JPH0515431B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 微生物系において外来性遺伝子を最大に発現せ
しめるためには一般に、発現ベクター中に相同性
制御要素を用いるのが有利である。発現の効率
（生成物の生産）は使用するプロモーターの強力
さの関数であり、それに比例すると信じられる。
さらに、実験者のコントロールの下での栄養的因
子による遺伝子発現の制御はさらに有用な操作手
段を提供する。酵母の解糖系酵素の遺伝子、例え
ばグリセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒド
ロゲナーゼ〔glyceraldehyde−３−
phosphatedehydrogenase（GAPDH）〕及びピル
ベートキナーゼ〔pyrvate kinase（PyK）〕につ
いてコードする遺伝子は上記の有用な性質、すな
わち高レベルの発現（非常に効率的なプロモータ
ーが推定される）及び増殖培地の成分による制御
に対する感受性を有する。例えば、GAPDHは、
市販のパン酵母の乾燥重量の５％という大きな部
分を占めることができる〔Krebs，E.G.，J. Biol．
Chem．（1953）200：471〕。さらに、これらの酵
素は非常に誘導されやすい。例えば、酵母の培養
が酢酸塩での増殖からグルコースでの増殖に移行
した場合、GAPDHの活性は倍地中の糖の濃度に
比例して200倍まで増加する〔Maitra P.K.及び
Lobo Z.，Ｊ．Biol．Chem．（1971）246：475〕。
これらの結果は、これらの遺伝子の転写機構が、
これらの遺伝子の5′非コードフランク領域中に存
在するDNA配列の関与により高度に制御される
ことを示唆する。 この発明は、制御可能な酵母遺伝子GAPDH及
びPyXの5′非コード領域に対応するDNA断片の
分離、構造、及び酵母発現プラスミド中での好結
果を伴う使用に関する。強力な転写促進
（promoting）活性を有するDNA配列を含有する
これらの断片を「プロモーター」と称する。この
プロモーターは、その転写制御の下で外来性遺伝
子によりコードされる蛋白質の商業的大量生産の
ためのDNAベクターの典型的な成分である。 さらに、この発明は、プロモーター−外来性遺
伝子−ターミーネーターの「カセツト」を構成す
る適当なターミーネーターをさらに含んで成る酵
母発現ベクターに関する。 酵母中で外来性DNAを発現しようとする初期
の試みは失敗した〔Beggs，J.D.等、Nature
（1980）283：285〕。この報告においては、ヘモグ
ロビンDNA（それ自体のプロモーターと共に挿入
された）は転写されたが、このRNAがスプライ
ス（Splice）されなかつた。この結果について
種々の説明が可能である。すなわち、転写開始位
置の不正確及び／又は介存配列（イントロン）を
スプライシングするための酵母の能力の不足であ
る。 酵母の３種類のGAPDH遺伝子がクローニング
されている〔Holland，M.J.等、Basic Life
Science（1981）19，291〕が、これらのプロモー
ターは組換DNA法による酵母中での発現系を構
成するために使用されていない。PyK遺伝子も
すでにクローニングされているが、遺伝的補完
（complementation）によつてのみである（構造
的研究は行われていない）〔カワサキG.及び
Fraenel D.G.，Biochem．Biophys．Res．
Comn．（1982）108：1107〕。他の酵母プロモー
ター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ
（alcohol dehydrogenase ）のプロモーター
〔Valenzuela，P.等、Nature（1982）298：347、
及びHityeman，R.A.等Nature（1981）293：
717〕、並びにホスホグセレートキナーゼ
（Phosphoglycerate Kinase）〔Tuite，M.F.等、
EMBO Ｊ．（1982）１：603、及びHitzeman，
R.A.等、Science（1983）219：620〕が、酵母に
おける発現のために外来性遺伝子に連結されてい
るが、ターミネーターは使用されなかつた。この
発明は、酵母発現系のための新規なプロモーター
を提供し、そして強化された発現を伴う非常に効
果的なプロモーターの利点と適切に連結されたタ
ーミネーターの利点を結びつける。 （発明の要約） この発明は、酵母GAPDEプロモーター又は酵
母PyKプロモーターの転写制御の下にある外来
性DNA断片、例えば肝炎Ｂウイルス（HBV）表
面抗原（HBsAg）についてコードするDNA断片
を含んでなる酵母発現ベクターに関する。ターミ
ネーターも又、適切に連結することができる。こ
の発現ベクターは典型的には酵母複製開始点及び
