JPH0543348B2 - - Google Patents
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- JPH0543348B2 JPH0543348B2 JP58501746A JP50174683A JPH0543348B2 JP H0543348 B2 JPH0543348 B2 JP H0543348B2 JP 58501746 A JP58501746 A JP 58501746A JP 50174683 A JP50174683 A JP 50174683A JP H0543348 B2 JPH0543348 B2 JP H0543348B2
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Description
請求の範囲
1 組み換え体DNAプラスミドを含むクルイベ
ロマイセス属の酵母であつて、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来の
対立型又は変異型および生成物の発現や性質に
有意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型
からなる群から選ばれるソーマチン様生成物を
コードする構造遺伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス(所謂
KARS)由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−3−燐酸デヒドロゲナーゼ
(GAPDH)遺伝子由来の酵母レギユロンを包
含し、この酵母は組み換え体DNAプラスミド
にてコードされるソーマチン様生成物を発現し
うることを特徴とする、上記酵母。 2 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第1項記載の酵母。 3 組み換え体DNAプラスミドは野生株K.ラク
テイスCBS2360由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第1項記載の酵母。 4 組み換え体DNAプラスミドはさらに選択マ
ーカおよび/又は酵母由来転写ターミネータおよ
び/又は酵母由来動原体および/又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第1項記載の酵
母。 5 クルイベロマイセス属酵母の調製法におい
て、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来対
立型又は変異型および生成物の発現や性質に有
意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型か
らなるソーマチン様生成物をコードする構造遺
伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス(所謂
KARS)由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−3−燐酸デヒドロゲナーゼ
(GAPDH)遺伝子由来の酵母レギユロンから
なる組み換え体DNAプラスミドを調製し、つ
いでこのプラスミドをクルイベロマイセス属の
酵母に導入し、得られた酵母は組み換え体
DNAプラスミドにてコードされるソーマチン
様生成物を発現しうることを特徴とする、上記
方法。 6 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第5項記載の方法。 7 組み換え体DNAプラスミドはK.ラクテイス
CBS2360野生株由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第5項記載の方法。 8 組み換えDNAプラスミドはさらに選択マー
カおよび/又は酵母由来転写ターミネータおよ
び/又は酵母由来動原体および/又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第5項記載の方
法。 明細書 本発明は、組換えDNA技術で可能となつたプ
レプロソーマチン及び関連化合物の微生物学的製
造法に関する。いずれも1982年6月23に公告され
たヨーロツパ特許出願(A2)0054330号及び
0054331号にはプロプロソーマチンの種々の対立
型、プロソーマチン、プロソーマチン及びソーマ
チンの様なその成熟型及びそれ等の誘導型を暗号
づけるDNA配列又該DNA配列より成るクローニ
ングビヒクル(伝播体)、又それ等の微生物特に
エシエリヒア コリー(E.coli)を形質転換する
ための使用及びソーマチン様蛋白質の製造法が記
載されている。 商業的に魅力ある生産のためには、エシエリヒ
ア コリー(E.coli)について得られる収量は充
分でないので、ソーマチン様蛋白質をはるかに高
い量生産出来る微生物系の必要性が存在する。ソ
ーマチン様蛋白質とは、プレプロソーマチン、そ
の種々の対立型又は誘導型及びプレソーマチン、
プロソーマチン及びソーマチンの様なそれ等の成
熟型を意味する。 上記のヨーロツパ特許出願に記載された構造遺
