JP2608540B2 - クルイベロミセス種のためのクローニング系 - Google Patents

クルイベロミセス種のためのクローニング系

Info

Publication number
JP2608540B2
JP2608540B2 JP58501749A JP50174983A JP2608540B2 JP 2608540 B2 JP2608540 B2 JP 2608540B2 JP 58501749 A JP58501749 A JP 58501749A JP 50174983 A JP50174983 A JP 50174983A JP 2608540 B2 JP2608540 B2 JP 2608540B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
kluyveromyces
plasmid
dna
cell
transformed
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP58501749A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS59500848A (ja
Inventor
ホ−レンベルグ・コルネリス・ペ−
ダス・スニル
デ・レ−ウ・アルベルト
フアン・デン・ベ−グ・ヨハネス・アベル
Original Assignee
ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19839766&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2608540(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ filed Critical ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ
Publication of JPS59500848A publication Critical patent/JPS59500848A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2608540B2 publication Critical patent/JP2608540B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換え体DNAバイオテクノロジーの分野に
関する。特に、本発明は、ポリペプチドの製造に於ける
組換え体DNAバイオテクノロジーの使用に関する。さら
に特に、本発明は、ポリペプチド、例えばβ−ガラクト
シダーゼ（ラクターゼ）、キモシンのような酵素および
その前駆物質の高収量生産のために使用することができ
る新規組換え体DNAクローニングベヒクルおよびそのた
めの適当な宿主微生物に関する。
発明の背景 過去数年間で、微生物は、形質転換系によつて人工的
に導入された異種遺伝子（foreign genes）によつて暗
号化されかつ調節配列の制御下で表現された異種ペプチ
ドおよび蛋白質を生産する能力があることを立証した。
この方法の基礎的技術の幾らかは、例えば米国特許第
4,237,224号に記載されている。
組換え体DNA技術の基礎的成分は −所望の性質を暗号化しかつ宿主微生物中に於ける表現
のために所要な適当な制御配列を備えた遺伝子、 −該遺伝子の安定な複製および高レベルの表現を保証す
るために該遺伝子をその中に挿入することができるベク
ター、通常はプラスミド、 −該遺伝子を有するベクターがその中で形質転換される
ことができかつ該遺伝子の情報を表現すべき細胞系を有
する適当な宿主微生物 によつて形成される。
かくして生成される生成物には、酵素、ホルモン、抗
原ならびにその他の有用なペプチドおよび蛋白質があ
る。
これらの生成物のあるものは、医薬品、例えば成長ホ
ルモン、インターフエロンとして、またあるものは食品
工業に於ける添加物、例えばβ−ガラクトシダーゼ（ラ
クターゼ）、キモシン、アミログルコシダーゼとして用
いられ、さらにあるものはある種の化合物の転化のため
の生物触媒として作用することができる。
医薬品又は食品の有害な微生物又は物質による如何な
る汚染も排除されねばならない。宿主微生物も、実験中
あるいは大規模な生産工程中に微生物を取扱つている人
に無害でなければならない。従つて、宿主の必要条件は
病原性でないことである。
初期の組換えDNA研究においては、所望でない副作
用、特に病原性微生物が環境中へ制御されずに播種され
ることを防止しまたは制限するために厳しい規則および
制限を課することを特徴としていた。
想定される危険に関する関心が過大視されていたよう
に思われるが、有害な作用を伴わない宿主に対する要望
は依然として残つている。
現在まで、種々の物質を生産するためのプラスミドの
遺伝的組換え操作を含む商業的努力は宿主微生物として
大腸菌（Escherichia coli）に集中して来た。その主な
理由は、大腸菌（E.coli）が歴史的に最も良く研究され
た微生物だということである。組換え体DNAテクノロジ
ーに於てなされた最初の発見および発明は、宿主として
大腸菌を用いてなされている。
しかし、大腸菌は、医薬品および食品工業に於て用い
られる物質の商業的生産のために使用する最も望ましい
微生物ではない。ある場合には、大腸菌は、多数の有害
な発熱性因子の存在のために、宿主／ベクター系として
不適当であると立証されている場合さえある。これら因
子の除去は、しばしば問題を生じる可能性がある。従つ
て、大腸菌は、醗酵工業に於ける生産微生物としては極
めて限られた用途しかない。大腸菌に於ける蛋白質分解
活性も、ある種の有用な生成物の収量をひどく限定する
可能性がある。
これらのことおよびその他のことを考えて、別の宿主
／ベクター系への関心が次第に増加して来た。その関心
は、特に、真核生物生成物の製造のための真核生物系の
使用に集中しつゝある。化学物質、特に食品用および医
薬品用生成物のための生産微生物として全く疑いの余地
が無くかつさらに工業に於ける大規模醗酵にも適してい
る新しい宿主への要望は依然としてある。
多くの無害な微生物の名称が、いわゆるGRAS〔安全性
認定（Generally Recognized as Safe）〕リスト中に見
られる。しかし、今まで、GRAS微生物に於ける遺伝子の
クローニングおよび表現については、ほんの２、３の遺
伝的操作しか知られていない。
商業的利用に適した真核微生物中で、おそらく酵母が
最も扱い易いものである。酵母、特にパン酵母は、比較
的安価で、大量増殖が容易であり、高度に発達した遺伝
系を有する。
酵母という用語は、しばしば、最も普通で周知の種の
１つであるサツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomy
ces cerevisiae）すなわちパン酵母のみを指すために用
いられる。本明細書中で使用する酵母という用語は、す
べての属を示すものであつて、サツカロミセス・セレビ
シアエ（Saccharomyces cerevisiae）に限定されるもの
でないことは言うまでもない。
最近、サツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyce
s cerevisiae）の細胞がプラスミドによつて形質転換を
受けやすいことが開示されている〔A.ヒンネン（A.Hinn
en）他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA75（1978）、1929〕。
この酵母中で、アンピシリン、クロラムフエニコール、
カナマイシンのための細菌耐性遺伝子をクローニングお
よび表現することに成功しているが、ラクターゼ遺伝子
ならびにオバルブミン、白血球インターフエロンＤのた
めの異種遺伝子（heterogous genes）をも、またドロソ
フイラ（Drosophila）遺伝子をもクローニングおよび表
現することに成功している〔C.P.ホレンバーグ（C.P.Ho
llenberg）、カレント・トピツクス・イン・マイクロバ
イオロジー・アンド・イムノロジー（Current Topics i
n Microbiology and Immunology）、96（1982）119−14
4参照〕。
現在まで、酵母表現ベクターのための宿主としては、
唯一つの他の酵母種しか研究されていない。サツカロミ
セス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）ロイ
シン遺伝子が、シザサツカロミセス・ポンベ（Schizosa
ccharomyces pombe）中で成功裏にクローニングされか
つ表現された〔D.ビーチおよびP.ナース（D.Beach and
P.Nurse）、ネーチヤー（Nature）、290（1981）140−1
42〕。
好結果の形質転換を与えると記載されている酵母ベク
ターは、S.セレビシアエの多くの種に存在する天然の２
μｍ（２ミクロン）プラスミド〔例えばJ.D.ベツグズ
（J.D.Beggs）、ネーチヤー（Nature）、275（1978）、
104−109参照〕および酵母染色体DNAに由来する自律的
複製配列（ARS）〔例えばK.ストルール（K.Struhl）
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA76（1979）、1035−1039
参照〕をそれぞれ基礎としている。形質転換用に用いる
ことができるサツカロミセス・セレビシアエのためのベ
クターは、C.P.ホレンバーグ（C.P.Hollenberg）、〔カ
レント・トピツクス・イン・マイクロバイオロジー・ア
ンド・イムノロジー（Current Topics in Microbiology
and Immunology）、96（1982）、119−144〕によつて
も記載されている。
十分には特性づけられていない酵母種又は工業的酵母
種の形質転換は、形質転換条件および適当なベクターに
ついての知識の不足によつてひどく妨げられている。そ
の上、栄養要求標識は、しばしば入手不可能かあるいは
望ましくなく、栄養要求変異種の相補性による直接選択
を妨げている。
発明の要旨 本発明の１つの目的は、挿入されたポリペプチド暗号
配列（coding sequence）を表現することができる酵母
ベクター系を提供することである。
本発明の別の目的は、大量生産用の培養中でポリペプ
チドを生産することができる、クルイベロミセス（Kluy
veromyces）属の新規の遺伝手術酵母株（遺伝子操作済
み酵母株）を提供することである。
本発明の別の目的は、大量生産用培養中でキモシンヌ
はその前駆物質を生産することができる、クルイベロミ
セス（Kluyveromyces）属の新規遺伝手術酵母株を提供
することである。
本発明のさらに別の目的は、大量生産用培養中でラク
ターゼを生産することができるクルイベロミセス（Kluy
veromyces）属の新規遺伝子操作済み酵母株を提供する
ことである。
本発明のさらに別の目的は、組換え体DNA技術によつ
て得られる生産用微生物としてのクルイベロミセス（Kl
uyveromyces）によるポリペプチド、特に酵素の製造方
法を提供することである。
本発明のさらにもう１つの目的は、ある種の酵素活性
を示すポリペプチドの生産に使用するための特別に変性
されたクルイベロミセス（Kluyveromyces）を提供する
ことである。
これらの目的および他の目的を、以下の明細書中で、
さらに詳細に説明する。
発明の説明 クルイベロミセス（Kluyveromyces）属の酵母、特に
K.ラクチス（K.lactis）およびK.フラギリス（K.fragil
is）は、バイオテクノロジー的に重要でありかつ商業的
に関心がある。例えば、クルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）およびクルイベロミセス・フ
ラギリス（Kluyveromyces fragilis）は、酵素ラクター
ゼ（β−ガラクトシダーゼ）の商業的生産に用いられ
る。クルイベロミセス（Kluyveromyces）菌はGRASリス
トに挙げられている。
形質転換実験で研究されたほとんどの細菌種とは対照
的に、酵母細胞は、プラスミドに対して不透過性の細胞
壁を有する。それ故、酵母の形質転換の通常の予備工程
は、細胞壁を除去してプラスミドを吸収することができ
る原形質体を得ることである。有利に使用することがで
きる細胞壁溶解性酵素（lytic enzyme）は、β−1,3−
グルカナーゼの群から選ばれる。適当な例は、蝸牛ヘリ
ツクス・ポマチア（Helix pomatia）の腸から誘導され
る粗製酵素製剤ヘリカーゼである。別の適当な例はチモ
リアーゼである。
次のインキユベーシヨン中に、適当な条件下で細胞壁
が再生され得ることは周知である。しかし、原形質体の
／分画しか再生せず、クルイベロミセス・ラクチス（Kl
uyveromyces lactis）では、この工程は、同様な条件下
でのサツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces ce
revisiae）の場合よりも20倍も低高率であると思われて
いた。
原形質体を用いる酵母の形質転換は、数人の著者が記
載しているが、ある種の酵母種、特に野生型酵母株およ
びクルイベロミセス（Kluyveromyces）種は、再生が極
めて困難のように思われる。ホレンバーグ（Hollenber
g）〔カレント・トピツクス・イン・マイクロバイオロ
ジー・アンド・イムノロジー（Current Topics in Micr
obiology and Immunology）96（1982）119−144〕は、
通常の浸透性安定剤ソルビツトの代わりに0.6M塩化カリ
ウムを用いるならば、サツカロミセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）の原形質体の再生もまた
如何に起こり得るかを記載している。今回、本発明者ら
は、この方法をクルイベロミケス（Kluyveromyces）の
原形質体に適用することによつて、再生される酵母細胞
の分画が３倍乃至５倍にも増加するという驚くべき発見
をした。
細菌、原形質体の代わりに全細胞を用いて再生工程を
回避する（circumvent）１つの方法がイトー（Ito）他
〔J.Bacteriol.153（1983）163−168〕によつて開示さ
れた。この方法は、ある型のプラスミドを有するS.セレ
ビシアエ（S.cerevisiae）に有効であることが示され
た。今回、本発明者らは、この方法がクルイベロミセス
に、特にプラスミドがKARS配列を含むプラスミドを用い
るとき（後述のように）驚異的に有効であることを発見
した。
適当なベクターの入手可能性が決定的に重要であるこ
とは、当業者には明らかであろう。特殊な宿主／ベクタ
ーの組み合わせが形質転換系として好結果で作用するか
どうかは予め不確かである。例えば、S.ダスおよびC.P.
