JPH0685720B2 - ソーマチン物質の製造法 - Google Patents

ソーマチン物質の製造法

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JPH0685720B2
JPH0685720B2 JP61041331A JP4133186A JPH0685720B2 JP H0685720 B2 JPH0685720 B2 JP H0685720B2 JP 61041331 A JP61041331 A JP 61041331A JP 4133186 A JP4133186 A JP 4133186A JP H0685720 B2 JPH0685720 B2 JP H0685720B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えDNA法で可能となったプレプロソーマ
チンとその関連タンパク質を酵母を用いて生産する方法
に関する。
1982年４月発行のL. Eden他,Gene, 18, 1-12（1982）に
は、プレプロソーマチンの天然に存在する各種対立型並
びにプレソーマチン、プロソーマチン及びソーマチンな
どのプレプロソーマチンの各種成熟型タンパク質をコー
ドする遺伝子の配列が記載されている。この文献には、
かかるソーマチン様タンパク質をコードする遺伝子のク
ローニング法並びにそれを用いて大腸菌（Escherichia
coli）を形質転換する方法が記載されている。また、19
82年６月23日に公開された欧州特許出願公開第0054330
号及び同第0054331号には、これらのソーマチン様タン
パク質に変異を導入して人工修飾型ソーマチン様タンパ
ク質を得る方法が記載されている。
しかしながら、商業生産には、大腸菌を宿主生産菌とし
て用いる方法で得られる収量では不十分であり、ソーマ
チン様タンパク質の産生量を格段に高めることのできる
微生物が必要とされている。ここで、ソーマチン様タン
パク質とは、プレプロソーマチンの各種対立型、並びに
プレソーマチン、プロソーマチン及びソーマチンなどの
上記プレプロソーマチンの各種成熟型、さらにはこれら
の人工修飾型を意味する。
今回、上記のソーマチン様タンパク質をコードする構造
遺伝子をクルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyce
s lactis）由来の自律的複製配列（Kluyveromyces lact
is autonomously replicating sequence,略してKARSと
呼ぶ）並びに選択マーカー及び酵母由来のレギュロンと
組合わせてプラスミドを構築し、そのプラスミドをクル
イベロミセス属の酵母細胞に導入すると、ソーマチン様
物質が産生されることが判明した。このようにして、ソ
ーマチン様タンパク質を酵母細胞中で発現させることに
成功した。
従って、本発明は、ソーマチン様タンパク質の酵母によ
る生産方法にして、下記〜の配列 プレプロソーマチン又はその各種対立型もしくは修飾
型及びそれらの成熟難からなる群から選択されるソーマ
チン様タンパク質をコードする構造遺伝子、 クルイベロミセス・ラクティス由来の自律的複製配列
（KARS）、及び サッカロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cere
visiae）のグリセルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（GAPDH）遺伝子由来の酵母レギュロン を必須構成要素として含むDNAプラスミドを含むクルイ
ベロミセス属の酵母を培養し、生産されたソーマチン様
物質を回収することを特徴とする方法を提供する。
この方法を用いると、タンパク質発現量を大幅に向上さ
せることができ、商業生産への展望が大きく開かれる。
このプラスミドは、好ましくはtrp-1遺伝子又はlac-4の
ような選択マーカーを含み、さらに好ましくは酵母由来
の転写ターミネーター及び／又は動原体及び／又は酵母
由来の複製領域を含む。
クルイベロミセス・ラクティスについて満足すべき結果
が実際に得られているが、クルイベロミセス属の他の種
に属する酵母についても同様の結果が得られるであろう
ことは十分に予測できる。プラスミドに組込むソーマチ
ン様タンパク質の構造遺伝子は、上記L. Eden他のGene,
18, 1-12（1982）及び上記欧州特許公開に記載されて
いる遺伝子から選択するのが好ましい。
所望の成果から得られるKARS配列は、後述の通り、クル
イベロミセス・ラクティスの野生株CBS 2360から単離さ
れた。
クルイベロミセス・ラクティスの形質転換においては、
例えばサッカロミセス・セレビシェー由来トリプトファ
ン遺伝子（trp-1）やクルイベロミセス・ラクティス由
来ラクターゼ遺伝子（lac-4）のような選択マーカーを
ベクターに組込むのが好ましい。これらのDNA配列は形
質転換時の選択マーカーとして有効なだけでなく、その
後、培養の際の培養系に選択圧力をかけるうえでも有効