細菌複製開始点を有し、そしていずれのタイプの
細胞中でも複製することができる。この発現ベク
ターは、酵母細胞を形質転換するのに使用された
場合、外来性DNAのセグメントによつてコード
される蛋白質の実質的な量を生成せしめるであろ
う。 （発明の具体的な記載） 本来、酵母発現プラスミドは次の点を含む特定
の利点を有する。酵母は、当業界においてよく知
られている方法により、商業的生産のための大規
模培養において増殖することができる。これに対
して、細菌は大規模培養において、しばしば、
「フアージ・アウト」（フアージによる溶菌）の問
題に遭遇する。酵母はさらに、哺乳動物細胞と同
様に新たに合成された蛋白質に炭水化物を付加す
る能力を有するようである。細菌はこの能力を有
しない。今や、cDNA配列を容易に利用すること
ができ、イントロンを有する発現ベクターの問題
は容易に回避される。 この発明のベクターは、非常に高い効率を有す
るプロモーターを含む。ここで、プロモーター
は、隣接するDNAセグメントの転写を開始する
ために機能することができるDNAセグメントと
して定義される。転写とは、プロモーター領域に
隣接するDNAの１本鎖に相補的なRNA（ここで
は、メツセンジヤーRNA、すなわちmRNA）の
合成である。真核生物においては、メツセンジヤ
ーRNA合成はRNAポリメラーゼと称する酵素
により触媒される。プロモーター機能の最少必須
要素は次の通りである。すなわち、転写開始のた
めの出発点を提供すること、及びこの出発部位の
近くにRNAポリメラーゼの結合部位を提供し
メツセンジヤーRNA合成のための鋳型として適
当なDNA鎖の選択を可能にすることである。さ
らに、真核性プロモーターは、そのコントロール
の下でコードセグメントの転写の相対的効率を制
御するために機能する。活性プロモーターは隣接
DNAコードセグメントの鎖に相補的なmRNAの
比較的大量の合成を惹起するプロモーターであ
る。 プロモーターの機能の構造的相互関係は明確に
は確率されていない。プロモーターセグメントは
通常、ある構造遺伝子の5′末端に隣接して存在す
る領域としての性質において同定される。（遺伝
子の5′末端及び3′末端は、これから転写された
mRNAの対応するそれぞれの末端を示し、そし
てコードされた蛋白質のNH₂−末端及び−
COOHにそれぞれ対応するものと理解される。）
色々な種からの色々な遺伝子のためのプロモータ
ーのヌクレオチド配列の比較から、これらの間で
共通な、ヌクレオ配列の類似性を有する非常に短
い領域が見出されている。これらの領域の内特に
顕著なものは、「TATAボツクス」、すなわち転
写開始部位から一般に約70〜230ヌクレオチド上
流に位置し、一般に類似するTATAA配列を有
する約５〜10ヌクレオチドのセグメントである。
構造的比較を概観するためには、Breathnach R.
及びChambon P.，Ann.Rev.of Biochem.（1981）
50：349を参照のこと。TATAボツクスは転写の
開始において機能すると信じられる。 外来性遺伝子は、プロモーターに関連する正常
な構造遺伝子由来のコドンを含有しないか又は実
質上含有しないであろう。通常、外来性遺伝子
は、プロモーターを含む制御領域の非コード3′末
端に連結され、制御遺伝子に天然に関連する内性
遺伝子（endogenous gene）のＮ末端のアミノ酸
が排除されるであろう。すなわち、外来性遺伝子
に連結された場合、制御領域に保存されるのは３
コドン（９ヌクレオチド）未満であろう。 コードセグメントの3′末端におけるターミネー
ター配列の存在により発現が強化される。この効
果は一般に原核性転写系へのrhoフアクターの付
加の場合に類似しており、RNAポリメラーゼの
離脱速度が上昇し、転写の再開始速度が上昇す
る。ターミネーター配列は外来性DNAセグメン
トの検出し得る発現には必要でないが、これを適
切に連結すれば発現が強化されることが理解され
よう。ターミネーター領域は、プロモーター領域
が関連するのと同一の又は異る構造遺伝子と関連
することが当然可能である。 この発明のGAPDH又はPyK構成のための最も
適当なDNAベクターはシヤトルベクターである。
これらのベクターは細菌株、例えばＥ．コリ（Ｅ
coli）と酵母との間を往復（shottle）することが
できる。なぜならこれらのベクターは細菌複製開
始点及び酵母複製開始点を有するからである〔例
えば、Ammerer G.等、Recombinant DNA，
Proc．Third Clevelant Symposium
Maclomolecules（Walton A.G.編）、185頁、エ
ルゼビール、アムステルダムを参照のこと〕。典
型的な細菌複製開始点は、例えばpBR 322 か
ら導かれる。最も有用な酵母複製開始点は、２ミ
クロンサークルとして知られる染色体外遺伝要素
に見出される。実験室株において、２ミクロンプ