ホレンバーグ（S.Dast and C.P.Hollenberg）〔カレン
ト・ゲネテイツクス（Current Genetics）６（1982）12
3−128〕の論文から、プラスミドpHP81はサツカロミセ
ス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）YT6−
２−IL（cir゜）中に形質転換されるが、クルイベロミ
セス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）中に形質転換
されないことが知られている。D.ビーチおよびP.ナース
（D.Beach and P.Nurse）は、ネーチヤー（Nature）290
（1981）140−142中で、プラスミドpJDB219はサツカロ
ミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）に
於て高いコピー数を有するが、シゾサツカロミセス・ポ
ンベ（Sahizosaccharomyces pombe）を、DNA/マイクロ
グラム（μｇ）当たり僅か２個の形質転換体の極めて低
頻度でしか形質転換しないことを記載している。
現在まで、クルイベロミセス（Kluyveromyces）のた
めのベクターは全く知られていない。
広範な研究および実験の結果として、本発明者らは、
宿主菌クルイベロミセス（Kluyveromyces）を形質転換
することができかつさらに形質転換された細胞に於て自
律的に複製することができる新規ベクターを発見した。
この新規ベクターは、クルイベロミセス（Kluyveromy
ces）、好ましくはK.ラクチス（K.lactis）およびK.フ
ラギリス（K.fragilis）に特に適しているが、例えばク
ルイベロミセス（Kluyveromyces）種に於ける複製およ
び維持の機能を制御する構成DNA配列に従つて下記の２
つのカテゴリーに分類されうる。
1.自律的複製配列（ARS）を含むベクター、および 2.自律的複製配列を欠如しているが、宿主染色体による
組換えのための部位として作用する相同クルイベロミセ
ス（Kluyveromyces）DNAを含むベクター。
適当でかつ好ましいARSベクターは、KARSベクターと
も呼ばれる、クルイベロミセス（Kluyveromyces）由来
のベクターである。KARS型の該ベクターは、好ましく
は、その高い形質転換頻度のために用いられる。第２の
カテゴリーのベクターは、通常、低頻度で形質転換する
が、これらのベクターは宿主細胞中に極めて安定に保持
される。
第１のカテゴリーの好ましいベクターは、例えばK.ラ
クチス（K.lactis）に由来するKARSベクターであり、そ
の中で、pKARS12、pKARS2が最も好ましい。pKARS12およ
びpKARS2は、既知のS.セレビシアエ（S.cerevisiae）プ
ラスミドYRp7中へ挿入される、それぞてKARS12およびKA
RS2配列を含むK.ラクチス（K.lactis）DNA断片から構成
される雑種プラスミドである。
第２のカテゴリーの好ましいベクターは、例えばARS1
配列を有するプラスミドYRp7とLAC4遺伝子を担持するK.
ラクチス（K.lactis）Xhol DNA断片とから構成される雑
種プラスミドpL4である。
クルイベロミセス（Kluyveromyces）に於ける形質転
換用には、例えば下記遺伝子を、該ベクター上の選択標
識として有利に用いることができる。
1.S.セレビシアエ（S.cerevisiae）から誘導されるトリ
プトフアン遺伝子、 2.K.ラクチス（K.lactis）から誘導されるラクターゼ遺
伝子（LAC4）、 3.大腸菌（E.coli）から誘導されるゲンタマイシンに関
係する抗生物質G418に対する耐性のためのKanR遺伝子暗
号。
ベクター上には、それ以上の遺伝子クローニングを許
す適当な制限部位がある。
形質転換されたプラスミドの安定性は、K.ラクチス
（K.lactis）又はS.セレビシアエ（S.cerevisiae）染色
体からのセントロマー領域（CEN）をベクター中に挿入
するならば、相当に増強され得る。
大腸菌（Escherichia coli）も、特にクローニングお
よび貯蔵のための適当な宿主である。その場合には、ア
ンピシリン・耐性遺伝子（AmpR）も、ベクター上の適当
な選択標識である。プラスミドは、好ましくは大腸菌
（E.coli）細胞、特にDG75株およびJA221株の大腸菌細
胞内で増殖および貯蔵される。形質転換された菌株は、 E.コリ（E.coli）DG75（PTY75−LAC4）用にはカナマ
イシン（20μg/ml）を、E.コリ（E.coli）DG75（PL4）
およびE.コリ（E.coli）JA221（pKARS/2）用にはアンピ
シリン（100μg/ml）を含有するＬ−ブロスで選択的に
増殖される。
該形質転換菌株は、ヨーロツパ特許条約のルール28、
resp.28aにより、オランダ国、3742SKバールン（Baar
n）、オーステルストラート（Oostersstraat）１、セン
トラール・ビユーロー・ボール・シンメルカルチヤーズ
（Centraal Bureau voor Schimmelcultures）に、それ
ぞれCBS351.82（＝LMD82.18）,CBS352.82（＝LMD82.1
9）,CBS353,82（＝LMD82.20）の番号で、1982年５月19
日に寄託された。プラスミドは、細胞から、例えばL.カ
ツツ（L.Katz）ら〔J.Bacteriol.114（1973）577〕の方
法で分離することができる。
酵母宿主の原形質体は、トリスと塩化カルシウムと20
00〜6000の範囲の、好ましくは4000の分子量を有するポ
リエチレングリコールとを含む、通常のインキユベーシ
ヨン培地中で、上記ベクターによつて形質転換される。
原核生物形質転換体は、公知の一次選択方法によつて
容易に検出することができる。所望の性質が形質転換体
の表現型中に認識可能でないとしても、ベクターは、通
常、抗生物質耐性のような一次選択可能な性質のための
１つ以上の遺伝子暗号あるいは必須成長因子のための遺
伝子暗号を含む。後者の場合には、宿主の対応する栄養
要求突然変異体が入手可能でなければならない。数多く
の栄養要求原核生物が入手可能であるが、栄養素要求性
の工業用酵母は限定されている。生産菌株からの遺伝子
の突然変異は、しばしば該菌株の重要な成長および生産
特性に悪影響を与える。
クルイベロミセス（Kluyveromyces）種の形質転換の
ために原形質体の代わりに全細胞を用いる、本発明の形
質転換方法は、相応しくは下記のように行うことができ
る。
本発明の方法は、クルイベロミセス（Kluyveromyce
s）細胞を標準酵母培地中で増殖させ、１〜25のOD610nm
で細胞を収穫することからなる。４〜10のOD610nmに於
て最適の結果が得られる。クルイベロミセス（Kluyvero
myces）細胞を洗浄し、ある種のカオトロピツク イオ
ン（chaotropic ions）、例えばLi+,Sc+,Rb+と共に予備
処理する。通常、LiclおよびLi2SO4を、一価イオンに基
いて計算して最終濃度約20mM−0.2M、好ましくは約0.1M
で使用する。クルイベロミセス（Kluyveromyces）細胞
を、該１価イオンと共に、30℃で約５〜120分間、通常
約60分間インキユベーシヨンした後、DNAと共にインキ
ユベーシヨンする。次にポリエチレングリコールを添加
するならば、形質転換を増大することができる。一般に
70％ポリエチレングリコール7000の等容量を用いる。ク
ルイベロミセス（Kluyveromyces）の形質転換は、細胞
を熱処理にかけることによつてさらに増大されうる。例
えば、約42℃で約５分間処理すると、約20倍増大され
る。本発明によるこの操作の使用は、クルイベロミセス
・ラクチス（Kluyveromyces lactis）SD11,クルイベロ
ミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）leu24,
クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragil
is）C21をそれぞれの宿主微生物として用いる実施例中
で詳細に示される。
原核生物とは対照的に、酵母中に於ける抗生物質耐性
標識の使用は決して容易ではない。酵母に対して活性な
抗生物質はほんの少数にすぎない。さらに、耐性因子は
主として細菌に由来し、それらが酵母細胞中で表現され
かつ選択標識として使用されることができるかどうかは
全く明らかでない。カナマイシンとゲンタマイシンに関
係するアミノグリコシドG418とは、野生型酵母株の細胞
に有毒であることが示されている。
ホレンバーグ（hollenberg），エクストラクロモソマ
ル（Extrchromosomal）DNA,ICN−UCLASymp.（1979）15:
325−338（Acad.Press,ニユーヨーク）から、転位耐性
要素（Tn601（細菌プラスミドpCR1上に存在する）がサ
ツカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisi
ae）の形質転換体にカナマイシンに対する耐性を与える
遺伝子を含むことも知られている。その後、A.ジメネジ
（A.Jimenez）およびJ.デービス（J.Davis）〔ネーチヤ
ー（Nature）287（1980）869−871〕は、該カナマイシ
ン耐性遺伝子がS.セレビシアエ（S.cerevisiae）形質転
換体に強力な酵母成長阻害剤、抗生物質G418に対する耐
性をも与えうることを示している。
プラスミドpCR1とS.セレビシアエ（S.cerevisiae）か
らの２μｍプラスミドとプラスミドpK16からのSall断片
とからなり、K.ラクチス（K.lactis）LAC4遺伝子を担持
しかつ本発明の１つの特徴をも形成する雑種プラスミ
ド、プラスミドPTY75−LAC4は同じ耐性遺伝子を含む。
今回、本発明者らは、該遺伝子がクルイベロミセス・ラ
クチス（Kluyveromyces lactis）中にも表現され、該株
が増殖倍地から吸収したG418を不活性することを可能に
しかつかくしてクルイベロミセス・ラクチル（Kluyvero
myces lactis）形質転換体の一次選択のための手段を与
えることを発見した。
プラスミドPTY75−LAC4は、クルイベロミセス（Kluyv
eromyces）からの自律的複製配列を含まないが、S.セレ
ビシアエ（S.cerevisiae）からの２μｍプラスミドを含
む、PTY75−LAC4のようなプラスミドはクルイベロミセ
ス（Kluyveromyces）種中で自律的に複製するという驚
くべきことが発見された。
PTY75−LAC4によつて形質転換されたG418耐性酵母細
胞の選択は、ブドウ糖とソルビツトと0.2mg/mlG418とを
含む再生平板上で行われた、Kclは、ここでは、塩濃度
が高いために不適である。クルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）細胞は、G418に対して、0.8m
g/mlまでの濃度でも感じない。
耐性コロニーは、PTY75−LAC4による形質転換後、５
−６日以内に現われる。真の形質転換体は、ラベル付き
pCR1 DNAによつてコロニーハイブリダイゼーシヨン（h
ybridisation）によるPTY75−LAC4DNAの存在を検査する
ことにより、自然突然変異で耐性となつたコロニーから
区別することができ、あるいは宿主株としてK.ラクチス
（K.lactis）Lac4突然変異株を用いる場合には、唯一の
炭素源として乳糖を有する最小培地〔酵母窒素ベース，
デイフコ（Difco）〕での増殖能力を調べることによつ
て区別することができる。平均して、耐性コロニーの５
％がPTY75−LAC4 DNAを含むことすなわちLac+であるこ
とが発見された。この選択方法で、プラスミドDNA1μｇ
当たり約４個の形質転換体が得られた。
唯一の炭素源としての乳糖と浸透性安定剤としての0.