である。
転写ターミネーターを用いる場合には、サッカロミセス
・セレビシェーの２μm DNAベクターのHind III-EcoR I
断片由来のターミネーター配列及びサッカロミセス・セ
レビシェーのGAPDH遺伝子由来のターミネーター配列か
らなる群から選択するのが好ましい。
サッカロミセス・セレビシェーやクルイベロミセス・ラ
クティスのような酵母の染色体から得られる動原体又は
複製領域が存在していると、本発明の方法で用いるプラ
スミドの安定性が改善される。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
クルイベロミセス属の酵母を用いるのは、食品や医薬品
の製造に使用することのできる数多くの無害な微生物が
この属に属しているからである。例えば、クルイベロミ
セス・ラクティス及びクルイベロミセス・フラジリス
（Kluyveromyces fragilis）は米国食品医薬品局（FD
A）のGRASリスト（GRASとは一般に安全であると認めら
れるの意味のGenerally Recognized As Safeの略であ
る）に記載されている安全な微生物種である。醗酵工程
の際のクルイベロミセス・ラクティスの挙動は大腸菌よ
りもよく理解されており、十分に管理することができ
る。培養液から酵母を分離するほうが大腸菌などを分離
する場合よりも有利であり、菌体外又は細胞周辺腔（pe
riplasm）タンパク質は酵母を用いたときのほうが大腸
菌を用いた場合よりも大量に産生される。このように、
商業生産には、大腸菌よりもクルイベロミセス属の酵母
のほうが適している。
しかしながら、クルイベロミセス属に適したベクターは
これまで全く知られていなかった。
そこで、鋭意研究と実験をかさねた結果、宿主微生物と
してのクルイベロミセス・ラクティスの形質転換に用い
ることができるだけでなく、得られる形質転換細胞内で
自律的に複製する能力を有する新規なベクターを発見し
た。
このクルイベロミセス・ラクティスベクターは、クルイ
ベロミセス・ラクティス中での複製及び維持機能を制御
する。これらの複製配列はクルイベロミセス・ラクティ
ス由来の自律的複製配列（KARS）である。
その形質転換頻度の高さに鑑みて、KARS型のベクターを
用いる。
KARS型ベクターの最も好適な代表例は、KARS-2配列を含
むクルイベロミセス・ラクティスDNA断片をサッカロミ
セス・セレビシェーの公知のプラスミドYRp7（Struhl
他,Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035-1039）に挿
入したものからなるハイブリッドプラスミドpKARS-2で
ある。このベクターには、遺伝子クローニングを行なう
ことのできる適切な制限部位も存在している。
大腸菌も好適な形質転換宿主である。大腸菌を用いる場
合、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）を選択マーカーと
してベクターに組込んでもよい。プラスミドを増幅して
大腸菌の中に保存するのが好ましい。形質転換株は、ア
ンピシリン（1000μg/ml）を添加したＬ培地中で選択的
に培養すればよい。このようなプラスミド（pKARS12）
で形質転換した株の一つである大腸菌JA 221株は、1982
年５月19日付けで、ブダペスト条約に規定する国際寄託
当局であるCentral Bureau voor Schimmelcultures（オ
ランダ国）に受託番号CBS 353.82（＝LMD 82.20）とし
て寄託されている。この菌体からプラスミドを単離する
には、例えばL. Katz他の方法（J. Bacteriol, 114, 57
7（1973））の方法を用いればよい。
上記プラスミドによる酵母宿主の形質転換は、酵母のプ
ロトプラストを調製して、これを、トリス、塩化カルシ
ウム及び分子量2000〜6000（好ましくは4000）のポリエ
チレングリコールを含む通常のトリス緩衝液中で形質転
換すればよい。
KARS型プラスミドを用いる場合、各種形質転換体の中の
トリプトファン原栄養株の存在について選択することも
できる。
形質転換細胞にKARS含有プラスミドが自律的に存在して
いることは、DNA分析によって実証された。形質転換体
の未消化微小溶解物を、pKARSプラスミドの細菌由来部
分である標識pBR322とのハイブリッド形成について、サ
ザン法で分析した。
形質転換していないクルイベロミセス・ラクティスlac-
4変異株の微小溶解物と精製プラスミド標品の微小溶解
物とを比較的電気泳動した結果、形質転換に用いたプラ
スミドの超コイル型及び開環型に相当する電気泳動移動
度のハイブリッド形成バンドは形質転換性についてのみ
観察された。
形質転換細胞中に上記プラスミドが存在していること
は、さらに、酵母形質転換株由来のDNA標品で大腸菌を
形質転換して得らた形質転換株から上記と同一のプラス
ミドが単離されたことによっても確認した。
特に有用な宿主はクルイベロミセス・ラクティスの変異
