNA-polymeraasia (Klenow-palanen) ja seosta inkuboitiin 30 minuuttia 20°: ssa. Sitten DNA-polymeraasi inaktivoitiin kuumentamalla 5 minuuttia 70°C:ssa.

Tähän seokseen lisättiin fosforyloitua Sall-sidok-senmuodostajaa (valmistettu julkaisussa Maniatis et ai., Molecular Cloning, CSH, kuvatulla tavalla) sekä T4-DNA-ligaasia (10^ yksikköä) ja ATP:tä.

Kun oli inkuboitu 4 tuntia 22°C:ssa, jatkettiin inku-bointia vielä 16 tuntia 4°C:ssa. Sitten seosta inkuboitiin endonukleaasin Sali ja Hindlll kanssa ja elektro-eluutiolla otettiin aqaroosista talteen DNA-palanen, jonka koko oli noin 1500 bp.

Palaset (A,B,C,D) puhdistettiin fenoli- ja klorofor-miuutolla ja propanoli-2-saostuksella.

Nämä palaset liitettiin 3,3 kb:n Hindlll-Sall-pala-seen (noin 0,5 μg), joka oli johdettu plasmidista pPA153-209, ja jossa oli lämpöherkkä replikoni ja ampisillii-nin suhteen vastustuskyvyn antava geeni (koodittaa beta-laktamaasia), ja joka oli puhdistettu agaroosigeelistä elektroeluutiolla.

Yhteenliitetyillä molekyyleillä transformoitiin E. coli HB 101 ja ampisilliinin suhteen vastustuskykyiset, tetrasykliinille herkät kloonit valittiin viljeltäviksi ja niistä uutettiin plasmidi-DNA. Kun plasmidi-DNA hajotettiin endonukleaaseilla Sali, EcoRI ja Hindlll,voitiin todeta, että oli saatu plasmidit pGB131, pGB122, pGB123 ja pGB124 (kuva 1).

B. KARS2- ja TRP1-geenin liittäminen plasmideihin pGB131, PGB122, pGBl23 ja pGB124 vastaavasti

Autonomisesti replikoituvat sekvenssit, jotka oli' 25 81 379 johdettu Kluyveromyces-suvusta, jossa ne myös replikoi-tuvat, saatiin esimerkeissä 2 ja 7-15 kuvatulla tavalla. Plasmidissa pKARS-2 oleva autonomisesti replikoituva sekvenssi sijaitsee 1,24 kb:n palasessa ja tämä palanen kloonattiin tunnettuun plasmidiin YRp7, jolloin saatiin uusi plasmidi pEK2-7 (kuva 2). Kun pEK2-7 hajotettiin endonukleaasilla Clal, saatiin 3,5 kb:n ja 5,5 kb:n palaset vastaavasti. 3,5 kb:n palanen, jossa oli S. cere-visiaesta johdettu TRP1-geeni ja K. lactiksesta johdettu KARS-2-sekvenssi (kuva 2) eristettiin agaroosigeelistä elektroeluutiolla ja liitettiin Clal:llä hajotettuihin plasmideihin pGB131, pGBl22, pGB123 ja pGBl24 vastaavasti. Saadulla seoksella transformoitiin E. coli JA300 (trpC) ja Trp+-transformanteista uutetun plasmidi-DNA:n karakterisointi vahvisti plasmidien pGBl51, pGB152, PGB153 ja pBG154 rakenteen vastaavasti (kuva 2).

C. Erilaisten promoottorjsekverssien liittäminen plasmideihin ohjaamaan preprokymosiinin eri kypsymismuotojen synteesiä Sällillä hajotetut plasmidit, joissa on KARS-2-sek-venssi, TRP1-geeni ja preprokymosiinin tai sen eri kypsymismuoto jen rakennegeeni, soveltuvat hyvin ottamaan vastaan Sall-sidoksenmuodostajaan liitettyjä promoottori-sekvenssejä ohjaamaan niistä etäämpänä olevien rakenne-geenien ilmentymistä K. lactis-transformanteissa.

Useimmissa tapauksissa promoottorisekvenssit pitää varustaa Sall-sidoksenmuodostajilla. Mikä tahansa pro-moottorisekvenssi voidaan varustaa Sall-sidoksenmuodosta-jalla, mitä selvennetään seuraavilla esimerkeillä: 1. isosytokromi c1-pranoottori, joka on saatu S. cerevisi-aesta, 2. laktaasipraroottori, joka on saatu K. lactiksesta.

