JPH0724594B2 - 酵母発現ベクターの発現方法 - Google Patents
酵母発現ベクターの発現方法Info
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- JPH0724594B2 JPH0724594B2 JP4200091A JP20009192A JPH0724594B2 JP H0724594 B2 JPH0724594 B2 JP H0724594B2 JP 4200091 A JP4200091 A JP 4200091A JP 20009192 A JP20009192 A JP 20009192A JP H0724594 B2 JPH0724594 B2 JP H0724594B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C07K—PEPTIDES
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- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
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Description
【0001】
【発明の背景】微生物系において外来性遺伝子を最大に
発現せしめるためには一般に、発現ベクター中に相同性
制御要素を用いるのが有利である。発現の効率(生成物
の生産)は使用するプロモーターの強力さの関数であ
り、それに比例すると信じられる。さらに、実験者のコ
ントロールの下での栄養的因子による遺伝子発現の制御
はさらに有用な操作手段を提供する。酵母の解糖系酵素
の遺伝子、例えばグリセルアルデヒド−3−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ〔glyceraldehyde−
3−phosphatedehydrogenase
(GAPDH)〕及びピルベートキナーゼ〔pyrva
te kinase(PyK)〕についてコードする遺
伝子は上記の有用な性質、すなわち高レベルの発現(非
常に効率的なプロモーターが推定される)及び増殖培地
の成分による制御に対する感受性を有する。例えば、G
APDHは、市販のパン酵母の乾燥重量の5%という大
きな部分を占めることができる〔Krebs,E.
G.,J.Biol.Chem.(1953)200:
471〕。さらに、これらの酵素は非常に誘導されやす
い。例えば、酵母の培養が酢酸塩での増殖からグルコー
スでの増殖に移行した場合、GAPDHの活性は培地中
の糖の濃度に比例して200倍まで増加する〔Mait
ra P.K.及びLobo Z.,J.Biol.C
hem.(1971)246:475〕。これらの結果
は、これらの遺伝子の転写機構が、これらの遺伝子の
5′非コードフランク領域中に存在するDNA配列の関
与により高度に制御されることを示唆する。
発現せしめるためには一般に、発現ベクター中に相同性
制御要素を用いるのが有利である。発現の効率(生成物
の生産)は使用するプロモーターの強力さの関数であ
り、それに比例すると信じられる。さらに、実験者のコ
ントロールの下での栄養的因子による遺伝子発現の制御
はさらに有用な操作手段を提供する。酵母の解糖系酵素
の遺伝子、例えばグリセルアルデヒド−3−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ〔glyceraldehyde−
3−phosphatedehydrogenase
(GAPDH)〕及びピルベートキナーゼ〔pyrva
te kinase(PyK)〕についてコードする遺
伝子は上記の有用な性質、すなわち高レベルの発現(非
常に効率的なプロモーターが推定される)及び増殖培地
の成分による制御に対する感受性を有する。例えば、G
APDHは、市販のパン酵母の乾燥重量の5%という大
きな部分を占めることができる〔Krebs,E.
G.,J.Biol.Chem.(1953)200:
471〕。さらに、これらの酵素は非常に誘導されやす
い。例えば、酵母の培養が酢酸塩での増殖からグルコー
スでの増殖に移行した場合、GAPDHの活性は培地中
の糖の濃度に比例して200倍まで増加する〔Mait
ra P.K.及びLobo Z.,J.Biol.C
hem.(1971)246:475〕。これらの結果
は、これらの遺伝子の転写機構が、これらの遺伝子の
5′非コードフランク領域中に存在するDNA配列の関
与により高度に制御されることを示唆する。
【0002】この発明は、制御可能な酵母遺伝子GAP
DH及びPyXの5′非コード領域に対応するDNA断
片の分離、構造、及び酵母発現プラスミド中での好結果
を伴う使用に関する。強力な転写促進(promoti
ng)活性を有するDNA配列を含有するこれらの断片
を「プロモーター」と称する。このプロモーターは、そ
の転写制御の下で外来性遺伝子によりコードされる蛋白
質の商業的大量生産のためのDNAベクターの典型的な
成分である。
DH及びPyXの5′非コード領域に対応するDNA断
片の分離、構造、及び酵母発現プラスミド中での好結果
を伴う使用に関する。強力な転写促進(promoti
ng)活性を有するDNA配列を含有するこれらの断片
を「プロモーター」と称する。このプロモーターは、そ
の転写制御の下で外来性遺伝子によりコードされる蛋白
質の商業的大量生産のためのDNAベクターの典型的な
成分である。
【0003】さらに、この発明は、プロモーター−外来
性遺伝子−ターミネーターの「カセット」を構成する適
当なターミネーターをさらに含んで成る酵母発現ベクタ
ーに関する。酵母中で外来性DNAを発現しようとする
初期の試みは失敗した〔Beggs,J.D.等、Na
ture(1980)283:285〕。この報告にお
いては、ヘモグロビンDNA(それ自体のプロモーター
と共に挿入された)は転写されたが、このRNAがスプ
ライス(splice)されなかった。この結果につい
て種々の説明が可能である。すなわち、転写開始位置の
不正確及び/又は介存配列(イントロン)をスプライシ
ングするための酵母の能力の不足である。
性遺伝子−ターミネーターの「カセット」を構成する適
当なターミネーターをさらに含んで成る酵母発現ベクタ
ーに関する。酵母中で外来性DNAを発現しようとする
初期の試みは失敗した〔Beggs,J.D.等、Na
ture(1980)283:285〕。この報告にお
いては、ヘモグロビンDNA(それ自体のプロモーター
と共に挿入された)は転写されたが、このRNAがスプ
ライス(splice)されなかった。この結果につい
て種々の説明が可能である。すなわち、転写開始位置の
不正確及び/又は介存配列(イントロン)をスプライシ
ングするための酵母の能力の不足である。
【0004】酵母の3種類のGAPDH遺伝子がクロー
ニングされている〔Holland,M.J.等、Ba
sic Life Science(1981)19,
291〕が、これらのプロモーターは組換DNA法によ
る酵母中での発現系を構成するために使用されていな
い。PyK遺伝子もすでにクローニングされているが、
遺伝的補完(complementation)によっ
てのみである(構造的研究は行われていない)〔カワサ
キ G.及びFraenel D.G.,Bioche
m.Biophys.Res.Comn.(1982)
108;1107〕。他の酵母プロモーター、例えばア
ルコールデヒドロゲナーゼI(alcohol deh
ydrogenase I)のプロモーター〔Vale
nzuela,P.等、Nature(1982)29
8:347、及びHityeman,R.A.等Nat
ure(1981)293:717〕、並びにホスホグ
セレートキナーゼ(Phosphoglycerate
Kinase)〔Tuite,M.F.等、EMBO
J.(1982)1:603、及びHitzema
n,R.A.等、Science(1983)219:
620〕が、酵母における発現のために外来性遺伝子に
連結されているが、ターミネーターは使用されなかっ