株のSD11 lac-4 trp-1及び変異株SD69 lac-4である。こ
れらの変異株は野生株CBS 2360から誘導されたもので、
1982年５月19日付けで、それぞれ、Central Bureau voo
r Schimmelcultures（オランダ国）に受託番号CBS 8092
及びCBS 8093として寄託されている。
通常、形質転換用プラスミドは宿主細胞中において自立
的に複製し発現する能力を有する独立した存在として存
続する。ただし、プラスミドに存在する遺伝子は（複製
配列の存在の有無を問わず）、後々その細胞の染色体DN
A中に組込まれることもあり得る。
プレプロソーマチンの生産についての詳細を説明するこ
とによって、本発明を例示する。ただし、以下に具体的
に述べる方法が、その他のソーマチン様タンパク質をコ
ードする遺伝子のクローニング及び発現にも応用できる
ことはいうまでもない。
本発明に係る菌株をさらに大量生産に適したものに適合
化する場合、ベクタープラスミドから細菌由来のDNA配
列をすべて除いておくことが望ましい。
遺伝子は、細胞への導入後、自立的複製プラスミド上に
存在し続ける可能性もあるし、或いは宿主細胞の染色体
DNAに組込まれる可能性もある。
1. KARS配列の単離、当該単離KARS配列の組換えDNAプ
ラスミドへの組込み並びに当該プラスミドのクルイベロ
ミセス・ラクティス細胞中への導入 1.A. 組換えpKARSプラスミドの調製 上記Struhl他のProc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035
-1039に記載のプラスミドYRp7 5μｇを制限酵素Sal Iで
消化した。クルイベロミセス・ラクティスの野生株CBS
2360由来のDNA 14μｇを制限酵素Xho Iで消化した。こ
れらのプラスミドの制限断片とクルイベロミセス・ラク
ティスDNA断片とを1:3のモル比で混合して、DNA断片混
合液を得た。
制限酵素を失活させた後、上記溶液のDNA濃度を25μg/m
lに調整して、標準条件下でT4リガーゼ（Boehringer社
製）と共にインキュベートした。
上記リガーゼ処理した混合物を用いて通常の条件下で大
腸菌DG75株を形質転換したところ、4.5×105のアンピシ
リン耐性（Ampr）形質転換株の混合集団が得られたが、
それらのテトラサイクリンに対する感受性からそのなか
の９×103はクルイベロミセス・ラクティス由来の挿入
配列を含んでいると考えられる。
シクロセリン処理（Bolivar, F.及びBackman, K. Metho
ds in Enzymology, 68, 245-267 （1979））によって、
テトラサイクリン感受性細胞の割合を85％まで増加させ
ることができた。L. Katz他の方法（J. Bacteriol, 11
4, 577 （1973）,Ex.1参照）を用いて、14種類の異なる
プラスミドを単離し、これらをpKARS 1〜pKARS 14と名
付けた。これらのプラスミドすべてについて、クルイベ
ロミセス・ラクティスSD11 lac-4 trp-1をDNA 1μｇ当
り103〜104の頻度でTrp+表現型に形質転換する能力があ
った。プラスミドpKARS 12はDNA 1μｇ当り３×104もの
形質転換頻度を示したが、後段の工程を行なうにはpKAR
S 2のほうが便利であった。
得られた組換えプラスミドは、大腸菌JA221株（trp E5,
leu B6,lac y, rec A, hsdM+, hsdR-）にも移入するこ
とができた。
1.B. プラスミドpKARS 12でTrp+型に形質転換したクル
イベロミセス・ラクティスSD11 lac-4 trp-1 クルイベロミセス・ラクティスSD11 lac-4 trp-1株の菌
体を、１％酵母エキス、２％ペプトン及び２％グルコー
スを含む増殖培地（pH 6.8）に懸濁した。対数増殖期
（３〜５×107細胞/ml）に達するまで培養を続けた。こ
のようにして培養した酵母の菌体を遠心で回収し、水洗
し、1.2Mのソルビトール及び25mMのEDTA、0.2Mの新品メ
ルカプトエタノールを含有する溶液（pH 8.0）に再懸濁
した。
30℃で10分間インキュベートした後、菌体を遠心で回収
し、1.2Mソルビトール溶液で２回洗浄し、1.2Mのソルビ
トール、10mMのEDTA、0.1Mのクエン酸ナトリウム及び10
mgのヘリカーゼを含有する溶液（pH 5.8）20ml中に懸濁
した。この処理によってプロトプラストが得られるが、
15〜20分後にこれらを遠心して、1.2Mソルビトールで３
回洗浄し、10mMのCaCl2及び1.2Mソルビトールを含有す
る溶液0.1ml中に、溶液1ml当り約５×1010個の菌体とな
るような濃度で、再懸濁した。
pKARS 12のDNA 10μｇを加えて、得られた混合物を25℃
で15分間インキュベートした。その後、10mMトリス、10
mM CaCl2及び20％（w/w）ポリエチレングリコール4000
を含む溶液0.5mlを加えてさらに20分間インキュベート
した。
