JP2000116392A - 新規ベクタ― - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝
子プロモーター；その改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーター
を含む改変ＬＥＵ２遺伝子；その改変ＬＥＵ２遺伝子を
含むベクター；ヤロウィア・リポリティカの組込み形質
転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含
むベクター；ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列と、それに作動可能に連結されている、ヤロウィア・
リポリティカにおいて機能的なプロモーターとを含むベ
クター；ベクターを含む大腸菌形質転換体；発現ベクタ
ーを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体；形質転
換体の製造に有用なヤロウィア・リポリティカ株；及び
改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーターの製造において有用な
ヌクレオチド配列の調製に有用なベクターを提供する。 【解決手段】 前記ベクターは、プラスミドｐＮＢ２５
８、プラスミドｐＮＢ６５０、及びプラスミドｐＮＢ２
６８である。
子プロモーター；その改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーター
を含む改変ＬＥＵ２遺伝子；その改変ＬＥＵ２遺伝子を
含むベクター；ヤロウィア・リポリティカの組込み形質
転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含
むベクター；ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列と、それに作動可能に連結されている、ヤロウィア・
リポリティカにおいて機能的なプロモーターとを含むベ
クター；ベクターを含む大腸菌形質転換体；発現ベクタ
ーを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体；形質転
換体の製造に有用なヤロウィア・リポリティカ株；及び
改変ＬＥＵ２遺伝子プロモーターの製造において有用な
ヌクレオチド配列の調製に有用なベクターを提供する。 【解決手段】 前記ベクターは、プラスミドｐＮＢ２５
８、プラスミドｐＮＢ６５０、及びプラスミドｐＮＢ２
６８である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規ベクターに関
する。本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＥＵ２遺伝子
プロモーター、及びその改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子プロモーターを含む改変ヤロウィア・リ
ポリティカＬＥＵ２遺伝子の調製に有用である。また、
本発明は、前記改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子を含むベクターの調製に有用である。前記ベクタ
ーには、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座
以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組
込み形質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ
配列を含むベクター；及びポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列と、それに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌ
ｙ）連結されている、ヤロウィア・リポリティカにおい
て機能的なプロモーターとを含むベクターが含まれる。
後者のベクターは、また、発現ベクターとして知られて
いる。更に、本発明は、本発明のベクターを含む大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体に関する。
する。本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａ
ｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＥＵ２遺伝子
プロモーター、及びその改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子プロモーターを含む改変ヤロウィア・リ
ポリティカＬＥＵ２遺伝子の調製に有用である。また、
本発明は、前記改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子を含むベクターの調製に有用である。前記ベクタ
ーには、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座
以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組
込み形質転換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ
配列を含むベクター；及びポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列と、それに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌ
ｙ）連結されている、ヤロウィア・リポリティカにおい
て機能的なプロモーターとを含むベクターが含まれる。
後者のベクターは、また、発現ベクターとして知られて
いる。更に、本発明は、本発明のベクターを含む大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体に関する。
【０００２】また、本発明は、発現ベクターを含むヤロ
ウィア・リポリティカ形質転換体；多重組込み発現ベク
ターを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体の製造
方法；前記形質転換体の製造に有用なヤロウィア・リポ
リティカ株；及び或るヤロウィア・リポリティカ形質転
換体によるポリペプチドの製造方法に有用である。更
に、本発明は、本発明による改変ヤロウィア・リポリテ
ィカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの製造において有用な
ヌクレオチド配列、及び改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２プロモーターの製造方法に有用である。
ウィア・リポリティカ形質転換体；多重組込み発現ベク
ターを含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体の製造
方法；前記形質転換体の製造に有用なヤロウィア・リポ
リティカ株；及び或るヤロウィア・リポリティカ形質転
換体によるポリペプチドの製造方法に有用である。更
に、本発明は、本発明による改変ヤロウィア・リポリテ
ィカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの製造において有用な
ヌクレオチド配列、及び改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２プロモーターの製造方法に有用である。
【０００３】
【従来の技術】ヤロウィア・リポリティカの形質転換方
法、それに有用なベクター、及びそのベクターを含む形
質転換体は、特に、米国特許第４，８８０，７４１号及
び第５，０７１，７６４号各明細書に開示及びクレーム
されており、両方とも本件の譲受人に譲渡されている。
ヤロウィア・リポリティカの形質転換に有用で、異種タ
ンパク質の発現及び分泌用のベクター、形質転換体、及
びそれによる異種タンパク質の製造方法は、特に、これ
も本件の譲受人に譲渡されている米国特許第４，９３
７，１８９号明細書に開示及びクレームされている。ま
た、米国特許第４，９３７，１８９号明細書には、ヤロ
ウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド
配列（配列番号１で表わされる配列）が開示されてい
る。
法、それに有用なベクター、及びそのベクターを含む形
質転換体は、特に、米国特許第４，８８０，７４１号及
び第５，０７１，７６４号各明細書に開示及びクレーム
されており、両方とも本件の譲受人に譲渡されている。
ヤロウィア・リポリティカの形質転換に有用で、異種タ
ンパク質の発現及び分泌用のベクター、形質転換体、及
びそれによる異種タンパク質の製造方法は、特に、これ
も本件の譲受人に譲渡されている米国特許第４，９３
７，１８９号明細書に開示及びクレームされている。ま
た、米国特許第４，９３７，１８９号明細書には、ヤロ
ウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド
配列（配列番号１で表わされる配列）が開示されてい
る。
【０００４】第ＷＯ９１／００９２０号（ＰＣＴ／ＥＰ
９０／０１１３８）公報（１９９１年１月２４日発行）
には、酵母染色体中への発現ベクターの多重コピー組込
みにより形質転換された酵母による、同種又は異種タン
パク質の製造方法が開示されている。この方法で使用す
る発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする「発
現可能な遺伝子」及び「特定の培地中で酵母の増殖に必
要な欠失選択マーカー」［例えば、欠失ＬＥＵ２遺伝子
（ｌｅｕ２ｄ）］の両方を含む。また、リボゾームＲＮ
ＡをコードするＤＮＡも含む前記ベクターが開示されて
いる。
９０／０１１３８）公報（１９９１年１月２４日発行）
には、酵母染色体中への発現ベクターの多重コピー組込
みにより形質転換された酵母による、同種又は異種タン
パク質の製造方法が開示されている。この方法で使用す
る発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする「発
現可能な遺伝子」及び「特定の培地中で酵母の増殖に必
要な欠失選択マーカー」［例えば、欠失ＬＥＵ２遺伝子
（ｌｅｕ２ｄ）］の両方を含む。また、リボゾームＲＮ
ＡをコードするＤＮＡも含む前記ベクターが開示されて
いる。
【０００５】第ＷＯ９２／０１８００号（ＰＣＴ／ＵＳ
９１／０４８９９）公報（１９９２年２月６日発行）に
は、酵母染色体のあらゆるところに高いコピー数で挿入
することが可能な組込みプラスミドベクター及び前記組
込みを達成する方法が開示されている。開示されたベク
ターは、「散在型反復要素（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｒｅ
ｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＤＲＥ’
ｓ）」、例えば、酵母δ配列、Ｔｙ配列、及びｔＲＮＡ
ＤＮＡ配列を使用する。
９１／０４８９９）公報（１９９２年２月６日発行）に
は、酵母染色体のあらゆるところに高いコピー数で挿入
することが可能な組込みプラスミドベクター及び前記組
込みを達成する方法が開示されている。開示されたベク
ターは、「散在型反復要素（ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｒｅ
ｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＤＲＥ’
ｓ）」、例えば、酵母δ配列、Ｔｙ配列、及びｔＲＮＡ
ＤＮＡ配列を使用する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明は、プラスミドｐＮＢ２５８、プラスミ
ドｐＮＢ６５０、及びプラスミドｐＮＢ２６８に関す
る。本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子の製造に有用な、改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子プロモーター（特には、配列番号１で表
わされる配列の第６９３番目〜第７９８番目のヌクレオ
チド、配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第
７９８番目のヌクレオチド、第７２４番目のヌクレオチ
ドがＡからＧに変えられている配列番号１で表わされる
配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第
７２５番目のヌクレオチドがＴからＧに変えられている
配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８
番目のヌクレオチド、第７２２番目のヌクレオチドがＡ
からＧに変えられている配列番号１で表わされる配列の
第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、配列番号
１で表わされる配列の第７４５番目〜第７９８番目のヌ
クレオチド、及びそれらの機能的等価物からなる群から
選んだ、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子
プロモーター）の調製に有用である。また、本発明は、
ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺伝子コード配
列に機能的に連結されている改変ＬＥＵ２遺伝子プロモ
ーターを含む、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子の調製に有用である。
の手段】本発明は、プラスミドｐＮＢ２５８、プラスミ
ドｐＮＢ６５０、及びプラスミドｐＮＢ２６８に関す
る。本発明は、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子の製造に有用な、改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子プロモーター（特には、配列番号１で表
わされる配列の第６９３番目〜第７９８番目のヌクレオ
チド、配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第
７９８番目のヌクレオチド、第７２４番目のヌクレオチ
ドがＡからＧに変えられている配列番号１で表わされる
配列の第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、第
７２５番目のヌクレオチドがＴからＧに変えられている
配列番号１で表わされる配列の第７１８番目〜第７９８
番目のヌクレオチド、第７２２番目のヌクレオチドがＡ
からＧに変えられている配列番号１で表わされる配列の
第７１８番目〜第７９８番目のヌクレオチド、配列番号
１で表わされる配列の第７４５番目〜第７９８番目のヌ
クレオチド、及びそれらの機能的等価物からなる群から
選んだ、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子
プロモーター）の調製に有用である。また、本発明は、
ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺伝子コード配
列に機能的に連結されている改変ＬＥＵ２遺伝子プロモ
ーターを含む、改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子の調製に有用である。
【０００７】更に、本発明は、前記の改変ヤロウィア・
リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むベクターの調製に有
用である。更に、本発明は、前記の改変ヤロウィア・リ
ポリティカＬＥＵ２遺伝子と、ヤロウィア・リポリティ
カのＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤロウィ
ア・リポリティカの組込み形質転換に充分なヤロウィア
・リポリティカＤＮＡ配列とを含むベクターの調製に有
用である。前記ベクター用の好ましいヤロウィア・リポ
リティカＤＮＡ配列は、ヤロウィア・リポリティカのリ
ボゾームＤＮＡ配列である。また、本発明により、以下
の発現ベクターの構築に有用なベクターが提供される。
ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座における組込み形質転
換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含む
ベクターは、形質転換において、複数部位に組込みが可
能であり、従って、前記ベクターの多重コピーを含むヤ
ロウィア・リポリティカ形質転換体が得られる。
リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むベクターの調製に有
用である。更に、本発明は、前記の改変ヤロウィア・リ
ポリティカＬＥＵ２遺伝子と、ヤロウィア・リポリティ
カのＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤロウィ
ア・リポリティカの組込み形質転換に充分なヤロウィア
・リポリティカＤＮＡ配列とを含むベクターの調製に有
用である。前記ベクター用の好ましいヤロウィア・リポ
リティカＤＮＡ配列は、ヤロウィア・リポリティカのリ
ボゾームＤＮＡ配列である。また、本発明により、以下
の発現ベクターの構築に有用なベクターが提供される。
ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座における組込み形質転
換に充分なヤロウィア・リポリティカＤＮＡ配列を含む
ベクターは、形質転換において、複数部位に組込みが可
能であり、従って、前記ベクターの多重コピーを含むヤ
ロウィア・リポリティカ形質転換体が得られる。
【０００８】更に、本発明は、ヤロウィア・リポリティ
カの形質転換により、前記ヤロウィア・リポリティカに
よる異種ポリペプチドの発現及びその分泌の両方が起き
る発現ベクターの調製に有用である。前記発現ベクター
は、（前記の）改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座
以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組
込み形質転換に充分なＤＮＡ配列、ヤロウィア・リポリ
ティカのＸＰＲ２プロモーター、及び前記プロモーター
に作動可能に連結される、ヤロウィア・リポリティカの
ＸＰＲ２遺伝子のシグナルプロ１−若しくはプロ２−配
列、又はその機能的断片若しくは等価物（従って、ポリ
ペプチドのコード配列に作動可能に連結される）を含
む。ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤロウィ
ア・リポリティカの組込み形質転換に充分なＤＮＡ配列
が、ヤロウィア・リポリティカのリボゾームＤＮＡ配列
である、ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子の
シグナルプロ１−又はプロ２−配列を含む前記発現ベク
ターが好ましい。また、前記発現ベクター、又はポリペ
プチドが異種ポリペプチドである好適発現ベクターが好
ましい。好ましい異種ポリペプチドには、プロキモシ
ン、プロインシュリン類似体、インシュリノトロピン
（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、及びヒトＴＧＦ−
β３が含まれる。
カの形質転換により、前記ヤロウィア・リポリティカに
よる異種ポリペプチドの発現及びその分泌の両方が起き
る発現ベクターの調製に有用である。前記発現ベクター
は、（前記の）改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子、ヤロウィア・リポリティカのＬＥＵ２遺伝子座
以外の遺伝子座におけるヤロウィア・リポリティカの組
込み形質転換に充分なＤＮＡ配列、ヤロウィア・リポリ
ティカのＸＰＲ２プロモーター、及び前記プロモーター
に作動可能に連結される、ヤロウィア・リポリティカの
ＸＰＲ２遺伝子のシグナルプロ１−若しくはプロ２−配
列、又はその機能的断片若しくは等価物（従って、ポリ
ペプチドのコード配列に作動可能に連結される）を含
む。ＬＥＵ２遺伝子座以外の遺伝子座におけるヤロウィ
ア・リポリティカの組込み形質転換に充分なＤＮＡ配列
が、ヤロウィア・リポリティカのリボゾームＤＮＡ配列
である、ヤロウィア・リポリティカのＸＰＲ２遺伝子の
シグナルプロ１−又はプロ２−配列を含む前記発現ベク
ターが好ましい。また、前記発現ベクター、又はポリペ
プチドが異種ポリペプチドである好適発現ベクターが好
ましい。好ましい異種ポリペプチドには、プロキモシ
ン、プロインシュリン類似体、インシュリノトロピン
（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、及びヒトＴＧＦ−
β３が含まれる。
【０００９】更に、本発明は、発現ベクターを含むヤロ