た。この発明は、酵母発現系のための新規なプロモータ
ーを提供し、そして強化された発現を伴う非常に効果的
なプロモーターの利点と適切に連結されたターミネータ
ーの利点を結びつける。
ニングされている〔Holland,M.J.等、Ba
sic Life Science(1981)19,
291〕が、これらのプロモーターは組換DNA法によ
る酵母中での発現系を構成するために使用されていな
い。PyK遺伝子もすでにクローニングされているが、
遺伝的補完(complementation)によっ
てのみである(構造的研究は行われていない)〔カワサ
キ G.及びFraenel D.G.,Bioche
m.Biophys.Res.Comn.(1982)
108;1107〕。他の酵母プロモーター、例えばア
ルコールデヒドロゲナーゼI(alcohol deh
ydrogenase I)のプロモーター〔Vale
nzuela,P.等、Nature(1982)29
8:347、及びHityeman,R.A.等Nat
ure(1981)293:717〕、並びにホスホグ
セレートキナーゼ(Phosphoglycerate
Kinase)〔Tuite,M.F.等、EMBO
J.(1982)1:603、及びHitzema
n,R.A.等、Science(1983)219:
620〕が、酵母における発現のために外来性遺伝子に
連結されているが、ターミネーターは使用されなかっ
た。この発明は、酵母発現系のための新規なプロモータ
ーを提供し、そして強化された発現を伴う非常に効果的
なプロモーターの利点と適切に連結されたターミネータ
ーの利点を結びつける。
【0005】
【発明の要約】この発明は、酵母GAPDEプロモータ
ー又は酵母PyKプロモーターの転写制御の下にある外
来性DNA断片、例えば肝炎Bウイルス(HBV)表面
抗原(HBsAg)についてコードするDNA断片を含
んでなる酵母発現ベクターに関する。ターミネーターも
又、適切に連結することができる。この発現ベクターは
典型的には酵母複製開始点及び細菌複製開始点を有し、
そしていずれのタイプの細胞中でも複製することができ
る。この発現ベクターは、酵母細胞を形質転換するのに
使用された場合、外来性DNAのセグメントによってコ
ードされる蛋白質の実質的な量を生成せしめるであろ
う。
ー又は酵母PyKプロモーターの転写制御の下にある外
来性DNA断片、例えば肝炎Bウイルス(HBV)表面
抗原(HBsAg)についてコードするDNA断片を含
んでなる酵母発現ベクターに関する。ターミネーターも
又、適切に連結することができる。この発現ベクターは
典型的には酵母複製開始点及び細菌複製開始点を有し、
そしていずれのタイプの細胞中でも複製することができ
る。この発現ベクターは、酵母細胞を形質転換するのに
使用された場合、外来性DNAのセグメントによってコ
ードされる蛋白質の実質的な量を生成せしめるであろ
う。
【0006】
【発明の具体的な記載】本来、酵母発現プラスミドは次
の点を含む特定の利点を有する。酵母は、当業界におい
てよく知られている方法により、商業的生産のための大
規模培養において増殖することができる。これに対し
て、細胞は大規模培養において、しばしば、「ファージ
・アウト」(ファージによる溶菌)の問題に遭遇する。
酵母はさらに、哺乳動物細胞と同様に新たに合成された
蛋白質に炭水化物を付加する能力を有するようである。
細胞はこの能力を有しない。今や、cDNA配列を容易
に利用することができ、イントロンを有する発現ベクタ
ーの問題は容易に回避される。
の点を含む特定の利点を有する。酵母は、当業界におい
てよく知られている方法により、商業的生産のための大
規模培養において増殖することができる。これに対し
て、細胞は大規模培養において、しばしば、「ファージ
・アウト」(ファージによる溶菌)の問題に遭遇する。
酵母はさらに、哺乳動物細胞と同様に新たに合成された
蛋白質に炭水化物を付加する能力を有するようである。
細胞はこの能力を有しない。今や、cDNA配列を容易
に利用することができ、イントロンを有する発現ベクタ
ーの問題は容易に回避される。
【0007】この発明のベクターは、非常に高い効率を
有するプロモーターを含む。ここで、プロモーターは、
隣接するDNAセグメントの転写を開始するために機能
することができるDNAセグメントとして定義される。
転写とは、プロモーター領域に隣接するDNAの1本鎖
に相補的なRNA(ここでは、メッセンジャーRNA、
すなわちmRNA)の合成である。真核生物において
は、メッセンジャーRNA合成はRNAポリメラーゼI
Iと称する酵素により触媒される。プロモーター機能の
最少必須要素は次の通りである。すなわち、転写開始の
ための出発点を提供すること、及びこの出発部位の近く
にRNAポリメラーゼIIの結合部位を提供しメッセン
ジャーRNA合成のための鋳型として適当なDNA鎖の
選択を可能にすることである。さらに、真核性プロモー
ターは、そのコントロールの下でコードセグメントの転
写の相対的効率を制御するために機能する。活性プロモ
ーターは隣接DNAコードセグメントの鎖に相補的なm
RNAの比較的大量の合成を惹起するプロモーターであ
る。
有するプロモーターを含む。ここで、プロモーターは、
隣接するDNAセグメントの転写を開始するために機能
することができるDNAセグメントとして定義される。
転写とは、プロモーター領域に隣接するDNAの1本鎖
に相補的なRNA(ここでは、メッセンジャーRNA、
すなわちmRNA)の合成である。真核生物において
は、メッセンジャーRNA合成はRNAポリメラーゼI
Iと称する酵素により触媒される。プロモーター機能の
最少必須要素は次の通りである。すなわち、転写開始の
ための出発点を提供すること、及びこの出発部位の近く
にRNAポリメラーゼIIの結合部位を提供しメッセン
ジャーRNA合成のための鋳型として適当なDNA鎖の
選択を可能にすることである。さらに、真核性プロモー
ターは、そのコントロールの下でコードセグメントの転
写の相対的効率を制御するために機能する。活性プロモ
ーターは隣接DNAコードセグメントの鎖に相補的なm
RNAの比較的大量の合成を惹起するプロモーターであ
る。
【0008】プロモーターの機能の構造的相互関係は明
確には確立されていない。プロモーターセグメントは通
常、ある構造遺伝子の5′末端に隣接して存在する領域
としての性質において同定される。(遺伝子の5′末端
及び3′末端は、これから転写されたmRNAの対応す
るそれぞれの末端を示し、そしてコードされた蛋白質の
NHZ−末端及び−COOHにそれぞれ対応するものと
理解される。)色々な種からの色々な遺伝子のためのプ
ロモーターのヌクレオチド配列の比較から、これらの間
で共通な、ヌクレオチド配列の類似性を有する非常に短
い領域が見出されている。これらの領域の内特に顕著な
ものは、「TATAボックス」、すなわち転写開始部位
から一般に約70〜230ヌクレオチド上流に位置し、
一般に類似するTATAA配列を有する約5〜10ヌク
レオチドのセグメントである。構造的比較を概観するた
めには、Breathnach R.及びChambo
nP.,Ann.Rev.of Biochem.(1
981)50:349を参照のこと。TATAボックス
は転写の開始において機能すると信じられる。
確には確立されていない。プロモーターセグメントは通
常、ある構造遺伝子の5′末端に隣接して存在する領域
としての性質において同定される。(遺伝子の5′末端
及び3′末端は、これから転写されたmRNAの対応す
るそれぞれの末端を示し、そしてコードされた蛋白質の
NHZ−末端及び−COOHにそれぞれ対応するものと
理解される。)色々な種からの色々な遺伝子のためのプ
ロモーターのヌクレオチド配列の比較から、これらの間
で共通な、ヌクレオチド配列の類似性を有する非常に短
い領域が見出されている。これらの領域の内特に顕著な
ものは、「TATAボックス」、すなわち転写開始部位
から一般に約70〜230ヌクレオチド上流に位置し、
一般に類似するTATAA配列を有する約5〜10ヌク
レオチドのセグメントである。構造的比較を概観するた