6MKclとを含む平板を用いる、LAC4遺伝子の存在による
K.ラクチス（K.lactis）SD69lac4中での直接選択では、
30℃で４〜５日間のインキユベーシヨン後、20個のLac+
形質転換体が得られた。DNAなしの対照平板上では、該
期間内にLac+コロニーは現われなかつた。この直接選択
のLac+コロニーは、G418平板上でKanR標識の存在を上記
のように示すことができるので、形質転換体であつて、
自然復帰突然変異体ではないことがわかつた。
プラスミドpL4（実施例３参照）又はKARS型プラスミ
ドを用いるときには、形質転換体中にトリプトフアン原
栄養性が存在することによつて選択することができる。
プラスミドPTY75−LAC4と比べて、プラスミドpL4を用い
ると、形質転換効率が実質的に増加し、DNA1μｇ当たり
30個の形質転換体が見いだされた。しかし、DNA1μｇ当
たり103−104個の形質転換体を有するKARS型プラスミド
の方が遥かに優れているように思われる。
プラスミドPTY75−LAC4およびKARS含有プラスミドは
自律的に複製する形質転換細胞中に存在することが見い
だされた。このことは、DNA分析によつて示された。形
質転換体の未消化ミニリゼート（undigested minilysat
es）を、サザーンブロツト法（Southernblot procedur
e）に従い、プラスミドPTY75−LAC4の細菌成分、32Pラ
ベル付きpCR1によるハイブリダイゼーシヨンにより、あ
るいはpKARSプラスミドの細菌部分、ラベル付きpBR322
によるハイブリダイゼーシヨンにより、分析した。
形質転換されなかつたクルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）lac4trp1突然変異株のミニリ
ゼート（minilysate）および精製プラスミド製剤の比較
電気泳動は、形質転換体中にのみ、形質転換のために用
いられたプラスミドのスーパーコイル状およびオープン
サーキユラー形に対応する電気泳動移動度を有するハイ
ブリダイゼーシヨンバンド（hybridizing bands）が存
在することを示す。
形質転換細胞中にプラスミドが存在することは、酵母
形質転換体からのDNA製剤により大腸菌（E.coli）を形
質転換しかつ生成した大腸菌（E.coli）形質転換体から
同プラスミドを分離することによつて、さらに確認され
た。
本発明の方法は、クルイベロミセス・ラクチス（Kluy
veromyces lactis）種の宿主株ならびにクルイベロミセ
ス・フラギリス（Kluyveromyces fragiris）の宿主株に
適用することができる。両種ともに安全な微生物であ
り、GRASリストに載つている。
特に有用な宿主は、野生型CBS2360から誘導される突
然変異株クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces
lactis）SD11 lac4 trp1およびSD69 lac4であり、これ
らは、ヨーロツパ特許条約のルール28,resp.28aによ
り、オランダ国,3742 SK Baarn,オーステルストラート
（Oosterstraat）１のセントラール・ビユーロー・ブー
ア・シンメルカルチヤーズ（Centraal Bureau Voor Sch
immelcultures）に、1982年５月19日に、それぞれCBS80
92およびCBS8093の番号で寄託されている。
通常、形質転換用プラスミドは、自律的複製および表
現のできる別個の因子として宿主細胞内に残る。しか
し、ここで、プラスミド（複製配列を有するか、あるい
は有しない）上へ導入された後の遺伝子を、次に細胞の
染色体DNA中へ組込むことも可能であることを指摘して
おく。
このいわゆる組込み形質転換は、プラスミドpL4によ
る形質転換後、安定なK.ラクチス（K.lactis）SD11 trp
l Lac+形質転換体中で起こつたように思われる。この場
合、形質転換体中には遊離のプラスミドDNAは存在しな
い。LAC4遺伝子の組込みは、ラベル付きハイブリダイゼ
ーシヨンプローブ（labelled hybridizationprobe）と
して働くpL4プラスミド、制限酵素によつて消化される
全細胞DNAのサザーンブロツト（Southernblot）DNA分析
によつて示すことができる。
酵母形質転換体中にプラスミドを維持するためには、
例えば下記の選択培地を用いることができる。K.ラクチ
ス（K.lactis）SD69 lac4（PTY75−LAC4）用およびK.ラ
クチス（K.lactis）SD69 lac4（pL4）用には酵母窒素ベ
ース培地（DIFCO）＋２％乳糖（ブドウ糖の代わりに）;
K.ラクチス（K.lactis）SD11 lac4 trp1（pKARS12）用
には酵母窒素ベース培地（DIFCO）＋２％ブドウ糖。
KARS12−LAC4およびKARS12−２μmDNA−LAC4配列を含
む雑種プラスミドを作つた。本発明による新規微生物を
大規模生産に用いる場合には、ベクタープラスミドから
すべての細菌DNA配列を除去することが望ましい。
遺伝子は、細胞中に導入された後、自律的複製プラス
ミド上に残ることができるか、あるいは宿主細胞の染色
体DNA中に組込まれることができる。
本発明は、好ましくは前述した型の１つのプラスミド
ベクターを用い、宿主としてのクルイベロミセス（Kluy
veromyces）中に於ける原核生物遺伝子および真核生物
遺伝子の両方のクローニングおよび表現のために用いる
ことができる。本発明に使用するための適当な原核生物
遺伝子は、例えばラクターゼ、α−アミラーゼ、アミク
グルコシダーゼ、β−ラクタマーゼを暗号化するもので
ある。本発明に使用するために適当な真核生物遺伝子
は、例えばラクターゼ、キモシン、インベルターゼ、イ
ンターフエロンを暗号化するものである。これらの生産
物のための遺伝子暗号の挿入のためには、前述したよう
に、ベクター上の適当な制限部位が有効である。
本発明では、相同および非相同の両方の、原核生物遺
伝子および真核生物遺伝子を用いることができる。本発
明は、化学物質、特にポリペプチドの高生産のために有
利に用いられうる。本発明の好ましい実施態様は、凝乳
酵素キモシンの生産である。
クルイベロミセス（Kluyveromyces）中に於ける遺伝
子のクローニングおよび表現のためのベクターおよびレ
ギユロンの選択は、勿論、特別な場合に用いられる遺伝
子によつて異なる。また、宿主としての特別なクルイベ
ロミセス（Kluyveromyces）株および最適なプロセス条
件も、特に、選択されるべき遺伝子およびベクターによ
つて異なる。最適選択ならびにプロセス条件は、日常の
実験で決めることができる。これらの変化は、すべて本
発明中に含まれる。
以下、 a.K.ラクチス（K.lactis）中に於ける相同遺伝子β−ガ
ラクトシダーゼ（ラクターゼ）； b.K.ラクチス（K.lactis）およびK.フラギリス（K.frag
ilis）中に於ける原核生物非相同遺伝子KanR; c.K.ラクチス（K.lactis）中に於ける真核生物非相同遺
伝子TRP1; d.K.フラギリス（K.fragilis）中に於ける真核生物非相
同遺伝子LEU2; e.K.ラクチス（K.lactis）中に於ける真核生物非相同遺
伝子，暗号化用プレプロキモシンおよびその成熟形； f.K.ラクチス（K.lactis）中に於ける真核生物非相同遺
伝子，暗号化用プレプロタウマチンおよびその成熟およ
び変性形 のクローニングおよび表現の詳細な説明によつて、本発
明をさらに例示する。
下記実施例は、本発明の幾つかの実施の態様を説明す
る。
実施例１ 組換え体プラスミドPTY75−LAC4 R.デイクソン（R.Dickson）〔ジーン（Gene）10（198
0）347−356〕が記載しているプラスミドpK16の0.5μｇ
およびC.P.ホレンバーグ（C.P.Hollenberg）ら〔ジーン
（Gene）１（1976）33−47〕が記載しているプラスミド
PTY75の0.5μｇを制限酵素Sal 1で消化した。この両消
化物を混合し、制限酵素を不活化させた後、溶液をT4−
リガーゼと共にインキユベーシヨンし、組換え体DNAを
有する溶液を得た。
このリガーゼ処理（ligated）混合物を、R.C.デイク
ソン（R.C.Dickson）ら〔セル（Cell）15（1978）123−
130〕に従つて大腸菌（E.coli）株DG75（hsdS1 leu−6
ara−14 galK2 xy1−5 mt−1 rpsL20 thi−1 supE44−
λ−−lac Δz39）へ形質転換させるために用い、カナ
マイシン耐性株（KanR）を得た。KanRコロニーを、乳糖
の唯一の炭素源として含む補足最小平板上で、Lac+コロ
ニーの生成のためにさらに選択した。選択されたKanRLa
c+形質転換体の１つから、L.カツツ（La.Katz）ら〔J.B
acteriol.144（1973）577−591〕の方法を用いて、プラ
スミドPTY75−LAC4を単離した。
実施例２ 組換え体pKARSプラスミド プラスミドYRp7〔ストルール（Struhl）ら,Proc.Nat
l.Acad.Sci.,76（1979）1035−39〕の５μｇを制限酵素
Sal1で消化した。野生株K.ラクチス（K.labtis）CBS236
0からのDNA14μｇを酵素Xho1で消化した。該プラスミド
およびK.ラクチス（K.lactis）の断片を、モル比1:3で
混合した。制限酵素を不活化した後、溶液を、DNA濃度2
5μg/mlにし、標準条件下でT4−リガーゼと共にインキ
ユベーシヨンした〔ベーリンガー（Boehringer）〕。
通常の条件下で、このリガーゼ処理（ligated）混合
物によりE.コリ（E.coli）DG75を形質転換させて4.5×1
05AmpR形質転換体混合物を得た。これらの形質転換体の
うちの９×103は、テトラサイクリンに対する感受性か
ら推論できるように、K.ラクチス（K.lactis）インサー
トを含んでいた。テトラサイクリン感受性細胞の比率
は、シクロセリン処理によつて85％に増加することが可
能である〔F.ボリバー（F.Boliver）およびK.バックマ
ン（K.Backman），メソツド，イン．エンジモノジー（M
ethods in Enzymology）68（1979）245−267参照〕。カ
ツツ（Katz）らの方法（実施例１参照）により、14種の
異なるプラスミドを単離し、これらをpKARS1〜14と称
す。これらはすべて、K.ラクチス（K.lactis）SD11 lac
4 trp1株を、DNA1μｇ当たり103−104個の頻度で、Trp+
表面型で形質転換させる能力を有していた。プラスミド
pKARS12は、DNA1μｇ当たり３×104個の最高形質転換頻
度を示したが、プラスミドpKARS2の方が、その後の処理
に都合がよいように思われた。
得られた組換え体プラスミドは、大腸菌（E.coli）JA
221（Δtrp E5,leu B6,lac y,rec A,hsdM+,hsdR+）へ転
移させることも可能であつた。
実施例３ 組換え体プラスミドpL4 YRo7およびK.ラクチス（K.lactis）DNA断片の混合物
を、実施例２記載のようにして調製した。このリガーゼ
処理（ligated）混合物で大腸菌（E.coli）DG75株を形
質転換させ、次に、M9最小寒天上で平板培養した。この
培地は、唯一の炭素源として乳糖を含んでおり、かつロ
イシンが添加されている。30℃で８日後に、Lac+コロニ
ーが出現した。これらのLac+コロニーの１つから、カツ
ツ（Katz）らの方法（実施例１参照）を用いてプラスミ
ドpL4を単離した。
実施例４ プラスミドPTY75−LAC4によるクルイベロミセス・ラク
チス（Kluyveromyces lactis）SD69 lac4のG418R lac4
+への形質転換 クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lacti
s）突然変異株SD69 lac4の細胞を、酵母エキス１％，
ペプトン２％，ブドウ糖２％を含む増殖培地（pH6.8）
中に懸濁し、指数期（３−５・107細胞/ml）に達するま
で増殖を続行した。
酵母細胞を、遠心分離で集め、水洗し、1.2Mソルビツ
ト、25mMEDTA、0.2Mの新しいメルカプトエタノールを含
む溶液（pH8.0）中に再懸濁させた。
30℃で１分間インキユベーシヨンした後、細胞を遠心
分離で集め、1.2Mソルビツト溶液で２回洗浄した後、1.