プロトプラストを遠心して沈殿させ、7mM CaCl2、1.2M
ソルビトール、0.5mg/ml酵母エキス、1mg/mlペプトン及
び2mg/mlのグルコースを含有する溶液（pH6.8）に、溶
液1ml当り約５×1010個のプロトプラストとなるような
濃度で、再懸濁した。
30℃で60分間インキュベートした後、プロトプラストを
遠心して、0.6M KCl溶液で洗浄し、0.6M KCl溶液に再懸
濁した。
Trp+形質転換株の選択を可能にするため、１×109個の
プロトプラストを、２％グルコース及び0.6M KClを添加
した２％寒天最小平板培地（３％寒天を重層）上に移し
た。
４〜５日後にコロニーが現れた。グルコースを炭素源と
する0.6M KCl平板上での再生は0.5〜1.5％であった。pK
ARS 12のDNA 1μｇ当り、3.4×104個のTrp+形質転換株
が得られた。
DNA標品はStruhl他の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 76, 1035-1039）に従って調製した。
1.C. KARS型プラスミドでTrp+に形質転換されたクルイ
ベロミセス・ラクティスSD11 lac-4 trp-1 上記1.B.に記載した方法と同様の方法で、他のKARS型プ
ラスミドを用いて形質転換実験を行なうことができた。
実験結果を下記の表にまとめた。
pKARSプラスミドの分子量は、EcoR I及びHind IIIエン
ドヌクレアーゼで消化した後、通常の分子量マーカーを
用いて0.8％アガロースゲル上で決定した。
以下、GAPDHレギュロンの単離、並びに当該レギュロン
のプレプロソーマチンをコードするプラスミドへの導入
について、詳細に説明する。
1.D. サッカロミセス・セレビシェーのグリセルアルデ
ヒド‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）オペロンを
含むクローンの単離 特記しない限り、酵素のインキュベーションはすべて製
造業者の指示する条件の下で行なった。酵素は、Amersh
am社、Boehringer社、BRL社又はBiolabs社から入手し
た。
M. Carlson及びD. Botsteinの方法（Cell 28, 145-154
（1982））と同様の方法で、サッカロミセス・セレビシ
ェーのDNAプールを大腸菌／酵母ハイブリッドプラスミ
ドpFl 1（M.R. Chevallier他,Gene 11, 11-19 （198
0））中に調製した。ここで、pFl 1は、pBR322のHind I
II部位にura3含有11kb Hind III断片を導入し、EcoR I
部位に酵母２μmDNAのEcoR I-D断片を導入して得たプラ
スミドである（上記文献参照）。精製した酵母DNAを制
限酵素Sau34で部分消化し、生成DNA断片（平均長5kb）
をpFl 1の脱リン酸化BamH I部位にT4 DNAリガーゼで連
結した。CaCl2処理した大腸菌細胞を期連結断片で形質
転換して、約30000のアンピシリン耐性コロニーのプー
ルを得た。これらのクローンをコロニーハイブリダイゼ
ーション法（R.E.Thayer, Anal. Biochem. 98, 60-63
（1979））でスクリーニングした。この際、プローブと
して化学合成32P標識オリゴマー５′‐TACCAGGAGACCAAC
TT-3′を用いた。
J.P. Holland及びM.J. Holland（J. Biol. Chem. 225,
2596-2605 （1980））の発表データによれば、このオリ
ゴマーはGAPDH遺伝子のアミノ酸306-310をコードするDN
A配列と相補的である（ただし、最後のアミノ酸のゆら
ぎ塩基はオリゴマーには含まれていない）。R.B.Wallac
e他の記載したハイブリダイゼーション条件（Nucleic A
cids Res. ９, 879-894 （1981））を用いて、６つの陽
性形質転換株が同定できた。そのうちの一つがプラスミ
ドpFl 1-33である。このプラスミドにはGAPDH遺伝子が
含まれており、その中にはGAPDH遺伝子のプロモーター
／レギュロン領域及びその遺伝子の転写終結／ポリアデ
ニル化領域が含まれている。pFl 1-33の約9kb挿入断片
の特徴を、制限酸素分析（第１図）及び塩基配列の部分
解析（第２図）によって明らかにした。
1.E. GAPDHプロモーター／調節領域の単離並びにプレ
プロソーマチンコードプラスミドへの当該領域の導入
（第４図） pFl 1-33の挿入断片の制限酵素分析及び塩基配列解析の
結果に基づいて、GAPDH遺伝子のRNA開始／調節領域を80
0塩基のDde I断片として単離した。このプロモーター断
片を同定するため、プラスミドpFl 1-33をSal Iで消化
して、得られた３つのDNA断片を化学合成オリゴマーと
のサザンハイブリダイゼーション法（E.M. Southern,
J. Mol. Biol. 98, 503-517 （1975））に付した。陽性
なハイブリッドを形成する4.3kbの制限断片を0.7％アガ