伝子はクルイベロミセス ラクテイス
(Kluyveromyces lactis)(いわゆるKARS)起
源の自律的に複製する配列、撰択マーカー、及び
プラスミド中への酵母レギユロンと組み合され、
そのプラスミドはクルイベロミセス属の酵母細胞
中に導入され次いでソーマチン様蛋白質を生産し
得る様になることが分つた。この方法で酵母細胞
中のソーマチン様蛋白質の発現が成功した。 従つて、本発明は: (i) プレプロソーマチン又はその各種の対立型、
又は修飾型又はそれ等の成熟型を暗号づける構
造遺伝子、 (ii) クルイベロミセス ラクテイス
Kluyveromyces lactis(いわゆるKARS)起源
の自律的複製配列、 (iii) サツカロミセス セレビシエー
Saccharomyces cerevisiaeのグリセルアルデ
ヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)
遺伝子から誘導された酵母レギユロン及び (iv) trp−1又はlac−4遺伝子の様な撰択マーカ
ーより成る組換えDNAプラスミドを含むクル
イベロミセス属の酵母を提供するものである。 この方法で、希望する蛋白質の大きく改良され
た発現が得られ、従つて商業的応用はずつと近付
いて来ている。 望ましくはプラスミドは酵母より誘導された転
写停止暗号及び/又は動原体及び/又は酵母から
誘導された複製領域を含むものである。 クルイベロミセス ラクテイス酵母について良
い結果が得られているがその他のクルイベロミセ
スの種も同様に効果的である可能性は充分であ
る。構造遺伝子は好ましくは上述のヨーロツパ特
許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群
から選択されたものである。 以下に記載する様に満足すべきKARS−配列
が野生株K.lactis CBS2360から分離された。 クルイベロミセス ラクテイス(K.lactis)中
の形質転換の目的のため、例えばサツカロミセス
セレビジエー(S.cerevisiae)に起因するトリ
プトフアン遺伝子(trp−1)及びクルイベロミ
セス ラクテイス(K.lactis)に起因するラクタ
ーゼ遺伝子(lac−4)の様なベクター上の選択
可能なマーカーの使用が望ましい。此等のDNA
配列は選択マーカーとしてのみならず其の後の増
殖中にシステムに選択圧力を働かせる点において
も効果的である。 もし転写停止暗号が使用される場合、これは好
ましくはサツカロミセス セレビジエー(S.
cerevisiae)の2ミクロンDNAベクターのHind
−Eco R断片に起因する停止配列及びサツ
カロミセス セレビジエー(S.cerevisiae)の
GAPDH遺伝子から誘導される停止配列より成る
群より選ばれる。 動原体又は例えばサツカロミセス セレビジエ
ー(S.cerevisiae)又はクルイベロミセス ラク
テイス(K.lactis)の様な酵母染色体から誘導さ
れた複製領域の存在は本発明に従うプラスミドの
安定性を改良する。 本発明は更に、上記の様にクルイベロミセス属
の酵母の製造法を提供するものであつて、その方
法は上記構造遺伝子をKARS−配列及び構造遺
伝子の上流に酵母GAPDHレギユロン、及び選択
マーカー又任意には酵母の染色体から誘導された
動原体又は複製領域又任意には構造遺伝子の下流
に酵母から誘導された転写停止暗号を組み合せる
組み換えDNAプラスミドの調製とこれに続いて
この様に調製したプラスミドをクルイベロミセス
属の酵母中への導入により成つている。 最終的に、本発明はプレプロソーマチン又はそ
の各種の対立型又は修飾型又は上述のヨーロツパ
特許出願中に開示されたそれ等の成熟型及びその
様に調製した蛋白質の微生物学的調製法を提供
し、その方法は上記のクルイベロミセス属の酵母
を培養し次いで酵母により生産されたソーマチン
又はソーマチン様蛋白質を採取することにより成
る。 本発明を以下に詳述する。 クルイベロミセス属の酵母を、これ等の微生物
は食品や医薬品の製造に使用出来る多くの無害な
微生物群より成つているという理由により選ん
だ。例えばクルイベロミセス ラクテイス
(Kluyveromyces lactis)及びクルイベロミセス
フラジリス(Kluyveromyces fragilis)はア
メリカ合衆国FDAのグラスリスト(GRAS=一
般的に安全と認められる)に記載されている安全
な種である。醗酵工程におけるクルイベロミセス
ラクテイス(K.lactis)の行動はエシエリヒア
コリー(E.coli)についてよりもよく知られて
いて全く管理可能である:醗酵液から酵母の分離
は例えばエシエリヒア コリー(E.coli)の場合
より好ましく、酵母はしばしばエシエリヒア コ
リー(E.coli)よりも大量の(細胞外又はペリプ
ラスム)蛋白質を生産する。従つてクルイベロミ
セス属の酵母はエシエリヒア コリー(E.coli)
よりも工業生産に好適である。 現在迄のところ、クルイベロミセスのためのベ
クターは全く知られていない。 広汎な研究と実験の結果としてホスト微生物ク
ルイベロミセス ラクテイスを形質転換させ更に
形質転換した細胞中で自律的に複製する新しいベ
クターが発見された。 新しいクルイベロミセス ラクテイス(K.
