JPH0253489A - メチロトローフ酵母のアルコールオキシダーゼ２調節領域をコードするｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮ＾バイオテクノロジーの分野に関す
る。その一つの観点において、本発明はＤＮＡの転写を
３１８１　ｉｆｆするＤＮＡ配列に関する。他の観点に
おいて、本発明は上記ＤＮＡ配列を取込むベクターに関
する。更に、他の観点において、本発明は上記ベクター
で形質転換した新規細胞に関する。

本発明は一般的には遺伝子材料の巧妙な取扱いに関し、
特にＤＮＡからＲＮＡへの転写頻度の調節に関する。本
発明は特に旦土工・パス上茎ス（崩ｉａ　　飢ｌ肛ｎ）
アルコールオキシダーゼ■遺伝子の調節領域に関する。

（従来技術） 組換えＤＮＡバイオテクノロジが近年発達してきたため
、細胞による多種類の有用ポリペプチドの制御生産が可
能になってきた。真核生物の多数のポリペプチド、例え
ばヒト成長ホルモン、白血球のインターフェロン、ヒト
インシュリンおよびヒトプロインシュリンはいろいろな
微生物によって生産されている。すでに研究中の技術の
応用を続けると、将来、数多くの他の有用ポリペプチド
生成物のｍｔａえ生産が可能になると期待される。

組換え技術の分野で使われる基本技術は当業者に既知で
ある。組換えＤＮＡバイオテクノロジーを実行するため
にあたって存在するのが望ましい要素は、これらに限定
されるわけではないが；（１）１個以上の所望のポリペ
プチドをコードする遺伝子であって、宿主細胞で発現す
るために必要とされる適切な調節配列と機能しうるよう
に連結した（゛′機能しうるように連結した“とは、成
分がそれらの通常の機能を果たすように配列された並置
を指す）上記遺伝子； （２）通常プラスミドであるヌクレオチド配列を挿入し
うるベクターであって；宿主の形質転換を可能にする構
築物を含む任意のヌクレオチド配列であるベクター； （３）所望のヌクレオチド配列を伝達しうる適切な宿主
であって、伝達されたヌクレオチド配列にコードされた
情報を発現させるための細胞器官をも有する宿主； が含まれる。

組換え技術に用いられる基本要素はプラスミドであり、
これは最初、微生物に発見された環状の染色体外二本ｔ
ＪｉＤＮＡである。プラスミドは細胞あたり多コピー存
在することがわかっている。天然のプラスミドに加えて
、多数の人造プラスミドが調製されている。プラスミド
内に含まれるものにはプラスミドの再生産に必要な情報
、即ち自己複製配列および／または複製開始点がある。

形質転換した細胞内に存在するプラスミドを表現型で選
択する１個以上の手段もまたプラスミドにコードされる
情報に含まれるであろう。抗生物質耐性のような表現型
またはマーカー選択特性は、目的とするプラスミドを含
む宿主細胞のクローンが選択壇地内での細胞の優先増殖
によって認識かつ選択されることを可能にする。ベクタ
ーまたはプラスミドは、特異的ヌクレオチド配列を個々
に認識する１種類以上の制限エンドヌクレアーゼまたは
制限酵素によって特異的に切断されるであろう、そうし
た後、異種遺伝子、即ち調節領域との結合が天然には存
在しない遺伝子、に機能しうるように連結した調節領域
、または他のヌクレオチド配列は、切断サイトまたは切
断サイトに隣接した再構築末端に所望の遺伝材料を機能
しうるように連結することによって挿入されるであろう
。

次いでベクターは宿主細胞内に導入され、細胞内ではベ
クターに含まれるヌクレオチド配列が宿主に種々の工程
または機能を実行するように導くであろう。そのような
実例は数少ないが、その中には異種のポリペプチドの発
現または同種あるいは異種ポリペプチドの過剰発現が含
まれる。宿主細胞内へのヌクレオチド導入の工程は一般
に形質転換と呼ばれる。多量のベクターが、そのベクタ
ーのコピー数を増加させるのに適切な宿主内にベクター
を導入することによって得られるであろう。

ベクターのコピー数を増加させるために通常用いられる
宿主細胞はｆＪＡＪＬ　（Ｅ−ｃｏ　Ｉ　ｉ　）である
。次いでベクターを第一宿主から単離し、さらにベクタ
ーに支配される所望の活性、例えばポリペプチドの生産
、が起こるであろう第二の宿主細胞に導入する。このよ
うなりＮＡからの最終生成物の生産を発現と呼ぶ。コー
ドするヌクレオチド配列の転写および翻訳を支配するベ
クタ一部分に関して遺伝子が正確にベクター内に挿入さ
れている場合、得られたベクターは挿入遺伝子がコード
するポリペプチド配列の生産を導くために使用され得る
。

発現は調節領域に支配される。調節領域はいろいろな刺
激に応答し、ＲＮ＾転写頻度に影響を及ぼす異種のヌク
レオチド配列である。発現は刺激に応答してスイッチを
入れたり切ったりする。刺激に応答してスイッチオンに
なっている発現は通常抑制解除または誘導と呼ばれる。

誘導発現システムの例は数少ないが、旦土ヱ・バノこし
旦フヨ（Ｐｉｅ紅虹ｎｕ肛ｎ）の皿システム、キセノプ
ス・立エビス（籾匹匹ｓ　Ｉａｅｖｉｓ）のエストロゲ
ンシステム、ならびにサル、ヒト、ハムスター、マウス
およびラットのメタロチオネインシステムが上げられる
。誘導発現システムは通常構成システムより厳重な支配
下にある。このようなシステムは遺伝子工学の目的とう
まく適合する。

実際問題として、組換えＤＮＡ技術を用いると異種のヌ
クレオチド配列を発現する能力をもつ細胞が作り出され
るであろう。異種のヌクレオチド配列は宿主内に天然に
は存在しないヌクレオチド配列である。そのような例と
して、宿主内に天然に存在する調節領域とこの調節領域
とは本来関連のない構造遺伝子との新規の結合が上げら
れる。もう一つの例として、宿主内には天然に存在しな
い遺伝子と調節領域との結合が挙げられる。異種のポリ
ペプチドは融合ポリペプチド、即ち同種または異種のポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部に融合させた異種のポ
リペプチド、として生産されるであろう。最初に得られ
る融合ポリペプチド生成物は時として、融合ポリペプチ
ドが細胞外環境で切断される迄不活性な不活性型として
生産される。

以前、欧州特許出願第８６１１４７００．７号明細書に
開示したように（この特許はここに参照として合成させ
る）、−り土１−・バス上ユ久（■薊亘　Ｌ１虹ｎ）ゲ
ノムは２種類の機能性アルコールオキシダーゼ遺伝子、
ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２、をコードしている。

我々は、今、ＡＯＸ２構造遺伝子と関連する５′調節領
域を発見した。この調節領域はメタノールによってまた
は炭素源を個渇させることによって誘導されうる。しか
しながら、ＡＯＸ２調節領域からの発現の最高水準はＡ
ＯＸＩ調節領域（坦■遺伝子は欧州特許出願第８５２０
１２３５．０号明細書に開示されており、ここに参照と
して合体させる）の発現の約５％〜１１％のみである。