ロースゲルから調整用規模で電気溶出して単離し、次い
でDde Iで切断した。得られたDde I断片のうち、最大の
断片だけにPvu II認識部位が存在していた。このPvu II
部位は、GAPDHレギュロン領域内に位置する切断部位で
ある（第１図）。この最大のDde I断片を単離して、DNA
ポリメラーゼのクレノウ（Klenow）フラグメント及び４
種類のdNTPと共にインキュベート（A. R. Davis他,Gene
10, 205-218 （1980））して平滑末端DNA分子を得た。
反応混合物をフェノール／クロロホルム（50/50 v/v）
で抽出し、水層をセファデックスG50カラムに通し、ボ
イドボリュームの溶出液中に存在する物質をエタノール
沈殿してDNAを単離した後、このDNA断片に32P標識EcoR
Iリンカー５′‐GGAATTCC-3′をT4 DNAリガーゼ処理に
より結合させた。このようなクレノウDNAポリメラーゼ
反応とその後のEcoR Iリンカーとの連結処理によって、
元のDde I部位をレギュロン断片の末端に再構築した。
反応混合物を65℃に10分間加熱してリガーゼを失活さ
せ、塩化ナトリウム（終濃度50mM）を添加して、混合物
全体をEcoR Iとインキュベートした。インキュベーショ
ンを停止するためにフェノール／クロロホルムを抽出し
て、DNAのエタノール沈殿・再懸濁を２回繰返した後、
適当なベクター分子に連結した。Dde Iレギュロン断片
にはEcoR I部位が結合しているため、pUR 528（L. Eden
他のGene, 18 1-12 （1982））のEcoR I部位に容易に導
入することができて、プレプロソーマチンをコードする
構造遺伝子に酵母レギュロンが隣接しているようなプラ
スミドを得ることができる。かかるプラスミドは、pUR
528をEcoR Iで切断して、線状化プラスミド分子をアル
カリホスファターゼ（仔ウシ腸由来）で処理して自己連
結を防止し、これらの各々のベクター分子を上記精製Dd
e Iプロモーター断片と共にT4 DNAリガーゼ処理して得
られる。このようにして得られる各種連結混合物でCaCl
2処理大腸菌HB101細胞を形質転換すると、幾つかのアン
ピシリン耐性コロニーが得られた。これらのコロニーの
幾つかから、プラスミドDNAを単離し（H.C. Birnboim及
びJ. Doly, Nucleic Acids Res. ７, 1513-1523 （197
9））、Pvu IIとインキュベートして挿入断片の配向を
調べた。
EcoR I（Dde I）GAPDHレギュロン断片を正しい配向（GA
PDHレギュロンからの転写が下流に位置する構造遺伝子
の方向に起こる）で含むプラスミドの命名は、元のプラ
スミドの記号に01を付記して示す（例えばpUR 508はpUR
528-01となる。第４図参照）。
EcoR Iレギュロン断片を含むプラスミドの取扱い操作を
簡単にするため、２つのEcoR I部位のうちの一方を破壊
した。２μｇのプラスミドDNA（pUR 528-01等）をEcoR
Iで部分消化した後、0.05M酢酸ナトリウム（pH 5.0）、
0.05M塩化ナトリウム、0.01M塩化亜鉛及び５ユニットの
ムングビーンヌクレアーゼ（P.L. Biochemicals Inc.社
から入手）を加えて全容積200μｌとして、室温で30分
間インキュベートして付着末端を除去した。終濃度0.1
％のSDSを添加して上記ヌクレアーゼを失活させ（D. Ko
walski他,Biochemistry 15, 4457-4463 （1976））、２
倍量の容積のエタノールを添加してDNAを沈殿させた
（このとき、0.1倍量の容積の3M酢酸ナトリウムの添加
は省いた）。線状化DNA分子をT4 DNAリガーゼ処理して
連結し、CaCl2処理大腸菌細胞の形質転換に使用した。
アンピシリン耐性コロニーから単離したプラスミドDNA
をEcoR I及びMlu Iで切断して、プレプロソーマチン遺
伝子に隣接するたった一つのEcoR I部位の存在について
検査した（第４図）。
GAPDHプロモーター断片を含んでいるが、その下流に位
置する構造遺伝子のATG開始コドンの隣にたった一つのE
coR I部位しか含んでいないようなプラスミドを‐02型
プラスミドと呼ぶ（例えばpUR 508-01はpUR 528-02とな
る。第４図参照）。
1.F. 合成DNA断片の導入による、プレプロソーマチン
コードプラスミド中での元のGAPDHプロモーター／調節
領域の再構成（第５図、第６図） 第２図に示す塩基配列にみられる通り、EcoR I（Dde
I）GAPDHプロモーター断片は、元のGAPDHプロモーター
／調節領域のヌクレオチド‐850〜‐39を含んでいる。
このプロモーター断片に含まれていない部分は、GAPDH
コード遺伝子のATG開始コドンに先立つ38個のヌクレオ
チドである。この38塩基の断片は、数種の酵母遺伝子に
見出だされるPuCACACA配列を含んでいる。このPuCACACA
配列は翻訳開始部位の約20bp上流に位置しており（M.J.