めには、Breathnach R.及びChambo
nP.,Ann.Rev.of Biochem.(1
981)50:349を参照のこと。TATAボックス
は転写の開始において機能すると信じられる。
【0009】外来性遺伝子は、プロモーターに関連する
正常な構造遺伝子由来のコドンを含有しないか又は実質
上含有しないであろう。通常、外来性遺伝子は、プロモ
ーターを含む制御領域の非コード3′末端に連結され、
制御遺伝子に天然に関連する内性遺伝子(endoge
nous gene)のN末端のアミノ酸が排除される
であろう。すなわち、外来性遺伝子に連結された場合、
制御領域に保存されるのは3コドン(9ヌクレオチド)
未満であろう。
正常な構造遺伝子由来のコドンを含有しないか又は実質
上含有しないであろう。通常、外来性遺伝子は、プロモ
ーターを含む制御領域の非コード3′末端に連結され、
制御遺伝子に天然に関連する内性遺伝子(endoge
nous gene)のN末端のアミノ酸が排除される
であろう。すなわち、外来性遺伝子に連結された場合、
制御領域に保存されるのは3コドン(9ヌクレオチド)
未満であろう。
【0010】コードセグメントの3′末端におけるター
ミネーター配列の存在により発現が強化される。この効
果は一般に原核性転写系へのrhoファクターの付加の
場合に類似しており、RNAポリメラーゼの離脱速度が
上昇し、転写の再開始速度が上昇する。ターミネーター
配列は外来性DNAセグメントの検出し得る発現には必
要でないが、これを適切に連結すれば発現が強化される
ことが理解されよう。ターミネーター領域は、プロモー
ター領域が関連するのと同一の又は異る構造遺伝子と関
連することが当然可能である。
ミネーター配列の存在により発現が強化される。この効
果は一般に原核性転写系へのrhoファクターの付加の
場合に類似しており、RNAポリメラーゼの離脱速度が
上昇し、転写の再開始速度が上昇する。ターミネーター
配列は外来性DNAセグメントの検出し得る発現には必
要でないが、これを適切に連結すれば発現が強化される
ことが理解されよう。ターミネーター領域は、プロモー
ター領域が関連するのと同一の又は異る構造遺伝子と関
連することが当然可能である。
【0011】この発明のGAPDH又はPyK構造のた
めの最も適当なDNAベクターはシャトルベクターであ
る。これらのベクターは細菌株、例えばE.コリ(Ec
oli)と酵母との間を往復(shottle)するこ
とができる。なぜならこれらのベクターは細菌複製開始
点及び酵母複製開始点を有するからである〔例えば、A
mmerer G.等、Recombinant DN
A,Proc.Third Clevelant Sy
mposium Maclomolecules(Wa
lton A.G.編)、185頁、エルゼビール、ア
ムステルダムを参照のこと〕。典型的な細菌複製開始点
は、例えばpBR322から導かれる。最も有用な酵母
複製開始点は、2ミクロンサークルとして知られる染色
体外遺伝要素に見出される。実験室株において、2ミク
ロンプラスミドDNAは細胞当り約50コピー見出さ
れ、そして安定に維持される。概観するために例えばC
urr.Topics Micro.Imn.(198
2)96:119を参照のこと。この酵母プラスミドも
配列決定されている〔Hartley,J.L.等、N
ature(1980)286:860〕。
めの最も適当なDNAベクターはシャトルベクターであ
る。これらのベクターは細菌株、例えばE.コリ(Ec
oli)と酵母との間を往復(shottle)するこ
とができる。なぜならこれらのベクターは細菌複製開始
点及び酵母複製開始点を有するからである〔例えば、A
mmerer G.等、Recombinant DN
A,Proc.Third Clevelant Sy
mposium Maclomolecules(Wa
lton A.G.編)、185頁、エルゼビール、ア
ムステルダムを参照のこと〕。典型的な細菌複製開始点
は、例えばpBR322から導かれる。最も有用な酵母
複製開始点は、2ミクロンサークルとして知られる染色
体外遺伝要素に見出される。実験室株において、2ミク
ロンプラスミドDNAは細胞当り約50コピー見出さ
れ、そして安定に維持される。概観するために例えばC
urr.Topics Micro.Imn.(198
2)96:119を参照のこと。この酵母プラスミドも
配列決定されている〔Hartley,J.L.等、N
ature(1980)286:860〕。
【0012】この発明の構成において使用されるプラス
ミド及び宿主細胞の代表例がアメリカン・タイプ・カル
チュアー・コレクション(ATCC)に寄託されてい
る。プラスミドpPyK9.1.1.並びに酵母細胞形
質転換体2150−2−3/pHBS−56 GAP3
47/33、及び2150−2−3/pHBs56Py
Kが、1983年2月18日に寄託され、それぞれAT
CC受け入れ番号(Accession No)400
61,20665及び20666が与えられた。
ミド及び宿主細胞の代表例がアメリカン・タイプ・カル
チュアー・コレクション(ATCC)に寄託されてい
る。プラスミドpPyK9.1.1.並びに酵母細胞形
質転換体2150−2−3/pHBS−56 GAP3
47/33、及び2150−2−3/pHBs56Py
Kが、1983年2月18日に寄託され、それぞれAT
CC受け入れ番号(Accession No)400
61,20665及び20666が与えられた。
【0013】次に記載する例において、多くの技法、反
応及び分離方法は当業界においてはすでによく知られて
いる。特にことわらない限りすべての酵素は1又は複数
の商業的供給源、例えばNew England Bi
olabs,ベベリー、マサチューセッツ;Colla
borative Research,ウアルサム、マ
サチューセッツ;Miles Laboratorie
s,エルクハート、インディアナ;Boehringe
r BiochemicalS,Inc,インディアナ
ポリス、インディアナ;及びBethesda Res
earch Laboratories,ロックビレ、
メイランドから入手することができる。
応及び分離方法は当業界においてはすでによく知られて
いる。特にことわらない限りすべての酵素は1又は複数
の商業的供給源、例えばNew England Bi
olabs,ベベリー、マサチューセッツ;Colla
borative Research,ウアルサム、マ
サチューセッツ;Miles Laboratorie
s,エルクハート、インディアナ;Boehringe
r BiochemicalS,Inc,インディアナ
ポリス、インディアナ;及びBethesda Res
earch Laboratories,ロックビレ、
メイランドから入手することができる。
【0014】制限酵素消化のための緩衝液及び反応条件
は、特にことわらない限り各酵素の製造者の推奨に従っ
て使用した。他の酵素反応、ゲル電気泳動分離及びE.
コリの形質転換は、Methods in Enzym
ology(1979)68に記載されている。酵母プ
ロトプラストの形質転換は本質上、Beggs,Nat
ure(1978)275:104に記戟されている方
法により行うことができる。
は、特にことわらない限り各酵素の製造者の推奨に従っ
て使用した。他の酵素反応、ゲル電気泳動分離及びE.
コリの形質転換は、Methods in Enzym
ology(1979)68に記載されている。酵母プ
ロトプラストの形質転換は本質上、Beggs,Nat
ure(1978)275:104に記戟されている方
法により行うことができる。
【0015】形質転換に有用なE.コリ株には、X17
76;K12ストレイン294(ATCC No.31
446);RR1及びHB101が含まれる。遺伝子型
(a,ade2,ade6,leu2,lysl,tr
pl,canl)を有する酵母株XV610−8c、及
び遺伝子型(Leu2,Trp1,His4,CYC1
−1CYP3−1)を有するGM−3C−2株〔Fay
e,G.等、Proc.Nat1.Acad.Sci.