2Mソルビツト、10mMEDTA、0.1Mクエン酸ナトリウム、10
mgのヘリカーゼ（helicase）を含む溶液（pH5.8）20ml
中に再懸濁させた。
原形質体が形成され、15−20分後、これらを遠心分離
し、1.2Mソルビツトで３回洗浄し、10mMCacl2と1.2Mソ
ルビツトとを含む溶液0.1ml中に約５・1010細胞/mlの濃
度になるように再懸濁させた。
10μｇのPTY75−LAC4を加え、混合物を25℃で15分間
インキユベーシヨンした。その後で、10mMトリスと10mM
Cacl2と20％（W/V）ポリエチレングリコール4,000とを
含む溶液（pH7.5）0.5mlを添加した後、20分間インキユ
ベーシヨンした。
遠心分離によつて原形質体を沈澱させた後、7mMCacl2
と1.2Mソルビツトと0.5mg/mlの酵母エキスと1mg/mlのペ
プトンと2mg/mlのブドウ糖とを含む溶液（pH6.8）中
に、約５・1010原形質体/mlの濃度に再懸濁させた。
30℃で60分間インキユベーシヨンした後、原形質体を
遠心分離し、0.6MKcl溶液で洗浄し、0.6MKcl溶液中に再
懸濁させた。
G418耐性形質転換体を選択することができるようにす
るため、２％ブドウ糖と1.2Mソルビツトと0.2mg/mlの抗
生物質G418とを含む２％最小寒天平版上の３％寒天重層
中で１・109個の原形質体を平板培養した。Lac+形質転
換体を同時選択するため、唯一の炭素源としての２％乳
糖と1.2Mソルビツトの代りの0.6MKclとを含む２％最小
寒天平板、DIFCO酵母窒素ベース培地上の３％寒天重層
中で平板培養した。
コロニーは４−５日以内に出現した。G418無しのソル
ビツト平板上では、原形質体再生率は、通常0.2−0.5％
であつたが、炭素源としてブドウ糖を有する0.6MKcl平
板上では、再生率は0.5−1.5％に増加した。
選択のためにG418を用いたとき、再生原形質体107個
当たり１個の形質転換体を得た。乳糖平板上での同時選
択では、再生原形質体107個当たり10個の形質転換体、
あるいはプラスミドDNA1μｇ当たり20個の形質転換体を
得た。
酵母細胞中のPTY75−LAC4の存在は、32pラベル付きpC
R1によるサザーンハイブリダイゼーシヨン法（Southern
hybridization method）によつて立証された。
ストルール（Struhl）ら〔Proc.Natl.Acad.Sci.76（1
979）1035−1039）に従つてDNA製剤を作つた。
実施例５ プラスミドpKARS12によるクルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）SD11 lac4 trp1のTrp+への形
質転換 K.ラクチス（K.lactis）SD11 lac4 trp1株の細胞を、
10μｇのpKARS12DNAで、実施例４記載のようにして形質
転換させた。２％のブドウ糖と0.6MKClとを含む２％最
小寒天平板上で形質転換体を選択した。pKARS12 DNA1μ
ｇ当たり3.4×104個のTrp+形質転換体が得られた。
実施例６ プラスミドpL4によるクルイベロミセス・ラクチス（Klu
yveromyces lactis）SD69 lac4のLac+への形質転換 実施例４に於てPTY75−LAC4について記載したと同じ
方法を用い、プラスミドpL4によりK.ラクチス（K.lacti
s）株SD69 lac4を形質転換させた。２％の乳糖を含む酵
母窒素ベース平板（DIFCO）上で形質転換体を選択し
た。形質転換頻度は、プラスミドDNA1μｇ当たり形質転
換体20個であつた。
実施例７−13 プラスミドpPTY75−LAC4又はKARS型プラスミドにより形
質転換されたクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromy
ces lactis）株 実施例５記載の方法と類似の方法で、他のKARS型プラ
スミドによる形質転換実験を行つた。実験結果を次表に
示す。比較のために実施例４の結果も記載する。
pKARSプラスミドの分子量は、エンドヌクレアーゼEco
RＩおよびHind IIIによる消化後、0.8％アガロースゲ
ルおよび通常の分子量標識を用いて測定した。
実施例14 KARS−２配列を含むプラスミドによる、全細胞での形質
転換法王を用いるクルイベロミセス・ラクチス（Kluyve
romyces lactis）SD11 lac4 trp1のTrp+への形質転換 プラスミドpEK2−７を用いてK.ラクチス（K.lactis）
SD11を形質転換させた。このプラスミドは、その中にKA
RS−２から誘導される自律的複製配列を含む1.2kb断片
がクローニングされている公知のプラスミドYRp7からな
る（第２図）。K.ラクチス（K.lactis）SD11を、１％酵
母エキス、２％ペプトン、２％ブドウ糖（pH5.3）を含
有する培地中で、30℃に於て１晩中増殖させた。４−８
のOD610nmに於て、1000xgで５分間遠心分離することに
よつて細胞を収穫した。この細胞を、TE緩衝液（10mM
トリスHCl、1mM EDTA、pH8.0）で洗浄し、ペレツトを、
TE−緩衝液中に、２×108細胞/mlの濃度で再懸濁した。
この懸濁液を、１容量の0.2MLiClで希釈し、30℃で60分
間振盪した。
このLi処理細胞0.1mlのプラスミドpEK2−7DNA（10μ
ｇ）を添加し、30℃で30分間、インキユベーシヨンを続
行した。１容量の70％ポリエチレングリコール7000を添
加し、混合物を、30℃でさらには60分間インキユベーシ
ヨンした。この混合物を、42℃で５分間、熱処理にか
け、細胞を滅菌脱塩水で洗浄した。この細胞を、２％ブ
ドウ糖と0.67％酵母窒素ベースとを含む最小寒天上で平
板培養した。
30℃に於て、36−48時間後に、形質転換体が観察され
た。
実施例15 KARS−２配列を含むプラスミドによるクルイベロミセス
・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）の形質転換 ２つの型のプラスミドを用いて、K.フラギリス（K.fr
agilis）を形質転換させた。
第１プラスミドpGB180は、K.ラクチス（K.lactis）か
らのKARS−２自律的複製配列とS.セレビシアエ（S.cere
visiae）からのTRP1遺伝子とを含むプラスミドpEK2−７
からの3.5kb Bg1II断片（第２図）をpJDB207のBam H1部
位中へクローニングすることによつて作られた〔J.D.ベ
ツグズ（J.D.Beggs）、アルフレツド・ベンゾン・シン
ポジウム（Alfred Benzon Symposium）16（1981）38
3〕。
K.フラギリス（K.fragilis）のUV処理後に得られた約
36個のK.フラギリス（K.fragilis）leu突然変異体を、
実施例14記載のLi+法でpGB180により形質転換させた。
１つの突然変異体K.フラギリス（K.fragilis）leu24
は、プラスミドDNA1μｇ当たり約103個の形質転換体の
頻度で、Leu+に形質転換された。
第２プラスミドpGB2は、カナマイシンとゲンタマイシ
ン誘導体G418とに対する耐性を与えるトランスポゾンTn
601を含む公知のプラスミドpACYC177（チャン（Chang）
ら、J.Bacteriol,134（1978）,1141−1156のBamH1部位
中へ、上記のpEK2−７からの3.5Kb Bg 1II断片をクロー
ニングすることによつて作られた。
実施例14記載のLi+法により、K.フラギリス（K.fragi
lis）株C21を、プラスミドpGL2で形質転換させた。形質
転換細胞を、50μg/mlのG418を含むYNPD寒天上で平板培
養した。30℃で48時間インキユベーシヨンした後、形質
転換体が検出されたが、自然耐性突然変異体は６日後に
しか検出されなかつた。K.フラギリス（K.fragilis）形
質転換体からDNAを抽出し、適当な大腸菌（E.coli）DG7
5細胞中へ形質転換させた。カナマイシン耐性大腸菌
（E.coli）細胞から抽出されたDNAはプラスミドpGL2の
存在を示した。これらの実験は、K.フラギリス（K.frag
ilis）株がKARS配列を含むプラスミドによつて形質転換
されることができかつこれらのプラスミドがK.フラギリ
ス（K.fragilis）中で自律的複製性であることを示して
いる。
実施例16 KARS−２配列とプレプロキモシンおよびその種々の成熟
形を暗号化する構造遺伝子と該構造遺伝子の合成を指示
する種々のプロモーターとを含むプラスミドによつて形
質転換された後のプレプロキモシンおよびその種々の成
熟形を表現するクルイベロミセス・ラクチス（Kluyvero
myces lactis）SD11 lac4 trp1 本実施例は多数の工程を含む。その最も本質的なもの
は下記の工程である。
1.プレプロキモシン、プロキモシン、プソイドキモシ
ン、キモシンを暗号化するクローニングされた構造遺伝
子の前へのSalＩリンカーの添加。
2.上で得られたプラスミド中への、K.ラクチス（K.lact
is）からのKARS−２自律的複製配列とS.セレビシアエ
（S.cerevisiae）からのTRP1遺伝子とを含むDNA断片の
導入。
3.上で得られたプラスミド中への、プレプロキモシンの
種々の成熟形の合成を指示する種々のプロモーターの導
入。
K.ラクチス（K.lactis）中に於ける牛のプレプロキモ
シンおよびその種々の成熟形の表現のための出発物質は
下記のクローニングされた構造遺伝子であつた。
−メチオニル−プソイドキモシン ,pUR1531として記載 −メチオニル−キモシン ,pUR1522として記載 −メチオニル−プロキモシン ,pUR1523として記載 −メチオニル−プレプロキモシン ,pUR1524として記載 これらのプラスミドの構成および構造は、1983年４月
20日に第0077109号として公告されたヨーロツパ特許出
願第822012720号中に詳細に記載されている。該記載に
従つてこれらの遺伝子を単離しかつこれのプラスミドを
作つた。
A. プラスミドpUR1531,pUR1522,pUR1523,pUR1524中へ
のSalＩリンカーの導入（第１図） プラスミドpUR1531,pUR1522,pUR1523,pUR1524は、ATG
開始コドンのすぐ前に１個のEco R I制限部位を含む。
キモシン遺伝子内にもう１個のEco RＩ部位が存在する
ので、第１のEco R I部位のすぐ前にSalＩリンカー分子
を導入して末梢の構造遺伝子の表現を指示する種々のプ
ロモーター配列の導入を容易にすることを目的とした。
約50μｇのDNAを、10mMトリス−HCl、50mM NaCl、6mM
β−メルカプトエタノール、10mMMgCl2、100μg/ml、
牛血清アルブミンを含有する培地中で、125μg/ml臭化
エチジウムの存在下に於て、pH7.5、37℃で60分間、50
単位のエンドヌクレアーゼEco I Rと共にインキユベー
シヨンした。プラスミドDNAを、これらの条件下で、線
状および開放環状分子に主に転化せしめた。DNAを１容
量のフエノールおよび１容量のクロロホルムで抽出し、
１容量のプロパノール−２で沈澱させた。このDNAをTE
緩衝液に溶解し、エンドヌクレアーゼSalＩで完全に消
化した。アガロースゲルから、電気泳動溶出によつて約
1800bpのDNA断片を単離した。
これらの断片をフエノールおよびクロロホルムで抽出
し、プロパノール−２で沈殿させ、沈殿をTE−緩衝液に
溶解した。
付着末端を、下記のようにしてDNAポリメラーゼでふ
さいだ（fillsd−in）。
1800 bp DNA断片を含有する15μ（約１−２μｇ）
に、dATP,dGTP,dCTP,dTTPの2mM溶液１μと0.2Mトリス
−HCl（pH7.2）、40mM MgSO4,4mMジチオスレイトール、
200mg/ml牛血清アルブミンを含む4xニツク緩衝液6.5μ
と水2.5μとを添加した。２単位のDNAポリメラーゼ
〔クレナウ（Klenow）断片〕を添加し、混合物を20℃で
30分間インキユベーシヨンした。次に、70℃に５分間加
熱してDNAポリメラーゼを不活化した。この混合物に、
燐酸化SalＩ−リンカー〔マニアテイス（Maniatis）
ら、モリキユラー・クローニング（Molecular Clonin
g）、CSH記載のようにして調製〕を、T4DNAリガーゼ（1
03単位）及びATPと共に添加した。混合物を、22℃で４
時間インキユベーシヨンした後、４℃でさらに16時間イ
ンキユベーシヨンした。次に、混合物を、エンドヌクレ
アーゼSalＩおよびHind IIIと共にインキユベーシヨン
し、電気泳動溶出により、アガロースゲルから約1500bp
のDNA断片を回収した。
これらの断片（A,B,C,D）を、フエノールおよびクロ
ロホルムによる抽出ならびにプロパノール−２による沈
澱によつて精製した。これらのフラグメントを、感温性
レプリコンとアンピシリン耐性遺伝子（暗号化用β−ラ
クタマーゼ）とを含むプラスミドpPA153−209から誘導
された3.3kb Hind III−SalＩ断片（約0.5μｇ）に連結
（ligated）させ、アガロースゲルから、電気泳動溶出
によつて精製した。
連結した（ligated）分子を大腸菌（E.coli）HB101中
に形質転換させ、アンピシリン耐性、テトラサイクリン
感受性クローンを培養し、プラスミドDNAを抽出した。
このプラスミドDNAをエンドヌクレアーゼSalＩ、Eco R
I、Hind IIIで消化することにより、プラスミドpGB131,
pGB122,pGB123,pGB124（第１図）が得られたことを確認
した。
B.プラスミドpGB131,pGB122,pGB123,pGB124のそれぞれ
の中へのKARS2およびTRP1遺伝子の導入 クルイベロミセス（Kluyveromyces）から誘導されか