lactis)のベクターはクルイベロミセス ラクテ
イス(K.lactis)中の複製と維持の機能を制御す
る。此等の複製配列はクルイベロミセス ラクテ
イス(KARS)に起源をもつ配列を自律的に複
製する。 その高い形質転換頻度の故にKARS型のベク
ターが使用される。 最も好適な代表は既知サツカロミセス セレビ
ジエー(S.cerevisice)プラスミドYRp7(Stouhl
等Proc.Natl.Acad.Sci USA76、1035−1039)中
に挿入したKARS−2配列を含むクルイベロミ
セス ラクテイス(K.lactis)DNA断片より成
るハイブリドプラスミド(雑種プラスミド)であ
るpKARS−2である。 ベクター上には更に遺伝子クローニングを可能
にするための適切な制限部位がある。 エシエリヒア コリー(Escherichia coli)も
又好適なホストである。その場合アンピシリン耐
性遺伝子(Amp R)も又ベクター上の選択可能
なマーカーである。プラスミドは好ましくは増加
させられ、エシエリヒア コリー(E.coli)細胞
中に貯蔵される。形質転換した株はアンピシリン
を含む(100マイクログラム/ミリリツター)L
−ブロス上で選択的に生育する。形質転換した株
の1つ即ちエシエリヒア コリー(E.coli)
JA221(pKARS12)はオランダのSK
Baarn3742、Oosterstraat1にあるCentral
Burean VOOR SchimmelculturesにCBS353、
82(=LMD82.20)の番号で1982年5月19日に寄
託された。プラスミドは例えばカツツ等の方法
で、J.Bacterol114(1973)577菌体から分離出来
る。 酵母ホストのプロトプラスト(原形質体)はト
リス、塩化カルシウム及び分子量が2000から6000
の範囲好ましくは4000のポリエチレングリコール
を含む通常のインキユベーシヨン培地の中で前述
のベクターにより形質転換される。 KARS−型プラスミドを使用すると、形質転
換物にトリプトフアン原栄養体を選択する可能性
がある。 形質転換細胞中のKARS−含有プラスミドの
自律的存在はDNA分析により示される。形質転
換物の未分解微小溶解物pKARSプラスミドの細
菌部である標識pBR322とのハイブリダイゼーシ
ヨン(雑種形成)によりサザーン法に従つて分析
した。 非形質転換クルイベロミセス ラクテイスlac
−4変異菌の微小溶解物と精製プラスミド調製物
の比較電気泳動は形質転換物にのみ、形質転換に
使用したプラスミドの高次コイル及び開環型に相
当する電気泳動移動度を持つハイブリツド形成バ
ンドの存在を示した。 形質転換細胞中のプラスミドの存在は酵母形質
転換物から調製したDNAによるE.coliの形質転
換と生じたE.coli形質転換物から同じプラスミド
を分離することにより更に確められた。 特に有用なホストはクルイベロミセス ラクテ
イスの変異菌SD11lac−4trp−1及びSD69lac−
4であり、これ等は野生株CBS2360から誘導さ
れオランダ国3242SK Baarn、Oosterstraat1の
Centraal Burean Voor Schimmelcultweに夫々
CBS8092及びCBS8093という寄託番号で1982年
5月19日に寄託された。 通常、形質転換するプラスミドはホスト細胞中
に自律的に複製及び発現可能な独立した存在とし
て止まる。しかしながらこゝでプラスミド(複製
配列であつてもなくても)上に存在する遺伝子は
引き続いて細胞の染色体DNA中にも組み込まれ
るということが指摘される。 本発明をプレプロソーマチンの生産に関する詳
細な記述により例示する。然し本発明の方法はソ
ーマチン−様蛋白質を暗号づけるその他の遺伝子
のクローニングと発現にも又応用出来る。 本発明の菌株を大量生産に適用する時は、ベク
タープラスミドからすべての細菌DNA配列を除
去することが望ましい。 遺伝子は細胞中に導入された後、自律的に複製
するプラスミド上に止まり得るか又はホスト細胞
の染色体DNA中に組み込むことができる。 KARS−配列の分離、その組み換えDNAプラ
スミドへの取り込み及びそれ等のクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)細胞中への導入 A 組み換えpKARSプラスミドの調製 プラスミドYRp7(Struhl等Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035−39、1979)5マイクログラ
ムを制限酵素Salで分解した。野生株クルイ
ベロミセス ラクテイス(K.lactis)CBS2360
からのDNA14マイクログラムを酵素Xhoで
分解した。プラスミドの断片とクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)のDNAをモル比
1:3の割合で混合し、DNA断片混合物を得
た。 制限酵素を失活後、溶液をDNA濃度25マイ
クログラム/mlにし、標準条件(ベーリンガ
ー)の下でT4−リガーゼと共にインキユベー
トした。 通常条件下で、リガーゼ処理混合物によるエ
シエリヒア コリー(E.coli)DG75の形質転
換により4.5×105AmpR形質転換物の混合物を