C\. Sall-sidoksenmuodostajien liittäminen S. cerevisi-aesta saatuun isosytokromi c1-promoottoriin ja plasmidei- 26 81 379 hin liittäminen (kuva 3) Lähtöaineena käytettiin plasmidia pYeCYCI, jossa oli isosytokromi c1-geeni kloonattuna plasmidiin pBR322 (G. Faye et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981) 2258).

Nukleotidisekvenssikartan perusteella tiedetään, että isosytokromi c1-geenissä on EcoRI-kohta nukleotidissa + 8 ( ibid.) .

Plasmidi pYeCYCI katkaistiin endonukleaasilla EcoRI ja liitettiin yhteen T4 DNA-ligaasilla ja liitännäisellä transformoitiin E. coli HB101, jolloin saatiin plasmidi pC15, jossa oli 1 930 bp:n palanen, joka sisälsi promoottorin ja 8 nukleotidia isosytokromi c1-geenistä.

Plasmidi pd5 katkaistiin endonukleaasilla EcoRI ja inkuboitiin nukleaasin Bal31 kanssa lyhyen aikaa, jotta saatiin poistetuksi vain muutama nukleotidi.

Bal31:llä hajotetut päät muunnettiin tylpiksi DNA-polymeraasi11a (Klenow-palanen) ja tähän DNA:han liitettiin fosforyloitu EcoRI-sidoksenmuodostaja. Kun oli inkuboitu endonukleaasin EcoRI-kanssa, suoritettu liittäminen ja transformoitu E. coli, tunnistettiin transformant-ti pC15-R12, jossa oli poistettu 12 nukleotidia syto-kromi c1-geenistä. Sall-sidoksenmuodostaja liitettiin katkaisemalla plasmidi pC15-R12 endonukleaasilla EcoRI, täyttämällä kohesiiviset päät DNA-polymeraasilla, liittämällä fosforyloitu Sall-sidoksenmuodostaja, inkuboimalla endonukleaasilla Sali ja saatu 1070 bp:n palanen kloonattiin uudestaan plasmideihin pGB151, pGB152, pGBl53 ja pGBl54 vastaavasti, jotka oli hajotettu Sällillä, jolloin saatiin isosytokromi d-promoottorin sisältävät plas-midit pGB161, pGB162, pGBl63 ja pGB164 vastaavasti, kun suoritettiin identifiointi pesäkehybridisaatiolla käyttä-mällä koettimena Prllä merkittyä 1070 bp:n palasta. Plas-midi-DNA valmistettiin positiivisista klooneista ja isosytokromi c 1-promoottorin oikea suunta varmistettiin 850 bp:n palasen läsnäololla Smal-endonukleaasihajotuksen jälkeen.

27 81 379 C2. Sall-sidoksenmuodostajien lisääminen Kluyveromyces lactiksesta saatuun laktaasipromoottoriin ja sen Liittäminen plasmideihin.

Lähtöaineena oli plasmidi pKl6, jossa oli K. lactik-sen laktaasigeeni kloonattuna plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan (R.C. Dickson and J.S. Markin, Cell 1_5 (1978), 123) .

Kun suurista osista laktaasirakennegeeniä ja sen promoottoria määritettiin sekvenssi, todettiin Clal-kohdan läsnäolo laktaasirakennegeenin paikassa noin 450 bp.

Plasmidi pKl6 hajotettiin endonukleaasilla Clal ja palanen, joka sisälsi pronoottorin ja noin 450 bp raken-negeenistä, kloonattiin uudestaan plasmidiin pBR322, joka oli hajotettu endonukleaaseilla Clal ja Accl (osittain) . Yhdessä plasmidissa, pGBl82, laktaasirakennegeenin noin 450 bp:n paikassa oleva Clal-kohta avattiin inkuboimalla endonukleaasilla Clal ja lyhennettiin inkuboimalla Bal31-nukleaasin kanssa. Bal31-päät tehtiin tylpiksi inkuboimalla DNA-polymeraasin kanssa ja fosfory-loitu EcoRI-sidoksenmuodostaja liitettiin tähän lyhennettyyn palaseen.

Kun lyhennetty palanen hajotettiin endonukleaasilla EcoRI ja suoritettiin uudelleenkloonaus, saatiin plasmidi pGBl83, jossa laktaasipranoottori oli jäljellä, mutta rakennegeeni oli poissa.