つクルイベロミセス（Kluyveromyces）中で複製する自
律的複製配列を、実施例２および７−15記載のようにし
て得た。プラスミドpKARS−２中に於ける自律的複製配
列は1.24kB断片上にあり、この断片を、公知のプラスミ
ドYRp7中にクローニングし、新プラスミドpEK2−７を得
た（第２図）。pEK2−７をエンドヌクレアーゼClaＩで
消化することにより、それぞれ3.5kbおよび5.5kbの断片
を得た。S.セレピシアエ（S.cerevisiae）から誘導され
るTRP1遺伝子とK.ラクチス（K.lactis）から誘導される
KARS−２配列とを含む3.5kb断片を、アガロースゲルか
ら電気泳動溶出によつて単離し、それぞれClaＩ消化プ
ラスミドpGB131,pGB122,pGB123,pGB124に結合（ligate
d）させた。得られた混合物を大腸菌（E,coli）JA300
（trpC）中に形質転換し、Trp+形質転換体から抽出した
プラスミドDNAのキヤラクタリゼーシヨンにより、それ
ぞれプラスミドpGB151,pGB152,pGB153,pGB154の構造を
もつことを確認した。
C.プレプロキモシンの種々の成熟形の合成を指示する種
々のプロモーター配列のプラスミド中への導入 KARS−２配列とTRP1遺伝子とプレプロキモシン又はそ
の種々の成熟形の構造遺伝子とを含むSalＩ消化プラス
ミドは、K.ラクチス（K.lactis）形質転換体中に於ける
末梢構造遺伝子の合成を指示するためのSalＩ結合プロ
モーター配列を受け入れるのに好適である。ほとんどの
場合、このプロモーター配列はSalＩリンカーを備えて
いなければならない。任意のプロモーター配列がかかる
SalＩリンカーを備えることが可能であり、このこと
は、下記実施例中で、 1.S.セレビシアエ（S.cerevisiae）からのイソチトクロ
ムC1プロモーター 2.K.ラクチス（K.lactis）からのラクラーゼプロモータ
ー について示される。
C1.S.セレビシアエ（S.cerevisiae）からのイソチトク
ロムC1プロモーターへのSalＩリンカーの添加およびプ
ラスミド中への導入 プラスミドpBR322中へクローニングされたイソチトク
ロムC1遺伝子からなるプラスミドpYeCYC1を出発物質と
して用いた〔G.フエイエ（G.Faye）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 78（1981）2258〕。
ヌクレオチド配列データから、イソチトクロムC1遺伝
子中、ヌクレオチド＋８にEco RＩ部位が存在すること
が知られている（同上）。
プラスミドpYeCYC1をエンドヌクレアーゼEco RＩで
切断し、T4DNAリガーゼで連結し、大腸菌（E.coli）HB1
01中に形質転換させて、プロモーターとイソチトクロム
C1遺伝子の８ヌクレオチドとを担持する1930bp断片を含
むプラスミドpC15を得た。
プラスミドpC15をエンドヌクレアーゼEco RＩで切断
し、ヌクレアーゼBal31と共に短時間インキユベーシヨ
ンし、ほんの2,3個のヌクレオチドを除いた。
Bal31消化末端を、DNAポリメラーゼ〔クレナウ（Klen
ow）断片〕でブラント（Blunt）末端に変え、このDNAに
燐酸化Eco RＩリンカーを連結させた。エンドヌクレア
ーゼEco RＩと共にインキユベーシヨンし、連結（liga
tion）させ、大腸菌（E.coli）中に形質転換させた後、
チトクロムC1遺伝子から12個のヌクレオチドが除かれて
いる形質転換体pC15−R12を確認した。プラスミドpC15
−R12をエンドヌクレアーゼEco RＩで切断し、付着末
端をDNAポリメラーゼでふさぎ（filling in）、燐酸化S
alＩリンカーを連結させ、エンドヌクレアーゼSalＩと
共にインキユベーシヨンし、得られた1070bp断片をSal
Ｉ消化プラスミドpGB151,pGB152,pGB153,pGB154中にそ
れぞれ再クローニングすることによつてSalＩリンカー
を導入し、32Pラベル付き1070bp断片をプローブとして
有するコロニーハイブリダイゼーシヨンによつて確認さ
れるように、それぞれイソチトクロムC1プロモーター含
有プラスミドpGB161,pGB162,pGB164を得た。この正クロ
ーン（positive clones）からプラスミドDNAを調製し、
エンドヌクレアーゼSmaＩによる消化後850bp断片の存在
によつてイソチトクロムC1プロモーターの正しい配向
（orentation）を確認した。
C2.クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lacti
s）からのラクターゼプロモーターへのSalＩリンカーの
添加およびプラスミド中への導入 出発物質は、プラスミドpBR322のEco RＩ部位中へク
ローニングしたK.ラクチス（K.lactis）からのラクター
ゼ遺伝子を含むプラスミドpK16であつた〔R.C.デイクソ
ン（R.C.Dickson）およびJ.S.マーキン（J.S.Marki
n）、セル（Cell）15（1978）、123〕。
ラクターゼ構造遺伝子およびそのプロモーターの大部
分のシーケンシング（Ssquencing）により、該ラクター
ゼ構造遺伝子中約450bpにClaＩ部位の存在が確立され
た。
プラスミドpK16をエンドヌクレアーゼClaＩで消化
し、プロモーターと約450bpの構造遺伝子とを含む断片
を、エンドヌクレアーゼClaＩおよびAccＩで（部分的
に）消化されたプラスミドpBR322中へ再クローニングし
た。１つのプラスミドpGB182に於て、ラクターゼ構造遺
伝子中約450bpに於ける保持（retained）ClaＩ部位をエ
ンドヌクレアーゼClaＩとのインキユベーシヨンによつ
て開き、ヌクレアーゼBA131とのインキユベーシヨンで
トリミングした（trimmed）。このBal31末端をDNAポリ
メラーゼとのインキユベーシヨンによつてブラント（bl
unt）末端とし、このトリミングした（trimmed）断片へ
燐酸化Eco RＩリンカーを連結させた。このトリミング
した（trimmed）断片をエンドヌクレアーゼEco RＩで
消化しかつ再クローニングすることにより、ラクラーゼ
プロモーターを保持しかつ構造遺伝子が欠失しているプ
ラスミドpGB183を得た。
この断片に、本実施例において先に（16.C1）記載の
ようにしてSalＩリンカーを添加し、このSalＩ結合ラク
ターゼプロモーターを、SalＩで切断されたプラスミドp
GB151,pGB152,pGB153,pGB154にそれぞれ連結させて、そ
れぞれプラスミドpGB171,pGB172,pGB173,pGB174を得
た。
本実施例16記載のようにして得たプラスミドを、実施
例14記載のLi+法によつてクルイベロミセス・ラクチス
（（Kluyveromyces lactis）SD11 lac4 trp1中へ導入
し、Trp+形質転換体を選択した。
クルイベロミセス（Kluyveromyces）抽出物中にプレ
プロキモシン又はその成熟形が存在することが、免疫的
ELISA技術により、ならびにD.J.ケンプ（D.J.Kemp）お
よびA.F.カウマン（A.F.Cowman）〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78（1981）4520−4524〕が記載している方法で抽
出物のアリコートをニトロセルロースフイルター上にス
ポツトし、そしてフイルターを検定することによつて示
された。
細胞抽出物は次のようにして調製された。
K.ラクチス（K.lactis）形質転換体を、２％デキスト
ロース含有YNB培地中で、30℃で約16−24時間増殖させ
た。2.2−6.0のOD610nmに於て、ソーバル（Sorvall）Ｇ
−S3ローター中で、6000rpmで10分間遠心分離して細胞
を収穫した。得られたペレツトを、600のOD600に滅菌蒸
留水中に再懸濁し、氷上で冷却した。
この細胞懸濁液0.5mlを氷冷水0.5mlで希釈し、2gのバ
ロテイニ（Ballotini）ビーズ〔直径0.25−0.35mm、ブ
ラウン−メルスンゲン（Braun−Melsungen）GMBH,GFR〕
と混合した。
ボーテツウス（Vortex）振盪機で、最高速度で４分間
振盪して細胞を破壊した。位相差顕微鏡検査した所、95
％以上の細胞が破壊されていた。エツペンドルフ（Eppe
ndorf）遠心分離機で１分間遠心分離して細胞破片を除
去し、抽出液のアリコートを、液体窒素で凍結させ、−
80℃で貯蔵した。
この細胞抽出液１−５μをニトロセルロースメンブ
ランフイルター上にスポツトし、フイルターを乾燥し、
192mM グリシン、25mMトリス、20％エタノールを含む
溶液（pH8.3）で潤し、22℃で60分間インキユベーシヨ
ンした。
次に、このフイルターを、プレインキユベーシヨン緩
衝液〔0.35M NaCl、10mMトリス−HCl（pH7.6）、２％牛
血清アルブミン〕と共に30分間インキユベーシヨンし
た。これらのフイルターを、RIA緩衝液〔0.125M NaCl、
10mMトリス−HCl、pH7.6、0.1mM PMSF、１％トライトン
（Triton）×100、0.5％ ナトリウムデスオキシコレー
ト（Sodium desoxycholate）、0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム、0.3％ゼラチン〕で、５分間、３回洗浄した。
これらのフイルターを、キモシン抗血清10μを含むRI
A緩衝液1ml中で、４℃に於て１晩中インキユベーシヨン
した。RIA緩衝液で（３回）洗浄して抗血清を除き、RIA
緩衝液1ml中で、１μCi125I−蛋白質Ａと共に、22℃で6
0分間、インキユベーシヨンした。125I−蛋白質ＡをRIA
緩衝液で洗浄（５回）して除去した。フイルターを乾燥
し、１晩中オートラジオグラフイーを行つた。K.ラクチ
ス（K.lactis）形質転換体中に、プレプロキモシン又は
その成熟形が存在することが、明らかに観察された。
K.ラクチス（K.lactis）からの細胞抽出液中のキモシ
ン活性の存在は、A.C.M.フーイドンク（A.C.M.Hooydon
k）およびC.オリーマン（C.Olieman）、Netherl.Milk D
airy36（1982）、153記載の方法で、高性能液体クロマ
トグラフイー（HPLC）で確認された。
10mMCaCl2中の粉乳（Difco）の10％溶液1mlに、酵素
溶液すなわち抽出液50μを添加し、この溶液を31℃で
15分間インキユベーシヨンした。12％トリクロロ酢酸
（TCA）2mlを添加して反応を停止させた。キモシンの作
用によりＫガセインから切断されていたグリコマクロペ
プチド（glycomacro peptide）（GMP）以外のほとんど
すべての蛋白質はTCAによつて沈殿される。得られた変
性蛋白質を遠心分離によつてペレツト化し、上澄液1ml
を1NNaOH0.4mlで中和した。この溶液を再び遠心分離
し、GMPの生成量を、214nmの吸光度で監視するHPLCで測
定した。プロキモシンを含むK.ラクチス（K.lactis）形
質転換体からの抽出液を、最初にpH2で２時間インキユ
ベーシヨンし、次に中和後、キモシン活性の試験を行つ
た。キモシンは、pH2処理にのみ見いだされた。
実施例17 プレプロタウマチンを暗号化する構造遺伝子とK.ラクチ
ス（K.lactis）からのKARS2配列とS.セレビシアエ（S.c
erevisiae）からのグリセルラルデヒド−３−燐酸デヒ
ドロゲナーゼプロモーターとS.セレビシアエ（S.cerevi
siae）からのTRP1遺伝子とを含むプラスミドpURK528−0
1で形質転換された後のプレプロタウマチンおよびその
種々の成熟形を表現するクルイベロミセス（Kluyveromy
ces）SD11 lac4 trp1 本実施例は多数の工程からなり、その最も本質的な工
程は下記の通りである。
1.S.セレビシアエ（S.cerevisiae）のグリセルアルデヒ
ド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ（GAPDH）オペ
ロンを含有するクローンの単離 M.カールソン（M.Carlson）およびボツトスタイン（B
otstein）、セル（Cell）28（1982）145−154記載の方
法と類似の方法で、雑種大腸菌（E.coli）−酵母プラス
ミドpFL〔M.R.シエバリヤー（M.R.Chevallier）ら、ジ
ーン（Gene）11（1980）11−19〕中で、S.セレビシアエ
（S.cerevisiae）のDNAプールを作つた。精製酵母DNAを
制限エンドヌクレアーゼSau 3Aで部分消化し、得られた
DNA断片（平均長5kbの）を、T4 DNAリガーゼによつてp
FL1の脱燐酸化Bam HＩ部位中に連結させた。該連結物
（ligated material）によるCaCl2処理大腸菌（E.col
i）細胞の形質転換後、約30,000個のアンピシリン耐性
クローンを得た。これらのクローンを、化学的に合成さ
れかつ32Pでラベルされた、５′TACCAGGAGACCAACTT3′
配列を有するオリゴマーによるコロニーハイブリダイゼ
ーシヨン方法〔R.E.テイヤー（R.E.Thayer,Anal.Bioche
m.,98（1979）60−63〕によつてスクリーニングした。
J.P.ホランド（J.P.Holland）およびM.J.ホランド
（M.J.Holland）〔J.Biol.Chem.,255（1980）2596−260
5〕によつて発振されたデータによると、このオリゴマ
ーは、GAPDH遺伝子のアミノ酸306−310（最終アミノ酸
のウオブル塩基がオリゴマーから省略されている）を暗
号化するDNA配列と相補的である。R.B.ウオレース（R.
