JPH04299984A - 変異型ａｏｘ２プロモーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋
白質の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性酵母はメタノールを炭
素源およびエネルギー源として増殖する。その際、メタ
ノール代謝経路において第１段階でアルコール酸化酵素
（ＡＯＸ、ＥＣ１．１．３．Ｂ）によりメタノールをホ
ルムアルデヒドに酸化する。

【０００３】メタノール資化性酵母の一種であるピキア
酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　）はゲノム中
に二種のＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝
子）を有する。この内ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ２
プロモーターには活性に大きな差があり、通常ピキア酵
母で発現されているＡＯＸはほとんどＡＯＸ１プロモー
ターによって転写されたものであることが示されている
。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．９，　１３１６（１９８９）
）。

【０００４】ＡＯＸはグルコース含有培地ではほとんど
発現されないのに対し、メタノール含有培地では細胞中
の可溶化蛋白質の３０％を示すといわれている。ＡＯＸ
をコードする２種類のＡＯＸ遺伝子の内、ＡＯＸ１遺伝
子の制御領域であるＡＯＸ１プロモーターは強い活性を
持ち、メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現に用い
られ、高い産生量を示した。しかしながら、ＡＯＸ２プ
ロモーターは活性が弱く、異種蛋白質の発現には適当で
はなかった。メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現
系は大量に産物が得られるために、その発現系に強力な
プロモーターが求められていた。

【０００５】最近、そのＡＯＸ遺伝子の調節領域を用い
て異種蛋白質を産生する方法が研究されている（Ｙｅａ
ｓｔ，　５，　１６７−１７７（１９８９）　、特開平
１−１２８７９０号公報、同２−１０４２９０号公報、
ヨーロッパ公開公報３４７９２８等）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高レ
ベルに異種蛋白質を産生する上で重要な働きを持つ新規
なプロモーターを提供すること及びそれを取得する方法
を示すことである。このプロモーターを担持したプラス
ミドを用いて形質転換体を取得し、異種蛋白質を産生す
る系を確立することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記■〜■記
載のものであり、これにより上記課題を解決できる。■
　　天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の一部を欠
失、置換または新たな塩基配列を付加してなる変異型Ａ
ＯＸ２プロモーターを担持してなるプラスミド。■　　
上記■記載のプラスミドを導入してなる形質転換体■　
　上記■記載の形質転換体を培養することにより異種蛋
白質を製造する方法。

【０００８】（１）変異型ＡＯＸ２プロモーター本発明
の変異型ＡＯＸ２プロモーターは天然型（即ち、野生型
）ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の一部を欠失、置換
または新たな塩基配列を付加してなる。

【０００９】ａ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を欠失してなる場合 欠失部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載した天然
型ＡＯＸ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３
０〜１５２８に位置すればよい。欠失は一塩基でもそれ
以上でもよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的
には配列番号１の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ
）の４３９ｂｐを欠失したもの、即ち配列番号２に記載
のプロモーターが挙げられる。

【００１０】ｂ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を他の塩基配列で置換してなる場合置換部位は
天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば特に制限さ
れない。例えば、配列番号１に記載したＡＯＸ２プロモ
ーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１５２８に位
置すればよい。置換は一塩基でもそれ以上でもよく、ま
た一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配列番号１の
塩基番号１２７４（Ｔ）を（Ｃ）に置換したもの、即ち
配列番号３に記載のプロモーターが挙げられる。

【００１１】ｃ．天然型ＡＯＸ２プロモーターに新たな
塩基配列を付加してなる場合 付加部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載したＡＯ
Ｘ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１
５２８に位置すればよい。付加は一塩基でもそれ以上で
もよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配
列番号１の塩基番号１３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の
間に配列番号７を付加したもの、即ち配列番号４に記載
したプロモーターが挙げられる。

【００１２】本発明において、上記配列番号２〜４の塩
基配列の例えば、塩基番号１〜７３０の領域は、簡明に
説明するため天然型と同一に記載したが、この領域は特
にこの配列に限定されないことは明白であり、適宜必要
に応じて塩基の欠失、置換、挿入を行うことができる。

