DE3486431T2 - Expressionssysteme für Hefe mit Vektoren, die einen GAPDH-Promotor enthalten und Oberflächenantigensynthese von Hepatitis B - Google Patents
Expressionssysteme für Hefe mit Vektoren, die einen GAPDH-Promotor enthalten und Oberflächenantigensynthese von Hepatitis BInfo
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Description
- Für die maximale Expression von Fremdgenen in mikrobiellen Systemen ist es im allgemeinen vorteilhaft, homologe regulatorische Elemente in dem Expressionsvektor zu verwenden. Es wird angenommen, daß die Effizienz der Expression (Produktbildung) von der Stärke des verwendeten Promotors abhängt und zu dieser proportional ist. Zusätzlich bietet die Regulation der Genexpression durch Ernährungsfaktoren unter der Kontrolle des Experimentators ein weiteres brauchbares Mittel zur Steuerung der Expression. Die Gene von Hefen, die glykolytische Proteine codieren, z.B. die Gene, die Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenase (GAPDH) und Pyruvat-Kinase (PyK) codieren, besitzen diese nützlichen Eigenschaften, das heißt, sie weisen hohe Expressionsniveaus auf (und stellen entsprechend sehr effiziente Promotoren dar) und können durch Bestandteile des Wachstumsmediums reguliert werden. GAPDH kann beispielsweise in einem hohen Mengenanteil von 5 %, bezogen auf das Trockengewicht, bei kommerzieller Bäckerhefe vorliegen (Krebs, EG., J. Biol. Chem. (1953) 200:471). Darüber hinaus sind diese Enzyme auch hoch induzierbar. Wenn Hefekulturen beispielsweise vom Wachstum auf Acetat auf Glucose übertragen werden, nimmt die Aktivität von GAPDH bis zu 200fach zu, und zwar proportional zur Zuckerkonzentration des Mediums (Maitra, P.K., und Lobo, Z., J. Biol. Chem. 246 (1971) 475). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß der Transcriptionsmechanismus dieser Gene stark reguliert ist, möglicherweise durch die Beteiligung von DNA-sequenzen, die im nicht codierenden 5'-flankierenden Bereich der Gene vorhanden sind.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und die Struktur von DNA-Fragmenten, die den nicht codierenden 5'-Regionen der regulierbaren GAPDH-Gene von Hefe entsprechen, und ihre erfolgreiche Verwendung in Hefe-Expressionsplasmiden. Diese Fragmente, die DNA-Sequenzen enthalten, die eine hohe Aktivität bei der Förderung der Transcription aufweisen, werden als "Promotoren" bezeichnet. Sie sind ideale Bestandteile von DNA-Vektoren für die kommerzielle Herstellung großer Mengen an Proteinen, die von Fremdgenen codiert werden, unter ihrer Transcriptionskontrolle.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hefe-Expressionsplasmide, die außerdem einen geeigneten Terminator enthalten, mit dem eine aus Promotor, Fremdgen und Terminator bestehende "Kassette" gebildet wird. Durch die Gegenwart des Terminators nimmt die Expression der Fremd-DNA zu.
- Ein früher Versuch zur Expression von Fremd-DNA in Hefe mißlang (Beggs, J. D., et al., Nature 283 (1980) 285). Nach dieser Publikation wurde die Hämoglobin-DNA (eingefügt mit ihrem eigenen Promotor) transkribiert, wobei allerdings die RNA nicht gespleißt war. Für dieses Ergebnis gibt es mehrere mögliche Erklärungen, z.B. eine nicht korrekte Stelle für die Initiation der Transcription und/oder die gering ausgebildete Fähigkeit von Hefezellen, das Spleißen von intervenierenden Sequenzen (Introns) durchzuführen.