生じ、そのテトラサイクリンに対する感受性か
ら推論して、その中9×103はクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)挿入物を含んでい
た。 テトラサイクリン−感受性細胞の割合はサイ
クロセリン処理により85%迄増加させ得る
(Bolivar F及びBackman K.Method in
Enzymology、68、1979、245〜267)。Katz等
の方法に従い(Ex.1参照)、14の異なつたプラ
スミドを分離した、これ等をpKARS1−14と
称する。これ等のすべてはクルイベロミセス
ラクテイス(K.lactis)SD11lac−4trp−1株
をDNAマイクログラム当り103〜104の頻度で
Trp+発現型に形質転換する能力があつた。プ
ラスミドpKARS−12はDNAマイクログラム
当り3×104の形質転換頻度を示したが、プラ
スミドpKARS−2の方がその後の工程におい
てもつと便利であることが分つた。 得られた組み換えプラスミドは又エシエリヒ
ア コリー(E.coli)JA221(trpE5、leuB6、
lacY、recA、hsdM+、hadR-)にも転移する
ことが出来るであろう。 B プラスミドpKARS−12によりTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイス
SD11lac−4trp−1 クルイベロミセス ラクテイス(K.lactis)
SD11lac−4trp−1株の菌体を酵母エキス1
%、ペプトン2%及びグルコース2%を含む生
育培地(PH6.8)中に懸濁させた。指数期(3
〜5・107細胞/ml)に達する迄生育を続けた。
酵母菌体を遠沈により集め、水洗し、
1.2mol/のソルビトール、25mmol/の
EDTA及び0.2mol/の新しいメルカプトエ
タノールを含む溶液(PH8.0)中に再懸濁した。 10分間30℃でインキユベートした後、菌体を
遠沈、1.2mol/のソルビトール溶液で2度
洗滌し、1.2mol/のソルビトール、10m
mol/のEDTA、0.1mol/のクエン酸ソー
ダ及び10mgのヘリケースを含む溶液(PH5.8)
20ml中に懸濁した。 プロトプラストが生じ、15〜20分後、これ等
を遠沈し、1.2mol/のソルビトールで3回
洗滌し、10mmol/のCaCl2と1.2mol/の
ソルビトールを含む溶液0.1ml中にml当り約
5.1010菌体の濃度で再懸濁した。 10マイクログラムのpKARS−12のDNAを
加え、混合物を25℃で15分間インキユベートし
た。その後、10mmol/のトリス、10m
mol/のCaCl2及び20%(w/v)のポリエ
チレングリコール4000を含む溶液0.5mlを加え、
其後20分間インキユベートした。 プロトプラストを遠沈で沈澱させ、7m
mol/のCaCl2、1.2mol/のソルビトール、
0.5mg/mlの酵母エキス、1mg/mlのペプトン
及び2mg/mlのグルコースを含む溶液(PH6.8)
中にml当り約5.1010プロトプラスト濃度で再懸
濁させた。 Trp+形質転換を選択可能にするため、1.109
プロトプラストをグルコース2%、
KCl0.6mol/を含む2%寒天最小平板培地
(3%の寒天重層)上に移した。 4〜5日中にコロニーが現れた。グルコース
を炭素源とする0.6mol/のKCl平板上でのプ
ロトプラストの再生は通常0.5〜1.5%である。
pKARS12DNAのマイクログラム当り、3.4×
104Trp+形質転換物が得られた。 DNAの調製はStruhl等(Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035〜1039、1979)に従つた。 C KARS−型プラスミドによるTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイスSD11
lac−4 trp−1 Bに記載された方法と類似した方法により他
のKARS−型プラスミドについての形質転換
実験を行うことが出来る。実験の結果を以下の
表に要約する。
ロマイセス属の酵母であつて、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来の
対立型又は変異型および生成物の発現や性質に
有意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型
からなる群から選ばれるソーマチン様生成物を
コードする構造遺伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス(所謂
KARS)由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−3−燐酸デヒドロゲナーゼ
(GAPDH)遺伝子由来の酵母レギユロンを包
含し、この酵母は組み換え体DNAプラスミド
にてコードされるソーマチン様生成物を発現し
うることを特徴とする、上記酵母。 2 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第1項記載の酵母。 3 組み換え体DNAプラスミドは野生株K.ラク