【００１３】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の
欠失、置換または付加処理は一般的な遺伝子工学的手法
を用いて行うことができるが、例えば、部位指定削除法
〔Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ，　
Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１，　１６４
５（１９８３）〕、部位特異的変異法〔Ｓｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　〕、制限酵素
処理と合成遺伝子の利用による方法等が挙げられる。

【００１４】また、ＡＯＸ１遺伝子によりＡＯＸが産生
されず、その染色体上において天然型（野生型）ＡＯＸ
２プロモーターを担持してなる菌株をメタノール含有培
地中で培養し、変異を起こして増殖良好となった菌株か
ら当該変異型ＡＯＸ２プロモーターを回収することがで
きる。

【００１５】（２）プラスミド 本発明のプラスミドは（１）の変異型ＡＯＸ２プロモー
ターを担持してなる。本発明のプラスミドはシグナルペ
プチド遺伝子、構造蛋白質遺伝子、ターミネーター、相
同領域、マーカー遺伝子、宿主中で複製可能な自律性複
製配列等を担持していてもよい。

【００１６】構造遺伝子は異種蛋白質（例えば、ヒト血
清アルブミン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター、Ｂ型肝炎表面抗原、各種インターフ
ェロン等）遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子等
が例示される。　　ターミネーターはＡＯＸ１ターミネ
ーターあるいはＡＯＸ２ターミネーター等が例示される
。

【００１７】相同領域はＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２
、ＡＲＧ４等が例示される。マーカー遺伝子は抗生物質
耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子等が用いられる。 抗生物質としてはシクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロ
ラムフェニコール、ブレオマイシン、ハイグロマイシン
等が例示される。栄養要求性相補遺伝子としては、ＨＩ
Ｓ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が挙げられる。

【００１８】転写ユニットは５′側から３′側に向かっ
て、変異型ＡＯＸ２プロモーター、シグナルペプチド遺
伝子、構造蛋白質遺伝子、ターミネーターの順に配置さ
れる。

【００１９】本発明のプラスミドは通常の遺伝子工学技
術を用いて調製することができる。 （３）形質転換体 本発明の形質転換体は（２）のプラスミドを導入してな
る。

【００２０】本発明の宿主は酵母が好ましく、より好ま
しくはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｒｉｓ）で
ある。具体的にはＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−
１５８５１）等が例示される。

【００２１】宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法
、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラストポ
リエチレン融合法、エレクトロポレーション法などが使
用でき、必要な形質転換体を選択する。

【００２２】プラスミドの宿主細胞中での存在の様式は
、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込ま
れる。または、プラスミド状態で存在していてもよい。 宿主に導入される外来遺伝子のコピー数は１コピーでも
複数コピーでもよい。

【００２３】また、他のプロモーターで異種遺伝子を発
現させるプラスミドと同じ菌株内に存在させても構わな
い。 （４）異種蛋白質の製造方法 （３）で得られた形質転換株は、宿主細胞の自体公知の
培地で培養する。培地としては０．０１〜５％メタノー
ルを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％　ＹｅａｓｔＮ
ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ　社）　〕、お
よび０．０１〜５％メタノールを含有したＹＰ培地〔１
％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ　社）　、２％
ポリペプトン（大五栄養社）〕などが例示される。

【００２４】培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０
℃程度）で２０〜３６０時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清を固定
し、自体公知の方法、例えばアフィニティクロマトグラ
フィー、ゲル濾過分画法などにより異種蛋白質を精製す
る。

【００２５】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。

【００２６】なお、本発明において多くの技法、反応お
よび分析方法は当業界においてよく知られている。特に
断らない限り、全ての酵素は商業的供給源、例えば、宝
酒造等から入手することができる。

【００２７】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用した
。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
）ＧＴＳ１１５、ＰＣ４１３０、ＰＣ４１０５及びプラ
スミドｐＰＧＰ１、ｐＰＧＳ１はフィリップス・ペトロ
リウム社から入手した。

【００２８】プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、
プラークハイブリダイゼーション法、及び電気泳動法は
「モレキュラークローニング」コールドスプリングハー
バーラボラトリー〔「Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　」Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載されている方法に
より行った。

【００２９】実施例１．ＧＣＰ１０１の取得（図１参照
） 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ）ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域
に、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転
写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切
断した断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られている。 この株はＡＯＸ１遺伝子が存在しないためにメタノール
を炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕ
ｔ−株）。