Sall-sidoksenmuodostajät lisättiin tähän palaseen aikaisemmin tässä esimerkissä (16.C1) kuvatulla tavalla. Sall-sidoksenmuodosta j illa varustettu laktaasipromoottori liitettiin Sall:llä katkaistuihin plasmideihin pGB151, pGB152, pGB153 ja pGB154 vastaavasti, jolloin saatiin plasmidit pGB171, pGBl72, pGB173 ja pGB174 vastaavasti.

Tässä esimerkissä 16 kuvatulla tavalla saadut plasmidit siirrettiin Kluyveromyces lactis SD11 lac4 trp1-kantaan Li+-menetelmällä esimerkissä 14 kuvatulla tavalla ja valittiin Trp+-transformantit.

Preprokymosiinin ja sen kypsymisasteiden läsnäolo Kluyveromyces-uutteissa osoitettiin immunologisilla ELISA- 28 81 379 menetelmillä ja täplittämällä uutenäytteet nitrosellu-loosasuotimille ja mittaamalla suotimet D.J. Kempin ja A.F. Cowmanin kuvaamalla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 4520-4524).

Solu-uutteet valmistettiin seuraavalla tavalla: K. lactis-transformantteja kasvatettiin noin 16-24 tuntia 30°C:ssa YNB-alustassa, jossa oli 2% dekstroosia.

Kun optinen tiheys ODg^onm välillä 2,2-6,0, solut otettiin talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 6000 kierr./min. Sorvali G-S3-roottorissa. Pelletti suspendoitiin uudestaan tislattuun veteen niin, että optiseksi tiheydeksi tuli 600, ja jäähdytettiin jäällä.

0,5 ml tätä solususpensiota laimennettiin 0,5 ml: 11a jääkylmää vettä ja mukaan sekoitettiin 2 g Ballo-tini-helmiä (halkaisija 0,25-0,35 mm, Braun-Melsungen GMBH, Länsi-Saksa).

Solut rikottiin ravistelemalla 4 minuuttia Vortex-sekoittimella maksiminopeudella.

Yli 95% soluista hajosi, kun tarkistettiin faasi-kontrastimikroskoopilla. Rikkinäinen solumateriaali poistettiin sentrifugoimalla 1 minuutti Eppendorf-sentri-fugilla. Uute-erät jäädytettiin nestemäisellä typellä ja varastoitiin -80°C:ssa.

1-5 yl:n solu-uute-erät täplitettiin nitroselluloo-sakalvosuotimille. Suotimet kuivattiin, kostutettiin liuoksella, jossa oli 192 mM glysiiniä, 25 mM Tris, 20 % etanolia (pH 8,3), ja inkuboitiin 60 minuuttia 22°C: ssa.

Sitten suotimia inkuboitiin esi-inkubointipuskurin (0,35 M NaCl, 10 mM Tris.HCl (pH 7,6), 2 % naudan seerumi-albumiinia) kanssa 30 minuuttia. Suotimia pestiin kolme kertaa 5 minuutin ajan RIA-puskurilla (0,125M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 0,1 mM PMSF, 1% Triton X100, 0,5 % natriumdesoksikolaattia, 0,1 % natriumdodekyylisulfaat-tia ja 0,3 % liivatetta). Suotimia inkuboitiin yön 29 81 379 yli 4°C:ssa 1 mlrssa RIA-puskuria, jossa oli 10 μιΐ ky-mosiinivastaseerumia. Vastaseerumi poistettiin pesemällä RIA-puskurilla (kolme kertaa) ja inkuboitiin 1 25 1 μ Ci:n kanssa I-proteiini A:ta 1 ml:ssa RIA-puskuria 60 minuuttia 22°C:ssa.

125 I-proteiini A poistettiin pesemällä RIA-pusku-ri11a (5 kertaa).

Suotimet kuivattiin ja autoradiografoitiin yön yli. Preprokymosiinin tai sen kypsymisasteiden läsnäolo K. lactis-transformanteissa havaittiin selvästi.

Kymosiiniaktiivisuuden läsnäolo K. lactis-trans-formanteista saaduissa solu-uutteissa määritettiin korkea-painenestekromatografisesti (HPLC) julkaisussa A.C.M. Hooydonk ja C. Olieman, Netherl. Milk Dairy _36 (1982), 153 kuvatulla tavalla.