- Drei GAPDH-Gene von Hefe sind kloniert worden (Holland, M.J., et al., Basic Life Science 19 (1981) 291), wobei jedoch ihre Promotoren nicht zur Konstruktion von Expressionssystemen in Hefe durch DNA-Rekombinationstechniken verwendet wurden. Das PyK-Gen ist ebenfalls kloniert worden, aber nur durch genetische Komplementation (strukturelle Untersuchungen wurden nicht durchgeführt) (Kawasaki, G. und Fraenel, D.G., Biochem. Biophys. Res. Comm. 108 (1982) 1107). Andere Hefepromotoren, z.B. der Promotor für Alkoholdehydrogenase 1 (Valenzuela, P., et al., Nature 298 (1982) 347, und Hitzemann, R.A., et al., Nature 293 (1981) 717) und der Promotor für Phosphoglyceratkinase (Tuite, M.F., et al., EMBO J. 1 (1982) 603, und Hitzemann, R.A., et al., Science 219 (1983) 620) wurden mit Fremdgenen verbunden, um eine Expression in Hefe zu erzielen, jedoch wurden dabei keine Terminatoren verwendet. Die vorliegende Erfindung gibt neue Promotoren für Hefe-Expressionssysteme an und verbindet die Vorteile von Promotoren mit hoher Expressionseffizienz mit der verstärkten Expression, die mit geeignet ligasierten Terminatoren erhalten wird.
- In einer veröffentlichten europäischen Patentanmeldung (EP-A- 072 318) ist die Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors offenbart, der bei Induktion das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBSAG)-S-Protein, unter der Kontrolle des Alkoholdehydrogenase-I (ADHI) -Promotors von Hefe exprimiert.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines codierenden DNA-Segments, das das Hepatitis-Boberflächenantigen oder einen Teil davon codiert, in Hefe, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Insertion des codierenden Segments in einen Hefe-Expressionsvektor unter Bildung eines das codierende Segment enthaltenden Expressionsvektors und
- b) Transformation der Hefezellen mit dem das codierende Segment enthaltenden Expressionsvektor, wobei der Hefe-Expressionsvektor ein Promotor-Segment enthält, das von einem Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor von Hefe abgeleitet ist und die in Fig. 2 dargestellte Sequenz besitzt und drei oder eine geringe Anzahl Codons vom 5'-Ende der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase von Hefe aufweist, wobei sich das Promotor-Segment in der für die Transcription des codierenden Segments richtigen Orientierung befindet. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Hepatitis-B-Oberflächenantigens oder eines Teils davon, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Kultivieren von Hefezellen, die mit dem oben angegebenen Expressionsvektor, der ein codierendes Segment aufweist, transformiert sind, und
- b) Isolieren des Hepatitis-B-Antigens oder eines Teils davon.
- Terminatoren können ebenfalls in geeigneter Weise angebunden werden. Der Expressionsvektor weist typischerweise einen Hefe-Replikationsursprung auf und kann in beliebigen Zelltypen repliziert werden. Der Expressionsvektor liefert, wenn er zur Transformation von Hefezellen verwendet wird, große Mengen des Proteins, das durch das Fremd-DNA-Segment codiert wird.
- Fig. 1: Isolieren und 'Maßschneidern' des GAPDH-Promotorfragments.
- Fig. 2: DNA-Sequenz des GAPDH-Promotorfragments.
- Fig. 3: Konstruktion eines Hefe-Expressionsplasmids, das den GAPDH-Promotor enthält.
- Hefe-Expressionsplasmide haben prinzipiell besondere Vorteile, zu denen die folgenden gehören: Hefe kann in großem Maßstab in Kulturen zur kommerziellen Produktion nach Verfahren vermehrt werden, die auf diesem Fachgebiet wohlbekannt sind. lin Gegensatz dazu trifft bei in großem Maßstab angelegten Bakterienkulturen häufig das Problem des "Phage-out" durch Phagen auf. Außerdem scheint Hefe weitestgehend die gleiche Fähigkeit wie Säugerzellen zu haben, Kohlenhydratgruppen an neu synthetisierte Proteinmoleküle anzuheften, wohingegen Bakterien diese Fähigkeit nicht besitzen. Da nunmehr cDNA-Sequenzen in einfacher Weise erhältlich sind, kann das Problem der Expression von Genen, die Introns aufweisen, leicht vermieden werden.
- Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promotoren mit unüblich hoher Effizienz. Ein Promotor ist hier als ein DNA-Segment definiert, das die Transcription eines angrenzenden DNA-Segments zu starten vermag. Transcription ist die Synthese von RNA (hier als Messenger-RNA oder mRNA bezeichnet), die komplementär zu einem Strang der an die Promotorregion angrenzenden DNA ist. In Eukaryonten wird die Synthese der Messenger-RNA durch ein als RNA-Polymerase II bezeichnetes Enzym katalysiert. Die minimal unbedingt erforderlichen Elemente der Promotor-Funktion sind: Bereitstellen eines Startpunkts für den Start der Transcription und Bereitstellung einer Bindungsstelle für die RNA-Polymerase II in der Nähe der Startstelle, um die Auswahl des richtigen DNA- Strangs als Matrize für die Synthese der Messenger-RNA zu ermöglichen. Zusätzlich dient ein eukaryontischer Promotor zur Regulierung der relativen Effizienz der Transcription codierender Segmente unter seiner Kontrolle. Ein aktiver Promotor ist ein Promotor, der die Synthese relativ großer Mengen an mRNA hervorruft, die komplementär zu einem Strang des benachbarten codierenden DNA-Segments ist.
- Die Wechselbeziehungen zwischen Struktur und Funktion von Promotoren sind noch nicht einwandfrei geklärt. Ein Promotor- Segment kann im natürlichen Gen als ein Bereich identifiziert werden, der benachbart zu dem 5'-Ende eines bestimmten Strukturgens angeordnet ist (die Bezugnahme auf das 5'- und das 3'-Ende eines Gens ist so zu verstehen, daß sie auf das entsprechende jeweilige Ende der von diesem Gen transkribierten mRNA hinweist, wobei diese beiden Enden wiederum so zu verstehen sind, daß sie sich auf den NH&sub2;-Terminus bzw. den COOH- Terminus des codierten Proteins beziehen).
- Durch Vergleiche der Nucleotidsequenzen von Promotoren für verschiedene Gene von verschiedenen Species hat sich herausgestellt, daß es zwischen ihnen nur wenige, kurze Bereiche mit gleichartiger Nucleotidsequenz gibt. Von diesen kurzen Bereichen ist die "TATA-Box" am wichtigsten, ein Segment von etwa 5 bis 10 Nudeotiden, das im allgemeinen etwa 70 bis 230 Nucleotide stromaufwärts von der Stelle des Transcriptionsstarts gelegen ist und eine Sequenz aufweist, die im allgemeinen der Sequenz TATAA ähnelt. Für einen Überblick über strukturelle Vergleiche siehe Breathnach, R., und Chambon, P., Ann. Rev. of Biochem. 50 (1981) 349. Es wird angenommen, daß die TATA-Box beim Transcriptionsstart eine Rolle spielt.
- Das Fremdgen ist frei oder im wesentlichen frei von Codons des natürlichen Strukturgens, das mit dem Promotor kombiniert ist. Das Fremdgen wird üblicherweise mit einem nicht codierenden 3'-Ende der Regulatorregion verbunden, die den Promotor enthält, so daß es frei von den Aminosäuren am N-Terminus des endogenen Gens ist, die im natürlichen Fall mit der Regulatorregion verbunden sind. Das bedeutet, daß weniger als etwa 3 Codons (9 Nudeotide) bei der Regulatorregion verbleiben, wenn sie mit dem Fremdgen verbunden wird.
- Durch die Gegenwart der Terminatorsequenz am 3'-Ende des codierenden Segments wird die Expression verstärkt. Die Wirkung ähnelt allgemein der durch Zugabe des Rho-Faktors zu prokaryontischen Transcriptionssystemen erzielten Wirkung, wodurch die Geschwindigkeit der Freisetzung von RNA-Polymerase erhöht wird und so eine Zunahme der Geschwindigkeit des erneuten Starts der Transcription erzielt wird. Es ist daher verständlich, daß es, obwohl die Terminatorsequenzen für eine nachweisbare Expression von Fremd-DNA-Segmenten nicht erforderlich sind, bevorzugt ist, sie zur Verstärkung der Expression in geeigneter Weise anzubinden. Die Terminatorregion kann natürlich mit dem gleichen Strukturgen wie dem der Promotorregion oder einem davon verschiedenen Strukturgen verbunden sein.