【００３０】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース
）３ｍｌに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ５４０　＝　
１となるようにＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。３日間
３０℃で培養後に初期ＯＤ５４０　＝　１となるように
ＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。さらに３日毎に同様の
継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０７ｃｅｌｌ／ｐ
ｌａｔｅになるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−
ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．　プレート（０．７％　イースト
ナイトロジェンベースウイズアウトアミノアシッド、２
％メタノール、１．５％寒天末）　に塗布し、３０℃５
　日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、
１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．　プレートから２０個のコロニーが生じた。こ
のプレートではＭｕｔ−株はほとんど成育できず、Ｍｕ
ｔ＋株は成育できる。即ち、このプレートでコロニーが
生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕ
ｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じた
コロニーの内の１　つを適当に滅菌水で希釈して２％Ｍ
ｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．　プレートに拡げシング
ルコロニーに単離した。その一つをＧＣＰ１０１と名付
けた。

【００３１】ＰＣ４１３０とＧＣＰ１０１との各種培地
における増殖度の比較を行った。ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．
プレート（０．７％　イーストナイトロジェンベースウ
イズアウトアミノアシッド、２％グルコース、１．５％
寒天末）　に４　℃に保存していた菌体をＹＰＤ　メデ
ィウム３ｍｌ／試験管に１　白金耳とり、２４時間３０
℃で培養する。初期ＯＤ５４０　＝０．１となるように
５０ｍｌ各種培地／　フラスコに植え、３０℃で培養し
、２４時間毎の増殖度を測定した（表１）。用いた培地
はＹＰＤ培地、２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（０．５％イー
ストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％メタノ
ール）、４％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（０．５％イーストエ
キストラクト、２％バクトペプトン、４％メタノール）
の３種類を使用した。その結果、グルコースを炭素源に
した培地では２つの株に差はなかったが、メタノールを
炭素源とした培地ではＧＣＰ１０１はＰＣ４１３０より
も増殖が良好になった（Ｍｕｔ＋株に変換した）ことが
観察された。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表１　
　　　ＧＣＰ１０１とＰＣ４１３０の各種培地での菌体
増殖（ＯＤ５４０　）―――――――――――――――
――――――――――――――――――――　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　培養時間（時間）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　培地　　　　　　　　　　　
　　　株　　　　　　　　　０　　　　　　　２４　　
　　　　　４８　　　　　　　　７２　　　　　　　　
　　　　―――――――――――――――――――――
――――――――――――――ＹＰＤ培地　　　　　　
　　ＰＣ４１３０　　　　　０．１　　　　　　　６７
　　　　　　　８０　　　　　　　　７８　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ
ＣＰ１０１　　　　　０．１　　　　　　　６３　　　
　　　　７８　　　　　　　　７９　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２％ＭｅＯＨ−ＹＰ　培地　　　　ＰＣ４１３０　　　
　　０．１　　　　　　　１６　　　　　　　３６　　
　　　　　　４６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＧＣＰ１０１　　　　　０
．１　　　　　　　２４　　　　　　　６３　　　　　
　　　６３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４％ＭｅＯＨ−ＹＰ　培
地　　　　ＰＣ４１３０　　　　　０．１　　　　　　
　　９　　　　　　　２０　　　　　　　　２８　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　ＧＣＰ１０１　　　　　０．１　　　　　　　１０
　　　　　　　５７　　　　　　　　８４　　　　　　
　　　　　　―――――――――――――――――――
――――――――――――――――実施例２．ＡＯＸ２
遺伝子のクローニングＡＯＸ２遺伝子付近の配列及び制
限酵素地図はＣｒｅｇｇ　らＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂ
ｉｏｌ，　９，１３１６−１３２３（１９８９）　及び