50 yl entsyymiliuosta tai -uutetta lisättiin 1 ml: aan 10 % maitojauheliuosta (Difco), joka oli tehty 10 mM CaC^ieen. Liuosta inkuboitiin 15 minuuttia 31°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 2 ml 12% trikloorietikka-happoa (TCA). Lähes kaikki proteiinit saostuvat TCArlla, paitsi glykomakropeptidi (GMP), joka on lohjennut kaseiinista kymosiinin vaikutuksesta.

Denaturoituneet proteiinit pelletoitiin sentrifugoi-malla ja 1 ml kirkasta emäliuosta neutraloidaan 0,4 ml :11a 1N NaOH.

Liuos sentrifugoitiin uudestaan ja muodostuneen GMP:n määrä havaittiin seuraamalla ekstinktiota HPLC:n avulla aallonpituudella 214 nm.

Niitä K. lactis-transformanttiuutteita, joissa oli pro-kymosiinia, inkuboitiin ensin 2 tuntia pH 2:ssa ja sen jälkeen neutraloitiin ja vasta sitten suoritettiin kymo-siiniaktiivisuudenmääritys. Kymosiini havaittiin vain, kun oli käsitelty pH 2:ssa.

30 81 379

Esimerkki 17

Kluyveromyces SD11 lac4 trp1, joka ilmentää prepro-taumatiinia ja sen eri kypsymisasteita sen jälkeen, kun se on transformoitu plasmidilla pURK 528-01, joka sisältää preprotaumatiinia koodattavan rakennegeenin, K. lactiksesta saadun KARS2-sekvenssin, S. cerevisiaesta saadun glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasipromoottorin ja S. cerevisiaesta saadun TRP1-geenin.

Tämä esimerkki koostuu lukuisista vaiheista, joista oleellisimmat ovat: 1. Sellaisten kloonien eristäminen, jotka sisältävät S. cerevisiaen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-operonin (GAPDH) S. cerevisiae-hiivan DNA-kokoelma (DNA pool) valmistettiin E. coli-hiivayhdistelmäplasmidiin pFLl (M.R. Chevallier et ai., Gene 21 (1980) 11-19) samanlaisella menetelmällä, jota on selostettu julkaisussa M.

Carlson ja D. Botstein, Cell 2jJ (1982) 145-154. Puhdistettu hiivan DNA hajotettiin osittain restriktioendo-nukleaasilla Sau 3A ja saadut DNA-palaset (joiden keskimääräinen koko oli 5 kb) liitettiin T4 DNA-ligaasin avulla oFL1 :n defosforyloituun BamHI-kohtaan. Kun CaCl2:lla käsitellyt E. coli-solut oli transformoitu yhteen- liitetyllä materiaalilla, saatiin noin 30 000 ampisil-liinin suhteen vastustuskykyisen pesäkkeen kokoelma. Nämä pesäkkeet seulottiin hybridisaatiomenetelmällä (R.E.

Thayer, Anal. Biochem. , 9ί) (1 979) 60-63) käyttämällä 32 koettimena kemiallisesti syntetisoitua, P:llä merkittyä oligomeeriä, jonka sekvenssi oli 5'TACCAGGAGACCAACTT3'.

J.P. Hollandin ja M.J. Hollandin (J. Biol. Chem., 255 (1980) 2596-2605) mukaan tämä oligomeeri on komplementaarinen GAPDH-geenin sille DNA-sekvenssille, joka koodit-taa aminohappoja 306-310 (viimeisen aminohapon epävarma emäs jätettiin pois oligomeeristä). Kun käytettiin julkaisussa R.B. Wallace et ai.. Nucleic Acids Res., (1981) 879-894, kuvattuja hybridisaatio-olosuhteita, saatiin 3' 81379 kuusi positiivista transformanttia. Yksi näistä nimettiin plasmidiksi pFLl 1-33. Viimeksimainittu plasmidi sisälsi GAPDH-geenin, jossa olivat mukana sen promoottori-/ säätöalue ja sen transkription päätös/polyadenylointi-alue. pFL1 1-33:n noin 9 kb pitkä liitännäinen karakterisoitiin restriktioentsyymianalyysillä (kuva 4) ja osittaisella nukleotidisekvenssianalyysillä (kuvat 5 ja 6) .