ウィア・リポリティカ形質転換体の調製に有用である。
また、本発明は、改変ＬＥＵ２遺伝子の選択に有用であ
る、ＬＥＵ２遺伝子座での欠失を含むヤロウィア・リポ
リティカ株の調製に有用である。本発明は、本発明のベ
クターを含む大腸菌形質転換体に関する。更に、本発明
は、同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水
性栄養培地中で、本発明のヤロウィア・リポリティカ形
質転換体を発酵させることを含む、ポリペプチドの製造
方法に有用である。
ウィア・リポリティカ形質転換体の調製に有用である。
また、本発明は、改変ＬＥＵ２遺伝子の選択に有用であ
る、ＬＥＵ２遺伝子座での欠失を含むヤロウィア・リポ
リティカ株の調製に有用である。本発明は、本発明のベ
クターを含む大腸菌形質転換体に関する。更に、本発明
は、同化可能な炭素源、窒素源、及び無機塩源を含む水
性栄養培地中で、本発明のヤロウィア・リポリティカ形
質転換体を発酵させることを含む、ポリペプチドの製造
方法に有用である。
【００１０】また、本発明は、多重組込み発現ベクター
を含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体の製造方法
に有用である。前記方法には、前記組込み形質転換が可
能な発現ベクター（ベクターは、組込み形質転換に充分
なＤＮＡ配列中で、発現ベクターを切断することによっ
て、予め線状化する）による、ＬＥＵ２遺伝子の欠失を
有するヤロウィア・リポリティカ株の形質転換と、ロイ
シンを欠く培地上における、もっともよく増殖する形質
転換体の選択とが含まれる。
を含むヤロウィア・リポリティカ形質転換体の製造方法
に有用である。前記方法には、前記組込み形質転換が可
能な発現ベクター（ベクターは、組込み形質転換に充分
なＤＮＡ配列中で、発現ベクターを切断することによっ
て、予め線状化する）による、ＬＥＵ２遺伝子の欠失を
有するヤロウィア・リポリティカ株の形質転換と、ロイ
シンを欠く培地上における、もっともよく増殖する形質
転換体の選択とが含まれる。
【００１１】また、本発明は、改変ヤロウィア・リポリ
ティカＬＥＵ２プロモーターの製造方法に有用である。
前記方法は、５’末端及び３’末端を有し、配列番号１
で表わされる配列の領域に相同性又は実質的な相同性を
有するＤＮＡ配列（前記５’末端は、配列番号１で表わ
される配列のプロモーター領域の５’末端とは末端を共
有せず、その内部にある）を調製し；（ｉ）直前の記載
のようにして調製したＤＮＡ配列の３’末端が、配列番
号１で表わされる配列由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ
配列の５’末端に連結され、ＬＥＵ２の構造遺伝子が形
成される、ＤＮＡ配列と、（ii）第２のヤロウィア・リ
ポリティカ構造遺伝子をコードする配列とを調製し；前
記第２の構造遺伝子に相当する構造遺伝子における変異
又は欠失と、ＬＥＵ２遺伝子の欠失とを有するヤロウィ
ア・リポリティカ宿主を、直前の記載のようにして調製
したベクターであって、前記第２の構造遺伝子をコード
する領域内部で切断したベクターで形質転換し；ロイシ
ンを含むが、増殖に前記第２の構造遺伝子を必要とする
培地上で、ヤロウィア・リポリティカ形質転換体を選択
し；そして、前記のヤロウィア・リポリティカ形質転換
体から、ロイシンを欠く培地上で増殖が劣る形質転換体
をスクリーニングすることを含む。前記方法で使用する
のに好ましい第２の構造遺伝子は、ヤロウィア・リポリ
ティカのＵＲＡ３遺伝子である。
ティカＬＥＵ２プロモーターの製造方法に有用である。
前記方法は、５’末端及び３’末端を有し、配列番号１
で表わされる配列の領域に相同性又は実質的な相同性を
有するＤＮＡ配列（前記５’末端は、配列番号１で表わ
される配列のプロモーター領域の５’末端とは末端を共
有せず、その内部にある）を調製し；（ｉ）直前の記載
のようにして調製したＤＮＡ配列の３’末端が、配列番
号１で表わされる配列由来のヌクレオチドを含むＤＮＡ
配列の５’末端に連結され、ＬＥＵ２の構造遺伝子が形
成される、ＤＮＡ配列と、（ii）第２のヤロウィア・リ
ポリティカ構造遺伝子をコードする配列とを調製し；前
記第２の構造遺伝子に相当する構造遺伝子における変異
又は欠失と、ＬＥＵ２遺伝子の欠失とを有するヤロウィ
ア・リポリティカ宿主を、直前の記載のようにして調製
したベクターであって、前記第２の構造遺伝子をコード
する領域内部で切断したベクターで形質転換し；ロイシ
ンを含むが、増殖に前記第２の構造遺伝子を必要とする
培地上で、ヤロウィア・リポリティカ形質転換体を選択
し；そして、前記のヤロウィア・リポリティカ形質転換
体から、ロイシンを欠く培地上で増殖が劣る形質転換体
をスクリーニングすることを含む。前記方法で使用する
のに好ましい第２の構造遺伝子は、ヤロウィア・リポリ
ティカのＵＲＡ３遺伝子である。
【００１２】本明細書及び付随する請求項において、
「機能的断片」とは、その語句が言及する配列の断片で
あって、その完全配列の全機能の少なくとも一部の機能
を有する断片を意味する。本明細書及び付随する請求項
において、「機能的等価物」とは、その語句が言及する
配列と同一又は実質的に同一の機能を有する配列を意味
する。
「機能的断片」とは、その語句が言及する配列の断片で
あって、その完全配列の全機能の少なくとも一部の機能
を有する断片を意味する。本明細書及び付随する請求項
において、「機能的等価物」とは、その語句が言及する
配列と同一又は実質的に同一の機能を有する配列を意味
する。
【００１３】
【発明の実施の形態】プラスミド調製用の宿主として、
大腸菌株ＤＨ５α（ベセスダリサーチラボラトリーズ，
ゲイサーズバーグ，メリーランド州からコンピテントセ
ルとして入手）を使用した。商品添付の説明書に従って
大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させた。ＬＢ培地
は、バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、
及び塩化ナトリウム１０ｇ（１リットル当たり）を含有
した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法［Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ７，１５１３
（１９７９）］又は煮沸法［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：１９
３（１９８１）］を使用して調製した。
大腸菌株ＤＨ５α（ベセスダリサーチラボラトリーズ，
ゲイサーズバーグ，メリーランド州からコンピテントセ
ルとして入手）を使用した。商品添付の説明書に従って
大腸菌細胞を形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）を含むＬＢ培地で３７℃で増殖させた。ＬＢ培地
は、バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇ、
及び塩化ナトリウム１０ｇ（１リットル当たり）を含有
した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法［Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ７，１５１３
（１９７９）］又は煮沸法［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：１９
３（１９８１）］を使用して調製した。
【００１４】制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ポリメラー
ゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、クレノウＤＮＡポリメラー
ゼ、ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ、及び後述する
他の必要な酵素は、ニューイングランドバイオラブズ
（ベバリー，マサチューセッツ州）及び／又はベセスダ
リサーチラボラトリーズ（ゲイサーズバーグ，メリーラ
ンド州）から購入し、商品添付の説明書に従って使用し
た。すべての分子生物学的操作は、標準的方法［Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第二
版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って実施
した。
ゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、クレノウＤＮＡポリメラー
ゼ、ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ、及び後述する
他の必要な酵素は、ニューイングランドバイオラブズ
（ベバリー，マサチューセッツ州）及び／又はベセスダ
リサーチラボラトリーズ（ゲイサーズバーグ，メリーラ
ンド州）から購入し、商品添付の説明書に従って使用し
た。すべての分子生物学的操作は、標準的方法［Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第二
版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に従って実施
した。
【００１５】ヤロウィア・リポリティカ株は、１％バク
ト酵母抽出物、２％バクトペプトン、及び２％デキスト
ロースを含む標準的な富養酵母培地（ＹＰＤ）又はロイ
シンを含まない完全最少培地［Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ
Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９
８６）］で２８℃で増殖させた。形質転換は、Ｄａｂｉ
ｄｏｗ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒＧｅｎｅｔ
１０：３９−４８（１９８５）による記載のようにし
て実施した。発現用には、メジウムＡ（Ｍｅｄｉｕｍ
Ａ；５％バクトペプトン，１％グルコース，０．１％酵
母抽出物）で培養した。酵母ＤＮＡは、Ｓｈｅｒｍａ
ｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏ
ｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８６）による記載のようにして調製し、サザン
分析は、標準条件［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．
Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第二版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）］を使用して実施した。参照した前記方法は、当
業者に周知である。
ト酵母抽出物、２％バクトペプトン、及び２％デキスト
ロースを含む標準的な富養酵母培地（ＹＰＤ）又はロイ
シンを含まない完全最少培地［Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．，
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ
Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａ
ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９
８６）］で２８℃で増殖させた。形質転換は、Ｄａｂｉ
ｄｏｗ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒＧｅｎｅｔ
１０：３９−４８（１９８５）による記載のようにし
て実施した。発現用には、メジウムＡ（Ｍｅｄｉｕｍ
Ａ；５％バクトペプトン，１％グルコース，０．１％酵
母抽出物）で培養した。酵母ＤＮＡは、Ｓｈｅｒｍａ
ｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏ
ｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８６）による記載のようにして調製し、サザン
分析は、標準条件［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．
Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第二版）ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）］を使用して実施した。参照した前記方法は、当
業者に周知である。
【００１６】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《改変ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子プロモーター及び改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子の構築》ヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２遺伝子のヌクレオチド配列を、以下の配列表に配列
番号１で表わされる配列として示す。ヤロウィア・リポ
リティカＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド配列は、特に、
米国特許第４，９３７，１８９号明細書に開示されてい
る。前記特許は、本件の譲受人に譲渡されており、その
内容は参照により本明細書に取り込まれる。更に、ヤロ
ウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミド
ｐＬＤ２５が、米国特許第５，０７１，７６４号明細書
に開示され、米国特許第４，８８０，７４１号明細書に
開示及びクレームされている。両方の特許もまた、本件
の譲受人に譲渡されており、その内容は参照により本明
細書に取り込まれる。プラスミドｐＬＤ２５は、ブタペ
スト条約の条件下、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ロックビル，メリーランド州，米国）に
大腸菌形質転換体（ｐＬＤ２５を伴う大腸菌ＪＣ−３５
５形質転換体）の形で寄託され、ＡＴＣＣ３９４６４と
命名されている。ＡＴＣＣ３９４６４の入手可能性にお
けるすべての制限は、米国特許第４，８８０，７４１号
の付与により取り除かれ、再び制限されることはない。
遺伝子プロモーター及び改変ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子の構築》ヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２遺伝子のヌクレオチド配列を、以下の配列表に配列
番号１で表わされる配列として示す。ヤロウィア・リポ
リティカＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド配列は、特に、
米国特許第４，９３７，１８９号明細書に開示されてい
る。前記特許は、本件の譲受人に譲渡されており、その
内容は参照により本明細書に取り込まれる。更に、ヤロ
ウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子を含むプラスミド
ｐＬＤ２５が、米国特許第５，０７１，７６４号明細書
に開示され、米国特許第４，８８０，７４１号明細書に
開示及びクレームされている。両方の特許もまた、本件
の譲受人に譲渡されており、その内容は参照により本明
細書に取り込まれる。プラスミドｐＬＤ２５は、ブタペ
スト条約の条件下、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ロックビル，メリーランド州，米国）に
大腸菌形質転換体（ｐＬＤ２５を伴う大腸菌ＪＣ−３５
５形質転換体）の形で寄託され、ＡＴＣＣ３９４６４と
命名されている。ＡＴＣＣ３９４６４の入手可能性にお
けるすべての制限は、米国特許第４，８８０，７４１号
の付与により取り除かれ、再び制限されることはない。
【００１７】図１〜図４に、プロモーターを欠失させた
ＬＥＵ２遺伝子の構築を模式的に示す。ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として働くプラスミドｐＮＢ
２５８には、形質転換効率用のポジティブコントロール
としての野生型ヤロウィア・リポリティカＵＲＡ３遺伝
子が含まれ、単一コピーでロイシン欠損宿主を相補する
能力に関して、プロモーターを欠失させたＬＥＵ２遺伝
子をテストする能力を提供する。ｐＮＢ２５８を構築す
るために、商品添付の説明書に従って、ＳｔｕＩ及びＳ
ａｌＩ制限酵素でプラスミドＤＮＡを消化し、クレノウ
フラグメントで制限消化物を処理することによって、Ｕ
ＲＡ３配列を含む１．６ｋｂの平滑末端化ＤＮＡ断片を
ｐＬＤ１０６から単離した。このＤＮＡ約２００ｎｇ
と、ＳａｌＩ消化、クレノウ平滑化、アルカリ性ホスフ
ァターゼ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫベクタ
ー（ストラトジーンクローニングシステムズ，ラホイ
ラ，カリフォルニア州）約５００ｎｇとを、商品添付の
説明書に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結し
た。連結混合物１／３で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート
に蒔いた。形質転換体の選ばれた単一コロニー単離体か
らＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で
消化した。１％アガロースゲルで制限断片を分離し、エ
チジウムブロマイド染色により目に見えるようにした。
ＵＲＡ３遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片がそこに
存在することを基にして、プラスミドｐＮＢ２５７を同
定した。
ＬＥＵ２遺伝子の構築を模式的に示す。ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として働くプラスミドｐＮＢ
２５８には、形質転換効率用のポジティブコントロール
としての野生型ヤロウィア・リポリティカＵＲＡ３遺伝
子が含まれ、単一コピーでロイシン欠損宿主を相補する
能力に関して、プロモーターを欠失させたＬＥＵ２遺伝
子をテストする能力を提供する。ｐＮＢ２５８を構築す
るために、商品添付の説明書に従って、ＳｔｕＩ及びＳ
ａｌＩ制限酵素でプラスミドＤＮＡを消化し、クレノウ
フラグメントで制限消化物を処理することによって、Ｕ
ＲＡ３配列を含む１．６ｋｂの平滑末端化ＤＮＡ断片を
ｐＬＤ１０６から単離した。このＤＮＡ約２００ｎｇ
と、ＳａｌＩ消化、クレノウ平滑化、アルカリ性ホスフ
ァターゼ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫベクタ
ー（ストラトジーンクローニングシステムズ，ラホイ
ラ，カリフォルニア州）約５００ｎｇとを、商品添付の
説明書に従って、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結し
た。連結混合物１／３で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート
に蒔いた。形質転換体の選ばれた単一コロニー単離体か
らＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で
消化した。１％アガロースゲルで制限断片を分離し、エ
チジウムブロマイド染色により目に見えるようにした。
ＵＲＡ３遺伝子を含む１．６ｋｂのＤＮＡ断片がそこに
存在することを基にして、プラスミドｐＮＢ２５７を同
定した。
【００１８】ＬＥＵ２コード配列を変えない一塩基変化
により、その内在のＥｃｏＲＩ部位を除去したＬＥＵ２
遺伝子を構築した。ＬＥＵ２遺伝子構築物は、単一のＥ
ｃｏＲＩ ＤＮＡ断片としてＬＥＵ２遺伝子を単離する
ことができ、以降の操作をより便利なものにした。この
構築物は、以下のようにして作製した。プラスミドｐＬ
Ｄ４０（ｐＢＲ３２２中にＬＥＵ２遺伝子を含み、米国
特許４，８８０，７４１号及び米国特許第５，０７１，
７６４号各明細書に開示されている）由来のＤＮＡをＸ
ｈｏＩで消化し、内在のＥｃｏＲＩ部位を含む２９塩基
対のＤＮＡ断片を除去し、アルカリ性ホスファターゼで
処理した。線状ＤＮＡを、０．７％アガロースゲルで電
気泳動的に分離し、電気溶出した。この線状ＤＮＡ２０
０ｎｇと合成リンカーＤＮＡ［相当するＬＥＵ２コドン
を変化させることなくＥｃｏＲＩ部位を除去する、一塩
基対変化（第２２番目の塩基においてＣ／ＧからＴ／Ａ
へ）を含む］５０ｎｇとを連結した。使用した合成リン