ラスミドDNAは細胞当り約50コピー見出され、
そして安定に維持される。概観するために例えば
Curr．Topics Micro．Imn．（1982） 96：119
を参照のこと。この酵母プラスミドも配列決定
されている〔Hartley，J.L.等、Nature（1980）
286：860〕。 この発明の構成において使用されるプラスミド
及び宿主細胞の代表例がアメリカン・タイプ・カ
ルチユアー・コレクシヨン（ATCC）に寄託され
ている。プラスミドpPyK 9.1.1.並びに酵母細胞
形質転換体2150−２−３／pHBS−56
GAP347／33、及び2150−２−３／pHBs56PyK
が、1983年２月18日に寄託され、それぞれATCC
受け入れ番号（Accession No）40061，20665及
び20666が与えられた。 次に記載する例において、多くの技法、反応及
び分離方法は当業界においてすでによく知られて
いる。特にことわらない限りすべての酵素は１又
は複数の商業的供給源、例えばNew England
Biolabs，ベベリー、マサチユーセツツ；
Collaborative Research、ウアルサム、マサチ
ユーセツツ；Miles Laboratories、エルクハー
ト、インデイアナ；Boehringer Biochemica−
ls，Inc，インデイアナポリス、インデイアナ；
及びBethesda Research Laboratories，ロツク
ビレ、メイランドから入手することができる。制
限酵素消化のための緩衝液及び反応条件は、特に
ことわらない限り各酵素の製造者の推奨に従つて
使用した。他の酵素反応、ゲル電気泳動分離及び
Ｅ．コリの形質転換は、Methods in
Enzymology（1979）68に記載されている。酵母
プロトプラストの形質転換は本質上、Beggs，
Nature（1978）275：104に記載されている方法
により行うことができる。 形質転換に有用なＥ．コリ株には、X1776；
K12ストレイン294（ATCCNo.31446）；RR1及び
HB101が含まれる。遺伝子型（ａ，ade2，ade6，
leu2，lys1，trp1，can1）を有する酵母株XV610
−8c、及び遺伝子型（Leu2，Trp1，His4，
CYC1−1CYP3−１）を有するGM−3C−２株
〔Faye，G.等、Proc．Nat1．Acad．Sci．
（1981）78：2258〕を、酵母の形質転換に典型的
に使用することができる。しかしながら、実質上
すべての酵母菌株が形質転換のために有用である
と理解すべきである。細菌は、Miller J.H.
Experiments in Molecular Genetics，コール
ド・スプリングハーバー・ラボラトリー、コール
ドスプリングハーバー、ニユーヨーク（1972）に
記載されている方法に従つて増殖せしめ、そして
選択することができる。酵母は次の培地に増殖せ
しめることができる。YEPD培地は１（Ｗ／Ｖ）
％の酵母エキストラクト、２（Ｗ／Ｖ）％のペプ
トン、及びグルコースを含有し、プレート培地の
場合にはさらに３（Ｗ／Ｖ）％の寒天を含有する。
YNB＋CAA培地は１中6.7gのイーストニトロ
ゲンベース（yeast nitrogenbase）（デイフコ・
ラボラトリース、ミネアポリス、ミネソタ）、10
mgのアデニン、10mgのウラシル、５ｇのカサミノ
酸（CAA）（デイフコ）及び20ｇのグルコースを
含有し、プレート培地の場合にはさらに30ｇの寒
天を含有する。トリプトフアン栄養要求性の選択
は、形質転換される株のトリプトフアン以外のす
べての増殖要求因子が補完された、6.7ｇのイー
ストニトロゲンベース（アミノ酸不含）を含有す
るプレート上で行うことができる。 例１ 酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフエー
トデヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子のクロ
ーニング 酵母GAPDHコード配列を含有する相補的
DNA（cDNA）を次のようにして調製した。 酵母A364A株からポリＡ＋RNAを分離した。
AMV逆転写酵素（revarse transcriptase）及び
E.コリDNAポリメラーゼを用いて２重鎖
cDNAを合成した。デオキシヌクレオチドターミ
ナルトランスフエラーゼ
（deoxynucleotideterminal transferase）を用い
て２重鎖cDNA分子にポリ−dc−テイルを付加
した。ポリ−dc−テイルを付加したcDNAをポ
リ−dG−テイルを付加したpBR322にアニーリン
グし、そしてこれを用いてE. コリHB101を形質
転換した。1000個の形質転換体を、ラベルされた
ポリＡ＋RNAへのコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンによりスクリーニングし、そしてサブセツト