2. GAPDH:n promoottori/säätöalueen eristäminen ja sen liittäminen preprotaumatiinia koodittavaan plasmidiin

Plasmidin pFLl 1-33 liitännäiselle suoritetun rest-riktioentsyymianalyysin ja nukleotidisekvenssitietojen perusteella GAPDH-geenin DNA:n sisältämä aloitus/säätö-alue eristettiin 800 nukleotidia pitkänä Ddel-palasena. Jotta tämä prancot tori jakso saataisiin identifioiduksi, plasmidipFLl 1-33 hajotettiin Sällillä ja saaduille 3 DNA-palaselle tehtiin Southernin pistehybridisaatiokoe käyttämällä kemiallisesti syntetisoitua oligomeeriä (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 9J3 ( 1 975) 503-51 7).

Positiivisesti hybridisoituva 4,3 kbrn restriktiopa-lanen eristettiin preparatiivisen mittakaavan elektroeluu-tiolla 0,7 % agaroosigeelistä ja katkaistiin sen jälkeen Ddelillä. Saaduista Ddel-palasista vain suurimmassa oli PvuIIin tunnistuskohta, joka katkaisukohta sijaitsee GADPH-regulonialueen sisällä (kuva 4). Suurin Ddel-pa-lanen eristettiin ja sitä inkuboitiin Klenow-polymeraa-sin ja neljän dNTPin kanssa (A.R. Davis et ai., Gene 10 (1980) 205-218) niin, että saatiin tylppäpäinen DNA-molekyyli. Reaktioseos uutettiin fenoli-kloroformiseok- sella (50/50 tilavuusosina), vesikerros laskettiin Sepha- ® dex G50-pylvään läpi ja välisijatilavuudessa oleva materiaali saostettiin etanolilla ja sen jälkeen DNA-palanen 32 varustettiin Pillä merkityllä EcoRI-sidoksenmuodosta-jalla 5'GGAATTCC3' inkuboimalla T4 DNA-ligaasin kanssa. Klenow-polymeraasireaktion ja sitä seuraavan EcoRI-si- 32 81 379 doksenmuodostajän liittämisen jälkeen olivat alkuperäiset Ddel-kohdat palautuneet regulonipalasen päihin. Ligaasin inaktivoimiseksi reaktioseosta kuumennettiin 10 minuuttia 65°C:ssa, sitten lisättiin natriumklori-dia (lopullinen väkevyys 50 mmol/1) ja koko seosta in-kuboitiin EcoRI:n kanssa. Inkubointi lopetettiin uuttamalla fenoli-kloroformiseoksella, DNA saostettiin kahdesti etanolilla, suspendoitiin uudestaan ja liitettiin sen jälkeen sopivaan vektorimolekyyliin. Koska Ddel-palanen oli varustettu EcoRI-kohdilla, se voitiin helposti liittää pUR 528 Edens et ai., Gene 18 (1982) 1-12:n EcoRI-kohtaan niin, että saatiin plasmidi, jossa hiivan reguloni oli preprotaumatiinia koodattavan rakennegeenin vieressä. Viimeksimainittu plasmidi saatiin katkaisemalla pUR 528 EcoRI:llä, jonka jälkeen linearisoitu plasmidimolekyyli käsiteltiin fosfataasilla (naudan sisäelin), jotta saatiin estetyksi itsestään tapahtuva yhteenliittyminen, ja sitten kutakin näistä vektorimolekyyleistä sekä puhdistettua Ddel-pranoottoripalasta inkuboitiin T4-DNA-ligaasin kanssa. Kun eri liitosseoksilla suoritettiin CaC^^Ha käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transfor-mointi, saatiin useita ampisilliinin suhteen vastustuskykyisiä pesäkkeitä. Plasmidi-DNA eristettiin joistakin näistä pesäkkeistä (H.C. Birnboim and J. Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523) ja inkuboitiin PvuII:n kanssa, jotta saatiin testatuksi liitännäisen suunta.

Plasmidien nimeämisessä sellaiset, joissa on EcoRI(Ddel)-GAPDH-regulonipalanen oikeassa suunnassa (so. transkriptio GAPDH-regulonista lähtien tapahtuu alapuolella sijaitsevan rakennegeenin suuntaan), on merkitty lisäämällä plasmidin alkuperäiseen koodiin -01 (esimerkiksi pUR 528 muutetaan pUR 528-01:ksi, ks. kuva 7) .