(1981)78:2258〕を酵母の形質転換に典型
的に使用することができる。しかしながら、実質上すべ
ての酵母菌株が形質転換のために有用であると理解すべ
きである。細胞は、Miller J.H.Exper
iments in Molecular Genet
ics,コールド・スプリングハーバー・ラボラトリ
ー,コールスプリングハーバー,ニューヨーク(197
2)に記載されている方法に従って増殖せしめ、そして
選択することができる。酵母は次の培地の増殖せしめる
ことができる。YEPD培地は1(W/V)%の酵母エ
キストラクト、2(W/V)%のペプトン、及びグルコ
ースを含有し、プレート培地の場合にはさらに3(W/
V)%の寒天を含有する。YNB+CAA培地は1l中
6.7gのイーストニトロゲンベース(yeast n
itrogen base)(ディフコ・ラボラトリー
ス,ミネアポリス,ミネソタ)、10mgのアデニン、
10mgのウラシル、5gのカサミノ酸(CAA)(デ
ィフコ)及び20gのグルコースを含有し、プレート培
地の場合にはさらに30gの寒天を含有する。トリプト
ファン栄養要求性の選択は、形質転換される株のトリプ
トファン以外のすべての増殖要求因子が補完された、
6.7gのイーストニトロゲンベース(アミノ酸不含)
を含有するプレート上で行うことができる。
76;K12ストレイン294(ATCC No.31
446);RR1及びHB101が含まれる。遺伝子型
(a,ade2,ade6,leu2,lysl,tr
pl,canl)を有する酵母株XV610−8c、及
び遺伝子型(Leu2,Trp1,His4,CYC1
−1CYP3−1)を有するGM−3C−2株〔Fay
e,G.等、Proc.Nat1.Acad.Sci.
(1981)78:2258〕を酵母の形質転換に典型
的に使用することができる。しかしながら、実質上すべ
ての酵母菌株が形質転換のために有用であると理解すべ
きである。細胞は、Miller J.H.Exper
iments in Molecular Genet
ics,コールド・スプリングハーバー・ラボラトリ
ー,コールスプリングハーバー,ニューヨーク(197
2)に記載されている方法に従って増殖せしめ、そして
選択することができる。酵母は次の培地の増殖せしめる
ことができる。YEPD培地は1(W/V)%の酵母エ
キストラクト、2(W/V)%のペプトン、及びグルコ
ースを含有し、プレート培地の場合にはさらに3(W/
V)%の寒天を含有する。YNB+CAA培地は1l中
6.7gのイーストニトロゲンベース(yeast n
itrogen base)(ディフコ・ラボラトリー
ス,ミネアポリス,ミネソタ)、10mgのアデニン、
10mgのウラシル、5gのカサミノ酸(CAA)(デ
ィフコ)及び20gのグルコースを含有し、プレート培
地の場合にはさらに30gの寒天を含有する。トリプト
ファン栄養要求性の選択は、形質転換される株のトリプ
トファン以外のすべての増殖要求因子が補完された、
6.7gのイーストニトロゲンベース(アミノ酸不含)
を含有するプレート上で行うことができる。
【0016】例1.酵母グリセルアルデヒド−3−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子のクロ
ーニング 酵母GAPDHコード配列を含有する相補的DNA(c
DNA)を次のようにして調製した。
フェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)遺伝子のクロ
ーニング 酵母GAPDHコード配列を含有する相補的DNA(c
DNA)を次のようにして調製した。
【0017】酵母A364A株からポリA+RNAを分
離した。AMV逆転写酵素(revarse tran
scriptase)及びE.コリDNAポリメラーゼ
Iを用いて2重鎖cDNAを合成した。デオキシヌクレ
オチドターミナルトランスフェラーゼ(deoxynu
cleotide terminal transfe
rase)を用いて2重鎖cDNA分子にポリ−dc−
ティルを付加した。ポリ−dc−ティルを付加したcD
NAをポリ−dG−ティルを付加したpBR322にア
ニーリングし、そしてこれを用いてE.コリHB101
を形質転換した。1000個の形質転換体を、ラベルさ
れたポリA+RNAへのコロニーハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そしてサブセットを、制限
酵素マッピング及びDNA配列決定によりさらに試験し
た。集団から、GAPDH配列を含有する3個のコロニ
ーを分離した。1つのクローン(PcGAP−9)が約
1200塩基対(bp)の挿入部を含有しており、これ
をその後の研究に使用した。
離した。AMV逆転写酵素(revarse tran
scriptase)及びE.コリDNAポリメラーゼ
Iを用いて2重鎖cDNAを合成した。デオキシヌクレ
オチドターミナルトランスフェラーゼ(deoxynu
cleotide terminal transfe
rase)を用いて2重鎖cDNA分子にポリ−dc−
ティルを付加した。ポリ−dc−ティルを付加したcD
NAをポリ−dG−ティルを付加したpBR322にア
ニーリングし、そしてこれを用いてE.コリHB101
を形質転換した。1000個の形質転換体を、ラベルさ
れたポリA+RNAへのコロニーハイブリダイゼーショ
ンによりスクリーニングし、そしてサブセットを、制限
酵素マッピング及びDNA配列決定によりさらに試験し
た。集団から、GAPDH配列を含有する3個のコロニ
ーを分離した。1つのクローン(PcGAP−9)が約
1200塩基対(bp)の挿入部を含有しており、これ
をその後の研究に使用した。
【0018】Blattner.F.R.等、Scie
nce(1977)196:161〜169に従って、
全酵母DNAを制限酵素Sau3Aにより部分消化した
後に得られた断片をλファージ・シャロン(Charo
n)28に挿入することによって酵母遺伝子ライブラリ
ーを調製した。GAPDAコード配列を含有する複数の
断片を、pcGAP−9由来のラベルDNAを用いてフ
ァージライブラリーをスクリーニングすることにより分
離した。これらのクローンの内の1つの酵母GAPDH
遺伝子を、2.1kb HindIII断片(pGAP
−1)、(図1参照)として、又は3.5kb Bam
HI断片(pGAP−2)としてpBR322でサブク
ローニングした。これらのクローンからGAPDHプロ
モーター活性断片を分離した。約800bpのHind
III−HhaI断片を約350bpのHhaI−Hi
ndIII断片に連結した。得られた1061bp H
indIII断片をゲル電気泳動により分離し、そして
pBR322中でクローニングし(pGAP−34
7)、そして配列を決定した(図2参照)。
nce(1977)196:161〜169に従って、
全酵母DNAを制限酵素Sau3Aにより部分消化した
後に得られた断片をλファージ・シャロン(Charo
n)28に挿入することによって酵母遺伝子ライブラリ
ーを調製した。GAPDAコード配列を含有する複数の
断片を、pcGAP−9由来のラベルDNAを用いてフ
ァージライブラリーをスクリーニングすることにより分
離した。これらのクローンの内の1つの酵母GAPDH
遺伝子を、2.1kb HindIII断片(pGAP
−1)、(図1参照)として、又は3.5kb Bam
HI断片(pGAP−2)としてpBR322でサブク
ローニングした。これらのクローンからGAPDHプロ
モーター活性断片を分離した。約800bpのHind
III−HhaI断片を約350bpのHhaI−Hi
ndIII断片に連結した。得られた1061bp H
indIII断片をゲル電気泳動により分離し、そして
pBR322中でクローニングし(pGAP−34
7)、そして配列を決定した(図2参照)。
【0019】例2.HBsAgの発現において活性を有
するGAPDHプロモーターを含有する酵母ベクターの
構成 酵母中でHBV表面抗原を発現するための、GAPDH
プロモーター断片を用いるプラスミドベクター(pHB
S−56GAP347/33)を、図3に示すようにし
て構成した。
するGAPDHプロモーターを含有する酵母ベクターの
構成 酵母中でHBV表面抗原を発現するための、GAPDH
プロモーター断片を用いるプラスミドベクター(pHB
S−56GAP347/33)を、図3に示すようにし
て構成した。