- Der am besten geeignete DNA-Vektor für die GAPDH-Konstruktion der vorliegenden Erfindung ist ein Pendelvektor (Schaukelvektor). Diese Vektoren können zwischen einem Bakterienstamm, wie z.B. E. coli, und Hefe pendeln, da sie einen Bakterien- Replikationsursprung und einen Hefe-Replikationsursprung aufweisen, siehe z.B. Ammerer, G., et al., Recombinant DNA, Proc. Third Cleveland Symposium Macromolecules (Walton, A.G., Hrsg.), S. 185, Elsevier, Amsterdam (1981). Ein typischer Bakterien-Replikationsursprung kann beispielsweise von PBR322 abgeleitet werden. Den brauchbarsten Hefe-Replikationsursprung findet man in dem extrachromosomalen genetischen Element, das als '2-Mikron-Ring' bekannt ist. In Laborstämmen findet man die DNA des 2-Mikron-Plasmids in einer Anzahl von etwa 50 Kopien pro Zelle, in denen es stabil enthalten bleibt. Einen Überblick gibt beispielsweise Curr. Topics Micro. Imm. 96 (1982) 119. Dieses Hefeplasmid ist außerdem sequenziert worden (Hartley, J.L., et al. Nature 286 (1980) 860).
- Typische Beispiele für die Plasmide und Wirtszellen, die bei den Konstruktionen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland hinterlegt. Die transformierte Hefezelle 2150-2-3/pHBS-56 GAP347/33 wurde am 18. Februar 1983 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer ATCC 20665 erhalten.
- Viele der in den folgenden Beispielen angegebenen Techniken, Reaktionen und Trennverfahren sind auf dem vorliegenden Fachgebiet bereits wohlbekannt. Alle Enzyme sind, sofern nichts anderes angegeben ist, von einer oder mehreren kommerziellen Quellen erhältlich, wie z.B. von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Collaborative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Laboratories, Elkhart, Indiana; Boehringer Chemicals, Inc., Indianapolis, Indiana and Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland. Puffer und Reaktionsbedingungen für die Spaltung mit Restriktionsenzymen wurden unter Beachtung der vom Hersteller für jedes Enzym abgegebenen Empfehlung angewandt, sofern nichts anderes angegeben ist. Standardmethoden für andere Enzymreaktionen, für Trennungen durch Gelelektrophorese und für die Transformation von E. coli können Methods in Enzymology, (1979) 68, entnommen werden. Die Transformation von Hefeprotoplasten kann im wesentlichen so wie von Beggs beschrieben (Nature 175 (1978) 104) ausgeführt werden.
- Zu den für die Transformation verwendbaren E.-coli-Stämmen gehören X1776, der K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), RR1 und HB101. Die Hefestämme XV610-8c mit dem Genotyp (a ade2 ade6leu2 lys1 trp1 can1) und GM-3C-2 mit dem Genotyp (Leu2 Trp1 His4 CYC1-1CYP3-1) (Faye, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981) 2258) können typischerweise für Hefetransformationen verwendet werden. Selbstverständlich können darüber hinaus aber auch beliebige andere Hefestämme verwendet werden, die für Transformationen brauchbar sind. Die Bakterien können nach den von Miller, J. H. (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972)) beschriebenen Verfahren gezüchtet und selektiert werden. Hefe kann auf den folgenden Medien gezüchtet werden: YEPD, das 1 % (G/V) Hefeextrakt, 2 % (G/V) Peptone und (G/V) Glucose und im Falle eines Plattierungsmediums 3 % (G/V) Agar enthält. YNB (yeast nitrogen base) plus CAA (casamino acids) enthält 6,7 g Hefestickstoffbase (Difco Laboratories, Minneapolis, Minnesota), 10 mg Adenin, 10 mg Uracil, 5 g Casein-Hydrolysat (casamino acids von Difco), 20 g Glucose und, wenn es sich um ein Plattierungsmedium handelt, 30 g Agar pro Liter. Die Selektion für Tryptophan-Prototrophie kann auf Platten erfolgen, die 6,7 g Hefestickstoffbase (ohne Aminosäuren) enthalten und mit Ausnahme von Tryptophan mit allen für die Züchtung des zu transformierenden Stamms erforderlichen Bestandteilen ergänzt ist.