Dobson他,Nucleic Acids Res. 10, 2526-2637（198
2））、タンパク質開始に最適なATGコドの上流塩基配列
を与える（M. Kozak, Nucleic Acids Res. ９, 5233-52
52 （1981））。さらに、第７図に示す通り、これらの3
8ヌクレオチドは、GAPDH遺伝子の発現調節に関与してい
ると考えられるループ構造を形成する。上述の議論に基
づいて、Dde Iプロモーター断片と下流の構造遺伝子のA
TCコドンとの間に上記38ヌクレオチドを導入することが
プロモーター活性及び翻訳開始の改良のために必要であ
ると考えた。
第５図に概略を示す通り、上記の欠失DNA断片を、２種
類の部分的に重複するオリゴマーを化学的に合成するこ
とによって得た。これらの２種類のオリゴマーの重複部
分に存在するSac I部位は次の二つの理由から導入し
た。第一に、ポリ（Ａ）テールを有する酵母発現ベクタ
ーの構築を含め、ATGコドンのすぐ上流の塩基配列の取
扱い操作を可能にするためであり、第二に、３′突出末
端を生ずるような酵素切断部位を与えるためであり、か
かる３′突出末端は４種類のdNTP存在下でのT4 DNAポリ
メラーゼ処理によって容易かつ再現性をもって除去する
ことができる。等モル量の上記２種類の精製オリゴマー
のそれぞれの５′末端をリン酸化して、これらをハイブ
リダイズさせ（J.J. Rossi他,J. Biol. Chem. 257, 922
6-9229 （1982））、二本鎖DNA分子へと変換した。この
変換は、二本鎖DNA合成について記載された条件（A.R.
Davis他,Gene 10, 205-218（1980））下でDNAポリメラ
ーゼクレノウフラグメント及び４種類のdNTPと共にイン
キュベートすることによって行なった。生成物を13％ア
クリルアミドゲル上で電気泳動してオートラジオグラフ
ィーで分析した結果、最初の一本鎖オリゴヌクレオチド
の80％以上が二本鎖に変換されていることが判明した。
反応混合物をセファデックスG50カラムに通して、ボイ
ドボリュームの溶出液中に存在する物質をエタノール沈
殿することによって、DNAを単離した。DNAをポリヌクレ
オチドキナーゼ処理してリン酸化して、Dde Iで消化し
た。後の反応中に切断されたヌクレオチドを除去するた
めに、反応混合物のエタノール沈殿処理を２回行なっ
た。
第６図に示す通り、生じた合成DNA断片のクローニング
は、この断片と、pUR 528-02中のBgl II-Dde I GAPDHプ
ロモーター調節断片との同時連結によって行なった。こ
のベクターからは、ムングビーンヌクレアーゼ消化でAT
Gコドンの前のEcoR I部位が除去されている（前記1.E.
参照）。上記Bgl II-Dde Iプロモーター／調節断片はプ
ラスミドpUR 528-02をDde IとBgl IIで消化して得た。
得られた制限断片を２％アガロースゲル電気泳動にかけ
て分離し、ゲルから断片を単離して精製793塩基のプロ
モーター／調節断片を得た。プラスミドpUR 528-02中の
ATGコドンに先行する上流塩基配列は５′‐GAATCC
（Ｔ）ATC-3′であり（欧州特許出願公開第0054330号及
び同第0054331号）、これはM. Kozak, Nucleic Acids R
es. ９, 5233-5252 （1981）に記載された塩基配列とは
異なっている。本発明の目的は元のGAPDHプロモーター
／調節／タンパク質開始領域をできるだけ正確に再構成
することにあるので、得られる平滑末端に上記合成断片
を連結するためにEcoR I部位を除去した。EcoR I部位の
除去は、EcoR Iで切断したpUR 528-02 DNAをムングビー
ンヌクレアーゼで消化（前記1.E.参照）して行なった。
次に、プラスミドDNAをBgl IIで消化し、ホスファター
ゼ処理した。0.7％アガロースゲル電気泳動で２つの断
片を分離し、最も大きい断片を単離して、上記Bgl II-D
de Iプロモーター断片及び上記Dde I処理合成DNA断片と
連結した後、ベクターとして使用した。
上記合成DNA断片を含むSac I認識部位と共にDde Iプロ
モーター／調節断片が導入されているプラスミドは、記
号‐03を付記して示す（例えばpUR 508-02はpUR 528-03
となる）。
1.G. ２μm DNA複製起点及び酵母leu-2遺伝子のプレプ
ロソーマチンコードプラスミドへの導入 サッカロミセス・セレビシェー中でのGAPDHレギュロン
の機能を試験するため、プラスミドpUR 528-02及びpUR
528−03に、酵母２μm DNAに由来する複製起点及び選択
マーカーを導入した。これらの機能遺伝子は共にpMP81
から切取って、上記２つのプレプロソーマチンコードプ
ラスミドに導入した。大腸菌−酵母シャトルベクターで
あるpMP81（第８図,C.P. Hollenberg, Current Topics
in Microbiol. and Immun., 96, 119-144 （1982））
は、lue-2遺伝子と酵母２μm DNA複製起点両者共に保有
するpJDB219（J.D. Beggs, Nature, 275, 104-109 （19
78））の二重EcoR I断片と、プラスミドpCRI（C.Covey