【0020】pGAP−347をSphIにより全消化
し、次にHindIIIにより部分消化することによ
り、GAPDHプロモーターの約1060bpとpBR
322の約530bpを有する約1700bpのSph
I−HindIII断片を得た。この1700bpのS
phI−HindIII GAPDHプロモーター断片
を、840bpのHindIII−HindIII断片
(HBsAgコード領域、26塩基の5′非コード領域
及び128bpの3′非コード領域を含有し、pHBS
−56から得られたもの)に連結し、そして次に350
bpのHindIII−SphI断片(pHBS−56
から分離され、ADH−1終結領域を含有する)と連結
した。2900bpのSphI断片(カセット)を分離
し、そしてあらかじめSphIにより消化されたpHB
S−56にクローニングした。プラスミドpHBS−5
6(ATCC受入No.40047)は係属中の米国特
許出願No.402,330,1982年7月27日出
願、「Synthesisof Human Viru
s Antigens by Yeast」に記載され
ており、そして酵母leu2遺伝子及びpBR322の
amp耐性座を伴う領域のほかに完全な2ミクロンプラ
スミドを含有する。プロモーター、遺伝子及び終結領域
が正しく方向付けられている得られたプラスミド(pH
BS−56GAP347/33)を分離し、そしてこれ
を用いて酵母AB102株(MATa,pep4−3,
leu2−3,leu2−112,ura3−52,h
is4−580,cir°)、又は2150−2−3株
(MATa,adel,leu2−04,cir°)を
形質転換した。AB102株は2ミクロンプラスミドの
キュアリング(curing)によりSF657−9c
から誘導されたものである。2150−2−3株はワシ
ントン大学におけるLeland Hartwell氏
のコレクションに由来する。
し、次にHindIIIにより部分消化することによ
り、GAPDHプロモーターの約1060bpとpBR
322の約530bpを有する約1700bpのSph
I−HindIII断片を得た。この1700bpのS
phI−HindIII GAPDHプロモーター断片
を、840bpのHindIII−HindIII断片
(HBsAgコード領域、26塩基の5′非コード領域
及び128bpの3′非コード領域を含有し、pHBS
−56から得られたもの)に連結し、そして次に350
bpのHindIII−SphI断片(pHBS−56
から分離され、ADH−1終結領域を含有する)と連結
した。2900bpのSphI断片(カセット)を分離
し、そしてあらかじめSphIにより消化されたpHB
S−56にクローニングした。プラスミドpHBS−5
6(ATCC受入No.40047)は係属中の米国特
許出願No.402,330,1982年7月27日出
願、「Synthesisof Human Viru
s Antigens by Yeast」に記載され
ており、そして酵母leu2遺伝子及びpBR322の
amp耐性座を伴う領域のほかに完全な2ミクロンプラ
スミドを含有する。プロモーター、遺伝子及び終結領域
が正しく方向付けられている得られたプラスミド(pH
BS−56GAP347/33)を分離し、そしてこれ
を用いて酵母AB102株(MATa,pep4−3,
leu2−3,leu2−112,ura3−52,h
is4−580,cir°)、又は2150−2−3株
(MATa,adel,leu2−04,cir°)を
形質転換した。AB102株は2ミクロンプラスミドの
キュアリング(curing)によりSF657−9c
から誘導されたものである。2150−2−3株はワシ
ントン大学におけるLeland Hartwell氏
のコレクションに由来する。
【0021】例3.酵母中、GAPDHプロモーターの
コントロール下でのHBsAgの合成(プラスミドpH
BS−56GAP347/33) プラスミドpHBS56−347/33を含有するAB
102株の培養物100mlを、650nmにおける光
学濃度が1になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共
に攪拌し、そして遠心分離によって細胞片を除去するこ
とにより無細胞溶解物を調製した。HBsAgをアボッ
ト アウスリアII(Abbott Ausria I
I)ラジオイムノ アッセイにより測定し、そして蛋白
質濃度をクーマシーブルー(Coomassie bl
ue)結合法により測定した。結果を第1表に示す。こ
の結果は、GAPDHプロモーターが、酵母における蛋
白質の発現のためにADH−1プロモーターに比べて約
5倍効果的であることを示している。
コントロール下でのHBsAgの合成(プラスミドpH
BS−56GAP347/33) プラスミドpHBS56−347/33を含有するAB
102株の培養物100mlを、650nmにおける光
学濃度が1になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共
に攪拌し、そして遠心分離によって細胞片を除去するこ
とにより無細胞溶解物を調製した。HBsAgをアボッ
ト アウスリアII(Abbott Ausria I
I)ラジオイムノ アッセイにより測定し、そして蛋白
質濃度をクーマシーブルー(Coomassie bl
ue)結合法により測定した。結果を第1表に示す。こ
の結果は、GAPDHプロモーターが、酵母における蛋
白質の発現のためにADH−1プロモーターに比べて約
5倍効果的であることを示している。
【0022】 酵母AB102株の代りに酵母2150−2−3株を使
用し例3を反復することにより同様の結果が得られた。
用し例3を反復することにより同様の結果が得られた。
【0023】例4.酵母ピルベートキナーゼ遺伝子のク
ローニング ピルベートキナーゼ遺伝子を補完(complemen
tation)によりクローニングした。酵母ピルベー
トキナーゼマイナス変異株を、野性型酵母ゲノム性DN
Aを含有する組換YEp24プラスミドのプールにより
形質転換した。酵母S 288C株(遺伝子型:SUC
2,mal,gal2,CUP1)、及びPyK1−5
株(遺伝子型:a,ade1,leu1,met14,
ura3,PyK1−5)をカリホルニア大学(バー
クレー)、生物物理学部(Department of
Biophysics)、酵母遺伝子貯蔵センター
(Yeast Genetic Stock Cent
er)から得た。使用した酵母遺伝子バンクは、S28
8C株由来の全DNAのSau3A部分分解物を「シャ
トル」ベクターYEp24のBamHI部位にクローニ
ングしたものから成る。ベクターYEp24は、細菌に
おける選択及び増殖のためのpBR322配列、酵母に
おける選択のための酵母URA3遺伝子、及び酵母にお
けるプラスミドの複製及び分離(Segregatio
n)を保証するための酵母2μサークルのEcoRI断
片を含有する。このプールは、全酵母ゲノムを代表する
のに十分な独立の組換プラスミドを含む。
ローニング ピルベートキナーゼ遺伝子を補完(complemen
tation)によりクローニングした。酵母ピルベー
トキナーゼマイナス変異株を、野性型酵母ゲノム性DN
Aを含有する組換YEp24プラスミドのプールにより
形質転換した。酵母S 288C株(遺伝子型:SUC
2,mal,gal2,CUP1)、及びPyK1−5
株(遺伝子型:a,ade1,leu1,met14,
ura3,PyK1−5)をカリホルニア大学(バー
クレー)、生物物理学部(Department of
Biophysics)、酵母遺伝子貯蔵センター
(Yeast Genetic Stock Cent
er)から得た。使用した酵母遺伝子バンクは、S28
8C株由来の全DNAのSau3A部分分解物を「シャ
トル」ベクターYEp24のBamHI部位にクローニ
ングしたものから成る。ベクターYEp24は、細菌に
おける選択及び増殖のためのpBR322配列、酵母に
おける選択のための酵母URA3遺伝子、及び酵母にお
けるプラスミドの複製及び分離(Segregatio
n)を保証するための酵母2μサークルのEcoRI断
片を含有する。このプールは、全酵母ゲノムを代表する
のに十分な独立の組換プラスミドを含む。
【0024】PyK1−5株における変異はPyK1及
びURA3座にあるので、この株はグルコースを含有す
る培地又はウラシルを含有しない培地には増殖すること