- Eine komplementäre DNA (cDNA), die die codierenden Sequenzen der Hefe-GAPDH enthält, wurde in folgender Weise hergestellt:
- Poly(A)+ RNA wurde aus dem Hefestamm A364A isoliert. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von AMV-Reverse-Transcriptase und DNA-Polymerase I von E. coli synthetisiert. Poly(dC)-Schwänze wurden unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidtransferase an das doppelsträngige cDNA-Molekül angeheftet. Die cDNA mit Poly(dC)-Schwanz ließ man mit PBR322 mit Poly(dG)-Schwanz reassozueren; sie wurde dann zur Transformation des E.-coli-Stamms HB101 verwendet. Eintausend Transformanten wurden einer Durchmusterung unter Anwendung der Kolonie-Hybridisierungstechnik mit markierter Poly(A)+ RNA unterzogen, und eine Untergruppe wurde durch Kartierung mit Restriktionsendonuclease und durch DNA-Sequenzierung weiter untersucht. Drei Klone, die GAPDH-Sequenzen enthielten, wurden aus dem Pool isoliert. Ein Klon (pcGAP-9) enthielt etwa 1200 insertierte Basenpaare (bp) und wurde für die weitere Arbeit verwendet.
- Eine Gen-Bibliothek der Hefe wurde durch Insertion von Fragmenten, die nach partieller Spaltung der Gesamt-DNA der Hefe mit der Restriktionsendonuclease Sau3a erhalten wurden, in den Lambdaphagen Charon 28 gemäß Blattner, F.R., et al., Science 196 (1977) 161-169, hergestellt. Verschiedene Fragmente, die codierende Sequenzen für Hefe-GAPDH enthielten, wurden durch Durchmustern der Phagenbibliothek mit markierter DNA von PCGAP-9 isoliert. Das GAPDH-Hefegen von einem dieser Klone wurde in PBR322 als 2,1-kb-HindIII-Fragment (PGAP-1, siehe Fig. 1) oder als 3,5-kb-BamHI-Fragment subkioniert. Die als Promotor aktiven Fragmente des GAPDH-Gens wurden aus diesen Klonen isoliert. Das HindIII-Hhai-Fragment aus etwa 800 bp wurde mit dem Hhai-HindIII-Fragment aus etwa 350 bp ligasiert. Das resultierende HindIII-Fragment aus 1061 bp wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in PBR322 kloniert, (PGAP-347), wonach die Sequenz bestimmt wurde (siehe Fig. 2).
- Ein Plasmidvektor (pHBS-56GAP347/33) für die Expression des HBV-Oberflächenantigens in Hefe wurde gemäß der Darstellung in Fig. 3 unter Verwendung des GAPDH-Promotorfragments konstruiert.
- Die vollständige Spaltung von PGAP-347 mit SphI, auf die die partielle Spaltung mit HindIII folgte, ergab ein SphI- HindIII-Fragment mit einer Größe von etwa 1700 bp, das etwa 1060 bp GAPDH-Promotor und etwa 530 bp pBR322 enthielt. Das SphI-HindIII-GAPDH-Promotorfragment aus 1700 bp wurde mit dem HindIII-HindIII-Fragment aus 840 bp (enthält die das HBsAG codierende Region, 26 Basen der nicht codierenden 5'-Region und 128 bp der nicht codierenden 3'-Region, erhalten aus pHBS-56) und dann mit dem HindIII-Sphi-Fragment aus 350 bp, das die ADH-1-Terminationsregion (isoliert aus pHBS-56) enthält, ligasiert. Das Sphi-Fragment aus 2900 bp (Kassette) wurde isoliert und in pHBS-56 kloniert, das zuvor mit SphI gespalten worden war. Das Plasmid pHBS-56 (Hinterlegungsnummer ATCC 40047) ist in einer anderen Patentanmeldung (europäische Anmeldung Nr. 82 401 473.2, Veröffentlichungsnummer EP-A-072 318, der Regents of the University of California) beschrieben worden und enthält das gesamte 2-Mikron- Plasmid zusätzlich zu einer Region mit dem leu2-Gen von Hefe und der Amp-Resistenzstelle von pBR322. Das resultierende Plasmid (pHBS-56GAP347/33), in dem der Promotor, das Gen und die Terminationsregionen in der richtigen Orientierung enthalten sind, wurde isoliert und zur Transformation des Hefestamins AB1O2 (MATA, pep 4-3, leu 2-3 leu 2-112, ura 3-52, his 4-580, cirº) und des Stamms 2150-2-3 (MATA, adel, leu2- 04, cirº) verwendet. Der Stamm AB102 wird aus SF657-9c durch Entfernen der 2-Mikron-Plasmide gewonnen. Der Stamm 2150-2-3 stammt aus der Sammlung von Dr. Leland Hartwell von der University of Washington.