Toinen kahdesta EcoRI-kohdasta tuhottiin, jotta EcoRI-regulonipalasen sisältävien plasmidien muokkaus olisi helpompaa. 2 ug plasmidi-DNA:ta (esim. pUR 528- 33 81 379 01) hajotettiin osittain EcoRIrllä ja sen jälkeen inkuboi-tiin 5 yksikön kanssa Mung-pavun nukleaasia (P.L. Bioche-micals Inc.) 200 μΐ-.ssa reaktioseosta, jossa oli 0,5 mol/1 natriumasetaattia (pH 5,0), 0,05 mol/1 natriumkloridia ja 0,001 mol/1 sinkkikloridia, 30 minuuttia huoneenlämpötilassa lomittaisten päiden poistamiseksi. Nukleaasi inakti-voitiin lisäämällä SDS:ää lopulliseen väkevyteen 0,1% (D. Kowalski et ai.. Biochemistry 1J5 (1976) 4457-4463) ja DNA saostettiin lisäämällä 2 tilavuutta etanolia. Sitten line-arisoidut DNA-molekyylit yhdistettiin uudestaan renkaiksi inkuboimalla T4 DNA-ligaasin kanssa ja niillä transformoitiin CaCl2:lla käsitellyt E. coli-solut. Ampisilliinin suhteen vastustuskykyisistä pesäkkeistä eristetty plasmidi-DNA tutkittiin hajottamalla EcoRI:llä ja Mlul:llä, jotta saatiin selville ainoan EcoRI-kohdan läsnäolo taumatiini-geenin vieressä (ks. kuva 7).

Plasmideista, joissa on GAPDH-promoottoripalanen, mutta vain yksi ainoa EcoRI-tunnistuskohta alapuolella sijaitsevan rakennegeenin ATG-aloituskodonin vieressä, käytetään nimitystä -02-plasmidit (esimerkiksi pUR 528-01 muutetaan plasmidiksi pUR 528-02, ks. kuva 7).

3. Alkuperäisen GAPDH-promoottori/säätöalueen rekonstruointi preprotaumatiinia koodittaviin plasmideihin liittämällä synteettinen DNA-palanen (kuva 8)

Kuten kuvan 5 mukaisessa nukleotidisekvenssissä on esitetty, sisältää EcoRI(Ddel)-GAPDH-promoottoripalanen alkuperäisen GAPDH-promoottori/säätöalueen nukleotidit -850 - -39. Tämä promoottoripalanen ei sisällä GAPDH:ta koodittavan sekvenssin alkukodonia ATG edeltäviä 38 nukleotidia. Viimeksimainittu 38 nukleotidin pituinen sekvenssi sisältää PuCACACA-sekvenssin, joka löytyy useista hiivageeneistä. Mainittu PuCACACA-sekvenssi sijaitsee 34 81 379 noin 20 bp translaation aloituskohdan yläpuolella (M.J. Dobson et ai., Nucleic Acids Res., 1_0 (1 982) 2625-2637) ja muodostaa ATG-kodonin yläpuolelle sellaisen nukleotidisekvenssin, joka on optimaalinen proteiinin aloitukselle (M. Kozak, Nucleic Acids Res. 9 (1981) 5233-5252). Lisäksi nämä nukleotidit tekevät mahdolliseksi pienen rengasrakenteen muodostumisen, joka saattaa olla osallisena GAPDH-geenin ilmentymisen säätelyssä. Edellämainittujen näkökohtien perusteella katsottiin tarpeelliseksi liittää 38 nukleotidia Ddel-pronoottoripalasen ja sen alapuolella olevan rakennegeenin ATG-kodonin väliin, jotta promoottorin aktiivisuus ja luennan aloitus saatiin paremmiksi.