ができない。この株をYEp24ゲノムライブラリーに
よって形質転換し、そしてウラシルを含有せずグルコー
スを含有する培地に増殖することができる形質転換体を
選択することにより、ピルベートキナーゼ遺伝子含有す
るYEp24を獲得した細胞が選択される。3.5×1
08個のPyK1−5酵母細胞を10μgのYEp24
組換体プラスミドプールDNAで形質転換することによ
り、ウラシルの非存在下及びグルコースの存在下で増殖
する5個の独立した形質転換体を得た。
びURA3座にあるので、この株はグルコースを含有す
る培地又はウラシルを含有しない培地には増殖すること
ができない。この株をYEp24ゲノムライブラリーに
よって形質転換し、そしてウラシルを含有せずグルコー
スを含有する培地に増殖することができる形質転換体を
選択することにより、ピルベートキナーゼ遺伝子含有す
るYEp24を獲得した細胞が選択される。3.5×1
08個のPyK1−5酵母細胞を10μgのYEp24
組換体プラスミドプールDNAで形質転換することによ
り、ウラシルの非存在下及びグルコースの存在下で増殖
する5個の独立した形質転換体を得た。
【0025】これらの形質転換体の挿入DNAを制限酵
素分析により特徴付けることにより、これらが重複する
DNA挿入部を含有することが示された。発明者は1つ
の形質転換体、すなわち7.0kbの挿入部(inse
rt)を含有するpPyk9.1に注目した。この挿入
部中のピルベートキナーゼ遺伝子の位置を、ピルベート
キナーゼmRNAであると予想される約1.7kbのm
RNAにハイブリダイズする挿入部特異的制限断片を決
定することにより決定した。PyK遺伝子の位置決定
を、挿入DNAの対応領域をサブクローニングし、そし
てPyK1−5変異株中の機能の補完を観察することに
より確認した。4.4kb挿入部上にPyK遺伝子を含
有するサブクローンpPyK9.1.1の配列を決定
し、そして発現プラスミドの構成において使用した。
素分析により特徴付けることにより、これらが重複する
DNA挿入部を含有することが示された。発明者は1つ
の形質転換体、すなわち7.0kbの挿入部(inse
rt)を含有するpPyk9.1に注目した。この挿入
部中のピルベートキナーゼ遺伝子の位置を、ピルベート
キナーゼmRNAであると予想される約1.7kbのm
RNAにハイブリダイズする挿入部特異的制限断片を決
定することにより決定した。PyK遺伝子の位置決定
を、挿入DNAの対応領域をサブクローニングし、そし
てPyK1−5変異株中の機能の補完を観察することに
より確認した。4.4kb挿入部上にPyK遺伝子を含
有するサブクローンpPyK9.1.1の配列を決定
し、そして発現プラスミドの構成において使用した。
【0026】例5.酵母ピルベートキナーゼ遺伝子の配
列 1つのオープンリーディングフレーム(oren re
ading frame)中の1497ヌクレオチド、
5′非翻訳領域の911ヌクレオチド、及び3′非翻訳
領域の477ヌクレオチドを含むPyK遺伝子の合計2
885ヌクレオチドの配列を決定した(図4参照)。こ
の遺伝子は499アミノ酸のポリペプチドをコードし、
単量体分子量54,608ダルトンをもたらし、これは
酵母PyKの予想値とよく一致する。ヌクレオチド配列
から誘導されるアミノ酸組成も、分離された酵母蛋白質
から測定されたそれとよく一致する。ヌクレオチド配列
からカルボキシ末端がバリンであることが予想され、こ
れは酵母ピルベートキナーゼについて見出されている。
列 1つのオープンリーディングフレーム(oren re
ading frame)中の1497ヌクレオチド、
5′非翻訳領域の911ヌクレオチド、及び3′非翻訳
領域の477ヌクレオチドを含むPyK遺伝子の合計2
885ヌクレオチドの配列を決定した(図4参照)。こ
の遺伝子は499アミノ酸のポリペプチドをコードし、
単量体分子量54,608ダルトンをもたらし、これは
酵母PyKの予想値とよく一致する。ヌクレオチド配列
から誘導されるアミノ酸組成も、分離された酵母蛋白質
から測定されたそれとよく一致する。ヌクレオチド配列
からカルボキシ末端がバリンであることが予想され、こ
れは酵母ピルベートキナーゼについて見出されている。
【0027】例6.ピルベートキナーゼプロモーター領
域を用いる酵母発現プラスミドの構成 2つの異なる構成pHBS16PyK及びpHBS56
PyKを調製した。方法の概略を図5に示す。
域を用いる酵母発現プラスミドの構成 2つの異なる構成pHBS16PyK及びpHBS56
PyKを調製した。方法の概略を図5に示す。
【0028】pBR322中にクローニングされた酵母
PyK遺伝子を含有するプラスミドpPyK9,1.1
を、xbaIにより消化し、そして突出した末端をDN
AポリメラーゼIを用いてデオキシヌクレオチドにより
満たした。この生成物をBamHIで消化することによ
り、PyKプロモーター及びPyKコード領域からの8
塩基を含有する212bpのBamHI−平滑末端断片
を最終的に分離した。この断片を、あらかじめNcoI
で消化しDNAポリメラーゼを用いて満たしそしてBa
mHIで消化したプラスミドpHBS−6〔pBR32
2中でクローニングされたHBsAg遺伝子(5′非コ
ード領域が除去されている)を含有する〕に連結した。
E.コリを形質転換した後、pHBS−6pyKを分離
した。このプラスミドは、HBsAgコード配列と同位
相で融合した3個の余分のアミノ酸をコードするコドン
ATGTCTAG CATGと共にPyKプロモーター
を含有する。pHBS−6PyKをBamHIを用いて
完全消化し、そしてEcoRIにより部分消化すること
によりHBsAg遺伝子に融合したPyKプロモーター
を含有する1750bp BamHI−EcoRI断片
を分離した。この1750bpの断片を、BamHI及
びEcoRIによりpHBS−16〔ATCC No.
40043、酵母中のアデノウイルスプロモーター(A
denovirus Promoter in Yea
st)と題して1982年11月18日に出願された米
国特許出願No.442,687に記裁されているプラ
スミド(引用によりこの明細書に組入れる)〕を消化し
た後に得られた大断片に連結し、そしてこれを用いて
E.コリを形質転換した。酵母発現プラスミドpHBS
−16PyKを得た。pHBS−16PyKを、Sph
I及びXbaIで完全消化し、そして1200bp S
phI−XbaI断片(pBR322の200bp,P
yKプロモーター及びHBsAg遺伝子の5′領域の1
00bpを含有する)を分離した。この1200bp
SphI−XbaI断片を、HBsAg遺伝子の3′末
端及びADH−1ターミネーターを含有する1070b
p XbaI−SphI断片(pHBS−56から分
離)に連結した。SphIで消化した後、PyKプロモ
ーター、HBsAg遺伝子及びADH−1ターミネータ
ーを含有するSphI−SphI 2300bp断片
(カセット)を分離した。このカセット断片を、Sph
Iによりあらかじめ消化したpHBS−56中にクロー
ニングした。酵母発現プラスミドpHBS−56PyK
を得た。このプラスミドを用いて酵母AB102株(例
2を参照)又は2150−2−3株(例2を参照)を形
質転換した。
PyK遺伝子を含有するプラスミドpPyK9,1.1
を、xbaIにより消化し、そして突出した末端をDN
AポリメラーゼIを用いてデオキシヌクレオチドにより
満たした。この生成物をBamHIで消化することによ
り、PyKプロモーター及びPyKコード領域からの8
塩基を含有する212bpのBamHI−平滑末端断片
を最終的に分離した。この断片を、あらかじめNcoI
で消化しDNAポリメラーゼを用いて満たしそしてBa
mHIで消化したプラスミドpHBS−6〔pBR32
2中でクローニングされたHBsAg遺伝子(5′非コ
ード領域が除去されている)を含有する〕に連結した。
E.コリを形質転換した後、pHBS−6pyKを分離
した。このプラスミドは、HBsAgコード配列と同位
相で融合した3個の余分のアミノ酸をコードするコドン
ATGTCTAG CATGと共にPyKプロモーター
を含有する。pHBS−6PyKをBamHIを用いて
完全消化し、そしてEcoRIにより部分消化すること
によりHBsAg遺伝子に融合したPyKプロモーター
を含有する1750bp BamHI−EcoRI断片
を分離した。この1750bpの断片を、BamHI及
びEcoRIによりpHBS−16〔ATCC No.