B.Wallace）ら〔ヌクレイツク・アシズ（Nucleic Acid
s）Res.,９（1981）879〜894〕が記載しているハイブリ
ダイゼーシヨン条件を用いて、６種の正形質転換体を確
認することができた。これらのうちの１つはプラスミド
pFL1−33と命名した。後者のプラスミドは、そのプロモ
ーター／調節領域およびその転写終了／ポリアデニル化
領域を含むGAPDH遺伝子を含んでいた。約9kbの長さのpF
L1−33のインサート（insert）は、制限酵素分析（第４
図）および部分的ヌクレオチド配列分析（第５図および
第６図）によつて確認された。
2.GAPDHプロモーター／調節領域の単離と、プレプロタ
ウマチン暗号化用プラスミド中へのその導入 制限酵素分析とプラスミドpHL1−33のインサートのヌ
クレオチド配列データに基づいて、GAPDH遺伝子のDNA開
始／調節領域を800個のヌクレオチド長さのDdeＩ断片と
して単離した。このプロモーター断片を固定するため、
プラスミドpFL1−33をSalＩで消化し、得られた３個のD
NA断片を、化学的に合成されたオリゴマーによるサザー
ンブロツトハイブリダイゼーシヨン（Southern blot hy
bridization）試験〔E.M.サザーン（E.M.Southern）,J.
Mol.Biol.98（1975）503−517〕にかけた。正ハイブリ
ダゼーシヨン用（positively hybridizing）の長さ4.3k
bの制限断片を、0.7％アガロースゲルから電気泳動溶出
によつて生産規模で単離し、次にDdeＩで切断した。得
られたDdeＩ断片のうち、最大の断片だけが、GADPHレギ
ユロン領域内にある切断部位、Pvu IIのための認識部位
をもつていた（第４図）。この最大DdeＩ断片を単離
し、クレナウ（Klenow）DNAポリメラーゼおよび４個のd
NTP′ｓ〔A.R.デービス（A.R.Davis）ら、ジーン（Gen
e）10（1980）205−218〕と共にインキユベーシヨン
し、ブラント（blunt）末端DNA分子を生成させた。反応
混合物をフエノール／クロロホルム（50/50V/V）で抽出
し、水層をセフアデツクス（Sephadex）G50カラム中を
通し、ボイド容積内に存在する物質をエタノールで沈殿
させた後、このDNA断片を、T4DNAリガーゼと共にインキ
ユベーシヨンすることにより、32pラベル付きEco RＩ
リンカー５′GGAATTCC3′と連結させた。クレナウ（Kle
now）ポリメラーゼ反応とそれに続くEco RＩリンカー
の連結のために、レギユロン断片の末端に元のDdeＩ部
位が再構成された。リガーゼを不活化するため、反応混
合物を65℃に10分間加熱した後、塩化ナトリウム（最終
濃度50ミリモル／）を添加し、全混合物をEco RＩと
共にインキユベーシヨンした。フエノール／クロロホル
ムで抽出することによつてインキユベーシヨンを終了
し、DNAをエタノールで２回沈殿させ、再懸濁した後、
適当なベクター分子中に連結させた。DdeＩレギユロン
断片がEco RＩ部位と連結されているので、pUR528（L.
エデンス（Edens）ら、Gene,18（1982）１−12）のEco
RＩ部位中へ容易に導入され、酵母レギユロンが構造
遺伝子暗号化用プレプロタウマチンに隣接しているプラ
スミドを生成することができる。後者のプラスミドは、
pUR528をEco RＩで切断し、線形化したプラスミド分子
を（小牛腸）ホスフアターゼによつて処理して自己連結
を防止し、これらベクター分子のおのおのおよび精製Dd
eＩプロモーター断片をT4DNAリガーゼと共にインキユベ
ーシヨンすることによつて得られた。これらの種々の連
結（ligation）混合物のCaCl2処理大腸菌（E.coli）HB1
01細胞中での形質転換により、数種のアンピシリコン耐
性コロニーを得た。これらコロニーの幾つかからプラス
ミドDNAを単離して〔H.C.バーンボイム（H.C.Birnboi
m）およびJ.ドーリー（J.Doly）、ヌクレイツク・アシ
ド（Nucleic Acids）Res.７（1979）1513−1523〕、Pvu
IIと共にインキユベーシヨンし、インサートの配向を
試験した。命名法に於て、Eco RＩ（DdeＩ）GAPDHレギ
ユロン断片を正しい方向で含むプラスミド（すなわちGA
PDHレギユロンからの転写が下流にある構造遺伝子の方
向に起こる）は、プラスミドの元のコード番号に追加番
号−01で示される（例えば、pUR528はpUR528−01に変わ
る；第７図参照）。
Eco RＩレギユロン断片を含むプラスミドの取扱いを
容易にするため、２個のEco RＩ部位のうちの１つを破
壊した。２μｇのプラスミドDNA（例えばpUR528−01）
をEco RＩで部分的に消化した後、５単位のムングビー
ン（Mung bean）ヌクレアーゼ〔P.L.バイオケミカルズ
社（P.L.Biochemicals Inc.）より購入〕と共に、0.05
モル／酢酸ナトリウム（pH5.0）、0.05モル／塩化
ナトリウム、0.001モル／塩化亜鉛の存在下に於て、
全容200μ中で、室温で30分間インキユベーシヨンし
て付着末端を除去した。SDSを、最終濃度0.1％に添加す
ることによつてヌクレアーゼを不活変し〔D.コワルスキ
ー（D.Kowalski）ら、バイオケミストリー（Biochemist
ry）15（1976）4457−4463〕２容量のエタノールを添加
してDNAを沈殿させた。線形化DNA分子を、次にT4DNAリ
ガーゼと共にインキユベーシヨンして再度連結（religa
ted）させ、またCaCl2処理大腸菌（E.coli）細胞を形質
転換させるためにそれを用いた。アンピシリン耐性コロ
ニーから単離したプラスミドDNAを、Eco RＩおよびMlu
Ｉで切断することにより、タウマチン遺伝子に隣接する
単一のEco RＩ部位の存在の試験を行つた（第７図参
照）。
GAPDHプロモーター断片を含むが下流にある構造遺伝
子のATG開始コドンに隣接する単一のEco RＩ認識部位
しか持たないプラスミドを−02型プラスミドと称す（例
えば、pUR528−01はpUR528−02に変えられる；第７図参
照）。
3.合成DNA断片の導入によるプレプロタウマチン暗号化
プラスミド中に於ける元のGAPDHプロモーター／調節領
域の再構成（第８図） 第５図に示したヌクレオチド配列によつて示されるよ
うに、Eco RＩ（DdeＩ）GAPDHプロモーター断片は、元
のGAPDHプロモーター／調節領域のヌクレオチド−850〜
−39を含む。このプロモーター断片中に含まれないもの
は、GAPDH暗号遺伝子のATG開始コドンに先行する38個の
ヌクレオチドである。後者の38個のヌクレオチドの長さ
の断片は、数種の酵母遺伝子中に見いだされるPuCACACA
配列（Puはプリンを示す）を含む。翻訳開始部位の約20
bp上流にある該PuCACACA配列〔M.J.ドブソン（M.J.Dobs
on）ら、ヌクレイツク・アシド（Nucleic acid）Res.,1
0（1982）2625−2637〕は、蛋白質開始のために最適で
あるATGコドンの上流にヌクレオチド配列を与える〔Ｍ
コザク（M.Kozak）、ヌクレイツク・アシド（Nucleic a
cid）Res.,９（1981）5233−5252〕。さらに、これらの
ヌクレオチドは、GAPDH遺伝子の表現の調節中に含まれ
る可能性がある小ループ構造の形成を許す。上記の議論
に基づいて、プロモーター活性ならびに翻訳開始を改良
するためには、DdeＩプロモーター−断片と下流にある
構造遺伝子のATGコドンとの間に38個のヌクレオチドの
導入が必要と考えられた。
第９図に略述するように、欠失DNA断片が、２種の部
分重複オリゴマーの化学的合成で得られた。２種のオリ
ゴヌクレオチドの重複部分中に存在するSacＩ部位は、 （ｉ） ポリＡ末尾（poly A−tailed）酵母表現ベクタ
ーの構造を含むATGコドンのすぐ上流でヌクレオチド配
列の捜査を可能にするため； （ii） ４個のdNTP′ｓの存在下に於てT4DNAポリメラ
ーゼと共にインキユベーシヨンすることによつて容易に
かつ再現可能に除去することができる３′−突出末端を
生成する酵素のための切断部位を与えるため の２つの理由で導入された。２種の精製オリゴマーの等
モル量を、それぞれの５′−末端で燐酸化し、ハイブリ
ダイゼーシヨンし、〔J.J.ロツシ（J.J.Rossi）ら、J.B
iol.Chem.257（1982）9226−9229〕、二本鎖DNA合成の
ために記載されている条件〔A.R.デービス（A.R.Davi
s）ら、ジーン（Gene）10（1980）205−218〕下で、ク
レナウ（Klenow）DNAポリメラーゼおよび４個のdNTP′
ｓとのインキユベーシヨンにより、二本鎖DNA分子に変
えた。13％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動とそれ
に続くオートラジオグラフイーとによる反応生成物の分
析の結果、出発一本鎖オリゴヌクレオチドの80％以上が
二本鎖ヌクレオチドに変化していた。反応混合物をセフ
アデツクス（Sephadex）G50カラムを通しかつボイド容
積中に存在する物質をエタノールで沈殿させることによ
つてDNAを単離した。このDNAを、次に、ポリヌクレオチ
ドキナーゼと共にインキユベーシヨンし燐酸化し、Dde
Ｉで消化した。後者の反応で切断されたヌクレオチドを
除去するため、反応混合物を、２回、エタノールによる
沈殿処理を行つた。
第８図に示すように、得られた合成DNA断片のクロー
ニングを、この断片と、ATG開始コドンに先行するEco
RＩがムングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼ消化によ
つて除去されているベクター分子中のBg1II−DdeI GAPD
Hプロモーター調節断片との同時連結（simultaneous li
gation）によつて行つた（工程２参照）。Bg1II−DdeＩ
プロモーター／調節断片は、プラスミドpUR528−02のDd
eＩおよびBg1IIによる消化によつて得られた。得られた
制限断片を、２％アガロースゲル中での電気泳動によつ
て分離した後、ゲルから該断片を単離して、精製793ヌ
クレオチド長のプロモーター／調節断片を得た。プラス
ミドpUR528−02中で、ATGコドンに先行するヌクレオチ
ド配列は５′−GAATTC（Ｔ）ATG−３′（EP−A54330お
よびEP−A54331）であり、M.コザク（M.Kozak）〔ヌク
レイツク・アシド（Nucleic Acids）Res.９（1981）523
3−5252〕が与えた好ましいヌクレオチド配列とは異な
る。本発明者らの目的は、元のGAPDHプロモーター／調
節／蛋白質開始領域をできるだけ正確に再構成すること
であつたので、得られたブラント末端（blunt−end）に
合成DNA断片を連結させるため、Eco RＩを除去した。E
co RＩ部位の除去は、Eco RＩ切断pUR528−02DNAのム
ングビーン（Mung bean）ヌクレアーゼ消化によつて達
成された。
次に、このプラスミドDNAをBg1IIで消化し、ホスフア
ターゼと共にインキユベーシヨンした。0.7％アガロー
スゲル中での電気泳動によつて２種のDNA断片を分離し
た後、最大断片を単離し、Bg1II−DdeＩプロモーター断
片ならびに−DdeＩ処理−合成DNA断片が連結されている
ベクターとして用いた。SacＩ認識部位含有合成DNA断片
と共にDdeＩプロモーター／調節断片が導入されている
プラスミドは追加番号−03で示される（例えば、pUR528
−02はpUR528−03に変えられる）。
4.K.ラクチス（K.lactis）からのKARS2レプリコンおよ
びS.セレビシアエ（S.cerevisiae）からのTRP1遺伝子の
プレプロタウマチン暗号化プラスミド中への導入 KARS2レプリコンおよびTRP1遺伝子は、pEK2−７か
ら、Bg1IIによる消化およびそれに続く3.5kb断片の0.7
％アガロースゲルからの単離によつて摘出された。この
精製断片を、T4DNAリガーゼとのインキユベーシヨンに
より、pUR528−03の燐酸化Bg1II切断部位中へ挿入し
た。この連結（ligation）混合物の大腸菌（E.coli）中
の形質転換により、プラスミドpURK528−03を得た（第1
0図）。プラスミドpURK528−03をLi+法によりK.ラクチ
ス（K.lactis）SD11細胞中へ導入することによつて生成
される形質転換体は、L.エデンズ（L.Edens）ら〔ジー
ン（Gene）18（1982）１−12.〕記載の方法で分析して
タウマチン様蛋白質を合成することが示された（第11図
参照）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） 微生物の受託番号 ＣＢＳ ８１５７ (72)発明者 デ・レ−ウ・アルベルト オランダ国2641エルテ−・ペイナツカ −・ホフジヒト20 (72)発明者 フアン・デン・ベ−グ・ヨハネス・アベ ル オランダ国2811ア−デ−・レ−ウウイイ ツク・ハネゲヴエヒト８ (56)参考文献 欧州公開48081（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，145（１) （1981）Ｐ．382−390 ＧＥＮＥ，10（1980）Ｐ．347−356 ＧＥＮＥ，15（1981）Ｐ．157−166 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，147（１) （1981）Ｐ．155−160 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，148（３) （1981）Ｐ．988−990

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】組み換え体DNAを含む形質転換されたクル
    イベロミセス属酵母細胞の新規株を製造する方法であっ
    て、 （１）５′−３′の転写方向に （ａ）クルイベロミセス中で機能するプロモーター調節
    領域； （ｂ）ポリペプチドを暗号化し、上記プロモーター調節
    領域の制御下にあるDNA配列； （ｃ）転写ターミネーター； 及びそれらに加えて （ｄ）選択標識；ならびに必要により （ｅ）クルイベロミセス中で機能する複製の起点を含む
    ベクターでクルイベロミセス属酵母細胞を形質転換する
    工程；および （２）得られた形質転換細胞を成長繊維培地中で増殖さ
    せる工程； を含む方法。
  2. 【請求項２】細胞がプロトプラストとして形質転換され
    る請求の範囲１に記載の方法。
  3. 【請求項３】細胞が全細胞として形質転換される請求の
    範囲１に記載の方法。
  4. 【請求項４】細胞が自律複製プラスミドまたは組み込み
    型プラスミドにより形質転換される請求の範囲１ないし
    ３に記載の方法。
  5. 【請求項５】自律複製プラスミドがKARS型プラスミドお
    よび２ミクロン型プラスミドからなる群から選ばれる請
    求の範囲４に記載の方法。
  6. 【請求項６】KARS型プラスミドがそれぞれ受託番号CBS8
    157及びCBS353.82を有するpURK52802またはpKARS12であ
    る請求の範囲５に記載の方法。
  7. 【請求項７】２ミクロン型プラスミドが受託番号CBS35
    1.82を有するpPTY75−LAC4である請求の範囲５に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】組み込み型プラスミドがクルイベロミセス
    DNAを含む請求の範囲４に記載の方法。
  9. 【請求項９】組み込み型プラスミドが受託番号CBS352.8
    2のpL4である請求の範囲８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】クルイベロミセス細胞がK.ラクチスまた
    はK.フリギリスである請求の範囲１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】形質転換酵母細胞を塩化カリウムを含有
    する培地中で培養する請求の範囲１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】塩化カリウム濃度が約0.6Mである請求の
    範囲11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】ポリペプチドを暗号化するDNA配列がキ