カーの配列は、 5'-ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣ-3' 3'-ＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＣＴ-5' （配列中、変化させた塩基を下線で示す）であり、以下
の配列表用に、５’から３’方向に示す以下の配列： 5'−ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣ
ＣＣＣＡＧＣ−3'（配列番号２）及び 5'−ＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＴＣＣＴＴ
ＧＡＧＧＡＣ−3'（配列番号３） からなる。連結混合物１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形
質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプ
レートに蒔いた。形質転換体コロニー１６個からＤＮＡ
を調製し、プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで
消化した。０．７％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気
泳動的に分離し、エチジウムブロマイドにより目に見え
るようにした。次に、１．６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断
片でなく、単一の２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片
を放出する、いくつかのプラスミド由来のＤＮＡ５μｇ
をＳａｃＩで消化し、変えた内在のＸｈｏＩ断片を含む
２４３ｂｐのＤＮＡ断片を放出した。５％ポリアクリル
アミドゲルで断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブ
ロマイド染色により目に見えるようにした。プラスミド
１種類由来の２４３ｂｐのＳａｃＩ ＤＮＡ断片を電気
溶出し、ＳａｃＩ消化及びアルカリ性ホスファターゼ処
理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ ＤＮＡ２００ｎ
ｇと連結した。青色／白色選択用の商品添付の説明書に
従って、連結混合物で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ス
トラトジーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリ
フォルニア州）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン、ＩＰＴＧ、及びＸ−ＧＡＬを含むＬＢプレート
に蒔いた。白色の形質転換体コロニー１０種類からプラ
スミドＤＮＡを調製し、ＳａｃＩで消化し、５％ポリア
クリルアミドゲルで断片を電気泳動的に分離し、挿入の
存在を確認した。挿入を含むプラスミド２種類由来のＤ
ＮＡを、ジデオキシチェインターミネーション法（シー
クエナーゼキット，ユナイテッドステーツバイオケミカ
ルコーポレーション，クリーブランド，オハイオ州）を
用いてシークエンスして、ＬＥＵ２コード配列内部のＸ
ｈｏＩ ＤＮＡ断片の正確な方向を確認した。変えた内
在のＸｈｏＩ断片を有するＬＥＵ２遺伝子を含むプラス
ミドの１種類をｐＬＤ１０４９と命名した。
により、その内在のＥｃｏＲＩ部位を除去したＬＥＵ２
遺伝子を構築した。ＬＥＵ２遺伝子構築物は、単一のＥ
ｃｏＲＩ ＤＮＡ断片としてＬＥＵ２遺伝子を単離する
ことができ、以降の操作をより便利なものにした。この
構築物は、以下のようにして作製した。プラスミドｐＬ
Ｄ４０（ｐＢＲ３２２中にＬＥＵ２遺伝子を含み、米国
特許４，８８０，７４１号及び米国特許第５，０７１，
７６４号各明細書に開示されている）由来のＤＮＡをＸ
ｈｏＩで消化し、内在のＥｃｏＲＩ部位を含む２９塩基
対のＤＮＡ断片を除去し、アルカリ性ホスファターゼで
処理した。線状ＤＮＡを、０．７％アガロースゲルで電
気泳動的に分離し、電気溶出した。この線状ＤＮＡ２０
０ｎｇと合成リンカーＤＮＡ［相当するＬＥＵ２コドン
を変化させることなくＥｃｏＲＩ部位を除去する、一塩
基対変化（第２２番目の塩基においてＣ／ＧからＴ／Ａ
へ）を含む］５０ｎｇとを連結した。使用した合成リン
カーの配列は、 5'-ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧＣ-3' 3'-ＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＣＴ-5' （配列中、変化させた塩基を下線で示す）であり、以下
の配列表用に、５’から３’方向に示す以下の配列： 5'−ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＴＴＣ
ＣＣＣＡＧＣ−3'（配列番号２）及び 5'−ＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＴＣＣＴＴ
ＧＡＧＧＡＣ−3'（配列番号３） からなる。連結混合物１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形
質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプ
レートに蒔いた。形質転換体コロニー１６個からＤＮＡ
を調製し、プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで
消化した。０．７％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気
泳動的に分離し、エチジウムブロマイドにより目に見え
るようにした。次に、１．６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断
片でなく、単一の２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片
を放出する、いくつかのプラスミド由来のＤＮＡ５μｇ
をＳａｃＩで消化し、変えた内在のＸｈｏＩ断片を含む
２４３ｂｐのＤＮＡ断片を放出した。５％ポリアクリル
アミドゲルで断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブ
ロマイド染色により目に見えるようにした。プラスミド
１種類由来の２４３ｂｐのＳａｃＩ ＤＮＡ断片を電気
溶出し、ＳａｃＩ消化及びアルカリ性ホスファターゼ処
理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ ＤＮＡ２００ｎ
ｇと連結した。青色／白色選択用の商品添付の説明書に
従って、連結混合物で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（ス
トラトジーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリ
フォルニア州）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン、ＩＰＴＧ、及びＸ−ＧＡＬを含むＬＢプレート
に蒔いた。白色の形質転換体コロニー１０種類からプラ
スミドＤＮＡを調製し、ＳａｃＩで消化し、５％ポリア
クリルアミドゲルで断片を電気泳動的に分離し、挿入の
存在を確認した。挿入を含むプラスミド２種類由来のＤ
ＮＡを、ジデオキシチェインターミネーション法（シー
クエナーゼキット，ユナイテッドステーツバイオケミカ
ルコーポレーション，クリーブランド，オハイオ州）を
用いてシークエンスして、ＬＥＵ２コード配列内部のＸ
ｈｏＩ ＤＮＡ断片の正確な方向を確認した。変えた内
在のＸｈｏＩ断片を有するＬＥＵ２遺伝子を含むプラス
ミドの１種類をｐＬＤ１０４９と命名した。
【００１９】次に、ｐＮＢ２５７由来のＤＮＡ約５００
ｎｇをＥｃｏＲＩで消化することによって、プラスミド
を線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬ
Ｄ１０４９から単離したヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２遺伝子を含む２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片
約２００ｎｇと連結した。得られた連結混合物１／５で
大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。
相当数の形質転換体コロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、各プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで消
化した。０．７％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気泳
動的に分離し、エチジウムブロマイドにより目に見える
ようにした。ＬＥＵ２遺伝子を含む２．５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片を含む形質転換体を、ｐＮＢ２５８と
命名した。プラスミドｐＮＢ２５８は、下記のアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５
−α形質転換体の形で寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９
３５３が付与されている。
ｎｇをＥｃｏＲＩで消化することによって、プラスミド
を線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬ
Ｄ１０４９から単離したヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２遺伝子を含む２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片
約２００ｎｇと連結した。得られた連結混合物１／５で
大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。
相当数の形質転換体コロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、各プラスミドＤＮＡ１〜２μｇをＥｃｏＲＩで消
化した。０．７％アガロースゲルでＤＮＡ断片を電気泳
動的に分離し、エチジウムブロマイドにより目に見える
ようにした。ＬＥＵ２遺伝子を含む２．５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片を含む形質転換体を、ｐＮＢ２５８と
命名した。プラスミドｐＮＢ２５８は、下記のアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５
−α形質転換体の形で寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９
３５３が付与されている。
【００２０】ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子
プロモーターヌクレオチド配列における欠失のシリーズ
を以下のようにして調製した。配列番号４〜８及び１２
で表わされる配列から作製された下記の欠失は、約５０
塩基対の間隔で間が開けられていた。配列番号９、１
０、及び１１で表わされる配列から作製された欠失は、
ＬＥＵ２遺伝子の推定ＴＡＴＡボックス内部の一塩基変
化を生じさせ、配列番号９で表わされる配列では、ＬＥ
Ｕ２遺伝子の第７２４位のヌクレオチドをＡからＧに変
化させ；配列番号１０で表わされる配列では、ＬＥＵ２
遺伝子の第７２５位のヌクレオチドをＴからＧに変化さ
せ；配列番号１１で表わされる配列では、ＬＥＵ２遺伝
子の第７２２位のヌクレオチドをＡからＧに変化させ
た。更に、作製しようとする配列のサブクローニングに
おける今後の使用のために、適当な制限酵素部位（例え
ば、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）を提供するように、プ
ライマーを設計した。本開示により実施可能な当業者で
あれば、本発明により、あるいは他の適当な制限部位の
使用により、任意の間隔又は複数間隔で任意の欠失又は
一連の欠失の調製が可能であることを理解することがで
きよう。
プロモーターヌクレオチド配列における欠失のシリーズ
を以下のようにして調製した。配列番号４〜８及び１２
で表わされる配列から作製された下記の欠失は、約５０
塩基対の間隔で間が開けられていた。配列番号９、１
０、及び１１で表わされる配列から作製された欠失は、
ＬＥＵ２遺伝子の推定ＴＡＴＡボックス内部の一塩基変
化を生じさせ、配列番号９で表わされる配列では、ＬＥ
Ｕ２遺伝子の第７２４位のヌクレオチドをＡからＧに変
化させ；配列番号１０で表わされる配列では、ＬＥＵ２
遺伝子の第７２５位のヌクレオチドをＴからＧに変化さ
せ；配列番号１１で表わされる配列では、ＬＥＵ２遺伝
子の第７２２位のヌクレオチドをＡからＧに変化させ
た。更に、作製しようとする配列のサブクローニングに
おける今後の使用のために、適当な制限酵素部位（例え
ば、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）を提供するように、プ
ライマーを設計した。本開示により実施可能な当業者で
あれば、本発明により、あるいは他の適当な制限部位の
使用により、任意の間隔又は複数間隔で任意の欠失又は
一連の欠失の調製が可能であることを理解することがで
きよう。
【００２１】以下の５’プライマーを、ミリジェン・サ
イクロン・プラス（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ Ｃｙｃｌｏｎｅ
Ｐｌｕｓ）・シンセサイザー（モデル８４００；ミリ
ポアコーポレーション，ベッドフォード，マサチューセ
ッツ州）を使用して合成した。前記のように、今後のサ
ブクローニングに適した制限酵素部位及び種々の５’末
端を有するヌクレオチド配列が得られるように、プライ
マーを設計した。調製したプライマーを以下の表にし
た。
イクロン・プラス（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ Ｃｙｃｌｏｎｅ
Ｐｌｕｓ）・シンセサイザー（モデル８４００；ミリ
ポアコーポレーション，ベッドフォード，マサチューセ
ッツ州）を使用して合成した。前記のように、今後のサ
ブクローニングに適した制限酵素部位及び種々の５’末
端を有するヌクレオチド配列が得られるように、プライ
マーを設計した。調製したプライマーを以下の表にし
た。
【００２２】《表Ｉ》 配列 得られたＬＥＵ２ ヌクレオチド配列 番号 遺伝子の５’末端 GCAGGATCCG AATTCCTTGA CGATCTCGTA TGTC ４ ５５９ GCAGGATCCG AATTCGCTGG GGTACGTTCG ATAG ５ ５９９ GCAGGATCCG AATTCTAGCC GATACCGCAC TACC ６ ６４８ GCAGGATCCG AATTCTCTTC CACATAGCAC GGGC ７ ６９３ GCAGGATCCG AATTCCGTAT ATATACAAGA GCGTTTGCC ８ ７１８ GCAGGATCCG AATTCCGTAT GTATACAAGA GCGTTTGCC ９ ７１８ GCAGGATCCG AATTCCGTAT AGATACAAGA GCGTTTGCC １０ ７１８ GCAGGATCCG AATTCCGTGT ATATACAAGA GCGTTTGCC １１ ７１８GCAGGATCCG AATTCCCACA GATTTTCACT CC １２ ７４５
【００２３】前記表Ｉのリストにあげた各プライマー
は、その５’末端方向に向かってＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩの制限酵素認識部位を含む。
は、その５’末端方向に向かってＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩの制限酵素認識部位を含む。
【００２４】ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２構造遺
伝子ヌクレオチド配列は、配列番号１で表わされる配列
の第７９９番目のヌクレオチドで始まる。３’プライマ
ーを調製し、ＬＥＵ２遺伝子の構造的コード領域内部に
便利な制限部位が含まれるように、その配列を選んだ。
選んだ部位は、配列番号１で表わされる配列の第９１９
番目のヌクレオチドに位置するＳｔｕＩ部位であった。
当然、他の適当な制限酵素部位を使用することもでき
た。下記の構築において使用した３’プライマーは、ヌ
クレオチド配列：ＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧ ＧＴＧＣＣＧ
ＧＡＧＧ ＣＣ（配列番号１３）を含んでいた。表Ｉに
リストアップした５’プライマーの調製用の前記方法に
従って、３’プライマーを調製した。
伝子ヌクレオチド配列は、配列番号１で表わされる配列
の第７９９番目のヌクレオチドで始まる。３’プライマ
ーを調製し、ＬＥＵ２遺伝子の構造的コード領域内部に
便利な制限部位が含まれるように、その配列を選んだ。
選んだ部位は、配列番号１で表わされる配列の第９１９
番目のヌクレオチドに位置するＳｔｕＩ部位であった。
当然、他の適当な制限酵素部位を使用することもでき
た。下記の構築において使用した３’プライマーは、ヌ
クレオチド配列：ＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧ ＧＴＧＣＣＧ
ＧＡＧＧ ＣＣ（配列番号１３）を含んでいた。表Ｉに
リストアップした５’プライマーの調製用の前記方法に
従って、３’プライマーを調製した。
【００２５】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用
することによって、前記表Ｉにリストアップしたプライ
マーの５’末端に相当する５’末端と、配列番号１３で
表わされる配列の３’プライマーの３’末端に相当する
３’末端とを有する、ヌクレオチド配列の多数コピーを
調製した。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）ＰＣＲ試薬キット
（カタログ番号Ｎ８０１−００５５）を使用してパーキ
ンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラー（Ｔｈｅ
ｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（ノーウォーク，コネチカッ
ト州）で実施した。反応混合物は、総容量１００μｌ中
に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００
μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、
１μＭ５’プライマー、１μＭ３’プライマー、アンプ
リタック（ａｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ２．
５ユニット、並びにｐＮＢ２５８ＤＮＡ約１０ｎｇを含
有した。反応は、以下のパラメーター（９４℃で１．５
分間溶融、５０℃で２分間アニール、７２℃で３分間伸
長）を使用して３０回実施した。
することによって、前記表Ｉにリストアップしたプライ
マーの５’末端に相当する５’末端と、配列番号１３で
表わされる配列の３’プライマーの３’末端に相当する
３’末端とを有する、ヌクレオチド配列の多数コピーを
調製した。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス（Ｐｅ
ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）ＰＣＲ試薬キット
（カタログ番号Ｎ８０１−００５５）を使用してパーキ
ンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラー（Ｔｈｅ
ｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（ノーウォーク，コネチカッ
ト州）で実施した。反応混合物は、総容量１００μｌ中
に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ
塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００
μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、
１μＭ５’プライマー、１μＭ３’プライマー、アンプ
リタック（ａｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ２．
５ユニット、並びにｐＮＢ２５８ＤＮＡ約１０ｎｇを含
有した。反応は、以下のパラメーター（９４℃で１．５
分間溶融、５０℃で２分間アニール、７２℃で３分間伸
長）を使用して３０回実施した。
【００２６】欠失させたプロモーターを伴う改変ヤロウ
ィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子は、以下のようにし
た、そして図１〜図４に示すようにして構築した。直前
の記載のようにして調製したＰＣＲで作製の各ＤＮＡ断
片を、ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩで消化し、ゲルで単離し
た。プラスミドｐＮＢ２５８ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＳ
ｔｕＩで消化することによって、野生型ＬＥＵ２プロモ
ーター、ＰＣＲで作製した各ＤＮＡ断片の３’末端を構
成するＳｔｕＩ部位までのＬＥＵ２コード配列、及びＬ
ＥＵ２遺伝子内部の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断
片を除去した。６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ Ｄ
ＮＡベクター断片、及び０．６８ｋｂのＳｔｕＩ間ＤＮ
Ａ断片を、電気泳動を使用してゲルで単離した。次に、
ＰＣＲで作製した各断片約２００ｎｇを、別々の反応液
中で、６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡ断片
約５００ｎｇ、及び０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断
片２００ｎｇと連結した。各連結混合物約１／５で大腸
菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相当
数の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｔｕＩで別々に消化することによって、正し
いＤＮＡ断片を含む前記プラスミドを同定した。以下の
オリゴデオキシヌクレオチド［前記のように合成（配列
番号５及び１４で表わされる配列）、又は商品として入
手可能（Ｔ３プライマー；ストラトジーンクローニング
システム，ラホイラ，カリフォルニア州）］の１種又は
それ以上を、プライマーとして使用する、ジデオキシチ
ェインターミネーション法［タックトラック（ＴａｑＴ
ｒａｃｋ）シークエンシングシステム，プロメガ，マジ
ソン，ウイスコンシン］によって、正しいプラスミドを
シークエンスした： （１）５’−ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＧＴＣＧＧ−
３’（配列番号１４で表わされる配列）；本プライマー
は、内在の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断片内部の
ＬＥＵ２遺伝子配列とハイブリダイズし、ＰＣＲ ＤＮ
Ａ断片の３’末端のＳｔｕＩ部位から上流のＤＮＡ配列
情報を与えるように設計された； （２）配列番号５で表わされる配列；本プライマーは、
オープンリーディングフレームの５’でＬＥＵ２配列に
ハイブリダイズし、プロモーター領域の３’末端から下
流方向にＬＥＵ２オープンリーディングフレームを経由
する配列情報を与えた。 （３）ＰＣＲで作製したＤＮＡ断片の５’末端の上流の
ベクター配列にハイブリダイズした市販のＴ３プライマ
ー。 こうして得られたＤＮＡ配列情報を使用して、内在のＳ
ｔｕＩ ＤＮＡ断片の方向が正しいか、そしてＰＣＲで
作製したＤＮＡ配列が本来のものであるかを決定した。
ィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子は、以下のようにし
た、そして図１〜図４に示すようにして構築した。直前
の記載のようにして調製したＰＣＲで作製の各ＤＮＡ断
片を、ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩで消化し、ゲルで単離し
た。プラスミドｐＮＢ２５８ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＳ
ｔｕＩで消化することによって、野生型ＬＥＵ２プロモ
ーター、ＰＣＲで作製した各ＤＮＡ断片の３’末端を構
成するＳｔｕＩ部位までのＬＥＵ２コード配列、及びＬ
ＥＵ２遺伝子内部の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断
片を除去した。６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ Ｄ
ＮＡベクター断片、及び０．６８ｋｂのＳｔｕＩ間ＤＮ
Ａ断片を、電気泳動を使用してゲルで単離した。次に、
ＰＣＲで作製した各断片約２００ｎｇを、別々の反応液
中で、６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡ断片
約５００ｎｇ、及び０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断
片２００ｎｇと連結した。各連結混合物約１／５で大腸
菌株ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相当
数の形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｔｕＩで別々に消化することによって、正し
いＤＮＡ断片を含む前記プラスミドを同定した。以下の
オリゴデオキシヌクレオチド［前記のように合成（配列
番号５及び１４で表わされる配列）、又は商品として入
手可能（Ｔ３プライマー；ストラトジーンクローニング
システム，ラホイラ，カリフォルニア州）］の１種又は
それ以上を、プライマーとして使用する、ジデオキシチ
ェインターミネーション法［タックトラック（ＴａｑＴ
ｒａｃｋ）シークエンシングシステム，プロメガ，マジ
ソン，ウイスコンシン］によって、正しいプラスミドを
シークエンスした： （１）５’−ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＧＴＣＧＧ−
３’（配列番号１４で表わされる配列）；本プライマー
は、内在の０．６８ｋｂのＳｔｕＩ ＤＮＡ断片内部の
ＬＥＵ２遺伝子配列とハイブリダイズし、ＰＣＲ ＤＮ
Ａ断片の３’末端のＳｔｕＩ部位から上流のＤＮＡ配列
情報を与えるように設計された； （２）配列番号５で表わされる配列；本プライマーは、
オープンリーディングフレームの５’でＬＥＵ２配列に
ハイブリダイズし、プロモーター領域の３’末端から下
流方向にＬＥＵ２オープンリーディングフレームを経由
する配列情報を与えた。 （３）ＰＣＲで作製したＤＮＡ断片の５’末端の上流の
ベクター配列にハイブリダイズした市販のＴ３プライマ
ー。 こうして得られたＤＮＡ配列情報を使用して、内在のＳ
ｔｕＩ ＤＮＡ断片の方向が正しいか、そしてＰＣＲで
作製したＤＮＡ配列が本来のものであるかを決定した。
【００２７】
【実施例２】《欠失させたＬＥＵ２遺伝子（ＬＥＵ２
Δ）を有するヤロウィア・リポリティカ宿主株の構築》
本発明の欠失ＬＥＵ２遺伝子の配列と相同的なＬＥＵ２
配列を欠失させた、ヤロウィア・リポリティカ宿主株を
構築した。前記株を構築するために、以下のプラスミド
（ｐＮＢ２４３）を調製した。図５〜図７に、前記プラ
スミドの構築を模式的に示す。ｐＬＤ１０６由来のＵＲ
Ａ３遺伝子を含む１．７ｋｂのＳａｌＩ断片を、クレノ
ウポリメラーゼのラージフラグメントで末端を埋めるこ
とにより平滑末端に変換し、１．７ｋｂのＳａｌＩ平滑
化断片約２００ｎｇを、ＥｃｏＲＩ消化、クレノウ平滑
化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター（ストラトジ
ーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリフォルニ
ア州）約５００ｎｇに連結した。また、平滑化ＵＲＡ３
遺伝子も、例えば、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIによる消
化、並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化によっ
て、前記のｐＮＢ２５８から回収することができる。連
結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形
質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ制限酵素
で消化した。１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動
的に分離し、エチジウムブロマイドによる染色によって
目に見えるようにした。
Δ）を有するヤロウィア・リポリティカ宿主株の構築》
本発明の欠失ＬＥＵ２遺伝子の配列と相同的なＬＥＵ２
配列を欠失させた、ヤロウィア・リポリティカ宿主株を
構築した。前記株を構築するために、以下のプラスミド
（ｐＮＢ２４３）を調製した。図５〜図７に、前記プラ
スミドの構築を模式的に示す。ｐＬＤ１０６由来のＵＲ
Ａ３遺伝子を含む１．７ｋｂのＳａｌＩ断片を、クレノ
ウポリメラーゼのラージフラグメントで末端を埋めるこ
とにより平滑末端に変換し、１．７ｋｂのＳａｌＩ平滑
化断片約２００ｎｇを、ＥｃｏＲＩ消化、クレノウ平滑
化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベクター（ストラトジ
ーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリフォルニ
ア州）約５００ｎｇに連結した。また、平滑化ＵＲＡ３
遺伝子も、例えば、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIによる消
化、並びにＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑化によっ
て、前記のｐＮＢ２５８から回収することができる。連
結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに形
質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体からプラスミド
ＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ制限酵素
で消化した。１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動
的に分離し、エチジウムブロマイドによる染色によって
目に見えるようにした。
【００２８】正しいプラスミドは、ＵＲＡ３配列を含む
１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含み、ｐＮＢ２４１と命名し
た。次に、ｐＮＢ２４１ＤＮＡ５００ｎｇを、ＳａｌＩ
で消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬＤ
２８由来の５．３ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片（ＬＥＵ
２コード配列と、ヤロウィア・リポリティカ染色体内の
ＬＥＵ２フランキングＤＮＡ配列とを含む断片）２００
ｎｇと一緒に連結した。プラスミドｐＬＤ２８は、米国
特許第５，０７１，７６４号明細書に開示され、米国特
許第４，８８０，７４１号明細書に開示及びクレームさ
れている。連結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを
形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ
プレートに形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体か
らＤＮＡを調製し、ＳａｌＩで消化した。１．０％アガ
ロースゲルで断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブ
ロマイドによる染色によって目に見えるようにした。正
しいプラスミドを消化すると、５．３ｋｂのＳａｌＩ
ＤＮＡ断片が放出された。このプラスミドをｐＮＢ２４
２と命名した。次に、プラスミドｐＮＢ２４２由来のＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによって、ＬＥＵ２コ
ード配列を含む１．６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断片を放
出した。残った７．４ｋｂの線状ベクターを、電気泳動
的にゲルで単離し、連結し、連結混合物を使用して大腸
菌株ＤＨ５−αを形質転換した。１００μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相
当数の形質転換体からＤＮＡを単離し、ＳａｌＩで消化
し、１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離
した。正しいプラスミド（ｐＮＢ２４３）は、２．８ｋ
ｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片を含んでいた。
１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含み、ｐＮＢ２４１と命名し
た。次に、ｐＮＢ２４１ＤＮＡ５００ｎｇを、ＳａｌＩ
で消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、ｐＬＤ
２８由来の５．３ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片（ＬＥＵ
２コード配列と、ヤロウィア・リポリティカ染色体内の
ＬＥＵ２フランキングＤＮＡ配列とを含む断片）２００
ｎｇと一緒に連結した。プラスミドｐＬＤ２８は、米国
特許第５，０７１，７６４号明細書に開示され、米国特
許第４，８８０，７４１号明細書に開示及びクレームさ
れている。連結混合物約１／５で大腸菌株ＤＨ５−αを
形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ
プレートに形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体か
らＤＮＡを調製し、ＳａｌＩで消化した。１．０％アガ
ロースゲルで断片を電気泳動的に分離し、エチジウムブ
ロマイドによる染色によって目に見えるようにした。正
しいプラスミドを消化すると、５．３ｋｂのＳａｌＩ
ＤＮＡ断片が放出された。このプラスミドをｐＮＢ２４
２と命名した。次に、プラスミドｐＮＢ２４２由来のＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによって、ＬＥＵ２コ
ード配列を含む１．６及び０．９ｋｂのＤＮＡ断片を放
出した。残った７．４ｋｂの線状ベクターを、電気泳動
的にゲルで単離し、連結し、連結混合物を使用して大腸
菌株ＤＨ５−αを形質転換した。１００μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢプレートに形質転換体を蒔いた。相
当数の形質転換体からＤＮＡを単離し、ＳａｌＩで消化
し、１．０％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離
した。正しいプラスミド（ｐＮＢ２４３）は、２．８ｋ
ｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片を含んでいた。
【００２９】プラスミドｐＮＢ２４３は、ＸｈｏＩ制限
部位３箇所（ＵＲＡ３遺伝内部に２箇所、及びＬＥＵ２
の２．８ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片内部に１箇所）を
含む。以下のようにして、ＸｈｏＩでプラスミドｐＮＢ
２４３を部分的に消化することによって、ベクターを線
状化した。ｐＮＢ２４３ＤＮＡ約２μｇを、３７℃で
５、１０、及び２０分間、ＸｈｏＩ酵素１０ユニットで
それぞれ処理した。反応混合物のエタノール沈殿により
反応を止め、消化したＤＮＡのサンプルを０．８％アガ
ロースゲルで電気泳動的に分析した。５分の時点（この
時点が、７．４ｋｂの線状ベクターの割合がもっとも高
い）を選択し、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６
９（ＭＡＴＢ，ｂｉｏ６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），
ｌｅｕ２−４０，ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）の
形質転換用に使用した。ウラシルを欠く最少培地上に形
質転換体を蒔くことによって、Ｕｒａ＋形質転換体を選
択した。相当数のＵｒａ＋形質転換体からＤＮＡを単離
し、ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで別々に消化した。得られた
ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離し、
ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎナイロン膜（アマーシャ
ムコーポレーション，アーリントン・ハイツ，イリノイ
州）に転写した。ｐＮＢ２４３由来のＬＥＵ２の２．４
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片と、膜とをハ
イブリダイズさせた。元来あった７．５ｋｂのＳｐｈＩ
ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の消失と、新しい約１６ｋｂのＳ
ｐｈＩ ＤＮＡ断片の出現は、ベクターがＬＥＵ２遺伝
子座に適当に組み込まれたことを示した。５．３ｋｂの
ＳａｌＩ（元来あった）及び２．９ｋｂのＳａｌＩ（欠
失）ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の両方の出現は、野生型及び欠
失ＬＥＵ２遺伝子の両方が存在することを証明した。前
記形質転換体２種類をＮＢＬ４６１及びＮＢＬ４６２と
命名した。
部位３箇所（ＵＲＡ３遺伝内部に２箇所、及びＬＥＵ２
の２．８ｋｂのＳａｌＩ ＤＮＡ断片内部に１箇所）を
含む。以下のようにして、ＸｈｏＩでプラスミドｐＮＢ
２４３を部分的に消化することによって、ベクターを線
状化した。ｐＮＢ２４３ＤＮＡ約２μｇを、３７℃で
５、１０、及び２０分間、ＸｈｏＩ酵素１０ユニットで
それぞれ処理した。反応混合物のエタノール沈殿により
反応を止め、消化したＤＮＡのサンプルを０．８％アガ
ロースゲルで電気泳動的に分析した。５分の時点（この
時点が、７．４ｋｂの線状ベクターの割合がもっとも高
い）を選択し、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６
９（ＭＡＴＢ，ｂｉｏ６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），
ｌｅｕ２−４０，ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）の
形質転換用に使用した。ウラシルを欠く最少培地上に形
質転換体を蒔くことによって、Ｕｒａ＋形質転換体を選
択した。相当数のＵｒａ＋形質転換体からＤＮＡを単離
し、ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで別々に消化した。得られた
ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により分離し、
ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎナイロン膜（アマーシャ
ムコーポレーション，アーリントン・ハイツ，イリノイ
州）に転写した。ｐＮＢ２４３由来のＬＥＵ２の２．４
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片と、膜とをハ
イブリダイズさせた。元来あった７．５ｋｂのＳｐｈＩ
ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の消失と、新しい約１６ｋｂのＳ
ｐｈＩ ＤＮＡ断片の出現は、ベクターがＬＥＵ２遺伝
子座に適当に組み込まれたことを示した。５．３ｋｂの
ＳａｌＩ（元来あった）及び２．９ｋｂのＳａｌＩ（欠
失）ＬＥＵ２ＤＮＡ断片の両方の出現は、野生型及び欠
失ＬＥＵ２遺伝子の両方が存在することを証明した。前
記形質転換体２種類をＮＢＬ４６１及びＮＢＬ４６２と
命名した。
【００３０】非選択的条件下で、ＮＢＬ４６１及びＮＢ
Ｌ４６２を、富養なＹＰＤ培地で２日間増殖させると、
相同組換えによりＵＲＡ３マーカーの消失又は「ポップ
アウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）」が起こった。次に、Ｂｏｅ
ｋｅ，Ｊ．Ｄ．らの記載［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４：１６４−１７５（１９８