胆■１１節領域は異種遺伝子を発現するために使用可能
であり、蛋白質の高水準発現が不都合であるような状況
下で特に有効である。

（発明の構成） 本発明に従って、我々はＤＮＡからＲＮＡへの転写頻度
を調節するＤＮＡ配列を発見し、単離し、さらにその特
徴を調べた。本発明の新規ＤＮＡ配列はビ土ヱ・ベム上
悲ス（■堕凰　胆１肛ｎ）のようなメチロトローフ酵母
によるポリペプチド生成物の生産に有益である。

本発明に従って、少なくとも１つの以下の条件に応答す
る調節領域を含む新規ＤＮＡ配列が提供される；条件と
は、宿主の周囲環境にメタノールが存在すること、また
は宿主細胞がメタノール以外の基質で増殖している場合
には炭素源が個渇することである。本発明の調節領域は
、ｍＲＮＡの生産をコードするＤＮＡ配列の５′末端に
機能しうるように連結した場合にＲＮＡの転写頻度を制
御する能力をもつ。

本発明のさらなるもう一つの態様に従って、上述のＤＮ
Ａ配列を含むプラスミドおよび形質転換された生物なら
びに液物を生産する方法が提供される。

本発明のこれらのまたはこれ以外の巨的は、ここに提供
された開示および特許請求の範囲より明確になるであろ
う。

１、アルコール　オキシ　−ゼ　　　　の完全なＡＯＸ
２遺伝子は第１図（ｂ）に提供された制限地図内に含ま
れる。ＡＯＸ２調節領域は第１図（ｂ）の制限地図に示
すように５′末端から第一番目のＥｃｏＲ１部位および
へ〇Ｘ２構造遺伝子の開始コドンとの間に含まれる。ア
ルコール　オキシダーゼ■蛋白質をコードするＤＮＡ配
列部分は制限地図の下に太い棒で示しである。アルコー
ル　オキシダーゼＩ遺伝子の制限地図は二つの遺伝子を
比較する目的で第１図（ａ）に提供する。遺伝子の蛋白
質コード部分を除いて、意味のある配列の相同性は認め
られなかった。

凰■融合構築物を用いてＡＯＸ２調節領域のさらなる特
徴を調べた結果、約−１５００塩基対から約−１塩基対
（第１表に示す）以外は調節活性に必要でないことがわ
かった。鴎調節領域を含むＤｌｉＡフラグメントのヌク
レオチド配列を第１表に示す。

第１表、ＡＯχ２調節領域およびその５′側非翻訳領域
ＣＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡ
ＣＴＴＴＴＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＡＣＴＧ
ＧＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡ
＾八＾八ＣＡＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＴ
ＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＡＡ
ＴＡＧＡＧＧＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴＡＴｔｒＴＧＡＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＡＣＣＴＣＴＧＡ
ＡＴＧＴＧＣＡＡＴ 八八ＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴ
ＡＣＧＣＣＣ八＾ＴＴＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴＡ
ＣＣＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴ八ＧＴＡＧ八八ＣＴＴＴＧ
ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴ
ＣＣＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＴ
ＣＣＴＴＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡ
八八ＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴ
ＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴＣ
ＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＴＣＣ
ＴＣＴＣ＾八ＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣ
ＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴ＝８９０ ＾ＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣ八
八８５０　　　　　　　　　−８３０　　　　へへ　　
　　−８１０ＣＣＣＣＴＣＡＡＴｍＣＣＡＴＣＣＡＡＧ
ＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＴＣＧ
ＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣ
ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡ
ＣＴＴＴＡＡＧＣＡＴＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴ
ＧＴＡＴＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＴＡＧ
ＡＧＴＴＴＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧＧＧＴＡＡＴＡＣＡＴ
ＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＣＧＡＣＴＣＣＧ
ＡＧＡＴＣＡＴＡ＝６３０ ＴＴ＾ ＴＴＣＡＴＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＡＣ ＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＣＡｍＣＣＣＣＡＡＴＧ
ＡＡＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＧ
ＴＴＴＴＧＩＩ　ＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＴＧＡ
ＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡ　Ａ　
ＡＣＡＡＴＧＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＴＣＡＣ
ＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧ
ＡＴＡＡＡ ＴＴ＾八ＧへＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＴＡＴＴＧ
ＧＴＡＴＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣ
ＴＴＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＣ
ＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡ　Ａ　Ａ　ＣＧ　
Ｇ　ＧＣＴＴＴＴＡ　Ａ　ＣＴ　ＡＣＡ　ＴＴＧＴＴＣ
ＴＴＡ　ＣＡＣＡ　ＴＴＧＣＡ　Ａ　Ａ　ＣＣＴＣＴＴ
ＣＣＴＴＣＴ　Ａ　ＴＴＴＣＧＧ　ＡＴＡＡＣＡＡＡＴ
Ｃ八＾ＣＴＧＡＧへＡＡＡ観■調節領域は少なくとも１
つの次の条件−く土ヱ・バ久土史入（ｈ堕植　匹Ｉ肛ｎ
）のようなメチロトローフ酵母宿主については唯一の炭
素源としてメタノールが存在すること、または該宿主細
胞の炭素源が涸渇すること：に応答する。さらに皿調節
領域によって促進されるβ−ガラクトシダーゼの蛋白質
生産は観程調節領域によるそれのおよそ５〜１１％であ
る。

沖１［− 別調節領域は旦土工ＭＣ１００−３株Ｏ工ｄ　旦討鉦紅
Ａ：：鎚飢４並ｘｇｊｙ　：　：Ｐｈ１ｓ４）を形質転
換することによって単離された。この株はＡＯＸ２遺伝
子内に挿入されたピキアのｇ遺伝子の変異体コピーを含
み、さらにＭＣ１００−３株をｐＢＲ３２２のＢａｍｔ
ｌｌサイトに挿入した旦土ヱのＨＩＳ４遺伝子を含む２
．７Ｋｂのシ１」−フラグメントを含むプラスミドｐＹ
Ｍ５で形質転換した。数種のＭＣ１ＭＣ１００−３（ｐ
Ｙ旧ｓ０形質転換株からのＤＮＡはサイン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）フィルターハイブリダイゼーションを行ない、
ＭＣ１００−３のＡＯＸ２座に位置する朋フラグメント
に組込まれたｐＹＭ５を含む形質転換体を選択した。次
いで、このようにして得られた株のうちの１株からのＤ
ＮＡをＨｉｎｄ　ｍで消化し、その結果ＡＯＸ２のｂ１
１サイトの５′側配列を５．３ｋｂ　、Ｉ？土１−の１
鉗遺伝子を２．７ｋｂ　、およびｐＢＲ３２２を４．Ｏ
ｋｂ含む約１２ｋｂのゲノムのフラグメントを遊離させ
た。ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＤＮＡを結合させ、大腸菌に形
質転換した。形質転換体はアンピシリン耐性で選択した
。プラスミドｐＭｌ？４を回収した。このプラスミドｐ
ＭＲ４の制限地図を第５図に示す。