    モシンまたはその前駆体の一種若しくはβ−ガラクトシ
    ダーゼを暗号化する請求の範囲１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】クルイベロミセス細胞がそれぞれ受託番
    号CBS8092またはCBS8093を有するK.ラクチス SD11 la
    c4 trp1またはK.ラクチス SD69 lac4に由来する請求
    の範囲１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】外来遺伝子の形質転換および発現のため
    の宿主として用いる組み換え体DNAを含む形質転換され
    たクルイベロミセス属酵母細胞。
  16. 【請求項１６】組み換え体DNAを含む形質転換されたク
    ルイベロミセス細胞であって、該DNAが （１）５′−３′の転写方向に （ａ）クルイベロミセス中で機能するプロモーター調節
    領域； （ｂ）ポリペプチドを暗号化し、上記プロモーター調節
    領域の制御下にあるDNA配列； （ｃ）転写ターミネーター； 及びそれらに加えて （ｄ）選択標識；ならびに必要により （ｅ）クルイベロミセス中で機能する複製の起点 を含むベクターを含み、該組み換え体DNA中で暗号化さ
    れたポリペプチドを発現することができる細胞。
  17. 【請求項１７】組み換え体DNAを含む形質転換された請
    求の範囲15に記載のクルイベロミセス細胞であって、該
    DNAが （ａ）キモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガ
    ラクトシダーゼを暗号化する構造遺伝子； （ｂ）クルイベロミセス由来の自律複製配列（KARS）； （ｃ）酵母レギュロン；および （ｄ）選択標識を含み、該組み換え体DNA中で暗号化さ
    れたキモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガラ
    クトシダーゼを発現することができる細胞。
  18. 【請求項１８】組み換え体DNAを含む形質転換された請
    求の範囲15に記載のクルイベロミセス細胞であって、該
    DNAが （ａ）キモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガ
    ラクトシダーゼを暗号化する構造遺伝子； （ｂ）サッカロミセス由来の２ミクロンプラスミド複製
    配列； （ｃ）酵母レギュロン；および （ｄ）選択標識を含み、該組み換え体DNA中で暗号化さ
    れたキモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガラ
    クトシダーゼを発現することができる細胞。
  19. 【請求項１９】組み換え体DNAを含む形質転換された請
    求の範囲15に記載のクルイベロミセス細胞であって、該
    DNAが （ａ）キモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガ
    ラクトシダーゼを暗号化する構造遺伝子； （ｂ）酵母レギュロン；および （ｃ）選択標識を含み、該組み換え体DNA中で暗号化さ
    れたキモシンまたはその前駆体の一種あるいはβ−ガラ
    クトシダーゼを発現することができる細胞。
  20. 【請求項２０】細胞株が受託番号CBS8092を有しプラス
    ミドがCBS353.82のK.ラクチス SD11 lac4 trp1（pKA
    RS12）である請求の範囲17に記載の形質転換されたクル
    イベロミセス細胞。
  21. 【請求項２１】細胞株が受託番号CBS8093を有しプラス
    ミドがCBS351.82のK.ラクチス SD69 lac4（PTY75−LA
    C4）である請求の範囲18に記載の形質転換されたクルイ
    ベロミセス細胞。
  22. 【請求項２２】細胞株の受託番号CBS8093を有しプラス
    ミドがCBS352.82のK.ラクチス SD69 lac4（PL4）であ
    る請求の範囲19に記載の形質転換されたクルイベロミセ
    ス細胞。
  23. 【請求項２３】クルイベロミセス発現ベクターであっ
    て、 （１）５′−３′の転写方向に； （ａ）クルイベロミセス中で機能するプロモーター調節
    領域； （ｂ）ポリペプチドを暗号化し、上記プロモーター調節
    領域の制御下にあるDNA配列； （ｃ）転写ターミネーター； 及びそれらに加えて （ｄ）選択標識；ならびに必要により （ｅ）クルイベロミセス中で機能する複製の起点を含む
    ベクター。
  24. 【請求項２４】複製の起点が２ミクロン複製起点である
    請求の範囲23に記載のクルイベロミセス発現ベクター。
  25. 【請求項２５】複製の起点がKARS配列である請求の範囲
    23に記載のクルイベロミセス発現ベクター。
  26. 【請求項２６】ポリペプチドがキモシンまたはその前駆
    体の一種である請求の範囲23に記載のクルイベロミセス
    発現ベクター。
  27. 【請求項２７】受託番号CBS351.82を有する大腸菌DG75
    に含まれるプラスミドpPTY75−LAC4である請求の範囲23
    に記載のクルイベロミセス発現ベクター。
  28. 【請求項２８】受託番号CBS352.82を有する大腸菌DG75
    に含まれるプラスミドpL4である請求の範囲23に記載の
    クルイベロミセス発現ベクター。
  29. 【請求項２９】受託番号CBS353.82を有する大腸菌JA221
    に含まれるプラスミドpKARS12である請求の範囲23に記
    載のクルイベロミセス発現ベクター。
JP58501749A 1982-05-19 1983-05-19 クルイベロミセス種のためのクローニング系 Expired - Lifetime JP2608540B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8202091 1982-05-19
NL8202091EEFR 1982-05-19
NL8202091 1982-05-19
PCT/EP1983/000128 WO1983004050A1 (en) 1982-05-19 1983-05-19 Cloning system for kluyveromyces species

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS59500848A JPS59500848A (ja) 1984-05-17
JP2608540B2 true JP2608540B2 (ja) 1997-05-07

Family

ID=19839766

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58501749A Expired - Lifetime JP2608540B2 (ja) 1982-05-19 1983-05-19 クルイベロミセス種のためのクローニング系
JP58501746A Granted JPS59501572A (ja) 1982-05-19 1983-05-19 クルイベロミセス属酵母およびその製造法
JP61041331A Expired - Lifetime JPH0685720B2 (ja) 1982-05-19 1986-02-26 ソーマチン物質の製造法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58501746A Granted JPS59501572A (ja) 1982-05-19 1983-05-19 クルイベロミセス属酵母およびその製造法
JP61041331A Expired - Lifetime JPH0685720B2 (ja) 1982-05-19 1986-02-26 ソーマチン物質の製造法

Country Status (20)

Country Link
US (2) US4657857A (ja)
EP (2) EP0096430B2 (ja)
JP (3) JP2608540B2 (ja)
AR (1) AR241796A1 (ja)
AT (2) ATE42338T1 (ja)
AU (1) AU571181B2 (ja)
BR (1) BR8307525A (ja)
CA (1) CA1224735A (ja)
DE (2) DE3379665D1 (ja)
DK (1) DK173699B1 (ja)
ES (1) ES522556A0 (ja)
FI (1) FI81379C (ja)
GR (1) GR78852B (ja)
HU (1) HU204097B (ja)
IE (1) IE55817B1 (ja)
IL (1) IL68733A (ja)
NO (1) NO172397C (ja)
NZ (1) NZ204302A (ja)
PT (1) PT76727B (ja)
WO (2) WO1983004051A1 (ja)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58146281A (ja) * 1981-10-19 1983-08-31 Suntory Ltd 酵母細胞の形質転換法
BR8307525A (pt) * 1982-05-19 1984-08-21 Unilever Nv Expressao de proteinas semelhantes a pretrotaumatina em leveduras kluyveromyces
US4943529A (en) * 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
JPH0716432B2 (ja) * 1982-10-20 1995-03-01 サントリー株式会社 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法
US4876197A (en) * 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
CA1341302C (en) * 1983-02-22 2001-10-09 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein
JPS60501290A (ja) * 1983-05-19 1985-08-15 ユニリ−バ−　ナ−ムロ−ゼ　ベンノ−トシヤ−プ 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良
AU577334B2 (en) * 1983-10-11 1988-09-22 International Genetic Engineering, Inc. Synthetic thaumatin genes
US5422267A (en) * 1984-05-22 1995-06-06 Robert R. Yocum Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene
US6214577B1 (en) 1984-05-22 2001-04-10 Robert Rogers Yocum Yeast vectors conferring antibiotic resistance
IL75210A0 (en) * 1984-05-22 1985-09-29 Bioteknika International Yeast vector
US5240838A (en) * 1984-07-27 1993-08-31 Internationale Otrool Maatschappij "Octropa" B.V. Regulatory sequences of alcohol oxidase (MOX) and dihydroxyacetonesynthase (DAS) of Hansenula polymorpha
US5741672A (en) * 1984-07-27 1998-04-21 Unilever Patent Holdings B.V. Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US5047340A (en) * 1985-06-05 1991-09-10 The University Of Kentucky Research Foundation LAC+ saccharomyces cerevisiae
CA1310923C (en) * 1985-11-13 1992-12-01 Joachim Ludwig Weickmann Dna encoding [asp --] and [lys -, asp --] thaumatin i
IT1203758B (it) * 1986-03-27 1989-02-23 Univ Roma Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori
CA1339101C (en) * 1986-06-03 1997-07-29 Nicolaas Overbeeke Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods
EP0260404B1 (en) * 1986-08-21 1995-05-31 VAN DEN BERG, Robert Amylolytic enzymes producing microorganisms constructed by recombinant DNA technology and their use for fermentation processes
US5151354A (en) * 1986-08-21 1992-09-29 Cornelius Hollenberg Fermentation processes using amylolytic enzyme producing microorganisms
EP0257115A1 (en) * 1986-08-21 1988-03-02 Heineken Technisch Beheer B.V. Amylolytic enzyme producing microorganisms, constructed by recombinant DNA technology, and their use in fermentation processes
US5882884A (en) * 1987-06-19 1999-03-16 Lucky Biotech Corporation Expression of proteinaceous sweeteners in yeast
FI107939B (fi) * 1987-07-28 2001-10-31 Dsm Nv Kluyveromyces isäntäkantana
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5221624A (en) * 1988-11-08 1993-06-22 International Genetic Engineering, Inc. DNA encoding (Lys46, Asp97, Asp113) and (Lys46, Asp.sup.137) thaumatin I polypeptides
US5204252A (en) * 1989-02-08 1993-04-20 Henkel Research Corporation Candida tropicalis transformation system
CA2024811A1 (en) 1989-02-24 1990-08-25 David A. Fischhoff Synthetic plant genes and method for preparation
US20010003849A1 (en) 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
FR2678636A1 (fr) * 1991-07-02 1993-01-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de production de proteines recombinantes et cellules hote utilisees.