- 100-ml-Kulturen des Stamms AB102, der das Plasmid pHBS56- 347/33 enthält, wurden gezüchtet, bis die optische Dichte bei 650 nm 1,0 betrug. Zelifreie Lysate wurden durch Rühren mit Glaskügeichen und Entfernen der Zellabfälle durch Zentrifugieren hergestellt. Das HBSAG wurde durch den Abbott- AusriaII-Radioimmunoassay gemessen, die Proteinkonzentration wurde durch Färben mit Coomassie Blau bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Sie zeigen, daß der GAPDH-Promotor bei der Expression des Proteinprodukts in Hefe etwa fünfmal wirksamer ist als der ADH-1-Promotor. Tabelle 1: Synthese von HBSAG in Hefe (a) Kontrollexperiment mit pHBS-56 (ADH-I-Promotor) Protein Spez. Aktivität (b) Expression in pHBS-56GAP347/33 (GAPDH-Promotor) Exp. Nr. Protein Spez. Aktivität
- Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn der Hefestamm AB102 durch den Hefestamm 2150-2-3 ersetzt und Beispiel 3 wiederholt wurde.
Claims (10)
1. Verfahren zur Expression eines codierenden DNA-Segments,
das das Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder einen Teil
davon codiert, in Hefe, das folgende Schritte umfaßt:
a) Insertion des codierenden Segments in einen Hefe-
Expressionsvektor unter Bildung eines das codierende
Segment enthaltenden Expressionsvektors und
b) Transformation der Hefezellen mit dem das codierende
Segment enthaltenden Expressionsvektor,
wobei der Hefe-Expressionsvektor ein Promotor-Segment
enthält, das von einem
Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor von Hefe abgeleitet ist und die in
Figur 2 dargestellte Sequenz besitzt und drei oder eine
geringere Anzahl Codons vom 5'-Ende der
Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase von Hefe aufweist, wobei sich das
Promotor-Segment in der für die Transcription des
codierenden Segments richtigen Orientierung befindet.
2. Verfahren zur Herstellung des
Hepatitis-B-Oberflächenantigens oder eines Teils davon, das folgende Schritte
umfaßt:
a) Kultivieren von Hefezellen, die mit einem
Expressionsvektor, der ein codierendes Segment enthält,
transformiert sind, der ein codierendes DNA-Segment
aufweist, das das Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder
einen Teil davon codiert, und
b) Isolieren des Hepatitis-B-Oberflächenantigens oder
eines Teils davon,
wobei der das codierende Segment enthaltende
Expressionsvektor ein Promotor-Segment enthält, das von einem
Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor von Hefe
abgeleitet ist und die in Figur 2 dargestellte Sequenz
besitzt und drei oder eine geringere Anzahl Codons vom
5'-Ende der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase von
Hefe aufweist, wobei sich das Promotor-Segment in der für
die Transcription des codierenden Segments richtigen
Orientierung befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der
Hefe-Expressionsvektor ferner einen Terminator enthält, der am
3'-Ende des eingesetzten codierenden DNA-Segments
angebunden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Terminator den Hefe-
Alkoholdehydrogenase-I-Terminator enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Terminator den Hefe-
GAPDH-Terminator enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Terminator den Hefe-
PyK-Terminator enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
Hefe-Expressionsvektor ferner einen Hefe-
Replikationsursprung enthält und befähigt ist, sich in
einer Hefezelle zu replizieren.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der
Hefe-Expressionsvektor ferner einen Bakterien-
Replikationsursprung enthält und befähigt ist, sich in
einer Bakterienzelle zu replizieren.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der
Hefeexpressionsvektor ferner einen Replikationsursprung aus
einer Hefezelle und einen Replikationsursprung aus einer
Bakterienzelle enthält und befähigt ist, sich in
Hefezeilen sowie in Bakterienzellen zu replizieren.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der
Hefe-Expressionsvektor ferner Hefe-2-Mikron-Plasmid-DNS
oder einen Teil davon enthält.
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