Kuten kuvassa 9 on kaaviollisesti esitetty, puuttuva DNA-palanen saatiin syntetisoimalla kemiallisesti kaksi osittain päällekkäistä oligomeeriä. Kahden oli-gonukleotidin päällekkäisissä osissa olevat Sacl-kohdat sijoitettiin kahdesta syystä: (i) jotta voitaisiin muo kata välittömästi ATG-kodonin yläpuolella olevaa nukleo-tidisekvenssiä, mukaanlukien poly-A-häntäisten hiivan ilmentämisvektorien rakentaminen; (ii) jotta saataisiin katkaisukohta ulostyöntyviä 3'-päitä synnyttävälle entsyymille, jotka päät voidaan helposti ja toistettavasti poistaa inkuboimalla T4 DNA-polymeraasin kanssa neljän dNTP:n läsnäollessa. Ekvimolaariset määrät molempia puhdistettuja oligomeerejä fosforyloitiin 5'-päistään, hybridisoitiin (J.J. Rossi et ai., J. Biol. Chem. 257 (1982) 9226-9229) ja muunnettiin kaksisäikeisiksi DNA-molekyyleiksi inkuboimalla Klenow-DNA-polymeraasin ja neljän dNTP:n kanssa edellä kaksisäikeisen DNA:n synteesin kohdalla kuvatuissa olosuhteissa (A.R. Davis et ai., Gene Kj (1980) 205-218). Kun reaktiotuotteet analysoitiin elektroforeesin avulla 13 % polyakryyliamidigeelis-sä ja sen jälkeen suoritettiin autoradiografia, havaittiin, että yli 80 % lähtöaineena käytetyistä yksisäi-keisistä oligonukleotideista oli muuttunut kaksisäi- 35 81 379 keiseksi materiaaliksi. DNA eristettiin laskemalla reak-tioseos Sephadex G50-pylvään läpi ja saostamalla välisi jatilavuudessa oleva materiaali etanolilla. Sitten DNA fosforyloitiin inkuboimalla polynukleotidikinaasin kanssa ja hajotettiin Ddelrllä. Jotta viimeksimai-nitussa reaktiossa poisleikatut nukleotidit saatiin poistetuksi, reaktioseos saostettiin kahdesti etanolilla.

Kuten kuvassa 8 on esitetty, saadun synteettisen DNA-palasen kloonaus suoritettiin liittämällä tämä palanen ja GAPDH-promoottorin säätöpalanen Bglll-Ddel samanaikaisesti vektorimolekyyliin, josta ATG-alkukodonia edeltävä EcoRl-kohta oli poistettu Mung-pavun nukleaasilla hajottamalla (ks. vaihe 2). Bglll-Ddel-promoottori/säätö-alue saatiin hajottamalla plasmidi pUR 528-02 Ddel:llä ja BglII:lla. Kun saadut restriktiopalaset erotettiin elektroforeesilla käyttämällä 2% agaroosigeeliä ja sen jälkeen eristämällä palaset geelistä, saatiin puhdistettu, 793 nukleotidin pituinen promoottori/säätöalue. Plas-midissa pUR 528-02 on ATG-kodonia edeltävä nukleotidisek-venssi 5'-GAATTC(T)ATG-3' (EP-A 54330 ja EP-A 54331), joka eroaa M. Kozakin mainitsemasta edullisesta nukleo-tidisekvenssistä (Nucleic Acids Res. _9 (1981) 5233-5252). Koska tarkoituksena oli rekonstruoida alkuperäinen GAPDH-promoottori/säätö/proteiinin aloitusalue mahdollisimman tarkasti, EcoRl-kohta poistettiin, jotta synteettinen DNA-palanen saatiin liitetyksi näin syntyneeseen tylppään päähän. EcoRl-kohta saatiin poistetuksi hajottamalla EcoRI:llä katkaistu pUR 528-02-DNA Mung-pavun nukleaasilla.

Sitten plasmidi hajotettiin Bgll:lla ja inkuboitiin fosfataasin kanssa. Kun syntyneet kaksi DNA-palasta oli erotettu elektroforeesilla käyttämällä 0,7 % agaroosigeeliä, suurempi palanen eristettiin ja käytettiin vektorina, johon Bglll-Ddel-pranoottoripalanen ja Ddel:llä käsitelty synteettinen DNA-palanen liitettiin.

Merkintä -03 liitettiin niiden plasmidien nimeen, 36 81 379 jotka sisälsivät Ddel-promoottori/säätöpalasen sekä Sacl-tunnistuskohdan sisältävän synteettisen DNA-palasen (esimerkiksi pUR 528-02 muutettiin pUR 528-03: ksi) .

4. K. lactiksesta saadun KARS2-replikonin ja S. cere-visiaesta saadun TRP1-geenin liittäminen preprotau-matiinia koodittaviin plasmideihin KARS2-replikoni ja TRP1-geeni leikattiin irti plas-midista pEK 2-7 hajottamalla BglII:lla ja sen jälkeen 3,5 kb:n palanen eristettiin 0,7 % agaroosigeelillä.