FR2680518A1 (fr) * 1991-08-21 1993-02-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisation.
ES2080689B1 (es) * 1994-04-21 1996-09-01 Urquima Sa Procedimiento de obtencion de un edulcorante natural proteico.
US5837517A (en) * 1995-05-05 1998-11-17 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
US6682924B1 (en) * 1995-05-05 2004-01-27 Novozymes A/S Protease variants and compositions
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
US6265186B1 (en) 1997-04-11 2001-07-24 Dsm N.V. Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces
ES2308805T3 (es) * 1997-04-11 2008-12-01 Dsm Ip Assets B.V. Celulas de levadura que comprenden al menos dos copias de un gen deseado integradas en el genoma cromosomico en mas de un domicio que codifica el arn no ribosomico particularmente con kluyveromyces.
ES2154995B1 (es) * 1998-11-20 2001-11-16 Consejo Superior Investigacion Levadura panadera recombinante capaz de asimilar lactosa.
US20050079573A1 (en) 1998-12-23 2005-04-14 Danisco A/S Proteins
JP4637372B2 (ja) 1999-05-21 2011-02-23 カーギル ダウ エルエルシー 有機生成物の合成方法および合成材料
DE19943383B4 (de) * 1999-09-10 2006-03-16 Tad Pharma Gmbh Regulatorische Sequenzen und Expressionskassetten für Hefen
AU2001277735A1 (en) * 2000-08-10 2002-02-25 Ono Pharmaceutical Co. Ltd. Glycerylaldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter inducing cell death
GB0020498D0 (en) 2000-08-18 2000-10-11 Sterix Ltd Compound
BR0115558A (pt) 2000-11-22 2004-08-17 Cargill Dow Polymers Llc ácido nucleico isolado, construção de expressão recombinante, célula de levedura transformada com a construção de expressão recombinante, e, método para produzir ácido lático
US7141410B2 (en) 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
ES2220835T3 (es) 2000-12-07 2004-12-16 Dsm Ip Assets B.V. Metodo para la prevencion o reduccion del enturbiamiento en bebidas.
NZ526271A (en) 2000-12-07 2005-02-25 Dsm Ip Assets B Protein hydrolysates enriched in peptides having a carboxy terminal proline residue
GB0116453D0 (en) 2001-07-05 2001-08-29 Imp College Innovations Ltd Method
DK2279755T3 (da) 2001-10-10 2014-05-26 Ratiopharm Gmbh Remodellering og glycokonjugering af fibroblastvækstfaktor (FGF)
ES2606840T3 (es) 2001-10-10 2017-03-28 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF)
US7517671B2 (en) 2002-02-28 2009-04-14 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for concentrating secreted recombinant protein
EP1511835B9 (en) 2002-06-07 2015-02-25 DSM IP Assets B.V. Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages
TWI328612B (en) 2002-07-25 2010-08-11 Dsm Ip Assets Bv Genes and their encoded polypeptides involved in the biosynthetic pathway of vitamin b12, vectors and host cells comprising the genes, and process for producing vitamin b12
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
GB0403864D0 (en) 2004-02-20 2004-03-24 Ucl Ventures Modulator
EP3199626A1 (en) 2005-11-28 2017-08-02 DSM IP Assets B.V. Enzyme preparations not yielding any bad taste
GB0600406D0 (en) 2006-01-10 2006-02-15 Univ Bath Crystal
WO2008101893A2 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Dsm Ip Assets B.V. Novel sialidase
EP2126060B1 (en) 2007-03-22 2016-10-05 DSM IP Assets B.V. Novel lysyl oxidases
WO2011101339A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation broth and filtration filter cake and uses thereof
WO2011105841A2 (ko) * 2010-02-24 2011-09-01 중앙대학교 산학협력단 브라제인 발현용 재조합 발현벡터 및 높은 단맛을 가지는 신규한 브라제인 다중 변이체
WO2012007445A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Mutarotase in crystallization
WO2012007446A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. Use of a mutarotase in the production of dried powders

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
FR2441659A1 (fr) * 1978-11-14 1980-06-13 Anvar Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant
IL63270A0 (en) * 1980-08-05 1981-10-30 Univ Leland Stanford Junior Eukaryotic autonomously replicating segment
IL63035A (en) * 1980-09-09 1985-05-31 Univ California Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them
EP0066617A1 (en) * 1980-12-10 1982-12-15 Beckman Instruments, Inc. Entraining vaporized sample in metastable gas
CA1193207A (en) * 1980-12-12 1985-09-10 Cornelis T. Verrips Structural genes encoding the various allelic maturation forms of preprothaumatin, recombinant cloning vehicles, comprising said structural genes and expression thereof in transformed microbial host cells
EP0054330B1 (en) * 1980-12-12 1986-09-17 Unilever N.V. Dna sequences encoding various allelic forms of mature thaumatin, recombinant plasmids comprising said dna's and a process for their preparation, bacterial cultures comprising said recombinant plasmids, and method for producing mature thaumatin
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
JPS57146571A (en) * 1981-03-09 1982-09-10 Mitsubishi Chem Ind Ltd Killer yeast
AU560472B2 (en) * 1981-08-25 1987-04-09 Celltech Limited Yeast expression vectors
BR8205954A (pt) 1981-10-14 1983-09-13 Unilever Nv Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos
BR8307525A (pt) * 1982-05-19 1984-08-21 Unilever Nv Expressao de proteinas semelhantes a pretrotaumatina em leveduras kluyveromyces

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＧＥＮＥ，１０（１９８０）Ｐ．３４７−３５６
ＧＥＮＥ，１５（１９８１）Ｐ．１５７−１６６
Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１４５（１）（１９８１）Ｐ．３８２−３９０
Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１４７（１）（１９８１）Ｐ．１５５−１６０
Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１４８（３）（１９８１）Ｐ．９８８−９９０

Also Published As

Publication number Publication date
HU204097B (en) 1991-11-28
DE3379665D1 (en) 1989-05-24
NO172397B (no) 1993-04-05
AR241796A1 (es) 1992-12-30
JPH0543348B2 (ja) 1993-07-01
DK11384D0 (da) 1984-01-11
FI840149A0 (fi) 1984-01-16
NO840133L (no) 1984-01-13
FI81379B (fi) 1990-06-29
JPS59500848A (ja) 1984-05-17
PT76727A (en) 1983-06-01
JPS59501572A (ja) 1984-09-06
WO1983004050A1 (en) 1983-11-24
EP0096910B1 (en) 1989-04-19
ATE49421T1 (de) 1990-01-15
IE55817B1 (en) 1991-01-30
DK11384A (da) 1984-01-11
JPH0685720B2 (ja) 1994-11-02
NO172397C (no) 1993-07-14
EP0096430B2 (en) 1998-04-01
JPS61275227A (ja) 1986-12-05
FI81379C (fi) 1990-10-10
EP0096430A1 (en) 1983-12-21
EP0096910A1 (en) 1983-12-28
WO1983004051A1 (en) 1983-11-24
NZ204302A (en) 1987-03-06
PT76727B (en) 1985-12-27
BR8307525A (pt) 1984-08-21
AU571181B2 (en) 1988-04-14
IE831185L (en) 1983-11-19
GR78852B (ja) 1984-10-02
DE3381090D1 (de) 1990-02-15
ES8402874A1 (es) 1984-03-01
US4859596A (en) 1989-08-22
CA1224735A (en) 1987-07-28
EP0096430B1 (en) 1990-01-10
ES522556A0 (es) 1984-03-01
IL68733A (en) 1989-01-31
US4657857A (en) 1987-04-14
FI840149A (fi) 1984-01-16
ATE42338T1 (de) 1989-05-15
AU1553983A (en) 1983-12-02
DK173699B1 (da) 2001-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2608540B2 (ja) クルイベロミセス種のためのクローニング系
US4943529A (en) Kluyveromyces as a host strain
JP3068139B2 (ja) 酵母よりヒト血清アルブミンおよびその他の異種蛋白質を微生物学的に生産する方法
EP0301670B2 (en) Kluyveromyces as a host strain
JP2873012B2 (ja) 酵母ベクター
JP4017966B2 (ja) キャンディダ・ユティリス酵母由来の制御配列
JP2617443B2 (ja) 機能遺伝子の分離法、同遺伝子を含むｄｎａ断片及びその製法、組換プラスミド及び同プラスミドによる酵母の形質転換法並びに同発現法
JPH06104065B2 (ja) 酵母菌における異質遺伝子の発現のプロモ−タ−類、それらからなるプラスミド類、およびポリペプチド類の生産
JPH0515431B2 (ja)
NZ217809A (en) Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia; and dna sequences therefor
US5627046A (en) Yeast promoter and its use
JPH08500014A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）トランスアルドラーゼ遺伝子のプロモーターおよびその使用
JP2752092B2 (ja) Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主
US6344341B1 (en) Increased production of secreted proteins by recombinant yeast cells
JPH08500008A (ja) Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）リボソームタンパク質ＲＰ２８の遺伝子のプロモーターおよびその使用
JP2003047471A (ja) 異種タンパク質の分泌生産に優れた改変酵母およびその酵母を用いた異種タンパク質の製造法
Barnes et al. Expression of lacZ gene fusions affects downstream transcription in yeast
JP2769279B2 (ja) 遺伝子組み換えｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産菌
Kimura et al. Sequencing of the β-isopropylmalate dehydrogenase gene (LEU2) from Acremonium chrysogenum and its application to heterologous gene expression
JPH03262487A (ja) ヒト血清アルブミンの安定な製造方法
JPH062063B2 (ja) 新規ｄｎａおよびその用途
JPH08511161A (ja) 酵母プロモーターおよびその使用