を、制限酵素マツピング及びDNA配列決定によ
りさらに試験した。集団から、GAPDH配列を含
有する３個のコロニーを分離した。１つのクロー
ン（pcGAP−９）が約1200塩基対（bp）の挿入
部を含有しており、これをその後の研究に使用し
た。 Blattner F.r.等、Science（1977）196161〜169
に従つて、全酵母DNAを制限酵素Sau 3Aによ
り部分消化した後に得られた断片をλフアージ・
シヤロン（Charon）28に挿入することによつて
酵母遺伝子ライブラリーを調製した。GAPDAコ
ード配列を含有する複数の断片を、pcGAP−９
由来のラベルDNAを用いてフアージライブラ
リーをスクリーニングすることにより分離した。
これらのクローンの内の１つの酵母GAPDH遺伝
子を、2.1kbHinｄ断片（pGAP−１）、（第１
図参照）として、又は3.5kbBamＨ断片
（pGAP−２）としてpBR322でサブクローニング
した。これらのクローンからGAPDHプロモータ
ー活性断片を分離した。約800bpのHinｄ−
Hha断片を約350bpのHha−Hinｄ断片に
連結した。得られた1061bpHinｄ断片をゲル電
気泳動により分離し、そしてpBR322中でクロー
ニングし（pGAP−347）、そして配列を決定した
（第２図参照）。 例 ２ HBsAgの発現において活性を有する
GAPDHプロモーターを含有する酵母ベクター
の構成 酵母中でHBV表面抗原を発現するための、
GAPDHプロモーター断片を用いるプラスミドベ
クター（pHBS−56GAP347／33）を、第３図に
示すようにして構成した。 pGAP−347をSphにより全消化し、次にHin
ｄにより部分消化することにより、GAPDHプ
ロモーターの約1060bpとpBR322の約530bpを有
する約1700bpのSph−Hinｄ断片を得た。こ
の1700bpのSph−HinｄGAPDHプロモータ
ー断片を、840bpのHinｄ−Hinｄ断片
（HBsAgコード領域、26塩基の5′非コード領域及
び128bpの3′非コード領域を含有し、pHBS−56
から得られたもの）に連結し、そして次に350bp
のHinｄ−Sph断片（pHBS−56から分離さ
れ、ADH−終結領域を含有する）と連結した。
2900bpのSph断片（カセツト）を分離し、そし
てあらかじめSphにより消化されたpHBS−56
にロクローニングした。プラスミドpHBS−56
（ATCC受入No.40047）は係属中の米国特許出願No.
402330，1982年７月27日出願、「Synthesis of
Human Virus Antigens by Yeast」に記載され
ており、そして酵母leu2遺伝子及びpBR322の
amp耐性座を伴う領域のほかに完全な２ミクロン
プラスミドを含有する。プロモーター、遺伝子及
び終結領域が正しく方向付けられている得られた
プラスミド（pHBS−56GAP347／33）を分離
し、そしてこれを用いて酵母AB102株（MATa，
pep4−３，leu2−３，leu2−112，ura3−52，
his4−580，cir°）、又は2150−２−３株
（MATa，adel，leu2−04，cir°）を形質転換し
た。AB102株は２ミクロンプラスミドのキユア
リング（curing）によりSF657−9cから誘導され
たものである。2150−２−３株はワシントン大学
におけるLeland Hartwell氏のコレクシヨンに由
来する。 例３ 酵母中、GAPDHプロモーターのコントロ
ール下でのHBsAgの合成（プラスミドpHBS
−56GAP347／33） プラスミドpHBS56−347／33を含有する
AB102株の培養物100mlを、650nmにおける光学
濃度が１になるまで増殖せしめた。ガラスビーズ
と共に撹拌し、そして遠心分離によつて細胞片を
除去することにより無細胞溶解物を調製した。
HBsAgをアボツト アウスリア（Abbott
Ausria）ラジオイムノ アツセイにより測定
し、そして蛋白質濃度をクーマシーブルー
（Coomassie blue）結合法により測定した。結果
を第１表に示す。この結果は、GAPDHプロモー
ターが、酵母における蛋白質の発現のために
ADH−１プロモーターに比べて約５倍効果的で
あることを示している。 【表】 酵母AB102株の代りに酵母2150−２−３株を
使用し例３を反復することにより同様の結果が得
られた。 例４ 酵母ビルベートキナーゼ遺伝子のクローニ
ング ビルベートキナーゼ遺伝子を補完
（complementation）によりクローニングした。
酵母ピルベートキナーゼマイナス変異株を、野性
型酵母ゲノム性DNAを含有する組換YEp24プラ
スミドのプールにより形質転換した。酵母S288C