テイスCBS2360由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第1項記載の酵母。 4 組み換え体DNAプラスミドはさらに選択マ
ーカおよび/又は酵母由来転写ターミネータおよ
び/又は酵母由来動原体および/又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第1項記載の酵
母。 5 クルイベロマイセス属酵母の調製法におい
て、 (i) プレプロソーマチン、プレソーマチン、プロ
ソーマチン、ソーマチン、これらの天然由来対
立型又は変異型および生成物の発現や性質に有
意に悪影響を及ぼさないこれらの人工修飾型か
らなるソーマチン様生成物をコードする構造遺
伝子、 (ii) クルイベロマイセス・ラクテイス(所謂
KARS)由来の自律的に複製する配列、およ
び (iii) サツカロマイセス・セレビジエのグリセルア
ルデヒド−3−燐酸デヒドロゲナーゼ
(GAPDH)遺伝子由来の酵母レギユロンから
なる組み換え体DNAプラスミドを調製し、つ
いでこのプラスミドをクルイベロマイセス属の
酵母に導入し、得られた酵母は組み換え体
DNAプラスミドにてコードされるソーマチン
様生成物を発現しうることを特徴とする、上記
方法。 6 酵母はクルイベロマイセス・ラクテイスであ
る、特許請求の範囲第5項記載の方法。 7 組み換え体DNAプラスミドはK.ラクテイス
CBS2360野生株由来のKARS−配列を含む、特
許請求の範囲第5項記載の方法。 8 組み換えDNAプラスミドはさらに選択マー
カおよび/又は酵母由来転写ターミネータおよ
び/又は酵母由来動原体および/又は酵母由来複
製領域を含む、特許請求の範囲第5項記載の方
法。 明細書 本発明は、組換えDNA技術で可能となつたプ
レプロソーマチン及び関連化合物の微生物学的製
造法に関する。いずれも1982年6月23に公告され
たヨーロツパ特許出願(A2)0054330号及び
0054331号にはプロプロソーマチンの種々の対立
型、プロソーマチン、プロソーマチン及びソーマ
チンの様なその成熟型及びそれ等の誘導型を暗号
づけるDNA配列又該DNA配列より成るクローニ
ングビヒクル(伝播体)、又それ等の微生物特に
エシエリヒア コリー(E.coli)を形質転換する
ための使用及びソーマチン様蛋白質の製造法が記
載されている。 商業的に魅力ある生産のためには、エシエリヒ
ア コリー(E.coli)について得られる収量は充
分でないので、ソーマチン様蛋白質をはるかに高
い量生産出来る微生物系の必要性が存在する。ソ
ーマチン様蛋白質とは、プレプロソーマチン、そ
の種々の対立型又は誘導型及びプレソーマチン、
プロソーマチン及びソーマチンの様なそれ等の成
熟型を意味する。 上記のヨーロツパ特許出願に記載された構造遺
伝子はクルイベロミセス ラクテイス
(Kluyveromyces lactis)(いわゆるKARS)起
源の自律的に複製する配列、撰択マーカー、及び
プラスミド中への酵母レギユロンと組み合され、
そのプラスミドはクルイベロミセス属の酵母細胞
中に導入され次いでソーマチン様蛋白質を生産し
得る様になることが分つた。この方法で酵母細胞
中のソーマチン様蛋白質の発現が成功した。 従つて、本発明は: (i) プレプロソーマチン又はその各種の対立型、
又は修飾型又はそれ等の成熟型を暗号づける構
造遺伝子、 (ii) クルイベロミセス ラクテイス
Kluyveromyces lactis(いわゆるKARS)起源
の自律的複製配列、 (iii) サツカロミセス セレビシエー
Saccharomyces cerevisiaeのグリセルアルデ
ヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)
遺伝子から誘導された酵母レギユロン及び (iv) trp−1又はlac−4遺伝子の様な撰択マーカ
ーより成る組換えDNAプラスミドを含むクル
イベロミセス属の酵母を提供するものである。 この方法で、希望する蛋白質の大きく改良され
た発現が得られ、従つて商業的応用はずつと近付
いて来ている。 望ましくはプラスミドは酵母より誘導された転
写停止暗号及び/又は動原体及び/又は酵母から
誘導された複製領域を含むものである。 クルイベロミセス ラクテイス酵母について良
い結果が得られているがその他のクルイベロミセ
スの種も同様に効果的である可能性は充分であ
る。構造遺伝子は好ましくは上述のヨーロツパ特
許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群
から選択されたものである。 以下に記載する様に満足すべきKARS−配列
が野生株K.lactis CBS2360から分離された。 クルイベロミセス ラクテイス(K.lactis)中
の形質転換の目的のため、例えばサツカロミセス
セレビジエー(S.cerevisiae)に起因するトリ
プトフアン遺伝子(trp−1)及びクルイベロミ
セス ラクテイス(K.lactis)に起因するラクタ
ーゼ遺伝子(lac−4)の様なベクター上の選択
可能なマーカーの使用が望ましい。此等のDNA
配列は選択マーカーとしてのみならず其の後の増
殖中にシステムに選択圧力を働かせる点において
も効果的である。 もし転写停止暗号が使用される場合、これは好
ましくはサツカロミセス セレビジエー(S.