ＩＩｌ、　ＡＯＸ２古、６の 赳■調節領域の発現をｇのそれと比較するために、胆■
−１ａｃＺ発現ベクターを観■−展融合ヘクターである
ｐｓＡＯＨ５（第１θ図に示す）にできる限り似せて構
築した。ＡＯＸ２−圏ａベクター、ｐＹＪ５５、の構築
法の工程図を第９図に示す。剋■の５′末端からの予備
的なりＮＡ配列データは、ｇがｇ構造遺伝子中に認めら
れるものと同じ構造遺伝子の位置にある２つのＢａｒＨ
Ｉサイトを含むことを示していた。それ故、ｐＹＪ５５
構築の第一段階は脂膜調節領域および４５塩基対のアミ
ノ末端蛋白質コード配列を含む１．８ｋｂの肚１［Ｂａ
ｍＨＩ　フラグメントをｐＢＰｆｌのＢａａ＋ｔｌｌサ
イトに挿入してｐＹＪ３８を作製することであった。第
二段階はｐＹＪ３８をＢａｍ１ｌ＋で切断し、ざらに観
程−１ａｃＺベクターを構築するために挿入したのと同
一のアダプターオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＴＣＡ
ＣＣＣＧＧＧＴ−３’　）を挿入することであった。こ
のアダプターを挿入するとｐＹＪ３８のＢａｍＨＩサイ
トが破壊され、挿入位置に新しく鎖１サイトができる。

このプラスミドｐＹＪ４５をＳｍａ↓で消化し、さらに
修飾されたＡＯＸ２プロモーターを含む１．８ｋｂのＳ
ｍａｒ７ラグメントをｐＢＰｆｌに挿入してプラスミド
ｐＹＪ４６を作製した。プラスミドｐＪＹ４６はＥｃｏ
ＲＩで消化してｐＹＪ４６のｇフラグメントの５′末端
から０．３ｋｂのフラグメントを除去した。プラスミド
を再結合させてプラスミドｐＹＪ５５を作製した。プラ
スミドｐＹＪ５５の制限地図を第８図に提供する。

プラスミドｐＹＪ５５をＧ５１１５（ｈｉｓ４）に形質
転換し、さらに旧Ｓ゛の形質転換体を絹込みプラスミド
の存在を示す安定な旧Ｓ゛表現型について選択した。数
種の安定な旧Ｓ“株のゲノムのＤＮＡをサインフィルタ
ーハイプリダイゼーションで分析して存在を確認すると
共にプラスミドの所定位置を決定した。

Ｕ■プロモーターおよびＡＯＸ２プロモーターの強さを
比較するために、ｐＹＪ５５およびｐｓＡＯＩ＋５によ
るβ−ガラクトシダーゼの生産を、これらのプラスミド
をＧ５１１５に形質転換することによって調べた。

形質転換したＧ５１１５株はそれぞれＧ５１１５（ｐＹ
Ｊ５５）およびＧ５１１５（ｐｓＡＯＨ５）　と名付け
た。それぞれの株は１１１５４座に組込まれたプラスミ
ドを含んでいる。それぞれの株の細胞はグリセコール培
地で増殖させ、次に炭素源を含まない培地で２４時間培
養し、そうした後さらに５０時間メタノール含有培地で
培養した。それぞれの培養液のサンプルは個々の増殖期
が終わるたびごとに採取し、抽出物を調製してβガラク
トシダーゼについてアッセイした。これらのアッセイの
結果を第２表に示す。

株 プロモーター　　　グリセロール　　　炭素源なし１　
メタノール（ｐＳ＾０■５） （ｐＹＪ５５） 八〇Ｘ２　　　　＜１０　　　　　１０９　　　　　７
３９ＹＮＢ培地 有効水準のβ−ガラクトシダーゼ活性は、グリセロール
増殖細胞ではＡＯＸＩ　−１ａσおよびＡＯＸ２　１ａ
ｃＺ株共に認められなかった。炭素源を含まない培地で
は、観キー１ａｃＺ株の活性水準は皿−ニ株で認められ
る活性のおよそ’／１０であった。則り一厘含有細胞に
メタノールを加えると、その結果βガラクトシダーゼの
活性水準はＡＯＸＩ　−１ａｃＺ細胞のそれの約１７．
になった。このように、ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２遺伝子
は同一様式で１１節されている。差異を示す一つの特徴
はＡＯＸ２調節遺伝子によるメタノールに対する応答お
よび炭素源の涸渇に対する応答が著るしく低いことであ
る。

ここでは宿主酵母細胞内への烈Ｘ２！Ｊ＠節領域−βガ
ラクトシダーゼ遺伝子融合物の導入について記載したが
、当業者は環状プラスミドまたはβガラクトシダーゼ構
造遺伝子を用いることが本発明を実施するにあたって必
要ではないことを認識している。従って酵母内に保持さ
れうる別のベクターもまた、この調節領域を別の異種遺
伝子と共に利用するために用いることができる。さらに
、他の異種遺伝子に機能しうるように連結させたＡＯＸ
２調節領域は、組込みベクターを用いて宿主酵母細胞の
染色体中に組込むことができる。さらに、ここに記載し
たＡＯＸ２調節領域を含む機能的変異体は５′末端から
のより短いＤＮＡ配列からなり、異種遺伝子の発現を調
節するためにも利用され得る。

（実施例）実施例に関係する一般情報 抹 一く土１−・パノＩＬ入（拐に恒Ｊ　但互的二臘）　Ｎ
ｌ？ＲＬＹ−１１４３０ −く土１−．ハλ」ヨＬム（Ｐｉｃｈｉａ　　因互イＬ
区）　Ｇ５１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ　　Ｙ−１５８
５１Ｙ］−乙・パフ」ｆＦ入（円工壇１　月ｊ乃工長−
）　ＰＰＦｌ（ａｇｅ　　ｈｉｓ４）　ＮＲＲＬ　’／
−１８０１７−く土１−・パｆ　（Ｐｉｃｈｉａ　　腫
）ワＬｕ）　ＫＭ７１２１す」劇　ｕＭ　並社Ａニー里
射赳ｘ２Ａ：：Ｐ旧５４）ＮＲＲＬ　　Ｙ−１８０１９ 太ＡＱＪＩ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣ１０６１［Ｆ−ａ
ｒａＤ＋３９　Δ（ａｒａ閥ｌ履Ｊμσ　７６７９Δ１
ａｃＸ７４　　距り曳　幻ｌ上　皿牡旦用ｊ 培廼、■」ｂ改および産直 １Ｍ−１−リス（Ｔｒｉｓ）緩衝液：　１２１．１ｇ　
）リス塩基／８００ｍ１Ｈ２０；濃Ｈ（Ｊ（３５％）水
ン容液を必要容量加えてｐＨを調整する；最約的にｐＨ
を調整する前に溶液を室温に冷却する；最 終容量ｌ！に希釈する。