７）］のように、ロイシン及びウラシルを補充した５−
フルオロウラシル選択プレート上に細胞を蒔いた。５−
フルオロウラシル（ｕｒａ −）の生き残り数種からＤＮ
Ａを調製し、ＳａｌＩで消化し、プローブとしてｐＮＢ
２４３の０．４ｋｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を使用
する前記のサザンハイブリダイゼーション分析によりス
クリーニングした。形質転換体２種類（ＮＢＬ４６３及
びＮＢＬ４６４）は、野生型サイズのＳａｌＩ断片を消
失しており、ＬＥＵ２ΔサイズのＳａｌＩ断片のみを保
持していた。以下のリストにあげた株は、ブタペスト条
約の条件下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（１２３０１パークローン・ドライブ，ロックビ
ル，メリーランド州２０８５２，米国）に１９９３年７
月２２日に寄託された。前記機関は、仮に本願に特許が
付与された場合に、公衆による容易な入手可能性と、寄
託の永続性とを提供する、認定された寄託機関である。
本願の対応出願又はその派生出願が出願されている外国
の特許法に従って、並びに米国特許法施行規則第１．１
４条及び米国特許法第１２２条に基づいて、資格を与え
られ、米国特許商標庁長官により決定された者は、本願
の係属期間中にその寄託を利用することができる。寄託
された微生物の公衆への入手可能性におけるすべての制
限は、特許の付与により取り除かれ、再び制限されるこ
とはない。 株 ＡＴＣＣ寄託番号 ヤロウィア・リポリティカＮＢＬ４６４ ＡＴＣＣ７４２３４ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ２５８ ＡＴＣＣ６９３５３ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ６５０ ＡＴＣＣ６９３５４ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ２６８ ＡＴＣＣ６９３５５
Ｌ４６２を、富養なＹＰＤ培地で２日間増殖させると、
相同組換えによりＵＲＡ３マーカーの消失又は「ポップ
アウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）」が起こった。次に、Ｂｏｅ
ｋｅ，Ｊ．Ｄ．らの記載［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４：１６４−１７５（１９８
７）］のように、ロイシン及びウラシルを補充した５−
フルオロウラシル選択プレート上に細胞を蒔いた。５−
フルオロウラシル（ｕｒａ −）の生き残り数種からＤＮ
Ａを調製し、ＳａｌＩで消化し、プローブとしてｐＮＢ
２４３の０．４ｋｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を使用
する前記のサザンハイブリダイゼーション分析によりス
クリーニングした。形質転換体２種類（ＮＢＬ４６３及
びＮＢＬ４６４）は、野生型サイズのＳａｌＩ断片を消
失しており、ＬＥＵ２ΔサイズのＳａｌＩ断片のみを保
持していた。以下のリストにあげた株は、ブタペスト条
約の条件下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（１２３０１パークローン・ドライブ，ロックビ
ル，メリーランド州２０８５２，米国）に１９９３年７
月２２日に寄託された。前記機関は、仮に本願に特許が
付与された場合に、公衆による容易な入手可能性と、寄
託の永続性とを提供する、認定された寄託機関である。
本願の対応出願又はその派生出願が出願されている外国
の特許法に従って、並びに米国特許法施行規則第１．１
４条及び米国特許法第１２２条に基づいて、資格を与え
られ、米国特許商標庁長官により決定された者は、本願
の係属期間中にその寄託を利用することができる。寄託
された微生物の公衆への入手可能性におけるすべての制
限は、特許の付与により取り除かれ、再び制限されるこ
とはない。 株 ＡＴＣＣ寄託番号 ヤロウィア・リポリティカＮＢＬ４６４ ＡＴＣＣ７４２３４ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ２５８ ＡＴＣＣ６９３５３ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ６５０ ＡＴＣＣ６９３５４ 大腸菌ＤＨ５−α／ｐＮＢ２６８ ＡＴＣＣ６９３５５
【００３１】
【実施例３】《欠失ＬＥＵ２遺伝子の評価》前記のよう
にして調製したＬＥＵ２遺伝子プロモーター欠失プラス
ミドを評価するために、ヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２Δ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）を、ｐＮ
Ｂ２５８及び各ＬＥＵ２プロモーター欠失プラスミド
で、別々に形質転換した。ヤロウィア・リポリティカ染
色体のｕｒａ３Δ領域を標的として、相同組換えによる
組込みを行うために、形質転換の前に各プラスミドをＰ
ｓｔＩで消化した。ウラシルを含まない完全最少培地で
形質転換体を選択し、次に、ロイシンを欠く完全最少培
地での増殖能により、Ｕｒａ ＋形質転換体からＬｅｕ表
現型をスクリーニングした。そのスクリーニングの結果
を以下の表にした。
にして調製したＬＥＵ２遺伝子プロモーター欠失プラス
ミドを評価するために、ヤロウィア・リポリティカＬＥ
Ｕ２Δ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）を、ｐＮ
Ｂ２５８及び各ＬＥＵ２プロモーター欠失プラスミド
で、別々に形質転換した。ヤロウィア・リポリティカ染
色体のｕｒａ３Δ領域を標的として、相同組換えによる
組込みを行うために、形質転換の前に各プラスミドをＰ
ｓｔＩで消化した。ウラシルを含まない完全最少培地で
形質転換体を選択し、次に、ロイシンを欠く完全最少培
地での増殖能により、Ｕｒａ ＋形質転換体からＬｅｕ表
現型をスクリーニングした。そのスクリーニングの結果
を以下の表にした。
【００３２】《表II》プラスミド ロイシンを欠く完全最少培地での増殖 ｐＮＢ２５８ 良 ｐＮＢ２７１ 良 ｐＮＢ２７２ 良ｐＮＢ２７６ 劣
【００３３】プラスミドｐＮＢ２７６は、弱い相補性を
示すＬＥＵ２遺伝子を含み、従って、ＬＥＵ２遺伝子の
第６９３番目の位置に５’末端を有する、欠失ＬＥＵ２
遺伝子プロモーターを含む。ｐＮＢ６５６（ＬＥＵ２遺
伝子の第７１８番位の５’末端）、ｐＮＢ６５２（ＬＥ
Ｕ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及び第７２４番
位のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、ｐＮＢ６５３
（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及び第７
２５番位のＴに代わりヌクレオチドＧを含む）、ｐＮＢ
６５４（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及
び第７２２番位のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、
及びｐＮＢ３１３（ＬＥＵ２遺伝子の第７４５番位の
５’末端）と命名したプラスミドに含まれ、かつ本発明
により製造される、他のＬＥＵ２プロモーター欠失遺伝
子は、同様の結果を与えた。
示すＬＥＵ２遺伝子を含み、従って、ＬＥＵ２遺伝子の
第６９３番目の位置に５’末端を有する、欠失ＬＥＵ２
遺伝子プロモーターを含む。ｐＮＢ６５６（ＬＥＵ２遺
伝子の第７１８番位の５’末端）、ｐＮＢ６５２（ＬＥ
Ｕ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及び第７２４番
位のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、ｐＮＢ６５３
（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及び第７
２５番位のＴに代わりヌクレオチドＧを含む）、ｐＮＢ
６５４（ＬＥＵ２遺伝子の第７１８番位の５’末端、及
び第７２２番位のＡに代わりヌクレオチドＧを含む）、
及びｐＮＢ３１３（ＬＥＵ２遺伝子の第７４５番位の
５’末端）と命名したプラスミドに含まれ、かつ本発明
により製造される、他のＬＥＵ２プロモーター欠失遺伝
子は、同様の結果を与えた。
【００３４】
【実施例４】《ｒＤＮＡ配列を含む多重組込みベクター
の構築》図８〜図１０に、多重組込みベクター（ｐＮＢ
３０８）の構築を模式的に示す。前記のようにして調製
及び同定したプラスミドｐＮＢ２７６を、そのプラスミ
ドのポリクローニング領域内部のＳａｃII部位の欠失に
より、改変した。欠失は、ＳａｃIIでｐＮＢ２７６を消
化することにより行った。続いて、ＳａｃIIで消化した
ｐＮＢ２７６を、クレノウフラグメントで平滑末端化
し、次に平滑末端連結を行った。平滑末端連結したプラ
スミドを使用して大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、正し
い構築物（ｐＮＢ３０５）を制限分析により同定した。
ＨｉｎｄIIIでプラスミドＤＮＡを消化することによ
り、ｐＮＢ６５０からリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配
列を単離した。ｐＮＢ６５０は、ｒＤＮＡの２．８ｋｂ
のＮｃｏＩ断片を含み［Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ１０：４４９−４５２
（１９８６）］、その中のＮｃｏＩ部位は、クレノウフ
ラグメントによる平滑化、及びＨｉｎｄIIIリンカーと
の連結、それに続くＨｉｎｄIIIで消化したｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ（ストラトジーンクローニングシス
テムズ，ラホイラ，カリフォルニア州）との連結によっ
て、ＨｉｎｄIII部位に変換されていた。プラスミドｐ
ＮＢ６５０は、前記のように、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５−α形質転換体
の形で寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９３５４が付与さ
れている。ｐＮＢ６５０由来の断片を含む２．８ｋｂの
ＨｉｎｄIII ｒＤＮＡを、標準的アガロースゲル電気
泳動法により単離した。次に、単離した２．８ｋｂのＨ
ｉｎｄIII ｒＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄIII消化したｐＮ
Ｂ３０５に連結した。得られた連結混合物を使用して大
腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。相当数の形質転換体由
来のＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．７％アガロー
スゲルで断片を電気泳動的に分離した。正しいプラスミ
ドは、２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を含み、
ｐＮＢ３０８と命名した。
の構築》図８〜図１０に、多重組込みベクター（ｐＮＢ
３０８）の構築を模式的に示す。前記のようにして調製
及び同定したプラスミドｐＮＢ２７６を、そのプラスミ
ドのポリクローニング領域内部のＳａｃII部位の欠失に
より、改変した。欠失は、ＳａｃIIでｐＮＢ２７６を消
化することにより行った。続いて、ＳａｃIIで消化した
ｐＮＢ２７６を、クレノウフラグメントで平滑末端化
し、次に平滑末端連結を行った。平滑末端連結したプラ
スミドを使用して大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、正し
い構築物（ｐＮＢ３０５）を制限分析により同定した。
ＨｉｎｄIIIでプラスミドＤＮＡを消化することによ
り、ｐＮＢ６５０からリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配
列を単離した。ｐＮＢ６５０は、ｒＤＮＡの２．８ｋｂ
のＮｃｏＩ断片を含み［Ｃｌａｒｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ１０：４４９−４５２
（１９８６）］、その中のＮｃｏＩ部位は、クレノウフ
ラグメントによる平滑化、及びＨｉｎｄIIIリンカーと
の連結、それに続くＨｉｎｄIIIで消化したｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ＋ＳＫ（ストラトジーンクローニングシス
テムズ，ラホイラ，カリフォルニア州）との連結によっ
て、ＨｉｎｄIII部位に変換されていた。プラスミドｐ
ＮＢ６５０は、前記のように、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに大腸菌ＤＨ５−α形質転換体
の形で寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６９３５４が付与さ
れている。ｐＮＢ６５０由来の断片を含む２．８ｋｂの
ＨｉｎｄIII ｒＤＮＡを、標準的アガロースゲル電気
泳動法により単離した。次に、単離した２．８ｋｂのＨ
ｉｎｄIII ｒＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄIII消化したｐＮ
Ｂ３０５に連結した。得られた連結混合物を使用して大
腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。相当数の形質転換体由
来のＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、０．７％アガロー
スゲルで断片を電気泳動的に分離した。正しいプラスミ
ドは、２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を含み、
ｐＮＢ３０８と命名した。
【００３５】
【実施例５】《多重組込みベクターを含むヤロウィア・
リポリティカ株の構築》前記のようにして調製したプラ
スミドｐＮＢ３０８を、そのプラスミドのｒＤＮＡ配列
内部で１回切断するＳａｃIIで消化した。宿主のヤロウ
ィア・リポリティカ株の反復ｒＤＮＡ配列を標的とし
て、相同組換えによる線状プラスミドの組み込みを行っ
た。前記の標準手法に従って、ヤロウィア・リポリティ
カ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）をＳａｃII消
化したｐＮＢ３０８で形質転換した。ロイシンを含まな
い完全最少培地で形質転換体を選択した。大型及び小型
のコロニータイプのＬｅｕ＋ 形質転換体が現われた。
リポリティカ株の構築》前記のようにして調製したプラ
スミドｐＮＢ３０８を、そのプラスミドのｒＤＮＡ配列
内部で１回切断するＳａｃIIで消化した。宿主のヤロウ
ィア・リポリティカ株の反復ｒＤＮＡ配列を標的とし
て、相同組換えによる線状プラスミドの組み込みを行っ
た。前記の標準手法に従って、ヤロウィア・リポリティ
カ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）をＳａｃII消
化したｐＮＢ３０８で形質転換した。ロイシンを含まな
い完全最少培地で形質転換体を選択した。大型及び小型
のコロニータイプのＬｅｕ＋ 形質転換体が現われた。
【００３６】大型の形質転換体コロニーからＤＮＡを単
離し、ＳａｌＩで消化し、アガロースゲルで泳動し、ハ
イボンドＮ膜に転写し、ＵＲＡ３ＤＮＡの０．４９ｋｂ
のＢｓｔＸＩ−ＳａｌＩ断片［染色体ｕｒａ３Δ遺伝子
（１．０ｋｂのＳａｌＩ断片上）の単一コピー、及びｐ
ＮＢ３０８由来のＵＲＡ３（３．５ｋｂのＳａｌＩ断片
上）の各コピーの両方にハイブリダイズすることができ
る］をプローブにして調べた。ベータ−スコープ６０３
ブロットアナライザー（ベータジェン，ウォルトハム，
マサチューセッツ州）を使用してハイブリダイゼーショ
ンシグナルを定量化し、１．０ｋｂバンドと比較して
３．５ｋｂバンドの総カウント数が何倍であるかを計算
することによって、各形質転換体のプラスミドコピー数
を決定した。サザン分析により調べた形質転換体のコピ
ー数を、以下の表IIIにまとめる。
離し、ＳａｌＩで消化し、アガロースゲルで泳動し、ハ
イボンドＮ膜に転写し、ＵＲＡ３ＤＮＡの０．４９ｋｂ
のＢｓｔＸＩ−ＳａｌＩ断片［染色体ｕｒａ３Δ遺伝子
（１．０ｋｂのＳａｌＩ断片上）の単一コピー、及びｐ
ＮＢ３０８由来のＵＲＡ３（３．５ｋｂのＳａｌＩ断片
上）の各コピーの両方にハイブリダイズすることができ
る］をプローブにして調べた。ベータ−スコープ６０３
ブロットアナライザー（ベータジェン，ウォルトハム，
マサチューセッツ州）を使用してハイブリダイゼーショ
ンシグナルを定量化し、１．０ｋｂバンドと比較して
３．５ｋｂバンドの総カウント数が何倍であるかを計算
することによって、各形質転換体のプラスミドコピー数
を決定した。サザン分析により調べた形質転換体のコピ
ー数を、以下の表IIIにまとめる。
【００３７】
【００３８】ベクターがｒＤＮＡ内部に組み込まれたか
を確認するために、形質転換体ＤＮＡを、ｒＤＮＡ配列
内部のそのプラスミド内部で１回切断するＳａｃIIで消
化し、アガロースゲルで泳動し、ハイボンドＮ膜に転写
し、ＵＲＡ３由来の０．４９ｋｂのＢｓｔＸＩ−Ｓａｌ
Ｉ ＤＮＡ断片をプローブにして調べた。１０．８ｋｂ
バンド（もとのままのプラスミドのサイズ）が検出さ
れ、このことは、ｒＤＮＡ内部にベクターが組み込ま
れ、しかも大きな再配列がないことを裏付けた。形質転
換体８及び９の安定性を調べた。形質転換体８及び９
を、別々のＹＰＤ培地に１：１００で接種し、２８℃で
２４時間増殖させ、新しいＹＰＤ培地中に１：１００で
希釈して再増殖させ、合計３サイクル行った。２４、４
８、及び７２時間（約１２、２４、及び３６世代に相
当）で、細胞をサンプリングした。細胞サンプルからＤ
ＮＡを調製し、前記のようにしてコピー数を分析した。
富養な非選択培地での継続的増殖中に、形質転換体８及
び９のコピー数は変化しなかった。
を確認するために、形質転換体ＤＮＡを、ｒＤＮＡ配列
内部のそのプラスミド内部で１回切断するＳａｃIIで消
化し、アガロースゲルで泳動し、ハイボンドＮ膜に転写
し、ＵＲＡ３由来の０．４９ｋｂのＢｓｔＸＩ−Ｓａｌ
Ｉ ＤＮＡ断片をプローブにして調べた。１０．８ｋｂ
バンド（もとのままのプラスミドのサイズ）が検出さ
れ、このことは、ｒＤＮＡ内部にベクターが組み込ま
れ、しかも大きな再配列がないことを裏付けた。形質転
換体８及び９の安定性を調べた。形質転換体８及び９
を、別々のＹＰＤ培地に１：１００で接種し、２８℃で
２４時間増殖させ、新しいＹＰＤ培地中に１：１００で
希釈して再増殖させ、合計３サイクル行った。２４、４
８、及び７２時間（約１２、２４、及び３６世代に相
当）で、細胞をサンプリングした。細胞サンプルからＤ
ＮＡを調製し、前記のようにしてコピー数を分析した。
富養な非選択培地での継続的増殖中に、形質転換体８及
び９のコピー数は変化しなかった。
【００３９】
【実施例７】《プロインシュリン類似体多重組込み発現
ベクターの構築》プロインシュリン類似体多重組込み発
現ベクターの構築における出発プラスミドは、プラスミ
ドｐＸＰＲＵＲＡｃａｓであり、前記プラスミドは、Ｘ
ＰＲ２プロモーター、プレ及びプロ配列、それに続く多
重クローニング部位、及びＸＰＲ２ターミネーター配
列、更には選択マーカーとしての野生型ＵＲＡ３遺伝子
を含む。図１１〜図１６に、プロインシュリン類似体多
重組込み発現ベクターの構築を示す。プラスミドｐＸＰ
ＲＵＲＡｃａｓを、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラー
ゼ処理により平滑化し、ＳａｃIIで再消化した。このベ
クター断片と、サイオスノバ社（Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖ
ａ，Ｉｎｃ．；マウンテンビュー，カリフォルニア州）
により供給されたプロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒ
ｐ）コード配列とを連結した。前記プロインシュリン類
似体コード配列は、以下の配列を有し、５’−平滑末端
及び３’−ＳａｃII制限末端を有した。 TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGATCCCAC CTGGTGGAAG CTCTCCACCT AAACACTTGG TTGTGGACAC GCCTAGGGTG GACCACCTTC GAGAGGTGGA AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGAGGG TCACACGCCC CTTGCTCCGA AGAAGATGTG TGGGTTCTGG GCGGCCTCCC CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGGGG CCCTGGTGCA GTCTCCTGGA CGTCCACCCC GTCCACCTCG ACCCGCCCCC GGGACCACGT GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT CCGTCGGACG TCGGGAACCG GGACCTCCCC AGGGACGTCT TCGCACCGTA TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACACCTTGTT ACGACATGGT CGTAGACGAG GGAGATGGTC GACCTCTTGA ACTGCAACTA GAAGCTTGGC CGC TGACGTTGAT CTTCGAACCG G