cerevisiae)の2ミクロンDNAベクターのHind
−Eco R断片に起因する停止配列及びサツ
カロミセス セレビジエー(S.cerevisiae)の
GAPDH遺伝子から誘導される停止配列より成る
群より選ばれる。 動原体又は例えばサツカロミセス セレビジエ
ー(S.cerevisiae)又はクルイベロミセス ラク
テイス(K.lactis)の様な酵母染色体から誘導さ
れた複製領域の存在は本発明に従うプラスミドの
安定性を改良する。 本発明は更に、上記の様にクルイベロミセス属
の酵母の製造法を提供するものであつて、その方
法は上記構造遺伝子をKARS−配列及び構造遺
伝子の上流に酵母GAPDHレギユロン、及び選択
マーカー又任意には酵母の染色体から誘導された
動原体又は複製領域又任意には構造遺伝子の下流
に酵母から誘導された転写停止暗号を組み合せる
組み換えDNAプラスミドの調製とこれに続いて
この様に調製したプラスミドをクルイベロミセス
属の酵母中への導入により成つている。 最終的に、本発明はプレプロソーマチン又はそ
の各種の対立型又は修飾型又は上述のヨーロツパ
特許出願中に開示されたそれ等の成熟型及びその
様に調製した蛋白質の微生物学的調製法を提供
し、その方法は上記のクルイベロミセス属の酵母
を培養し次いで酵母により生産されたソーマチン
又はソーマチン様蛋白質を採取することにより成
る。 本発明を以下に詳述する。 クルイベロミセス属の酵母を、これ等の微生物
は食品や医薬品の製造に使用出来る多くの無害な
微生物群より成つているという理由により選ん
だ。例えばクルイベロミセス ラクテイス
(Kluyveromyces lactis)及びクルイベロミセス
フラジリス(Kluyveromyces fragilis)はア
メリカ合衆国FDAのグラスリスト(GRAS=一
般的に安全と認められる)に記載されている安全
な種である。醗酵工程におけるクルイベロミセス
ラクテイス(K.lactis)の行動はエシエリヒア
コリー(E.coli)についてよりもよく知られて
いて全く管理可能である:醗酵液から酵母の分離
は例えばエシエリヒア コリー(E.coli)の場合
より好ましく、酵母はしばしばエシエリヒア コ
リー(E.coli)よりも大量の(細胞外又はペリプ
ラスム)蛋白質を生産する。従つてクルイベロミ
セス属の酵母はエシエリヒア コリー(E.coli)
よりも工業生産に好適である。 現在迄のところ、クルイベロミセスのためのベ
クターは全く知られていない。 広汎な研究と実験の結果としてホスト微生物ク
ルイベロミセス ラクテイスを形質転換させ更に
形質転換した細胞中で自律的に複製する新しいベ
クターが発見された。 新しいクルイベロミセス ラクテイス(K.