他,MGG, 145, 155-158 （1976））とで構成されてい
る。pMP81をHind III及びSal Iで消化して、lue-2遺伝
子と酵母２μm DNA複製起点を切出した。生じた4.4kb制
限断片をpUR 528-02又はpUR 528-03（プレプロソーマチ
ン遺伝子とサッカロミセス・セレビシェー由来のGAPDH
プロモーター／調節遺伝子を含む）に連結してプラスミ
ドを得た。この操作は、上記プラスミドpUR 528-02又は
pUR 528-03をHind III及びSal Iで切断（第６図、第９
図）した後、得られた断片をホスファターゼ処理するこ
とによって行なった。１％アガロースゲル電気泳動で断
片を分離した後、最大の断片を単離して、pMP81由来の
精製Hind III-Sal I断片と混合し、T4 DNAリガーゼで連
結して、CaCl2処理大腸菌細胞を形質転換した。アンピ
シリン耐性形質転換株から、プラスミドDNAを単離し
て、制限酵素分析に付した。正確に挿入された挿入断片
を含むプラスミド（pURY 528-02又はpURY 528-03）をCs
Cl-臭化エチジウム密度勾配遠心法で精製し、J.D. Begg
sの方法（Nature 275, 104-109 （1978））によるサッ
カロミセス・セレビシェーの形質転換に使用した。
1.H. プレプロソーマチンコードプラスミドへのKARS-2
及びtrp-1遺伝子の導入 大腸菌−酵母シャトルベクターpEK 2-7は、1.2kb KARS-
断片を含有するプラスミドYRp7（D.T. Stinchbomb他,Na
ture 282, 39-43 （1979））からなる。プラスミドpEK
2-7には、酵母trp-1遺伝子が存在しているので、このプ
ラスミドはクルイベロミセス・ラクティスSD11 lac-4 t
rp-1中に保持しておくことができる。
クルイベロミセス・ラクティス中でのGAPDH遺伝子のプ
ロモーター／調節領域の機能を実証するために、プラス
ミドpUR 528-03（第９図）にKARS-2断片及びtrp-1遺伝
子を結合させた。pEK 2-7をBgl II消化してKARS-2及びt
rp-1を含む断片を切り取り、次いで生じた断片の中で最
も小さい断片を0.7％アガロースゲルから単離した。こ
の断片を精製した後、pUR 528-03の脱リン酸化Bgl II切
断部位にT4 DNAリガーゼで挿入した。この連結物でCaCl
2処理大腸菌細胞を形質転換して、プラスミドpURK 528-
03を得た（第10図）。プラスミドpURK 528-03をクルイ
ベロミセス・ラクティスSD11に導入して得られた形質転
換株は、ソーマチン様タンパク質を合成することが判明
した（第11図）。
上述の手順と同様の方法で、プラスミドpURY 528-03
（上記1.G.参照）にKARS-2断片及び酵母trp-1遺伝子を
結合させてプラスミドpURK 528-33を得て、クルイベロ
ミセス・ラクティスSD11に導入した（第10図）。
1.I. サッカロミセス・セレビシェーのGAPDHオペロン
のプロモータ／調節領域の調節下に置かれたプレプロソ
ーマチンコード遺伝子のクルイベロミセス・ラクティス
中での発現 上記と同一の検出方法を用いて、pURK 528-33を有する
クルイベロミセス・ラクティス細胞についてもソーマチ
ン様タンパク質を産生することが確認された（第11
図）。ただし、pURK 528-33を有する菌体のソーマチン
様タンパク質の産生量は、pURY 528-33を有する菌体よ
りも約３倍も高かった。同様の結果が、酵母ura-3遺伝
子を上記２μm DNAのコード領域「エーブル（Able）」
中に挿入したときのura-3遺伝子の発現について観察さ
れているので（C. Gerbaud他,Gene ５, 233-253 （197
9））、pURK 528-33によるソーマチン様タンパク質の発
現の増加は上記「エーブル」オペロンの転写が転写／ポ
リアデニル化領域で効率的に終結するという事実による
ものと考えられる。この観察結果は、GAPDHプロモータ
ー／調節領域によって転写される構造遺伝子の効率的な
転写領域の下流に効率的な転写終結／ポリアデニル化領
域が存在していることが、遺伝子発現の至適化において
重要な因子であることを示している。「エーブル型ター
ミネーター」をGAPDH終結ポリアデニル化領域（第３
図）で置換しても、少なくとも同程度には発現が改良さ
れると期待される。
第11図に示すフルオログラムは次のようにして得た。各
種酵母形質転換株を35S-システイン添加最小培地中で増
殖させた。遠心で集菌して、これを2.0Mソルビトール、
0.025MのNaPO4（pH7.5）、1mM EDTA、1mA MgCl2、2.5％
β‐メルカプトエタノール、1mg/mlザイモリアーゼ6000
0中に再懸濁して、30℃で30分間インキュベートした。
スフェロプラストを遠心で沈殿させ、270μｌのH2O、４
μｌの100mM PMSF、８μｌの250mM EDTA、40μｌの９％
NaCl及び80μｌの５×PBSTDS（50mM NaPO4（pH 7.2）、
５％ Triton X100、2.5％デオキシコール酸、2.5％ SD
S）を加えて可溶化した。ソーマチン様タンパク質の免
疫沈降及び沈降タンパク質の分析はL. Eden他のGene 1