株（遺伝子型：SUC2，ma1，ga12，CUP1）、及
びPyK1−５株（遺伝子型：ａ，ade1，leu1，
met14，ura3，PyK1−５）をカリホルニア大学
（バークレー）、生物物理学部（Department of
Biophysics）、酵母遺伝子貯蔵センター（Yeast
Genetic Stock Center）から得た。使用した酵
母遺伝子バンクは、S288C株由来の全DNAのSau
3A部分分解物を「シヤトル」ベクターYEp24の
BamＨ部位にクローニングしたものから成る。
ベクターYEp24は、細菌における選択及び増殖
のためのpBR322配列、酵母における選択のため
の酵母URA3遺伝子、及び酵母におけるプラスミ
ドの複製及び分離（Segregatlon）を保証するた
めの酵母2μサークルのEcoＲ断片を含有する。
このプールは、全酵母ゲノムを代表するのに十分
な独立の組換プラスミドを含む。 PyK1−５株における変異はPyK1及びURA3
座にあるので、この株はグルコースを含有する培
地又はウラシルを含有しない培地には増殖するこ
とができない。この株をYEp24ゲノムライブラ
リーによつて形質転換し、そしてウラシルを含有
せずグルコースを含有する培地に増殖することが
できる形質転換体を選択することにより、ピルベ
ートキナーゼ遺伝子含有するYEp24を獲得した
細胞が選択される。3.5×10⁸個のPyK1−５酵母
細胞を10μgのYEp24組換体プラスミドプール
DNAで形質転換することにより、ウラシルの非
存在下及びグルコースの存在下で増殖する５個の
独立した形質転換体を得た。 これらの形質転換体の挿入DNAを制限酵素分
析により特微付けることにより、これらが重複す
るDNA挿入部を含有することが示された。発明
者は１つの形質転換体、すなわち7.0kbの挿入部
（insert）を含有するpPyK9.1に注目した。この
挿入部中のピルベートキナーゼ遺伝子の位置を、
ピルベートキナーゼmRNAであると予想される
約1.7kbのmRNAにハイブリダイズする挿入部特
異的制限断片を決定することにより決定した。
PyK遺伝子の位置決定を、挿入DNAの対応領域
をサブクローニングし、そしてPyK1−５変異株
中の機能の補完を観察することにより確認した。
4.4kb挿入部上にPyK遺伝子を含有するサブクロ
ーンpPyK9.1.1の配列を決定し、そして発現プラ
スミドの構成において使用した。 例５ 酵母ピルベートキナーゼ遺伝子の配列 １つのオープンリーデイングフレーム
（openreading frame）中の1497ヌクレオチド、
5′非翻訳領域の911ヌクレオチド、及び3′非翻訳
領域の477ヌクレオチドを含むPyK遺伝子の合計
2885ヌクレオチドの配列を決定した（第４図参
照）。この遺伝子は499アミノ酸のポリペプチドを
コードし、単量体分子量54，608ダルトンをもた
らし、これは酵母PyKの予想値とよく一致する。
ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸組成
も、分離された酵母蛋白質から測定されたそれと
よく一致する。ヌクレオチド配列からカルボキシ
末端がバリンであることが予想され、これは酵母
ピルベートキナーゼについて見出されている。 例６ ピルベートキナーゼプロモーター領域を用
いる酵母発現プラスミドの構成 ２つの異なる構成pHBS16PyK及び
pHBS56PyKを調製した。方法の概略を第５図に
示す。 pBR322中にクローニングされた酵母PyK遺伝
子を含有するプラスミドpPyK9.1.1を、xbaに
より消化し、そして突出した末端をDNAポリメ
ラーゼを用いてデオキシヌクレオチドにより満
たした。この生成物をBamＨで消化すること
により、PyKプロモーター及びPyKコード領域
からの８塩基を含有する212bpのBamＨ−平滑
末端断片を最終的に分離した。この断片を、あら
かじめNcoで消化しDNAポリメラーゼを用い
て満たしそしてBamＨで消化したプラスミド
pHBS−６〔pBR322中でクローニングされた
HBsAg遺伝子（5′非コード領域が除去されてい
る）を含有する〕に連結した。Ｅ．コリを形質転
換した後、pHBS−6pyKを分離した。このプラ
スミドは、HBsAgコード配列と同位相で融合し
た３個の余分のアミノ酸をコードするコドン
ATGTCTAG CATGと共にPyKプロモーター
を含有する。pHBS−6PyKをBamＨを用いて
完全消化し、そしてEcoＲにより部分消化する
ことによりHBsAg遺伝子に融合したPyKプロモ
ーターを含有する1750bpBamＨ−EcoＲ断
片を分離した。この1750bpの断片を、BamＨ
及びEcoＲによりpHBS−16〔ATCCNo.40043、
酵母中のアデノウイルスプロモーター
（Adenovirus Promoter in Yeast）と題して
1982年11月18日に出願された米国特許出願No.