ＴＥ緩衝液　１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、０１月（ｐＨ
７，４）　）リス緩衝液 ＳＳＣ０，１５Ｍ−ＮａＣ４ １５ｍ−クエン酸ナトリウム ＮａＯＨでｐｏ’７．ｏに調整 ＴＡＢ　　　　４０ｍＭ酢酸、５ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、
０２Ｍ　（ｐＨ８，３）トリス緩衝液 デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄυの？８液（５０ｘ）５ｇ
フィコール ５ｇポリビニルピロリドン ５ｇ牛血清アルブミン［ＢＳＡ；　ペンタックス（Ｐｅ
ｎｔａｘ）フラクシロンＶ〕水で総容量を５００ｒＲ１
にする ５ＳＰＥ　（２０倍）　２０５Ｍ　ＥＤＴＡｏ、　１６
Ｍ−ＮａＯＨ ０，２Ｍ−ＮａＨｚＰＯａ−ＨｚＯ ３，６Ｍ　ＮａＣｊ ＮａＯＨでｐｌ＋を７．０に調整 ＬＢ　（ルリアーベルクニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎ
ｉ）］培地５ｇハタトートリプトン ５ｇバクトー酵母エキス ２．５ｇ　ＮａＣ／／　Ｉ　ＱＨｚＯ ＮａＯＨでｐＨを７．５に調整 ＹＰＤ培地　１％バクトー酵母エキス ２％バタトーペプトン ２％デキストロース ＹＮＢ培地　６．７５ｇアミノ酸非含存酵母窒素塩基〔
デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）　）　１７！　ＨｚＯＳ［！Ｄ
　　　　ＩＭ　　ソルビトール２５ｍＭ−ＥｆｌＴ＾ ５ｈＭ−ＤＴＴ ＳＣＥ　１１街液　９．１ｇ　　ソルビトール１．４７
ｇクエン酸ナトリウム ０．１６８ｇ　ＥＤＴＡ ５０ｄ　Ｈ，０ ＨＣＺでｐＨを５．８に調整 ＣａＳ　　　　　ＬＭ　　ソルビトール１０ｍＭ−Ｃａ
（Ｊ　ｚ 濾過滅菌 ＰＥＧ溶液　　２０％ポリエチレングリコール１０＋＋
Ｍ−ＣａＣＪ。

１０５Ｍ　　）リス塩酸（ｐＨ７，４）濾過滅菌 ＳＯＳ　　　　　ＬＭ　　ソルビトール０．３ｘ　ＹＰ
Ｄ培地 １０ｓ＋Ｍ−Ｃａ（Ｊ　＊ ホルムアミド染料混合物 ０．１χ　キシレン　シレノールｌ’ＦＯ，２χ　ブロ
モフェノール　ブルー １０ｍＦＩ　ＥＤＴＡ ９５χ　脱イオン化ホルムアミド ゲル（最上部）７６．８ｇ　　尿素 ２４雇　アクリルアミド原液 ８　ｍｌ　　１０ｘ　ＴＢＥ 最初容量を１６ｈ＋１にする アクリルアミド原液 ３８ｇ　　アクリルアミド ２ｇ　ビス（Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド） 水を加えて総容量１００ｄｋする ゲル（底部）１４．４ｇ　　尿素 ３．０　ｇ　　スクロース ７．５　ｍｌ　　１０ｘ　ＴＨＥ ４．５ｍｌ　　アクリルアミド原液 ０．３　ｄ　　ブロモフェノールブルー溶液（０，０１
ｇ／ａｌｌ） 水を添加し総容量を３０ｍ１とする ジテオキ’ｉ　：　ｄｄ　ＡＴＰ　　　　　　Ｏ，Ｉ２
５ｍＭｄｄ　ＣＴＰ　　　　　　Ｏ，１０ｍＭｄｄ　Ｇ
ＴＰ　　　　　　Ｏ，１０ｍＭｄｄ　ＴＴＰ　　、　　
　　０．８０　ｍＭＤＮＴＰ原液　　０．５ｍＭ　　ｄ
ＧＴＰＯ，５ｍＭ　　ｄＣＴＰ ０．５ｍＭ　　ＴＴＰ Ｏ，５ｍＭ　　ｄＡＴＰ クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）希釈用緩衝液（１０ｘ）７０
ｍＭ）リス・ＭＣＩ、　ｐＨ７，５２００＋Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊ ７０　＋ｍＭ　　ＭｇＣｈ １　ｍＭ　　ＥＤＴＡ １０ＸＴＭＤ、　　ｐＨ７，５ ０，１Ｍ　　　トリス・ＨＣ７、ｐＨ７，５０，０５Ｍ
　　　Ｍｇ（Ｊ２ ０．０７５　　Ｍ　　ＤＴＴ 特に明記しない限り、上記溶液は使用時の基本濃度（ｌ
　ｘ）で表わした。実施例を通して、異なる濃度水準が
用いられ、その事実は溶液を基本濃度（１χ）の倍率で
呼ぶことによって示した。

再生朋＾天 １）寒天−ＭＣＩ　：　９　ｇバクトー寒天、１３．４
　ｇ塩化カリウム、２４０ｍ　）１２０、オートクレー
ブ。

２）　　１０ｘグルコース：２０ｇデキストロース、１
００１１＋１　ＩＬｚＯ、オートクレーブ。

３）　　１０ｘ　ＹＮＢ　　：６．７５ｇの酵母窒素塩
基（アミノ酸非含有）　、１ｏａｄ　ｎｚｏ、オートク
レーブ。（オートクレーブの前または後に最大で２００
ｘ／ｄ濃度の任意の所望のアミノ酸または核酸を加える
。）４）　　３０ｄの１０ｘグルコースおよび３０ｍ１
の１０ｘＹＮＢを２４０　ｍｌの融解寒天−ＫＣＩ溶液
に添加する。０．２ｍｇ　／　ｍｌビオチンを０．６−
および任意の他の所望アミノ酸または核酸を濃度が２０
６　／　ａｉｌになるように加えた。融解した再生用寒
天は５５〜６０°Ｃに保った。

ピキア・パス　１スの１ 旦土工・バス上ユ入はＹＰＤ（濃厚）またはＹＮＢ　（
最少）培地で増殖させた。必要に応じて、ＹＮＢ培地に
は炭素源（２％デキストロース、１％グリセロール、ま
たは０．５χメタノール）および５０ｇｇ　／　ｍｌの
アミノ酸を補足した。

酊Ａ吠定 ＤＮＡの配列決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら；プロ
シーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミイー・オ
プ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイク
・オプ・アメリカ（ＰＮＡＳ）、７４．５４６３（１９
７７）　；のジデオキシヌクレオチド　チエイン・ター
ミネーション（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅ　
ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法に従って行な
った。