ベクターの構築》プロインシュリン類似体多重組込み発
現ベクターの構築における出発プラスミドは、プラスミ
ドｐＸＰＲＵＲＡｃａｓであり、前記プラスミドは、Ｘ
ＰＲ２プロモーター、プレ及びプロ配列、それに続く多
重クローニング部位、及びＸＰＲ２ターミネーター配
列、更には選択マーカーとしての野生型ＵＲＡ３遺伝子
を含む。図１１〜図１６に、プロインシュリン類似体多
重組込み発現ベクターの構築を示す。プラスミドｐＸＰ
ＲＵＲＡｃａｓを、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラー
ゼ処理により平滑化し、ＳａｃIIで再消化した。このベ
クター断片と、サイオスノバ社（Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖ
ａ，Ｉｎｃ．；マウンテンビュー，カリフォルニア州）
により供給されたプロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒ
ｐ）コード配列とを連結した。前記プロインシュリン類
似体コード配列は、以下の配列を有し、５’−平滑末端
及び３’−ＳａｃII制限末端を有した。 TTTGTGAACC AACACCTGTG CGGATCCCAC CTGGTGGAAG CTCTCCACCT AAACACTTGG TTGTGGACAC GCCTAGGGTG GACCACCTTC GAGAGGTGGA AGTGTGCGGG GAACGAGGCT TCTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGAGGG TCACACGCCC CTTGCTCCGA AGAAGATGTG TGGGTTCTGG GCGGCCTCCC CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGGGG CCCTGGTGCA GTCTCCTGGA CGTCCACCCC GTCCACCTCG ACCCGCCCCC GGGACCACGT GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT CCGTCGGACG TCGGGAACCG GGACCTCCCC AGGGACGTCT TCGCACCGTA TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACACCTTGTT ACGACATGGT CGTAGACGAG GGAGATGGTC GACCTCTTGA ACTGCAACTA GAAGCTTGGC CGC TGACGTTGAT CTTCGAACCG G
【００４０】下記の配列表のために、前記配列の内、
５’−３’一本鎖を配列番号１４で、３’−５’一本鎖
を配列番号１５で表わす。但し、配列番号１５で表わさ
れる配列では相当する５’−３’鎖として表わす。この
連結は、ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２プロ領域の
最後のコドンと、プロインシュリン類似体Ａ１４ｔｒｐ
の最初のコドンとの間で、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａ
ｍｅ）融合を創出した。連結混合物の一部で大腸菌ＤＨ
５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIIIで消化
し、０．８％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離
した。正しい構築物は、プロインシュリン類似体遺伝子
断片内部への付加的ＨｉｎｄIII部位の導入による、
２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片の放出を示し
た。ポジティブクローン数種類を同定及びシークエンス
することによって、ＸＰＲ２プロ領域とプロインシュリ
ン遺伝子との間の連結部の正確さ、及びＰＣＲで作製し
たプロインシュリン類似体遺伝子それ自体の正確さを保
証した。ＸＰＲ２のプロ領域内部にハイブリダイズする
プライマーと、タックトラックキット及びデアザ−ヌク
レオチド（プロメガ，マジソン，ウイスコンシン州）と
を使用してプラスミドＤＮＡをシークエンスすることに
よって、ＸＰＲ２プロ−プロインシュリン連結部を越
え、プロインシュリン遺伝子の端から端までの配列情報
が得られた。プライマーの配列は、ＴＡＣＡＣＧＧＡＴ
ＧＧＡＴＣＴＧＧ（配列番号１６）である。前記のプロ
インシュリン類似体発現ベクターの１つをｐＸＰＲＵＲ
ＡＩＮＳと命名した。
５’−３’一本鎖を配列番号１４で、３’−５’一本鎖
を配列番号１５で表わす。但し、配列番号１５で表わさ
れる配列では相当する５’−３’鎖として表わす。この
連結は、ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２プロ領域の
最後のコドンと、プロインシュリン類似体Ａ１４ｔｒｐ
の最初のコドンとの間で、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａ
ｍｅ）融合を創出した。連結混合物の一部で大腸菌ＤＨ
５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを
含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。相当数の形質転換体
からプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIIIで消化
し、０．８％アガロースゲルで断片を電気泳動的に分離
した。正しい構築物は、プロインシュリン類似体遺伝子
断片内部への付加的ＨｉｎｄIII部位の導入による、
２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片の放出を示し
た。ポジティブクローン数種類を同定及びシークエンス
することによって、ＸＰＲ２プロ領域とプロインシュリ
ン遺伝子との間の連結部の正確さ、及びＰＣＲで作製し
たプロインシュリン類似体遺伝子それ自体の正確さを保
証した。ＸＰＲ２のプロ領域内部にハイブリダイズする
プライマーと、タックトラックキット及びデアザ−ヌク
レオチド（プロメガ，マジソン，ウイスコンシン州）と
を使用してプラスミドＤＮＡをシークエンスすることに
よって、ＸＰＲ２プロ−プロインシュリン連結部を越
え、プロインシュリン遺伝子の端から端までの配列情報
が得られた。プライマーの配列は、ＴＡＣＡＣＧＧＡＴ
ＧＧＡＴＣＴＧＧ（配列番号１６）である。前記のプロ
インシュリン類似体発現ベクターの１つをｐＸＰＲＵＲ
ＡＩＮＳと命名した。
【００４１】次に、プラスミドｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳを
ＭｌｕＩ（ＸＰＲ２プロモーター内部のユニーク部位）
及びＳａｃII（プロインシュリン類似体遺伝子の３’末
端のユニーク部位）で消化し、１．７ｋｂのＤＮＡ断片
を電気泳動的にゲル単離した。１．７ｋｂのＤＮＡ断片
と、ＭｌｕＩ及びＳａｃIIでｐＸＰＲＬＥＵｃａｓを消
化することによって生じる７．３ｋｂのＤＮＡ断片とを
連結した。プラスミドｐＸＰＲＬＥＵｃａｓ（ｐＮＢ２
６８とも称する）は、前記のアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６
９３５５が付与されている。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。いくつかの形質転換体
からＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIIIで消化することによ
って、図１３に示す正しいプラスミド（ｐＸＰＲＬＥＵ
ＩＮＳと命名）を同定した。
ＭｌｕＩ（ＸＰＲ２プロモーター内部のユニーク部位）
及びＳａｃII（プロインシュリン類似体遺伝子の３’末
端のユニーク部位）で消化し、１．７ｋｂのＤＮＡ断片
を電気泳動的にゲル単離した。１．７ｋｂのＤＮＡ断片
と、ＭｌｕＩ及びＳａｃIIでｐＸＰＲＬＥＵｃａｓを消
化することによって生じる７．３ｋｂのＤＮＡ断片とを
連結した。プラスミドｐＸＰＲＬＥＵｃａｓ（ｐＮＢ２
６８とも称する）は、前記のアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ６
９３５５が付与されている。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。いくつかの形質転換体
からＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄIIIで消化することによ
って、図１３に示す正しいプラスミド（ｐＸＰＲＬＥＵ
ＩＮＳと命名）を同定した。
【００４２】次に、プラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを
ＳａｃIIで消化し、クレノウフラグメントで処理するこ
とによって、平滑末端を作製し、再連結した。これによ
ってプロインシュリン類似体遺伝子の３’末端のＳａｃ
II部位は壊されるので、ｐＮＢ６５０のｒＤＮＡ断片内
部のＳａｃII部位は、唯一の部位となることができ、こ
の部位での消化を使用することにより、多重組込み発現
ベクターの組込みの標的をｒＤＮＡ遺伝子座とすること
ができた。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質
転換体を蒔いた。形質転換体ＤＮＡを調製し、ＳａｃII
で消化した。ＳａｃIIでの消化でそれ以上線状化されな
い、正しいプラスミドを同定した。このプラスミドをｐ
ＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（−ＳａｃII）と命名した。次に、
ＥｃｏＲＩでｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（−ＳａｃII）を消
化することによって、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、
７．４ｋｂベクター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した
欠失ＬＥＵ２（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂ
のＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で
大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲ
Ｉで制限消化することにより［野生型１．６及び０．９
ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥ
Ｕ遺伝子を含む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出す
る］、正しいプラスミドを同定した。この正しいプラス
ミドをｐＸＰＲ（ｄ）ＬＥＵＩＮＳと命名した。次に、
前記と同様にして、ＨｉｎｄIIIによる部分消化によっ
てこのプラスミドを線状化し、ウシ小腸ホスファターゼ
処理により脱リン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤ
ＮＡ配列を含む２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片
と連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質
転換体を蒔いた。ｒＤＮＡ配列がＸＰＲ２プロモーター
上流のＨｉｎｄIII部位に連結した、正しいプラスミド
を、ＥｃｏＲＩによる制限消化（４．９、５．４、及び
２．４ｋｂの断片を放出する）によって同定した。この
プラスミドをｐＭＩＶＩＮＳと命名した。
ＳａｃIIで消化し、クレノウフラグメントで処理するこ
とによって、平滑末端を作製し、再連結した。これによ
ってプロインシュリン類似体遺伝子の３’末端のＳａｃ
II部位は壊されるので、ｐＮＢ６５０のｒＤＮＡ断片内
部のＳａｃII部位は、唯一の部位となることができ、こ
の部位での消化を使用することにより、多重組込み発現
ベクターの組込みの標的をｒＤＮＡ遺伝子座とすること
ができた。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質
転換体を蒔いた。形質転換体ＤＮＡを調製し、ＳａｃII
で消化した。ＳａｃIIでの消化でそれ以上線状化されな
い、正しいプラスミドを同定した。このプラスミドをｐ
ＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（−ＳａｃII）と命名した。次に、
ＥｃｏＲＩでｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（−ＳａｃII）を消
化することによって、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、
７．４ｋｂベクター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した
欠失ＬＥＵ２（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂ
のＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で
大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲ
Ｉで制限消化することにより［野生型１．６及び０．９
ｋｂのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥ
Ｕ遺伝子を含む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出す
る］、正しいプラスミドを同定した。この正しいプラス
ミドをｐＸＰＲ（ｄ）ＬＥＵＩＮＳと命名した。次に、
前記と同様にして、ＨｉｎｄIIIによる部分消化によっ
てこのプラスミドを線状化し、ウシ小腸ホスファターゼ
処理により脱リン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤ
ＮＡ配列を含む２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片
と連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換
し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質
転換体を蒔いた。ｒＤＮＡ配列がＸＰＲ２プロモーター
上流のＨｉｎｄIII部位に連結した、正しいプラスミド
を、ＥｃｏＲＩによる制限消化（４．９、５．４、及び
２．４ｋｂの断片を放出する）によって同定した。この
プラスミドをｐＭＩＶＩＮＳと命名した。
【００４３】
【実施例８】《プロインシュリン類似体発現多重組込み
ベクター形質転換ヤロウィア・リポリティカの構築》Ｓ
ａｃIIでプラスミドｐＭＩＶＩＮＳを消化することによ
って、その標的をｒＤＮＡ遺伝子座とし、ヤロウィア・
リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）を
形質転換した。ロイシンを含まない完全最少培地上で、
２９℃で４８時間後に形質転換体が得られた。以下の表
IVにおいて１及び２で示す別々の実験における形質転換
体２組からＤＮＡを得た。ゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄII
I及びＥｃｏＲＩ（実験１）又はＨｉｎｄIII（実験２）
で消化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動的に断片
を分離し、ハイボンドＮ膜にブロッティングした。ＸＰ
Ｒ２のプロモーター領域から単離した０．８ｋｂのラベ
ル化ＰｓｔＩ−ＭｌｕＩ ＤＮＡ断片をプローブにして
膜を調べた。このプローブは、ＸＰＲ２のゲノムコピー
由来の３．７ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片（Ｈｉｎ
ｄIII−ＥｃｏＲＩ消化又はＨｉｎｄIII消化のいずれか
から）と、ｐＭＩＶＩＮＳ由来の２．８ｋｂのＨｉｎｄ
III ＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ消化又はＨ
ｉｎｄIII消化のいずれかから）とにハイブリダイズし
た。前記ベータ−スコープ６０３ブロットアナライザー
を使用してブロットをスキャンすることによって、各形
質転換体株に組み込まれたｐＭＩＶＩＮＳのコピー数を
決定した。また、同じ方法により、コントロール形質転
換体（ＮＢＬ４４９及びＮＢＬ４５１）（本発明の実施
には必要でなく、以下のようにして調製した）も分析し
た。
ベクター形質転換ヤロウィア・リポリティカの構築》Ｓ
ａｃIIでプラスミドｐＭＩＶＩＮＳを消化することによ
って、その標的をｒＤＮＡ遺伝子座とし、ヤロウィア・
リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴＣＣ７４２３４）を
形質転換した。ロイシンを含まない完全最少培地上で、
２９℃で４８時間後に形質転換体が得られた。以下の表
IVにおいて１及び２で示す別々の実験における形質転換
体２組からＤＮＡを得た。ゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄII
I及びＥｃｏＲＩ（実験１）又はＨｉｎｄIII（実験２）
で消化し、０．７％アガロースゲルで電気泳動的に断片
を分離し、ハイボンドＮ膜にブロッティングした。ＸＰ
Ｒ２のプロモーター領域から単離した０．８ｋｂのラベ
ル化ＰｓｔＩ−ＭｌｕＩ ＤＮＡ断片をプローブにして
膜を調べた。このプローブは、ＸＰＲ２のゲノムコピー
由来の３．７ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片（Ｈｉｎ
ｄIII−ＥｃｏＲＩ消化又はＨｉｎｄIII消化のいずれか
から）と、ｐＭＩＶＩＮＳ由来の２．８ｋｂのＨｉｎｄ
III ＤＮＡ断片（ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ消化又はＨ
ｉｎｄIII消化のいずれかから）とにハイブリダイズし
た。前記ベータ−スコープ６０３ブロットアナライザー
を使用してブロットをスキャンすることによって、各形
質転換体株に組み込まれたｐＭＩＶＩＮＳのコピー数を
決定した。また、同じ方法により、コントロール形質転
換体（ＮＢＬ４４９及びＮＢＬ４５１）（本発明の実施
には必要でなく、以下のようにして調製した）も分析し
た。
【００４４】コントロール形質転換体ＮＢＬ４４９及び
ＮＢＬ４５１を、以下のようにして調製した。ＸｈｏＩ
でプラスミドｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳを消化することによ
って、その組込みの標的をＵＲＡ３遺伝子座とし、ヤロ
ウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６９（ＭＡＴＢ，ｂｉ
ｏ−６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），ｌｅｕ２−４０，
ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）を形質転換した。ウ
ラシルを含まない完全最少培地に形質転換体を蒔くこと
によって、Ｕｒａ＋形質転換体を同定した。次に、Ｘｈ
ｏＩでプラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを消化すること
によって、その組込みの標的をＬＥＵ２遺伝子座とし、
ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６９と、直前の記
載のようにして得られたＵｒａ＋形質転換体とを別々に
形質転換するのに使用した。ロイシンを含まない、又は
ウラシル及びロイシンを含まない完全最少培地上に、各
形質転換の形質転換体を蒔くことによって、Ｌｅｕ＋及
びＬｅｕ＋Ｕｒａ＋形質転換体をそれぞれ同定した。１
コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを含むＬｅｕ＋形質転換