lactis)のベクターはクルイベロミセス ラクテ
イス(K.lactis)中の複製と維持の機能を制御す
る。此等の複製配列はクルイベロミセス ラクテ
イス(KARS)に起源をもつ配列を自律的に複
製する。 その高い形質転換頻度の故にKARS型のベク
ターが使用される。 最も好適な代表は既知サツカロミセス セレビ
ジエー(S.cerevisice)プラスミドYRp7(Stouhl
等Proc.Natl.Acad.Sci USA76、1035−1039)中
に挿入したKARS−2配列を含むクルイベロミ
セス ラクテイス(K.lactis)DNA断片より成
るハイブリドプラスミド(雑種プラスミド)であ
るpKARS−2である。 ベクター上には更に遺伝子クローニングを可能
にするための適切な制限部位がある。 エシエリヒア コリー(Escherichia coli)も
又好適なホストである。その場合アンピシリン耐
性遺伝子(Amp R)も又ベクター上の選択可能
なマーカーである。プラスミドは好ましくは増加
させられ、エシエリヒア コリー(E.coli)細胞
中に貯蔵される。形質転換した株はアンピシリン
を含む(100マイクログラム/ミリリツター)L
−ブロス上で選択的に生育する。形質転換した株
の1つ即ちエシエリヒア コリー(E.coli)
JA221(pKARS12)はオランダのSK
Baarn3742、Oosterstraat1にあるCentral
Burean VOOR SchimmelculturesにCBS353、
82(=LMD82.20)の番号で1982年5月19日に寄
託された。プラスミドは例えばカツツ等の方法
で、J.Bacterol114(1973)577菌体から分離出来
る。 酵母ホストのプロトプラスト(原形質体)はト
リス、塩化カルシウム及び分子量が2000から6000
の範囲好ましくは4000のポリエチレングリコール
を含む通常のインキユベーシヨン培地の中で前述
のベクターにより形質転換される。 KARS−型プラスミドを使用すると、形質転
換物にトリプトフアン原栄養体を選択する可能性
がある。 形質転換細胞中のKARS−含有プラスミドの
自律的存在はDNA分析により示される。形質転
換物の未分解微小溶解物pKARSプラスミドの細
菌部である標識pBR322とのハイブリダイゼーシ
ヨン(雑種形成)によりサザーン法に従つて分析
した。 非形質転換クルイベロミセス ラクテイスlac
−4変異菌の微小溶解物と精製プラスミド調製物
の比較電気泳動は形質転換物にのみ、形質転換に
使用したプラスミドの高次コイル及び開環型に相
当する電気泳動移動度を持つハイブリツド形成バ
ンドの存在を示した。 形質転換細胞中のプラスミドの存在は酵母形質
転換物から調製したDNAによるE.coliの形質転
換と生じたE.coli形質転換物から同じプラスミド
を分離することにより更に確められた。 特に有用なホストはクルイベロミセス ラクテ
イスの変異菌SD11lac−4trp−1及びSD69lac−
4であり、これ等は野生株CBS2360から誘導さ
れオランダ国3242SK Baarn、Oosterstraat1の
Centraal Burean Voor Schimmelcultweに夫々
CBS8092及びCBS8093という寄託番号で1982年
5月19日に寄託された。 通常、形質転換するプラスミドはホスト細胞中
に自律的に複製及び発現可能な独立した存在とし
て止まる。しかしながらこゝでプラスミド(複製
配列であつてもなくても)上に存在する遺伝子は
引き続いて細胞の染色体DNA中にも組み込まれ
るということが指摘される。 本発明をプレプロソーマチンの生産に関する詳
細な記述により例示する。然し本発明の方法はソ
ーマチン−様蛋白質を暗号づけるその他の遺伝子
のクローニングと発現にも又応用出来る。 本発明の菌株を大量生産に適用する時は、ベク
タープラスミドからすべての細菌DNA配列を除
去することが望ましい。 遺伝子は細胞中に導入された後、自律的に複製
するプラスミド上に止まり得るか又はホスト細胞
の染色体DNA中に組み込むことができる。 KARS−配列の分離、その組み換えDNAプラ
スミドへの取り込み及びそれ等のクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)細胞中への導入 A 組み換えpKARSプラスミドの調製 プラスミドYRp7(Struhl等Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035−39、1979)5マイクログラ
ムを制限酵素Salで分解した。野生株クルイ
ベロミセス ラクテイス(K.lactis)CBS2360
からのDNA14マイクログラムを酵素Xhoで