以下の略号を実施例を通して使用する。

ＥＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸ＴＥＭＥＤ　　
μ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチレンジアミンＤＴＴ　
　　ジチオスレイトール １１５Ａ　　　牛血清アルブミン ＥｔＢｒ　　　臭化エチジウム Ｃｉ　　　　キュリー ｄＡＴＰ　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＧＴＰ　
　　デオキシグアノシン三リン酸ＴＴＰ　　　　ナミジ
ン三リン酸 ｄＣＴＰ　　　デオキシシチジン三リン酸ｄＸＴＰ　　
　デオキシ三リン酸ヌクレオチドの“総称゛オリゴ（ｄ
Ｔ）　＋　２＋ｌ　ｓコールラポラティブ・リサーチ社
（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋Ｉ
ｎｃ、）製ザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）　６
０，０００マイルス・ラボラトリ−（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａ
ｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ）製 イ乍ｊ＄ｉ ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　　匹ｌ肛控）　Ｐ
ＰＦＩ（肛＠　　ｈｉｓ４）　　（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８
０１７）およびＫＭ７１２１（肛ロ　皿　ｍｌΔ：：皿
４赳鴎Δ：　：ＰＨＩＳ４（ＮＲＲＬ　Ｙ−１８０１９
）は新鮮なｙｐ口平板培地から無菌水の入ったチューブ
にそれぞれ接種した。約５×１０７細胞からなるそれぞ
れの株を混合し、簡単に超音波処理して細胞凝塊を粉砕
し、さらにＧＮＡＰ寒天平板培地（５％デキストロース
、２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％寒天、２．
３％栄養寒天）上に撒いた。未混合のそれぞれの株（お
よそｌＸｌ０”細胞）を対照標準サンプルとして同様の
方法で処理した。ＧＮＡＰ平板培地は３０°Ｃで２４時
間インキユヘーションし、次いで胞子形成用寒天平板培
地（０，５％酢酸ナトリウム、１％ＫＣＩ、２％寒天）
にレプリカ培養した。このプレートを２０時間３０’Ｃ
でインキュベーションし、次いで炭素源を含まない最少
寒天平板培地にレプリカ培養した。メタノールは最少培
地上の細胞に蒸気相として流加した。

５日後、約２００個のコロニーが混合した細胞からレプ
リカ培養した最少平板培地上に表われた。

非混合の対照標準平板培地上にコロニーは発生せず、こ
のような結果は混合平板培地上のＡｒｇ”　Ｈｉｓ・Ｍ
ｕｔ”（Ｍｕｔ’はメタノール資化性を示す）コロニは
ＰＰＦＩおよびＫＭ７１２１細胞が交配した結果得られ
た二倍体であることを示唆している。このようなＡｒｇ
’　１ｌｔｓ”　Ｍｕｔ”株の二倍体の性質はサインフ
ィルターハイブリダイゼーションを行なってこれらの株
の４株のＡＯＸ座を試験することによってＩｉｎ認した
。使用した特異的プローブは：　ｐＰＧ３．０（ＮＲＲ
ＬＢ−１８０２２）、ＡＯＸ２特異的プローブ；　ｐＹ
Ｊ３０（ＮＲＲＬ　Ｂ１５８９０）、１ｌＴｓ４に特異
的なプローブ；およびｐＰＧ４．０（ＮＲＲＬ　Ｂ−１
５８６８）、ＡＯｘ１ニ特異的なプローブ；である。

ＰＰＦＩχＫＭ７１２に培体の胞子を形成させるために
、最初にコロニー（ＭＣ１００）をメタノール含有の二
培体選択用平板培地より回収した。約ｌＸｌ０ｈ個のこ
れら細胞をＧＮＡＰ平板培地に撒き、交配方法に記載し
た方法に従って処理したが、胞子形成用培地は４日間３
０°Ｃでインキュベーションして細胞を完全に胞子化し
た。胞子はそれぞれのプレートを５成の無菌水でリンス
することによって平板培地から回収した。９濁液は３ｍ
ｌのリン酸緩衝液（０，ＩＭＮａ、ＰＯ，、ｐＨ７，５
）で２回洗浄した。酵母溶菌用酵素グルスラーゼ（Ｇｌ
ｕｓｕｌａｓｅ）　　（エンド・ラボラトリーズ（Ｅｎ
ｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ニューヨーク）
およびザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）　　（６
０，０００単位／ｇ；マイルス・ラボラトリーズ（Ｍｉ
ｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））ならびにβ−メ
ルカプトエタノールの混合物を最終濃度がそれぞれ２％
（ｖ／ｖ）　、０．５＋ａｇ／ｍ、および０．１％にな
るように加えて栄養細胞を破壊した。

混合物は５時間３０°Ｃでインキュベーションした。

そうした後、胞子調製物は０．２％ツウィーン（Ｔｗｅ
ｅｎ）　８０　（ｖ／ｖ）を含む無菌水で２度洗浄し、
リン酸緩衝液に再懸濁した。次いで調製物は２０秒周期
の超音波処理を３回行なって胞子の凝塊を粉砕した。そ
うした後、胞子調製物サンプルを希釈し、２．０％グル
コースならびに５０ｎｌｄずつのアルギニンおよびヒス
チジンを含む最少培地の非選択マスタープレートに撒い
た。これらは４８時間３０°Ｃでインキュベーションし
た。次いで、それぞれのマスタープレートを次の一連の
最少平板培地上にレプリカ培養した。：１）グルコース
、　−ａｒｇ、　−ｈｉｓ２）グルコース、−ａｒｇ、
＋ｈｉｓ　　３）グルコース、＋ａｒｇｌｈｉｓおよび
４）グルコース、＋ａｒｇ、　＋ｈｉｓ　。

２４時間３０’Ｃでインキュベージジンした後、コロニ
ーのＡｒｇおよび旧Ｓ表現型を調べた。次いでＡｒｇ”
旧Ｓ−のコロニーをＹＮＢメタノール寒天寒天平板上地
上線培養してメタノール上での増殖性を試験した。約１
週間室温でインキュベーションした後、平板培地をＭｕ
ｔ表現型について調べた。１つの＾ｒｇ″Ｈ４５−Ｍｕ
ｔ−株をＭＣ１００−３と名付けた。

■　ピキア・パス　　スの 酵母細胞を約１０ｄのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１
２〜２０時間振とう培養した。次いで細胞を＾、。。が
約０．０１〜０．１になる様に希釈し、３０゛Ｃで６〜
８時間ＹＰＤ培地で対数増殖期に保った。１００ｍｆｆ
１のＹＰＤ培地にＡ６゜。が約０．１の種培養０．５ｍ
を接種し、３０°Ｃで約１２〜２０時間振とう培養した
。そうした後、培養液はＡ、。。が杓０．２〜０．３（
およそ１６〜２０時間後）になった時点でＤＡＭＯＮ　
ＩＥＣＤＰＲ−６００遠心分離機を用いて１５００　ｇ
で５分間遠心分離することによって集菌した。

スフェロプラストを調製するために、細胞を１０−の無
菌水（遠心分離は洗浄のたびごとに上述の方法に従って
行なった）で１回、１０ｄの新しく調製したＳＥＤで１
回、１０Ｉｄの滅菌１Ｍソルビトールで１回洗浄し、５
−のＳＣＥ緩衝液に再懸濁した。

４　ｍｇ　／　ｔｎｌｎゴザリアーゼ（Ｚｙ＋ｗｏｌｙ
ａｓｅ）６０，０００　　（マイルス　ラボラトリ−ズ
（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を５ｐＺ
加え、細胞を３０’Ｃで約３０分間インキュベーション
した。