体をＮＢＬ４４９と命名した。１コピーのｐＸＰＲＵＲ
ＡＩＮＳ及び１コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（すなわ
ち、２コピーのプロインシュリン類似体コード配列）を
含むＬｅｕ＋Ｕｒａ＋形質転換体をＮＢＬ４５１と命名
した。以下の表IVに、前記のようにしてテストした形質
転換体株、並びにコントロール形質転換体ＮＢＬ４４９
及びＮＢＬ４５１のコピー数を示す。
ＮＢＬ４５１を、以下のようにして調製した。ＸｈｏＩ
でプラスミドｐＸＰＲＵＲＡＩＮＳを消化することによ
って、その組込みの標的をＵＲＡ３遺伝子座とし、ヤロ
ウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６９（ＭＡＴＢ，ｂｉ
ｏ−６：：ＢＩＯ（ｐＢＲ３２２），ｌｅｕ２−４０，
ｘｐｒ２−１００２，ｕｒａ３Δ）を形質転換した。ウ
ラシルを含まない完全最少培地に形質転換体を蒔くこと
によって、Ｕｒａ＋形質転換体を同定した。次に、Ｘｈ
ｏＩでプラスミドｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを消化すること
によって、その組込みの標的をＬＥＵ２遺伝子座とし、
ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ３６９と、直前の記
載のようにして得られたＵｒａ＋形質転換体とを別々に
形質転換するのに使用した。ロイシンを含まない、又は
ウラシル及びロイシンを含まない完全最少培地上に、各
形質転換の形質転換体を蒔くことによって、Ｌｅｕ＋及
びＬｅｕ＋Ｕｒａ＋形質転換体をそれぞれ同定した。１
コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳを含むＬｅｕ＋形質転換
体をＮＢＬ４４９と命名した。１コピーのｐＸＰＲＵＲ
ＡＩＮＳ及び１コピーのｐＸＰＲＬＥＵＩＮＳ（すなわ
ち、２コピーのプロインシュリン類似体コード配列）を
含むＬｅｕ＋Ｕｒａ＋形質転換体をＮＢＬ４５１と命名
した。以下の表IVに、前記のようにしてテストした形質
転換体株、並びにコントロール形質転換体ＮＢＬ４４９
及びＮＢＬ４５１のコピー数を示す。
【００４５】
【００４６】
【００４７】ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用し
て、ｐＭＩＶＩＮＳの多重コピーを含むヤロウィア・リ
ポリティカ形質転換体により分泌されるプロインシュリ
ン類似体関連物質の相対量を測定した。前記の形質転換
体株を、メジウムＡ（５％バクトペプトン，１％グルコ
ース，０．１％酵母抽出物）中で４８時間増殖させ、上
清を採取した。次に、市販のキット［インクスター（Ｉ
ｎｃｓｔａｒ）コーポレーション，スチルウォーター，
ニューメキシコ州］を使用して、インシュリンの遊離の
Ｃペプチドを測定する、ＣペプチドＲＩＡを実施した。
コピー数の増加に伴って、Ｃペプチド抗体に反応する物
質が増加することを見い出した。５コピーの形質転換体
は、単一コピーのプロインシュリン発現株に対して、約
４〜４．５倍量のＣペプチド関連タンパク質を分泌し
た。
て、ｐＭＩＶＩＮＳの多重コピーを含むヤロウィア・リ
ポリティカ形質転換体により分泌されるプロインシュリ
ン類似体関連物質の相対量を測定した。前記の形質転換
体株を、メジウムＡ（５％バクトペプトン，１％グルコ
ース，０．１％酵母抽出物）中で４８時間増殖させ、上
清を採取した。次に、市販のキット［インクスター（Ｉ
ｎｃｓｔａｒ）コーポレーション，スチルウォーター，
ニューメキシコ州］を使用して、インシュリンの遊離の
Ｃペプチドを測定する、ＣペプチドＲＩＡを実施した。
コピー数の増加に伴って、Ｃペプチド抗体に反応する物
質が増加することを見い出した。５コピーの形質転換体
は、単一コピーのプロインシュリン発現株に対して、約
４〜４．５倍量のＣペプチド関連タンパク質を分泌し
た。
【００４８】
【実施例９】《インシュリノトロピン多重組込み発現ベ
クターの構築》以下の工程に従って、インシュリノトロ
ピンをコードする合成遺伝子を調製した。以下の配列： ＣＡＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧ
ＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣ（配列番号１７）； ＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧ
ＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号１
８）； ＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧ
ＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧ
ＧＡＣＧＡＧＧＡＴＡＧＴ（配列番号１９）；及び ＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＡＡ
ＧＴＡＧＣＧＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴＣ（配列番号２０） を有する配列番号１７、１８、１９、及び２０で表わさ
れる配列は、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）バイオテク
ノロジーズ社（ウッドランズ，テキサス州）から得た。
次に、１００℃で１０分間加熱し、室温までゆっくりと
冷却することによって、配列番号１７及び１８で表わさ
れる配列を一緒にハイブリダイズさせ、同じ条件で配列
番号１９及び２０で表わされる配列を一緒にハイブリダ
イズさせた。得られたハイブリダイズした配列を、ポリ
ヌクレオチドキナーゼで処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結することによって、インシュリノトロピンを
コードし、かつＡｐａＩ粘着性５’末端及びＸｂａＩ粘
着性３’末端を含む、１００ｂｐの断片を得た。次に、
配列確認に使用するために、ＡｐａＩ／ＸｂａＩ消化し
たプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＫＳ（ストラト
ジーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリフォル
ニア州）に前記断片を連結した。確認したコード配列を
含むプラスミドをｐＮＢ７１６と命名した。配列を確認
したところで、図１７及び図１８に模式的に示したよう
に、最初の発現ベクター（ｐＮＢ７４７）を以下のよう
に構築した。
クターの構築》以下の工程に従って、インシュリノトロ
ピンをコードする合成遺伝子を調製した。以下の配列： ＣＡＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＧ
ＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣ（配列番号１７）； ＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧ
ＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号１
８）； ＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧ
ＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧ
ＧＡＣＧＡＧＧＡＴＡＧＴ（配列番号１９）；及び ＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＡＡ
ＧＴＡＧＣＧＧＡＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴ
ＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴＣ（配列番号２０） を有する配列番号１７、１８、１９、及び２０で表わさ
れる配列は、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）バイオテク
ノロジーズ社（ウッドランズ，テキサス州）から得た。
次に、１００℃で１０分間加熱し、室温までゆっくりと
冷却することによって、配列番号１７及び１８で表わさ
れる配列を一緒にハイブリダイズさせ、同じ条件で配列
番号１９及び２０で表わされる配列を一緒にハイブリダ
イズさせた。得られたハイブリダイズした配列を、ポリ
ヌクレオチドキナーゼで処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結することによって、インシュリノトロピンを
コードし、かつＡｐａＩ粘着性５’末端及びＸｂａＩ粘
着性３’末端を含む、１００ｂｐの断片を得た。次に、
配列確認に使用するために、ＡｐａＩ／ＸｂａＩ消化し
たプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＫＳ（ストラト
ジーンクローニングシステムズ，ラホイラ，カリフォル
ニア州）に前記断片を連結した。確認したコード配列を
含むプラスミドをｐＮＢ７１６と命名した。配列を確認
したところで、図１７及び図１８に模式的に示したよう
に、最初の発現ベクター（ｐＮＢ７４７）を以下のよう
に構築した。
【００４９】プラスミドｐＮＢ２６８（ＡＴＣＣ６９３
５５）ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで粘着性末端を平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂａ
Ｉで消化して、前記と同様にして調製したインシュリノ
トロピンをコードする断片の３’末端を得た。インシュ
リノトロピンをコードする配列を含むプラスミドｐＮＢ
７１６のＤＮＡをＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで粘着性末端を平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂ
ａＩで消化した。得られた１００ｂｐ断片を、２．０％
ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロース（ＦＭＣバイオ
プロダクツ，ロックランド，メイン州）ゲルで電気泳動
的に単離し、ＫｐｎＩ消化、平滑化、及びＸｂａＩ消化
したｐＮＢ２６８のＤＮＡと連結した。得られた連結混
合物を用いて大腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。正しい
構築物を有するプラスミドを制限酵素分析により同定
し、平滑化連結部領域をシークエンスすることによっ
て、ＸＰＲ２プレプロ配列とインシュリノトロピンをコ
ードする配列との間のインフレーム融合を確認した。こ
のようなプラスミドの１つであるｐＮＢ７４７を図１８
に示す。
５５）ＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで粘着性末端を平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂａ
Ｉで消化して、前記と同様にして調製したインシュリノ
トロピンをコードする断片の３’末端を得た。インシュ
リノトロピンをコードする配列を含むプラスミドｐＮＢ
７１６のＤＮＡをＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで粘着性末端を平滑化した。次に、ＤＮＡをＸｂ
ａＩで消化した。得られた１００ｂｐ断片を、２．０％
ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロース（ＦＭＣバイオ
プロダクツ，ロックランド，メイン州）ゲルで電気泳動
的に単離し、ＫｐｎＩ消化、平滑化、及びＸｂａＩ消化
したｐＮＢ２６８のＤＮＡと連結した。得られた連結混
合物を用いて大腸菌ＤＨ５−αを形質転換した。正しい
構築物を有するプラスミドを制限酵素分析により同定
し、平滑化連結部領域をシークエンスすることによっ
て、ＸＰＲ２プレプロ配列とインシュリノトロピンをコ
ードする配列との間のインフレーム融合を確認した。こ
のようなプラスミドの１つであるｐＮＢ７４７を図１８
に示す。
【００５０】プラスミドｐＮＢ７４７をＥｃｏＲＩで消
化して野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７．４ｋｂベク
ター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２
（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化
することにより［野生型１．６及び０．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含
む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しい
プラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＮＢ７５
１と命名した。
化して野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７．４ｋｂベク
ター断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２
（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化
することにより［野生型１．６及び０．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含
む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しい
プラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＮＢ７５
１と命名した。
【００５１】次に、プラスミドｐＮＢ７５１をＳａｃII
で消化し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を
作製し、再連結した。これによってインシュリノトロピ
ン遺伝子の３’末端のＳａｃII部位は壊されるので、ｐ
ＮＢ６５０のｒＤＮＡ断片内部のＳａｃII部位は、唯一
の部位となることができ、この部位での消化を使用する
ことにより、多重組込み発現ベクターの組込みの標的を
ｒＤＮＡ遺伝子座とすることができた。連結混合物で大
腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。形質転換体
ＤＮＡを調製し、ＳａｃIIで消化した。ＳａｃIIでの消
化でそれ以上線状化されない、正しいプラスミドを同定
した。このプラスミドをｐＸＰＲＬＥＵＩＳＴ（−Ｓａ
ｃII）と命名した。次に、ＥｃｏＲＩでプラスミドｐＸ
ＰＲＬＥＵＩＳＴ（−ＳａｃII）を消化することによっ
て、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７．４ｋｂベクタ
ー断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２
（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化
することにより［野生型１．６及び０．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含
む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しい
プラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＸＰＲ
（ｄ）ＬＥＵＩＳＴと命名した。次に、前記と同様にし
て、ＨｉｎｄIIIによる部分消化によってこのプラスミ
ドを線状化し、ウシ小腸ホスファターゼ処理により脱リ
ン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤＮＡ配列を含む
２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と連結した。連
結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔い
た。ｒＤＮＡ配列がＸＰＲ２プロモーター上流のＨｉｎ
ｄIII部位に連結した、正しいプラスミドを、ＥｃｏＲ
Ｉによる制限消化（４．９、５．４、及び２．４ｋｂの
断片を放出する）によって同定した。このプラスミドを
ｐＭＩＶＩＳＴと命名した。
で消化し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を
作製し、再連結した。これによってインシュリノトロピ
ン遺伝子の３’末端のＳａｃII部位は壊されるので、ｐ
ＮＢ６５０のｒＤＮＡ断片内部のＳａｃII部位は、唯一
の部位となることができ、この部位での消化を使用する
ことにより、多重組込み発現ベクターの組込みの標的を
ｒＤＮＡ遺伝子座とすることができた。連結混合物で大
腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピ
シリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。形質転換体
ＤＮＡを調製し、ＳａｃIIで消化した。ＳａｃIIでの消
化でそれ以上線状化されない、正しいプラスミドを同定
した。このプラスミドをｐＸＰＲＬＥＵＩＳＴ（−Ｓａ
ｃII）と命名した。次に、ＥｃｏＲＩでプラスミドｐＸ
ＰＲＬＥＵＩＳＴ（−ＳａｃII）を消化することによっ
て、野生型ＬＥＵ２遺伝子を除去し、７．４ｋｂベクタ
ー断片と、ｐＮＢ２７６から単離した欠失ＬＥＵ２
（（ｄ）ＬＥＵ）遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片とを連結した。連結混合物で大腸菌ＤＨ５
−αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ上に形質転換体を蒔いた。ＥｃｏＲＩで制限消化
することにより［野生型１．６及び０．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片の代わりに、（ｄ）ＬＥＵ遺伝子を含
む単一の２．２ｋｂのＤＮＡ断片を放出する］、正しい
プラスミドを同定した。正しいプラスミドをｐＸＰＲ
（ｄ）ＬＥＵＩＳＴと命名した。次に、前記と同様にし
て、ＨｉｎｄIIIによる部分消化によってこのプラスミ
ドを線状化し、ウシ小腸ホスファターゼ処理により脱リ
ン酸化し、前記ｐＮＢ６５０由来のｒＤＮＡ配列を含む
２．８ｋｂのＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と連結した。連
結混合物で大腸菌ＤＨ５−αを形質転換し、１００μｇ
／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上に形質転換体を蒔い
た。ｒＤＮＡ配列がＸＰＲ２プロモーター上流のＨｉｎ
ｄIII部位に連結した、正しいプラスミドを、ＥｃｏＲ
Ｉによる制限消化（４．９、５．４、及び２．４ｋｂの
断片を放出する）によって同定した。このプラスミドを
ｐＭＩＶＩＳＴと命名した。
【００５２】
【実施例１０】《インシュリノトロピン発現多重組込み
ベクター形質転換ヤロウィア・リポリティカの構築》プ
ラスミドｐＭＩＶＩＳＴを使用し、ＳａｃIIで消化した
後に、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴ
ＣＣ７４２３４）を形質転換体した。ロイシンを含まな
い完全最少培地上で得た、得られた形質転換体は、多重
組込みベクターを含んでいた。組み込まれたコピー数と
インシュリノトロピンの発現レベルとの相互関係は、不
明であった。
ベクター形質転換ヤロウィア・リポリティカの構築》プ
ラスミドｐＭＩＶＩＳＴを使用し、ＳａｃIIで消化した
後に、ヤロウィア・リポリティカ株ＮＢＬ４６４（ＡＴ
ＣＣ７４２３４）を形質転換体した。ロイシンを含まな
い完全最少培地上で得た、得られた形質転換体は、多重
組込みベクターを含んでいた。組み込まれたコピー数と
インシュリノトロピンの発現レベルとの相互関係は、不
明であった。
【００５３】
【配列表フリーテキスト】配列表の配列番号２及び３の
配列に記載の各塩基配列は、ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子の改変用リンカーとして設計した塩基配
列である。また、配列表の配列番号４〜１２の配列に記
載の各塩基配列は、ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子プロモーターの塩基配列の部分配列を含む。ま
た、配列表の配列番号１４の配列に記載の塩基配列は、
プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒｐ）をコードする