442687に記載されているプラスミド（引用により
この明細書に組入れる）〕を消化した後に得られ
た大断片に連結し、そしてこれを用いてＥ．コリ
を形質転換した。酵母発現プラスミドpHBS−
16PyKを得た。pHBS−16PyKを、Sph及び
Xbaで完全消化し、そして1200bpSph−Xba
断片（pBR322の200bp，PyKプロモーター及
びHBsAg遺伝子の5′領域の100bpを含有する）を
分離した。この1200bpSph−Xba断片を、
HBsAg遺伝子の3′末端及びADH−１ターミネー
ターを含有する1070bpXba−Sph断片
（pHBS−56から分離）に連結した。Sphで消
化した後、PyKプロモーター、HBsAg遺伝子及
びADH−１ターミネーターを含有するSph−
Sph2300bp断片（カセツト）を分離した。この
カセツト断片を、Sphによりあらかじめ消化し
たpHBS−56中にクローニングした。酵母発現プ
ラスミドpHBS−56PyKを得た。このプラスミド
を用いて酵母AB102株（例２を参照）又は2150
−２−３株（例２を参照）を形質転換した。 例７ 酵母中PyKプロモーターの制御下での
HBsAgの合成 プラスミドpHBS−56PyKを含有するAB102株
の培養物100mlを650nmにおいて光学濃度が１〜
２になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共に
撹拌し、そして細胞片を遠心分離によつて除去す
ることにより無細胞溶解物を得た。アボツト・ア
ウスリア、ラジオイムノアツセイにより
HBsAgを測定し、そしてクーマシーブルー結合
法により蛋白質濃度を測定した。結果を第２表に
示す。 【表】 【表】 酵母AB102株の代りに酵母2150−２−３株を
用い、例７の方法を反復することにより同様の結
果が得られた。 この発明を特定の具体例と関係させて記載した
が、この発明の範囲内において、他の種々の変法
や応用を行うことができよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はGAPDHプロモーター断片の分離及び
連結を示し、第２図はGAPDHプロモーターの
DNA配列を示し、第３図はGAPDHプロモータ
ーを含有する酵母発現プラスミドの構成を示し、
第４図はピルベートキナーゼ（PyK）遺伝子の
ヌクレオチド配列を示し、そして第５図はPyK
プロモーター領域を含有する酵母発現プラスミド
の構成を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のヌクレオチド配列： 【表】 【表】 により特定される酵母グリセルアルデヒド−３−
   ホスフエートデヒドロゲナーゼプロモーターの転
   写制御下にある外来性DNAのセグメントを含ん
   で成り、前記セグメントが転写のために正しく方
   向付けられており、そして酵母グリセルアルデヒ
   ド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼからのコ
   ドンを前記外来性DNAの5′末端に実質上含有し
   ない酵母発現ベクター。 ２ 外来性DNAセグメントの3′末端に連結され
   たターミネータをさらに含んで成る特許請求の範
   囲第１項記載の酵母発現ベクター。 ３ 酵母２ミクロンプラスミドDNA又はその部
   分をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項記載
   の酵母発現ベクター。 ４ 前記外来性DNAが肝炎Ｂ表面抗原又はその
   部分についてコードする特許請求の範囲第１項記
   載の酵母発現ベクター。