スフェロプラストの形成は次のようにして検査した。　
１００　ｐｉアリコートの細胞をサイモリアーゼ添加前
または直後およびさまざまなインキュベーション期間後
に９００ｐＺの５％ＳＯＳおよび９００μｌの１Ｍソル
ビトールに添加した。インキュベーションは細胞がＳＯ
３で溶菌されるがソルビトールでは溶菌されない時点で
終了させた。スフェロプラスト形成後、１０＊ｆｆｉの
ＩＭ−ソルビトール滅閑溶液で１回洗浄して１．０００
ｇで５〜ＩＯ分間遠心分離し、さらに１０ｄの無１ｃａ
ｓで１回洗浄し遠心分離して、０．６　ｄのＣａＳに再
懸濁した。

形質転換を行なうために、水またはＴＥ緩衝液内のＤＮ
八へンプル（総容１２０ｐＺ）を１２　Ｘ　７５ｍｍの
無菌ポリプロピレンチューブに加えた。（少量のＤＮＡ
を用いて形質転換を最大にするためにはそれぞれのサン
プルに、５　ｇ／ｌｄの超音波処理した大腸菌ＤＮＡを
約ｌｐｌ使用する。）　１００　ｐｌのスフェロプラス
トを各々のＤＮＡサンプルに加え、室温で約２０分間イ
ンキュベーションした。ｌｄのＰＥＧ　溶液を各々のサ
ンプルに加え、室温で約１５分間インキュベーションし
た。サンプルは１，０００　ｇで５〜１０分間遠心分離
し、上澄液を除去した。ペレットを１５０．１のＳＯ３
に再懸濁し、室温で３０分間インキユヘーションした。

８５０μｌの無菌ＩＭ−ソルビトールを各々に加え、サ
ンプルを下記の方法に従って平板培養した。

ＬＯｍｆｌの再生用寒天は形質転換サンプルが準備でき
る少なくとも３０分前にプレートに注いだ。また１０ｍ
Ｎアリコートの再生用寒天は形質転換サンプルがＳＯ５
内にある期間にチューブに分配し４５〜５０°Ｃの浴内
に置いた。次いでサンプルをチューブに加え固体の底部
寒天層を含むプレート上に注ぎ、さらに３０’Ｃで３〜
５日間インキュベージロンした。

いろいろな時点でのスフェロプラストの質は次のように
して決定した。１０μｌのサンプルを採取し、９９０μ
！の１Ｍソルビトールに加えて１００倍希釈した。１０
μｌの希釈液を採取して、さらなる９９０μ！アリコー
トのＩＭ−ソルビトールを加えた。両希釈液１００　ｐ
ｌをＹＰＤ寒天培地に撒き平板培養して調製物中に残存
するスフ二ロプラスト化していない全細胞の濃度を定量
した。１００μｌの各々の希釈液は、宿主に必要な４０
ｎ／Ｉｄの全アミノ酸を追加した再生用寒天１０ｍ１！
に加えて再生可能なスフェロプラストの総数を定量した
。形質転換実験では良好な値が得られ、１　ｄ当りの再
生可能なスフェロプラスト総数は１〜３ＸＩＯ？個であ
り、１　ｍｌ当りの全細胞は１×１０３個であった。

１［Ｉ　ＭＣ１００−３ＹＭ５の 約１０ｘのｐＢＩ１３２２をｈ緋■で消化し、さらに脱
リン酸化した。−く土ｊＪ土鑓遺伝子を含む約５０μｇ
のｐＹＪ８（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８８９）はｑｎで消化
した。約２．７ｋｂの１ｍフラグメントを０．８％調製
アガロースゲルから単離した。３００ｎｇのフラグメン
トおよび３００ｎｇのＢａｍ１ｌＴで消化したｐＢＲ３
２２は０．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い、総容量
１０ｔｒｌの６６ｍＭ　トリス塩酸ｐｌ＋７．４．６．
６１１Ｍ−ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ−ＤＴＴおよび０．４
ｍＭ−ＡＴＰ溶液中で２４時間４°Ｃでインキュベーシ
ョンして結合させた。

結合反応物は実施例Ｖ記載の方法に従って大川Ｊ］ＭＣ
１０６１をアンピシリン耐性に形質転換するために用い
た。形質転換体は制限消化を行なってその特徴を調べる
と共に、正確な挿入サイズおよび方向をアガロースゲル
電気泳動によって確認した。

このプラスミドはｐＹＭ５と呼ばれ、マニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）、フーリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ
　Ｅ、Ｆ、）およびサムブロークス（Ｓａｍｂｒｏｏｘ
、Ｊ、）　、７ノーコールド　スプリング　バーバーラ
ボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）＋コールド　スプリング　ハー
バ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニュ
ーヨーク；に記載のアルカリ溶菌プラスミド調製技術（
ｔｈｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｉｙｓｉｓ　ｐｌａｓｍｉ
ｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｇｎｅ）を用
いて大腸菌より回収した。

約１０尾のｐＹＭ５はＭＣ１００−３を形質転換する前
にＳｔｕ上で消化した。こうすることによってプラスミ
ドは−Ｃ１００−３に存在する朋遺伝子配列のうちの本
来の肛鉦座または修飾された観■座のどちらか１方に組
込まれる。形質転換は実施例■に概説した方法に従って
行なった。

数種のＭＣ１００−３（ｐＹＭ５）旧ｓ４形質転換体か
らのＤＮＡを実施例■に従って単離し、サインフィルタ
ーハイブリダイゼーションによってＡＯＸ２座に位置す
る…鉗遺伝子に組込まれたｐＹ）＋５をもつ形質転換体
を選択した。使用した特異的プローブは：　ｐＰＧ３．
０（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０２２）、観■に特異的なプロ
ーブ；ｐＹＪ３０（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９０）　、朋
に特異的なプローブ：である。

酵母細胞は１００ｄのＹＮＢ培地に２％デキストロース
を添加した培地中、３０“Ｃでれ。。が１〜２になるま
で増殖させ、その後ダモン（Ｄａｍｏｎ）ＴＥＣＤＲＲ
６０００遠心分離機を用いて２．０００ｇで５分間遠心
分離して細胞をペレット状にした。ペレットはｄＨ，ｏ
で１回、ＳＥＤで１回、１Ｍ−ソルビトールで１回洗浄
し、次いで５ｄの０．１Ｍ）リス塩酸ｐＨ７，０および
１Ｍソルビトールの溶液に再懸濁した０次いで細胞に４
■／Ｉｄのサイモリアーゼ６０００溶液〔マルイス・ラ
ボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
））を５０〜１００　ｐＨ加えて混合し、３０°Ｃで１
時間インキュベーションした。そうした後、得られたス
フ二ロプラストを１　、０００ｇで５〜１０分間遠心分
離し、さらに５！Ｒ１のリシス・バッフｙ　−（Ｌｙｓ
ｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ）〔０，１χＳＯＳ、　１０ｍＭ　
）リス塩酸（ｐＨ７，４）、５ｍＭ−１！ＤＴＡ　。