40043、酵母中のアデノウイルスプロモーター(A
denovirus Promoter in Yea
st)と題して1982年11月18日に出願された米
国特許出願No.442,687に記裁されているプラ
スミド(引用によりこの明細書に組入れる)〕を消化し
た後に得られた大断片に連結し、そしてこれを用いて
E.コリを形質転換した。酵母発現プラスミドpHBS
−16PyKを得た。pHBS−16PyKを、Sph
I及びXbaIで完全消化し、そして1200bp S
phI−XbaI断片(pBR322の200bp,P
yKプロモーター及びHBsAg遺伝子の5′領域の1
00bpを含有する)を分離した。この1200bp
SphI−XbaI断片を、HBsAg遺伝子の3′末
端及びADH−1ターミネーターを含有する1070b
p XbaI−SphI断片(pHBS−56から分
離)に連結した。SphIで消化した後、PyKプロモ
ーター、HBsAg遺伝子及びADH−1ターミネータ
ーを含有するSphI−SphI 2300bp断片
(カセット)を分離した。このカセット断片を、Sph
Iによりあらかじめ消化したpHBS−56中にクロー
ニングした。酵母発現プラスミドpHBS−56PyK
を得た。このプラスミドを用いて酵母AB102株(例
2を参照)又は2150−2−3株(例2を参照)を形
質転換した。
【0029】例7.酵母中PyKプロモーターの制御下
でのHBsAgの合成 プラスミドpHBS−56PyKを含有するAB102
株の培養物100mlを650nmにおいて光学濃度が
1〜2になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共に攪
拌し、そして細胞片を遠心分離によって除去することに
より無細胞溶解物を得た。アボット・アウスリアII、
ラジオイムノアッセイによりHBsAgを測定し、そし
てクーマシーブルー結合法により蛋白質濃度を測定し
た。結果を第2表に示す。
でのHBsAgの合成 プラスミドpHBS−56PyKを含有するAB102
株の培養物100mlを650nmにおいて光学濃度が
1〜2になるまで増殖せしめた。ガラスビーズと共に攪
拌し、そして細胞片を遠心分離によって除去することに
より無細胞溶解物を得た。アボット・アウスリアII、
ラジオイムノアッセイによりHBsAgを測定し、そし
てクーマシーブルー結合法により蛋白質濃度を測定し
た。結果を第2表に示す。
【0030】
【0031】酵母AB102株の代りに酵母2150−
2−3株を用い、例7の方法を反復することにより同様
の結果が得られた。この発明を特定の具体例と関係させ
て記載したが、この発明の範囲内において、他の種々の
変法や応用を行うことができよう。
2−3株を用い、例7の方法を反復することにより同様
の結果が得られた。この発明を特定の具体例と関係させ
て記載したが、この発明の範囲内において、他の種々の
変法や応用を行うことができよう。
【図1】GAPDHプロモーター断片の分離及び連結を
示す。
示す。
【図2】GAPDHプロモーターのDNA配列を示す。
【図3】GAPDHプロモーターを含有する酵母発現プ
ラスミドの構成を示す。
ラスミドの構成を示す。
【図4】ピルベートキナーゼ(PyK)遺伝子のヌクレ
オチド配列を示す。
オチド配列を示す。
【図5】PyKプロモーター領域を含有する酵母発現プ
ラスミドの構成を示す。
ラスミドの構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645) (C12P 21/02 C12R 1:645) C12R 1:645) (72)発明者 スティーブン ローゼンベルグ アメリカ合衆国,カリフォルニア,オーク ランド,フルートベイル アベニュ 3861 (72)発明者 パブロ ディー.ティー.バレンツェラ アメリカ合衆国,カリフォルニア,サンフ ランシスコ,アッパー テラス ナンバー 3 455
Claims (6)
- 【請求項1】 (a)コードセグメントを酵母発現ベク
ターに挿入し、このベクターが酵母グリセルアルデヒド
−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼの5′末端からの
コドンを実質上含有しない酵母グリセルアルデヒド−3
−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター由来のD
NAセグメントを含んで成り、このDNAセグメントが
次のヌクレオチド配列: AAGCTTACCA GTTCTCACAC GGAACACCAC TAATGGACAC AAATTCGAAA TACTTTGACC CTATTTTCGA GGACCTTGTC ACCTTGAGCC CAAGAGAGCC AAGATTTAAA TTTTCCTATG ACTTGATGCA AATTCCCAAA GCTAATAACA TGCAAGACAC GTACGGTCAA GAAGACATAT TTGACCTCTT AACTGGTTCA GACGCGACTG CCTCATCAGT AAGACCCGTT GAAAAGAACT TACCTGAAAA AAACGAATAT ATACTAGCGT TGAATGTTAG CGTCAACAAC AAGAAGTTTA ATGACGCGGA GGCCAAGGCA AAAAGATTCC TTGATTACGT AAGGGAGTTA GAATCATTTT GAATAAAAAA CACGCTTTTT CAGTTCGAGT TTATCATTAT CAATACTGCC ATTTCAAAGA ATACGTAAAT AATTAATAGT AGTGATTTTC CTAACTTTAT TTAGTCAAAA ATTAGCCTTT TAATTCTGCT GTAACCCGTA CATGCCCAAA ATAGGGGGCG GGTTACACAG AATATATAAC ATCGTAGGTG TCTGGGTGAA CAGTTTATCC CTGGCATCCA CTAAATATAA TGGAGCTCGC TTTTAAGCTG GCATCCAGAA AAAAAAAGAA TCCCAGCACC AAAATATTGT TTTCTTCACC AACCATCAGT TCATAGGTCC ATTCTCTTAG CGCAACTACA GAGAACAGGG GCACAAACAG GCAAAAAACG GGCACAACCT CAATGGAGTG ATGCAACCTG CCTGGAGTAA ATGATGACAC AAGGCAATTG ACCCACGCAT GTATCTATCT CATTTTCTTA CACCTTCTAT TACCTTCTGC TCTCTCTGAT TTGGAAAAAG CTGAAAAAAA AGGTTGAAAC CAGTTCCCTG AAATTATTCC CCTACTTGAC TAATAAGTAT ATAAAGACGG TAGGTATTGA TTGTAATTCT GTAAATCTAT TTCTTAAACT TCTTAAATTC TACTTTTATA GTTAGTCTTT TTTTTAGTTT TAAAACACCA AGAACTTAGT TTCGAATAAA CACACATAAA CAAACAAGCT T により特定されるものであり、前記プロモーターが挿入
されたDNAコードセグメントの5′末端に隣接しそし
て該プロモーター内で開始される転写が前記コードセグ
メントを包含するように方向付けられており、このよう
にしてコードセグメント発現ベクターを得る段階、及
び、 (b)このコードセグメント発現ベクターにより酵母細
胞を形質転換する段階を含んで成る、酵母中でDNAコ
ードセグメントを発現する方法。 - 【請求項2】 前記酵母発現ベクターが、挿入されたD
NAコードセグメントの3′末端に連結されたターミネ
ーターをさらに含んで成る請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 前記酵母発現ベクターが細菌細胞複製開
始点をさらに含んで成り、そして細菌細胞中で複製する
ことができる請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 前記ターミネーターが酵母アルコールデ
ヒドロゲナーゼIターミネーターから成る請求項3記載
の方法。 - 【請求項5】 前記ターミネーターが酵母GAPDHタ
ーミネーターから成る請求項3記載の方法。 - 【請求項6】 前記ターミネーターが酵母PyKターミ
ネーターである請求項3記載の方法。
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AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | B型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
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US5422267A (en) * | 1984-05-22 | 1995-06-06 | Robert R. Yocum | Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene |
EP0173997A1 (en) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines and their preparation |
DE3587307T2 (de) * | 1984-12-06 | 1993-09-02 | Fina Research | Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung. |
DE3677851D1 (de) * | 1985-08-05 | 1991-04-11 | Merck & Co Inc | Verfahren zur steigerung der produktion von rekombinantem protein in hefearten der gattung saccharomyces. |
JPH0655155B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1994-07-27 | 株式会社ミドリ十字 | 蛋白質の製造方法 |
ES2028779T3 (es) * | 1985-10-03 | 1992-07-16 | Green Cross Corporation | Promotor de levadura y procedimiento para preparar proteina heterologa. |
DK162900C (da) * | 1985-10-24 | 1992-05-11 | Danisco | Fremgangsmaade til ekspression af gener i gaer samt dna-fragment, rekombineret dna-segment og plasmider, hvor disse indgaar til brug ved udoevelse af fremgangsmaaden |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | HBsAgの製造方法 |
US4839283A (en) * | 1986-12-30 | 1989-06-13 | Zymogenetics, Inc. | Method of expressing alpha-1-antitrypsin in yeast |
ATE207535T1 (de) * | 1987-06-22 | 2001-11-15 | Medeva Holdings Bv | Hepatitis-b-oberflächenantigen enthaltendes peptid |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
AU644619B2 (en) | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
FI103206B (fi) * | 1990-01-29 | 1999-05-14 | Novartis Ag | Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten |
US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