塩基配列である。また、配列表の配列番号１５の配列に
記載の塩基配列は、プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔ
ｒｐ）をコードする塩基配列の相補的塩基配列である。
また、配列表の配列番号１６の配列に記載の塩基配列
は、ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２のプロ領域内部
にハイブリダイズする塩基配列である。また、配列表の
配列番号１７〜２０の配列に記載の各塩基配列は、イン
シュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列であ
る。
配列に記載の各塩基配列は、ヤロウィア・リポリティカ
ＬＥＵ２遺伝子の改変用リンカーとして設計した塩基配
列である。また、配列表の配列番号４〜１２の配列に記
載の各塩基配列は、ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２
遺伝子プロモーターの塩基配列の部分配列を含む。ま
た、配列表の配列番号１４の配列に記載の塩基配列は、
プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒｐ）をコードする
塩基配列である。また、配列表の配列番号１５の配列に
記載の塩基配列は、プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔ
ｒｐ）をコードする塩基配列の相補的塩基配列である。
また、配列表の配列番号１６の配列に記載の塩基配列
は、ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２のプロ領域内部
にハイブリダイズする塩基配列である。また、配列表の
配列番号１７〜２０の配列に記載の各塩基配列は、イン
シュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列であ
る。
【００５４】
【配列表】 <110> Phizer Inc. <120> Novel Vectors <130> PC8154DIV <150> US 08/117,375 <151> 1993-09-02 <160> 20 <210> 1 <211> 2810 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 1 gtcgacacca tatcatataa aactaacaat gcattgctta ttacgaagac tacccgttgc 60 tatctccaca ccgttatctc cacggtccaa aggctgctca atgtgctgca tacgtaacgt 120 ggggtgcaac cttgagcaca tagtactttt ccgaaaaccg gcgataatta agtgtgcact 180 ccaacttttc acactgagcg taaaatgtgg agaagaaatc ggcactaaaa agtcaggtag 240 actggaaaat gcgccatgaa atgaatatct cttgctacag taatgcccag catcgagggg 300 tattgtgtca ccaacactat agtggcagct gaagcgctcg tgattgtagt atgagtcttt 360 attggtgatg ggaagagttc actcaatatt ctcgttactg ccaaaacacc acggtaatcg 420 gccagacacc atggatgtag atcaccaagc ctgtgaatgt tattcgagct aaaatgcaca 480 tggttggtga aaggagtagt tgctgtcgaa ttccgtcgtc gcctgagtca tcatttattt 540 accagttggc cacaaaccct tgacgatctc gtatgtcccc tccgacatac tcccggccgg 600 ctggggtacg ttcgatagcg ctatcggcat cgacaaggtt tgggtcccta gccgataccg 660 cactacctga gtcacaatct tcggaggttt agtcttccac atagcacggg caaaagtgcg 720 tatatataca agagcgtttg ccagccacag attttcactc cacacaccac atcacacata 780 caaccacaca catccacaat ggaacccgaa actaagaaga ccaagactga ctccaagaag 840 attgttcttc tcggcggcga cttctgtggc cccgaggtga ttgccgaggc cgtcaaggtg 900 ctcaagtctg ttgctgaggc ctccggcacc gagtttgtgt ttgaggaccg actcattgga 960 ggagctgcca ttgagaagga gggcgagccc atcaccgacg ctactctcga catctgccga 1020 aaggctgact ctattatgct cggtgctgtc ggaggcgctg ccaacaccgt atggaccact 1080 cccgacggac gaaccgacgt gcgacccgag cagggtctcc tcaagctgcg aaaggacctg 1140 aacctgtacg ccaacctgcg accctgccag ctgctgtcgc ccaagctcgc cgatctctcc 1200 cccatccgaa acgttgaggg caccgacttc atcattgtcc gagagctcgt cggaggtatc 1260 tactttggag agcgaaagga ggatgacgga tctggcgtcg cttccgacac cgagacctac 1320 tccgttcctg aggttgagcg aattgcccga atggccgcct tcctggccct tcagcacaac 1380 ccccctcttc ccgtgtggtc tcttgacaag gccaacgtgc tggcctcctc tcgactttgg 1440 cgaaagactg tcactcgagt cctcaaggac gaattccccc agctcgagct caaccaccag 1500 ctgatcgact cggccgccat gatcctcatc aagcagccct ccaagatgaa tggtatcatc 1560 atcaccacca acatgtttgg cgatatcatc tccgacgagg cctccgtcat ccccggttct 1620 ctgggtctgc tgccctccgc ctctctggct tctctgcccg acaccaacga ggcgttcggt 1680 ctgtacgagc cctgtcacgg atctgccccc gatctcggca agcagaaggt caaccccatt 1740 gccaccattc tgtctgccgc catgatgctc aagttctctc ttaacatgaa gcccgccggt 1800 gacgctgttg aggctgccgt caaggagtcc gtcgaggctg gtatcactac cgccgatatc 1860 ggaggctctt cctccacctc cgaggtcgga gacttgttgc caacaaggtc aaggagctgc 1920 tcaagaagga gtaagtcgtt tctacgacgc attgatggaa ggagcaaact gacgcgcctg 1980 cgggttggtc taccggcagg gtccgctagt gtataagact ctataaaaag ggccctgccc 2040 tgctaatgaa atgatgattt ataatttacc ggtgtagcaa ccttgactag aagaagcaga 2100 ttgggtgtgt ttgtagtgga ggacagtggt acgttttgga aacagtcttc ttgaaagtgt 2160 cttgtctaca gtatattcac tcataacctc aatagccaag ggtgtagtcg gtttattaaa 2220 ggaagggagt tgtggctgat gtggatagat atctttaagc tggcgactgc acccaacgag 2280 tgtggtggta gcttgttact gtatattcgg taagatatat tttgtggggt tttagtggtg 2340 tttggtaggt tagtgcttgg tatatgagtt gtaggcatga caatttggaa aggggtggac 2400 tttgggaata ttgtgggatt tcaatacctt agtttgtaca gggtaattgt tacaaatgat 2460 acaaagaact gtatttcttt tcatttgttt taattggttg tatatcaagt ccgttagacg 2520 agctcagtgc catggctttt ggcactgtat ttcattttta gaggtacact acattcagtg 2580 aggtatggta aggttgaggg cataatgaag gcaccttgta ctgacagtca cagacctctc 2640 accgagaatt ttatgagata tactcgggtt cattttaggc tccgattcga ttcaaattat 2700 tactgtcgaa atcggttgag catccgttga tttccgaaca gatctcggca gtctctcgga 2760 tgtagaatta ggtttccttg aggcgaagat cggtttgtgt gacatgaatt 2810 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子の改変用リンカーとして設計し た塩基配列である。 <400> 2 tcgagtcctc aaggacgaat ttccccagc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子の改変用リンカーとして設計し た塩基配列である。 <400> 3 tcgagctggg gaaattcgtc cttgaggac 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 4 gcaggatccg aattccttga cgatctcgta tgtc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 5 gcaggatccg aattcgctgg ggtacgttcg atag 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 6 gcaggatccg aattctagcc ｇataccgcac tacc 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 7 gcaggatccg aattctcttc cacatagcac gggc 34 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 8 gcaggatccg aattccgtat atatacaaga gcgtttgcc 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 9 gcaggatccg aattccgtat gtatacaaga gcgtttgcc 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 10 gcaggatccg aattccgtat agatacaaga gcgtttgcc 39 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 11 gcaggatccg aattccgtgt atatacaaga gcgtttgcc 39 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＬＥＵ２遺伝子プロモーターの塩基配列の部分 配列を含む。 <400> 12 gcaggatccg aattcccaca gattttcact cc 32 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <400> 13 cacaaactcg gtgccggagg cc 22 <210> 14 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒｐ）をコードする塩基配列である。 <400> 14 attctttgtg aaccaacacc tgtgcggatc ccacctggtg gaagctctcc acctagtgtg 60 cggggaacga ggcttcttct acacacccaa gacccgccgg agggcagagg acctgcaggt 120 ggggcaggtg gagctgggcg ggggccctgg tgcaggcagc ctgcagccct tggccctgga 180 ggggtccctg cagaagcgtg gcattgtgga acaatgctgt accagcatct gctccctcta 240 ccagctggag aactactgca actagaagct tggccgcgg 279 <210> 15 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プロインシュリン類似体（Ａ１４ｔｒｐ）をコードする塩基配列の相補的 塩基配列である。 <400> 15 ggccaagctt ctagttgcag tagttctcca gctggtagag ggagcagatg ctggtacagc 60 attgttccac aatgccacgc ttctgcaggg acccctccag ggccaagggc tgcaggctgc 120 ctgcaccagg gcccccgccc agctccacct gccccacctg caggtcctct gccctccggc 180 gggtcttggg tgtgtagaag aagcctcgtt ccccgcacac taggtggaga gcttccacca 240 ggtgggatcc gcacaggtgt tggttcacaa a 271 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヤロウィア・リポリティカＸＰＲ２のプロ領域内部にハイブリダイズする 塩基配列である。 <400> 16 tacacggatg gatctgg 17 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> インシュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列である。 <400> 17 cacgccgagg gcaccttcac ctccgacgtc tcctc 35 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> インシュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列である。 <400> 18 ccgggtgcgg ctcccgtgga agtggaggct gcagaggagg atgg 44 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> インシュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列である。 <400> 19 ctacctggag ggacaggccg ccaaggagtt catcgcctgg ctggtcaagg gacgaggata 60 gt 62 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> インシュリノトロピンをコードする塩基配列の部分配列である。 <400> 20 acctccctgt ccggcggttc ctcaagtagc ggaccgacca gttccctgct cctatcagat 60 c 61
【図１】プラスミドｐＮＢ２７６構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図２】プラスミドｐＮＢ２７６構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図３】プラスミドｐＮＢ２７６構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図４】プラスミドｐＮＢ２７６構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図５】プラスミドｐＮＢ２４３構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図６】プラスミドｐＮＢ２４３構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図７】プラスミドｐＮＢ２４３構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図８】プラスミドｐＮＢ３０８構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図９】プラスミドｐＮＢ３０８構築の工程の一部を模
式的に説明する説明図である。
式的に説明する説明図である。
【図１０】プラスミドｐＮＢ３０８構築の工程の一部を
模式的に説明する説明図である。
模式的に説明する説明図である。
【図１１】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１２】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１３】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１４】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１５】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１６】プラスミドｐＭＩＶＩＮＳ構築の工程の一部
を模式的に説明する説明図である。
を模式的に説明する説明図である。
【図１７】プラスミドｐＮＢ７４７構築の工程の一部を
模式的に説明する説明図である。
模式的に説明する説明図である。
【図１８】プラスミドｐＮＢ７４７構築の工程の一部を
模式的に説明する説明図である。
模式的に説明する説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 プラスミドｐＮＢ２５８。
- 【請求項２】 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５３。
- 【請求項３】 プラスミドｐＮＢ６５０。
- 【請求項４】 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５４。
- 【請求項５】 プラスミドｐＮＢ２６８。
- 【請求項６】 大腸菌ＡＴＣＣ６９３５５。
- 【請求項７】 ヤロウィア・リポリティカＡＴＣＣ７４
２３４。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP7508023A Division JPH08508892A (ja) | 1993-09-02 | 1994-05-30 | 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体 |
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7508023A Pending JPH08508892A (ja) | 1993-09-02 | 1994-05-30 | 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体 |
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|---|---|---|---|
| JP7508023A Pending JPH08508892A (ja) | 1993-09-02 | 1994-05-30 | 多重組込みベクター及びヤロウィア・リポリティカ形質転換体 |
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| EP2078092A2 (en) | 2006-09-28 | 2009-07-15 | Microbia, Inc. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
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