および５０ｍＭ−Ｎａ（Ｊ　）に懸濁した。プロティナ
ーゼＫ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　）およびＲＮアーゼＡ　
〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）をそれぞれ１００　ｔ！ｇ
／ｄ加え、溶液を３７°Ｃで３０分間インキュベーショ
ンした。ＤＮＡは調製物に同容量のイソアミルアルコー
ル含有りｂロホルム（１：２４、Ｖ／ν）を加えて緩や
かに混合することによって除蛋白し、さらに層を１２，
０００ｇで２０分間遠心分離することによって分離させ
た。上（水性）層を新しいチューブに移し、さらに同量
のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ−シー
で抽出した。

層を前記のようにして分離し、最上部層を２〜３倍容量
の冷１００Ｘエタノールを含むチューブに移した。サン
プルは緩やかに混合し、ＤＮＡはプラスチック棒に巻き
取ることによって収集した。ＤＮＡはすぐに１４１［！
のＴＢ緩衝液に溶解し、さらに１００倍容量のＴＥ緩衝
液を用いて４°Ｃで一晩透析した。

１旌１−、已肘夏構築 ＤＮＡは実施例■の方法に従って、実施例■で作製した
ＭＣ１００−ＭＣ１００−３（ｐＹ”形質転換体より単
離した。１０ｔ！ｇのこのゲノムＤＮＡは旧ｎｄｎｌで
消化してさらに結合させた。結合反応は４°Ｃで２４時
間、６６ｍＭトリス塩酸ｐＨ７，４，６，６＋＋＋Ｍ−
ＭｇｔＪｚ　、１０ｍＭ−ＤＴＴ。

０．４＋ｗＭ−＾ＴＰおよび０．５単位のＴ４ＤＮ八リ
ガーゼ中で行なった。

結合混合物は直接、ｔＪｌｌｉＴｃ？ＩＣ１０６１細胞
に形質転換した。このＭＣ１０６１は形質転換に適格な
ように作られており、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら（１９８２）によって記載された上記方法に従って形
質転換した。アンピシリン耐性株の選択は細胞を５０ｇ
ｇ／ｄのアンピシリンを追加したＬＢ培地または２Ｂ培
地（０，２％ＮＨ４ＰＯ４、■、２％ＮａｔＨＰＯｎ　
、０．０１３％Ｍｇ５Ｏａ　・７１ｈＯ１０，０７４％
ＣａＣ１ｘ　・２ＨｇＯ１１ｐｇ／１ｎｆｌチアミン、
０．４％デキストロース）のどちらかで培養して行なっ
た。

９ＭＲ４と命名した１２．ＯＫｂプラスミドはマニアチ
スら（１９８２）の上記方法に従って回収した。このプ
ラスミドは５．３ｋｂ　０）観粋−ｊ通Ｉサイトの５′
側ＯＮ＾、２．７ｋｂの旦土ヱ　肛旦遺伝子および４．
ＯｋｂのｐＢＲ３２２を含んでいた。

尖旌拠■、■邦し■構築 ＡＯＸ２プロモーターの調節および発現を測定するため
に、大腸菌のｈ４遺伝子に融合させたＡＯＸ２の５′側
配列を含むベクターを構築した。５０Ｉ！ｇの９ＭＲ４
（実施例Ｖ）は製造業者の指導に従ってＩｎおよびＢａ
ｗｌ　［で消化した。ＡＯＸ２プロモーターを含む１．
８ｋｂの！！４１　ＩＩ　　Ｂａｍ１１１　フラグメン
トは０．８％調製用アガロースゲルより単離した。１０
河のｐＢＰｆｌ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８９２）をｈ畦！
で消化し、さらにアルカリホスファターゼを用いて５０
ｐ１の反応容量で脱リン酸化した（１単位の酵素を用い
て３７°Ｃで１時間５０１１Ｍトリス塩酸ｐＨ９，０、
１ｍＭ−ＭｇｔＪｚ　、１００μトＺｎＣ１ｚおよび１
１ＩＩＭスペルミジン中でインキエベーションした）。

３００ｎｇの１．８ｋｂフラグメントおよび３００ｎｇ
のｐＢＰｆｌは以下のようにしてＴ４リガーゼを用いて
結合させた。結合反応は２３°Ｃで１時間、１０μ！反
応容量の６６ＭＭ　）リス塩酸１））！７．６．５＋ｅ
Ｍ−Ｍｇ（Ｊ、、５＋ＩＩＭジチオスレイトール、１　
ｍＭ−ＡＴＰおよびｌヴアイス（ｗｅｉｓｓ）単位のＴ
４リガーゼを含む溶液中で行なった。得られたベクター
はｐＹＪ３８と命名した。

新規Ｓ＋ａａ　１制限サイトは以下のようにしてｐＹＪ
３８内に作製した。アダプターオリゴヌクレオチドはア
プライド・バイオシステムズのＤＮＡ　シンセサイザ（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　、モデル（Ｍｏｄｅｌ）３８０
Ａを用い、シアノエチルホスホルアミダイト（ｃｙａｎ
ｏｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を用
いて化学的に合成した： ５’　−ＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＧＴ−３’１０尾のｐＹ
Ｊ３８をＢＬＵｌで消化し、さらに上記の方法に従って
アルカリホスファターゼで脱リン酸化した＊　　１ｊ’
Ｈの上記アダプターおよび０．ｌ１１ｇのハ１！消化ｐ
ＹＪ３Ｂは上記方法に従ってＴ４リガーゼを用いて結合
させた。修飾したベクターはｐＹＪ４５と命名した。修
飾されたｆｉプロモーターを含む１．８ｋｂの鎖１フラ
グメントは、５０尾のｐＹＪ４５　を皿で消化すること
によって得られた。フラグメントは０．８％調製用アガ
ロースゲルから単離した。０．３眉のフラグメントおよ
び０．３鱈の皿消化ｐＢＰｆｌを上記方法に従って結合
してベクターｐＹＪ４６を作製した。０．３ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ　フラグメントを次のようにしてｐＹＪ４６のＡ
ＯＸ２セグメントの５′末端から欠落させた。１０Ｊｔ
ｇのｐＹＪ４６をに吐■で消化し、上記方法に従ってア
ルカリホスファターゼで処理した。これとは別に５０ｔ
ＩｇアリコートのｐＹＪ４６もまたｔＥｃｏＲＩで消化
し、１．５ｋｂフラグメントを０．８％調製用アガロー
スゲルから単離した。約０．３ｇずつのホスファターゼ
処理したｐＹＪ４６および単離フラグメントを結合させ
、上記方法に従って大腸菌内へ形質転換した。正しい構
造をもつ１つのプラスミドを単離し、ｐＹＪ５５と命名
した。

プＬ晦Ｊ引■し　ＧＳ　１５　ＹＪ５５　　の　　１１
旦土ヱ・バ入上悲久Ｇ５１１５　、ヒスチジン栄養要求
株（ＮＲＲＬ　Ｙ−１５８５１；　ｈｉｓ４）を実施例
■記載の方法に従ってプラスミドｐＹＪ５５（実施例■
）で形質転換した。安定な旧Ｓ゛株からのゲノムＤＮＡ
をサインフィルター　ハイブリダイゼーションで分析し
てプラスミドの位置を決定した。）１１５４座に組込ま
れた一ｐＹＪ５５を含む１つの形質転換体をＧＳＩ　１
５　（ｐＹＪ５５）と命名した。

ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２のプロモーターの調節および発
現は、Ｇ５１１５（ｐＳ＾０Ｈ５）株およびＧ５１１５
（ｐＹＪ５５）株のβ−ガラクトシダーゼ活性を定量す
ることによって比較した。それぞれの株の培養＞＆　１
００ｄをＹＮＢの１％グリセロール添加培地で２４時間
３０°Ｃで増殖させた後、炭素源を含まないＹＮＢ培地
に移して２４時間３０°Ｃで培養し、その後０．５％メ
タノール含有のＹＮＢ培地に移して５０時間３０°Ｃで
培養した。それぞれの培養液からのサンプルは以下の時
期に採取した＝１）グリセロール培地で２４時間培養後
、２）炭素源を含まない培地に移して２４時間後、３）
メタノール培地に移して２４時間後および５０時間後。

抽出物を調製し、下記方法に従ってβ−ガラクトシダー
ゼ活性についてアッセイを行なった。これらのアッセイ
の結果を第２表に示す。

β−ガラクトシダーゼのアッセイ法 １）必要な溶液 Ｌバ１スＬ二　　　　　　　−員笠盈度−ＮａｚＨＰＯ
，・７１（２０１６，１ｇ　　　Ｏ，０６ＭＮａＨｚＰ
Ｏａ　　　　　　　　　　５．５　　ｇ　　　０．０４
　　Ｍ。

ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　０．７５ｇ　　　０．
０１　　ＭＭｇＳＯ４・７１１□０　　　　　　　０．
２４６ｇ　　　０．００１　Ｍ２−メルカプトエタノー
ル２．７ｍｌ　　　０．０５　　Ｍ水で１１にする；ρ
１１は７になる ０−ニ　ロフェニルー　−Ｄ−ガータ　シトＯＮＰＧ４
００ｍｇＯＮＰＧ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｎ−１１２
７）を１００戚の蒸留水に溶解し、４■／ｄの０ＮＰＧ
溶液を作った。

２）　細胞を除去した蛋白質抽出物の調製それぞれのサ
ンプルはｄＨｚｏで１回、溶菌用緩衝液で１回洗浄し、
さらに溶菌用緩衝液に濃度が１５０＾６゜。／ｄになる
ように再懸濁した。０．５ｇのガラスピーズを３５０ｐ
Ｚアリコートのサンプルに加え、さらに混合物を氷上で
１回につき６０秒間、１分間隔で４回うす巻き攪拌した
。細胞スラリーをガラスピーズから除去し、上澄液を５
分間微量遠心機で遠心分離した。上澄液はアッセイを行
なうためにポリプロピレン製の微量遠心管に移した。そ
れぞれの抽出物中の総蛋白質量はブラケットフォルト（
Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ法〔バイオ・ラド（Ｂｉ。

Ｒａｄ）　）によって定量した。　ＢＳＡを標準蛋白質
として用いた。

３）　アッセイ法 １〜５０ｐ１の細胞除去蛋白質抽出物に１　ｍｌのＺ・
バッファーを加えた。次いで、混合物をうす巻き攪拌し
、さらに５分間３０°Ｃでインキュベーションした。反
応は０．２ｍｌの０ＰＮＧ（４■／瀬）を添加すること
によって開始させた。０．５成のＬＭ　　ＮａｘＣＯ３
溶液を適当な時間（Ａ４２゜〈１）に加えて反応を停止
させた。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定した。

４）　β−ガラクトシダーゼ活性単位の計算ＩＵとは、
３０°Ｃ，ｐＨ７で１分間に１　ｎｍｏｌｅのオルトニ
トロフェノール（ＯＮＰ）を遊離する酵素活性をさす。

１　ｎｍｏｌｅのＯＮＰは１ｃｍの光路長で０．００４
５の４２０ｎｍの吸光度（Ａ４２Ｇ）を持つ。それ故、
４２０ｎｍでの吸光度１は２２２ｎｍｏｌｅｓ　ＯＮＰ
／ｄ、または３７８ｎｍｏｌｅｓＯＮＰ／１．７　ｄ　
（分析した上澄液の総容量は１．７　ｄであった）に相
当する。第２表に表示した単位は次式に従って計算した
： Ｌ（分）

【図面の簡単な説明】

第１図はＡ−ＯＸ　ｌ　（ａ）および並イ鶏）遺伝子の
制限地図を表わす模式図である。 第２図はｐＢＲ３２２の制限地図を表わす模式図である
。 第３図はｐＹＪ８の制限地図を表わす模式図である。 第４図はプラスミドｐＹＭ５の制限地図を表わす模式図
である。 第５図はプラスミドルＹ門４の制限地図を表わす模式図
である。 第６図はｐＭＲ４構築のための工程図である。 第７図はプラスミドｐＢＰｆｌの制限地図を表わす模式
図である。 第８図はプラスミドｐＹＪ５５の制限地図を表わす模式
図である。 第９図はプラスミドｐＹＪ５５構築のための工程図であ
る。 第１０図はプラスミドｐｓＡＯＨ５の制限地図を表わす
模式図である。 （外４名） 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、 Ｆｌに。 ＹＭ５ ＭＣ１００−３＋ｐＹＭＳＩＨ＋ｓ争 ＭＲ４ ρＢＰｆ　１ ９ＭＲ４ ＹＪ３Ｅｌ ＹＪ４５ ＹＪ４６ ＹＪｓ５ ０Ｘ２ ＦＩＧ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、宿主細胞のための唯一の炭素源としてのメタノール
   の存在に応答するメチロトローフ酵母のアルコールオキ
   シダーゼII調節領域をコードするＤＮＡ配列であって；
   該配列が第１図（ｂ）の制限地図に示すように５′末端
   から最初の￥ＥｃｏＲ￥ I サイトおよびアルコールオ
   キシダーゼII（ＡＯＸ２）構造遺伝子の開始コドンとの
   間に含まれる、またはその機能的変異体である、上記の
   ＤＮＡ配列。 ２、前記ＤＮＡ配列が； 【遺伝子配列があります】 またはその機能的変異体である、請求項１記載のＤＮＡ
   配列。 ３、異種遺伝子に機能しうるように連結した、請求項１
   または２記載のＤＮＡ配列。 ４、実質的に純粋な￥ピキア￥・￥パストリス￥（￥Ｐ
   ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ￥）株であって、アルギニ
   ン原栄養性であり、ヒスチジン栄養要求性であり、かつ
   炭素源としてのメタノールを資化できない、上記の￥ピ
   キア・パストリス￥株。 ５、ＭＣｌ００−３である、請求項４記載の株。 ６、請求項１または２記載のＤＮＡ配列の調製法であっ
   て、￥ピキア・パストリス￥株のゲノムから該ＤＮＡ配
   列を含むフラグメントを単離することからなる、上記の
   調製法。 ７、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と結合することか
   らなる、発現カセット調製法。 ８、このようにして作成した前記発現カセットをベクタ
   ー内に取り込むことを含む、請求項７記載の方法。 ９、微生物をこのようにして作製した前記ベクターで形
   質転換することを含む、請求項８記載の方法。