DK0574402T3 (da) | 1990-11-26 | 1998-05-18 | Chiron Corp | Ekspression af PACE i værtsceller og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
CA2162557C (en) | 1993-05-12 | 2004-09-28 | Amy J. Weiner | Conserved motif of hepatitis c virus e2/ns1 region |
US5629167A (en) | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
ES2229288T3 (es) | 1995-12-22 | 2005-04-16 | Dsm Ip Assets B.V. | Metodos mejorados para transformar cepas de phaffia, cepas de phaffia transformadas asi obtenidas y dna recombinante en dichos metodos. |
BR9813930A (pt) | 1997-11-06 | 2006-12-19 | Chiron Spa | antìgeno neisserial |
WO1999036544A2 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
US6087128A (en) | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
JP5102414B2 (ja) | 1998-05-01 | 2012-12-19 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス,インコーポレーテッド | 髄膜炎菌抗原および組成物 |
WO2001031019A2 (en) | 1999-10-29 | 2001-05-03 | Chiron Spa | Neisserial antigenic peptides |
CN100392082C (zh) | 1999-04-30 | 2008-06-04 | 启龙股份公司 | 保守的奈瑟球菌抗原 |
GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
US6709863B2 (en) | 1999-12-08 | 2004-03-23 | Iowa State University Research Foundation | Nucleic acid molecules encoding multiple start codons and histidine tags |
CN1416352B (zh) | 2000-01-17 | 2011-05-25 | 启龙股份公司 | 含有脑膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白质的外膜囊(omv)疫苗 |
EP1328543B1 (en) | 2000-10-27 | 2009-08-12 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
WO2002059297A2 (en) | 2001-01-25 | 2002-08-01 | Evolva Biotech A/S | A library of a collection of cells |
US8008459B2 (en) | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
ES2386386T3 (es) | 2001-12-12 | 2012-08-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Inmunización contra Chlamydia trachomatis |
WO2003099854A2 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
ATE466875T1 (de) | 2002-11-15 | 2010-05-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis |
GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
SI1704234T1 (sl) | 2003-11-21 | 2012-08-31 | Nps Pharma Inc | Proizvodnja glukagonu podobnih peptidov 2 in analogov |
DE10356218A1 (de) * | 2003-12-03 | 2005-06-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Pyruvatkinasen aus Pilzen |
US8906676B2 (en) | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
KR101699142B1 (ko) | 2004-06-18 | 2017-01-23 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도 |
JP2008525473A (ja) | 2004-12-22 | 2008-07-17 | アンブレツクス・インコーポレイテツド | 修飾されたヒト成長ホルモン |
CA2590429C (en) | 2004-12-22 | 2014-10-07 | Ambrx, Inc. | Compositions of aminoacyl-trna synthetase and uses thereof |
SG158148A1 (en) | 2004-12-22 | 2010-01-29 | Ambrx Inc | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
WO2006113528A2 (en) | 2005-04-18 | 2006-10-26 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Expressing hepatitis b virus surface antigen for vaccine preparation |
CN102703446B (zh) | 2005-08-18 | 2014-05-28 | Ambrx公司 | tRNA组合物和其用途 |
EP2308505A3 (en) | 2005-09-01 | 2011-11-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH | Multiple vaccines including serogroup C meningococcus |
PT2339014E (pt) | 2005-11-16 | 2015-10-13 | Ambrx Inc | Métodos e composições compreendendo aminoácidos não-naturais |
CA2882445A1 (en) | 2005-12-14 | 2007-06-21 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
US20110206692A1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-25 | Novartis Ag | Conformers of bacterial adhesins |
WO2008030613A2 (en) | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Hybrid suppressor trna for vertebrate cells |
KR20090060294A (ko) | 2006-09-08 | 2009-06-11 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 인간 혈장 폴리펩티드 또는 Fc 스캐폴드 및 그의 용도 |
CN104163864B (zh) | 2007-03-30 | 2017-08-01 | Ambrx公司 | 经修饰fgf‑21多肽和其用途 |
WO2008139591A1 (ja) * | 2007-05-11 | 2008-11-20 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 組換えアプロチニンの生産方法 |
JP5547083B2 (ja) | 2007-11-20 | 2014-07-09 | アンブルックス,インコーポレイテッド | 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用 |
CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
UA118536C2 (uk) | 2008-07-23 | 2019-02-11 | Амбркс, Інк. | Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування |
KR101647164B1 (ko) | 2008-09-26 | 2016-08-09 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 |
NZ607477A (en) | 2008-09-26 | 2014-09-26 | Ambrx Inc | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
CN107056929A (zh) | 2009-12-21 | 2017-08-18 | Ambrx 公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
CN107674121A (zh) | 2009-12-21 | 2018-02-09 | Ambrx 公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
EP2571991A1 (en) | 2010-05-20 | 2013-03-27 | Evolva SA | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
MX346786B (es) | 2010-08-17 | 2017-03-31 | Ambrx Inc | Polipeptidos de relaxina modificados y sus usos. |
AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
PL3412302T3 (pl) | 2014-10-24 | 2021-11-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Zmodyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowania |
CN110637027B (zh) | 2017-02-08 | 2024-08-30 | 百时美施贵宝公司 | 包含药代动力学增强子的修饰的松弛素多肽及其用途 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
JP2608540B2 (ja) * | 1982-05-19 | 1997-05-07 | ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ | クルイベロミセス種のためのクローニング系 |
AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
JPH0716432B2 (ja) * | 1982-10-20 | 1995-03-01 | サントリー株式会社 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
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