8,1-12 （1982）記載の方法で行なった。第11図のレー
ンa-cは、それぞれ、プラスミドpEK 2-7、pURK 528-03
及びpURK 528-33で形質転換したクルイベロミセス・ラ
クティスSD11細胞の産生したソーマチン様タンパク質の
フルオログラムである。
【図面の簡単な説明】
第１図 プラスミドpFL 1-33の酵母グリセルアルデヒド
‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）オペロンを含む
部分の制限酵素地図。 第２図 プラスミドpFL 1-33にクローニングされたグリ
セルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）
オペロンのプロモーター／調節領域の塩基配列（TATA配
列及びTATAAA配列は実線の下線部で示す。推定転写終結
シグナルは点線の下線部で示す。括弧内の配列は逆方向
反復塩基配列を示す。38アミノ酸残基のペプチドをコー
ドする塩基配列は四角で囲んである。）。 第３図 プラスミドpFL 1-33にクローニングされたグリ
セルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）
オペロンの転写終結／ポリアデニル領域の塩基配列（AA
TAA配列は実線の下線部で示す。推定転写終結シグナル
は点線の下線部で示す。）。 第４図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
へのEcoR I（Dde I）GAPDHプロモーター／調節断片の挿
入並びに生成プラスミドからのEcoR I切断部位の除去の
操作手順を示す図。 第５図 プレプロソーマチンをコードする塩基配列の上
流の元GAPDHプロモーター／調節領域を再構成するため
に用いた合成DNA断片の調整段階を示す図。 第６図 プレプロソーマチンをコードするプラスミド中
に合成DNA断片を導入する際の操作手順を示す図。 第７図 ステム構造及びループ構造を取る可能性のある
部分を含むGAPDHプロモーター／調節領域を示す図（推
定転写終結シグナルは斜線で示す。本断片上における、
38アミノ酸残基のペプチドをコードする塩基配列の位置
はATGコドンとTAAコドンで示す。）。 第８図 プラスミドpMP81の制限酵素地図。 第９図 pMP81をHind III及びSal I消化して得られる２
μm DNA複製起点及びleu-2遺伝子の、プレプロソーマチ
ンコードプラスミドへの導入の操作手順を示す図。 第10図 pEK 2-7をBgl II消化して得られるKARS-2及びt
rp-1遺伝子の、プレプロソーマチンコードプラスミドへ
の導入の操作手順を示す図。 第11図 各種プラスミドを含むクルイベロミセス・ラク
ティス細胞中で合成された35S標識ソーマチン様タンパ
ク質の電気泳動図。 第12図 プレプロソーマチン構造遺伝子の塩基配列を示
す図。 第13図 プレプロソーマチンの対立型構造遺伝子の具体
例を示す図。 第14図 プレプロソーマチンの修飾型構造遺伝子の具体
例を示す図。 第15図 成熟ソーマチン構造遺伝子の塩基配列を示す
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ベリツプス，コルネリス テオドルス オランダ国 3142 ケイビー マースルイ ス、ハゲドールン 18 (72)発明者 バン デン ベルグ、ヨハネス アベル オランダ国 2811 エイデイー レーウヴ イユク ハネゲベクト ８

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記（ａ）〜（ｆ） （ａ）プレプロソーマチン、 （ｂ）プレソーマチン、 （ｃ）プロソーマチン、 （ｄ）ソーマチン、 （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）の天然に存在する対立型又は
    変異型、及び （ｆ）生成物の発現及び性質に有意に悪影響を及ぼさな
    い上記（ａ）〜（ｄ）の人工修飾型 からなる群から選択されるソーマチン様タンパク質の微
    生物生産法にして、下記〜の配列 上記ソーマチン様タンパク質をコードする構造遺伝
    子、 クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lact
    is）由来の自律的複製配列（KARS）、及び サッカロミセス・セレビシェー（Saccharomyces cere
    visiae）のグリセルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナ
    ーゼ（GAPDH）遺伝子由来の酵母レギュロン を必須構成要素として含むDNAプラスミドを含むクルイ
    ベロミセス（Kluyveromyces）属の酵母を培養し、生産
    されたソーマチン様物質を回収することを特徴とする方
    法。
JP61041331A 1982-05-19 1986-02-26 ソーマチン物質の製造法 Expired - Lifetime JPH0685720B2 (ja)

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