Tämä puhdistettu palanen liitettiin pUR 528-03:n de-fosforyloituun Bglll-katkaisukohtaan inkuboimalla T4 DNA-ligaasin kanssa. Kun E. coli transformoitiin liitosseoksella, saatiin plasmidi pURK 528-03 (kuva 10). Transformanttien, jotka saatiin siirtämällä plasmidi pURK 528-03 K. lactis SD11-soluihin Li+-menetelmällä, havaittiin syntetisoivan taumatiinin kaltaisia proteiineja, kun määritys suoritettiin L. Edens et al:n kuvaamalla menetelmällä, Gene 1_8 (1 982) 1-12, ks. kuva 11.

Claims (19)

37 81 379

1. Menetelmä Kluyveromyces-hiivakannan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että (1) transformoidaan Kluyveromyces-hi ivasolut vektorilla, jossa on transkription 51-3'-suunnassa: a) Kluyveromyces-hi ivassa toimiva promoottori-säätelyalue, b) DNA-sekvenssi, joka koodittaa polypeptidiä mainitun promoottori-säätelyalueen säätelyn alaisena, c) transkription päätössignaali, ja d) mahdollisesti valintamerkki, ja e) mahdollisesti Kluyveromyces-hi ivassa toimiva repli-kaation aloituskohta, ja (2) kasvatetaan saatuja transformoituja soluja kasvua ylläpitävässä kasvualustassa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että solut transformoidaan protoplasteina tai kokonaisina soluina.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut transformoidaan autonomisesti replikoituvi11a plasmideilla tai integroituvilla plasmideil-la.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että autonomisesti repiikoituvat plasmidit ovat KARS-tyyppisiä plasraideita tai 2 mikronityyppisiä plasmidei-ta.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että KARS-tyyppinen plasmidi on pKARS2 tai pKARS12, joilla on tailetusnumerot CBS 8157 ja vastaavasti CBS 353.82 ja 2 mikronityyppinen plasmidi on pPTY75-LAC4, jolla on talletusnumero CBS 351.82. 38 81 379

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että integroituvat plasmidit sisältävät Kluyve-romyces-DNA:t a.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että integroituva plasmidi on pL4, jolla on tal-letusnumero CBS 352.82.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että Kluyveromyces-solut ovat K. lactis- tai K. tragi 1 is-lajista.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että transformoituja hiivasoluja inkuboidaan ka-liumkloridia sisältävässä kasvualustassa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että kaiiumkloridin konsentraatio on noin 0,6 M.

11. Jonkin edelläolevista patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Kluyveromyces-solut ovat peräisin K. lactis SD11 lac4trpl- tai K. lactis SD69 lac4-kannasta, joilla on tailetusnumerot CBS 8092 ja vastaavasti CBS 8093.

12. Jonkin edelläolevista patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidiä koodattava DNA-sekvenssi koodittaa beta-galaktosidaasia tai kymo-siinia ja sen esiasteita.

13. Menetelmä halutun proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi Kluyveromyces-hi ivassa, tunnettu siitä, että viljellään jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukaisella menetelmällä saatuja Kluyveromyces-soluja. 39 81 379

14. Kluyveromyces-hiivan käyttö isäntänä vieraiden geenien transformoimiseksi ja ilmentämiseksi.

15. Kluyveromyces-ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää a) Kluyveromyces-hiivassa toimivan promoottori-säätelyalueen, b) DNA-sekvenssin, joka koodittaa polypeptidiä mainitun promoottori-säätelyalueen säätelyn alaisena, c) transkription päätössignaalin, ja d) mahdollisesti valintamerkin ja e) mahdollisesti Kluyveromyces-hiivassa toimivan repli-koitumisen aloituskohdan.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen Kluyveromyces-ilmentä-misvektori, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää Kluyveromyces-hiivan kromosomaalisen DNA-sekvenssin kanssa homologisen sekvenssin.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen Kluyveromyces-ilmentä-misvektori, tunnettu siitä, että mainittu replikoi-tumisen aloituskohta on 2 mikronin sekvenssi tai Kluyveromy-ces-suvusta peräisin oleva autonomisesti replikoituva sekvenssi (KARS).

18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen Kluyveromyces-ilmeniä-misvektori, tunnettu siitä, että mainittu polypep-tidi on kymosiini, prokymosiini, preprokymosiini tai pseudo-kymosiini.

19. Patenttivaatimuksen 15 mukainen Kluyveromyces-ilmeniä-misvektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi PTY75-LAC4, talletusnumero CBS 351.82, plasmidi pL4, talle-tusnumero CBS 352.82, tai plasmidi pKARS12, talletusnumero CBS 353.82. 40 81 379