分解した。プラスミドの断片とクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)のDNAをモル比
1:3の割合で混合し、DNA断片混合物を得
た。 制限酵素を失活後、溶液をDNA濃度25マイ
クログラム/mlにし、標準条件(ベーリンガ
ー)の下でT4−リガーゼと共にインキユベー
トした。 通常条件下で、リガーゼ処理混合物によるエ
シエリヒア コリー(E.coli)DG75の形質転
換により4.5×105AmpR形質転換物の混合物を
生じ、そのテトラサイクリンに対する感受性か
ら推論して、その中9×103はクルイベロミセ
ス ラクテイス(K.lactis)挿入物を含んでい
た。 テトラサイクリン−感受性細胞の割合はサイ
クロセリン処理により85%迄増加させ得る
(Bolivar F及びBackman K.Method in
Enzymology、68、1979、245〜267)。Katz等
の方法に従い(Ex.1参照)、14の異なつたプラ
スミドを分離した、これ等をpKARS1−14と
称する。これ等のすべてはクルイベロミセス
ラクテイス(K.lactis)SD11lac−4trp−1株
をDNAマイクログラム当り103〜104の頻度で
Trp+発現型に形質転換する能力があつた。プ
ラスミドpKARS−12はDNAマイクログラム
当り3×104の形質転換頻度を示したが、プラ
スミドpKARS−2の方がその後の工程におい
てもつと便利であることが分つた。 得られた組み換えプラスミドは又エシエリヒ
ア コリー(E.coli)JA221(trpE5、leuB6、
lacY、recA、hsdM+、hadR-)にも転移する
ことが出来るであろう。 B プラスミドpKARS−12によりTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイス
SD11lac−4trp−1 クルイベロミセス ラクテイス(K.lactis)
SD11lac−4trp−1株の菌体を酵母エキス1
%、ペプトン2%及びグルコース2%を含む生
育培地(PH6.8)中に懸濁させた。指数期(3
〜5・107細胞/ml)に達する迄生育を続けた。
酵母菌体を遠沈により集め、水洗し、
1.2mol/のソルビトール、25mmol/の
EDTA及び0.2mol/の新しいメルカプトエ
タノールを含む溶液(PH8.0)中に再懸濁した。 10分間30℃でインキユベートした後、菌体を
遠沈、1.2mol/のソルビトール溶液で2度
洗滌し、1.2mol/のソルビトール、10m
mol/のEDTA、0.1mol/のクエン酸ソー
ダ及び10mgのヘリケースを含む溶液(PH5.8)
20ml中に懸濁した。 プロトプラストが生じ、15〜20分後、これ等
を遠沈し、1.2mol/のソルビトールで3回
洗滌し、10mmol/のCaCl2と1.2mol/の
ソルビトールを含む溶液0.1ml中にml当り約
5.1010菌体の濃度で再懸濁した。 10マイクログラムのpKARS−12のDNAを
加え、混合物を25℃で15分間インキユベートし
た。その後、10mmol/のトリス、10m
mol/のCaCl2及び20%(w/v)のポリエ
チレングリコール4000を含む溶液0.5mlを加え、
其後20分間インキユベートした。 プロトプラストを遠沈で沈澱させ、7m
mol/のCaCl2、1.2mol/のソルビトール、
0.5mg/mlの酵母エキス、1mg/mlのペプトン
及び2mg/mlのグルコースを含む溶液(PH6.8)
中にml当り約5.1010プロトプラスト濃度で再懸
濁させた。 Trp+形質転換を選択可能にするため、1.109
プロトプラストをグルコース2%、
KCl0.6mol/を含む2%寒天最小平板培地
(3%の寒天重層)上に移した。 4〜5日中にコロニーが現れた。グルコース
を炭素源とする0.6mol/のKCl平板上でのプ
ロトプラストの再生は通常0.5〜1.5%である。
pKARS12DNAのマイクログラム当り、3.4×
104Trp+形質転換物が得られた。 DNAの調製はStruhl等(Proc.Natl.Acad.
Sci.USA76 1035〜1039、1979)に従つた。 C KARS−型プラスミドによるTrp+に形質転
換されたクルイベロミセス ラクテイスSD11
lac−4 trp−1 Bに記載された方法と類似した方法により他
のKARS−型プラスミドについての形質転換
実験を行うことが出来る。実験の結果を以下の
表に要約する。
【表】
【表】
菌株 遺伝子型 プラスミド
当りの形質転換物 の大きさ
当りの形質転換物 の大きさ
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