Ｋｏｕｔｚ　らＹＥＡＳＴ，　５，　１６７−１７７（
１９８９）　によって報告されており、それらを参考に
してＡＯＸ２遺伝子のクローニングを計画した。ＡＯＸ
２遺伝子付近の制限酵素地図を図２に示した。まず、Ｐ
Ｃ４１３０とＧＣＰ１０１両株よりＣａｍｅｒｏｎ　ら
の方法Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　４，
　１４２９（１９７７）　により染色体ＤＮＡ　を抽出
精製した。両染色体ＤＮＡ　をＡＯＸ２プロモーター領
域・ＡＯＸ２構造遺伝子・ＡＯＸ２ターミネーターが完
全に含まれるＸｂａＩとＰｓｔＩでの完全な消化を行っ
た。エタノール沈殿を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶
かした。 ＥｃｏＲＩ　メチラーゼ（　宝酒造製）　を加え、反応
させた。ＴＥ飽和フェノール・クロロホルム抽出、続い
てクロロホルム抽出を行い、水層についてエタノール沈
殿を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶かした。ＤＮＡ　
ブランティングキット（宝酒造製）を用いて末端を平滑
化し、そこにＥｃｏＲＩ　リンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ−
Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ）　（宝酒造製）をＤＮＡ　ライゲ
ーションキット（宝酒造製）を用いてライゲーションし
た。再度エタノール沈殿を行い、遠心、乾燥後に滅菌水
に溶かし、ＥｃｏＲＩ　を加え３７℃１　時間インキュ
ベーションした。１％アガロース電気泳動で４　〜５ｋ
ｂ　に相当する領域を切り出し、ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ
　ＩＩ（ＢＩＯ　１０１　社製）　による溶出精製を行
ってＤＮＡ　を回収し、滅菌水にとかした。λｇｔ１０
　ａｒｍｓ（Ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ　ＴＭ　Ｓｙｓｔｅ
ｍ）（プロメガ社製）　とライゲーションし、Ｇｉｇａ
ｐａｃｋ−ＧＯＬＤ３（　ストラタジーン社製）　を用
いてインビトロパッケイジングを行った。Ａ　６００　
＝２に調製しておいたＥ．ｃｏｌｉＣ６００　株とＣ６
００ｈｆｌ　株に吸着させ、ＮＺＹ　プレート（１％Ｎ
Ｚ　アミン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％イース
トエクストラクト、０．０２％　硫酸マグネシウム、１
．５％寒天末）　に播きライブラリーを作成し、タイタ
ーを測定した。組み換えファージをＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ６
００ｈｆｌ株に吸着させ、１　プレートに約５００　個
ずつプラークが生じるようにＮＺＹ　プレートに播いた
。ＰＣ４１３０とＧＣ１０１　両株由来共に４　枚のナ
イロンメンブラン　Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ　Ｓｃ
ｒｅｅｎ　ＴＭ（　ＮＥＮ　製）　を用い、プラークを
メンブランに移行し、変成・中和・固定処理を行った。 Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＩＦｏ１０１３　株
由来ＡＯＸ１　構造遺伝子前半分に当たるＥｃｏＲＶ　
とＢｇｌＩＩ　で消化して得られる断片をランダムプラ
イマーラベリングキット（宝酒造製）を用いて３２Ｐ　
標識し、プローブとした。プレハイブリダイゼーション
は１％ＢＳＡ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５Ｍ　　Ｎａ
Ｈ２　ＰＯ４　（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ溶液中６５
℃、５分行った。ハイブリダイゼーションは１％ＢＳＡ
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．５ＭＮａＨ２　ＰＯ４　（
ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、３２Ｐ−プローブ溶液中６
５℃、一夜行った。洗浄は０．５Ｍ　　ＮａＨ２　ＰＯ
４　（ｐＨ７．２）溶液中で室温１０分間インキュベー
トし、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、４０ｍＭ ＮａＨ２　ＰＯ４　（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ溶液中
で３７℃３０分間３回インキュベートした。フィルター
を風乾し、Ｘ線フィルム露光カセット中Ｘ線フィルムと
合わせて−８０℃１６時間放置し、オートラジオグラフ
ィーを行った。それぞれの株由来共に２個ずつのポジテ
ィブクローンが得られた。その内の１クローンずつにつ
いてファージの増殖を行い、ファージＤＮＡを抽出した
。ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動で目的の断
片（１．５ｋｂと２．９ｋｂ）が生じていることを確か
めた。ｐＵＣ１９（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
社製）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリフォスファター
ゼ処理した断片を回収し、ファージから回収してＥｃｏ
ＲＩ消化したＤＮＡとをライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＨＢ１０１を形質転換し、４０μｇ／ｍＬアンピシリ
ン含有Ｌプレート（トリスベース０．６２ｇ、ポリペプ
トン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリ
ウム５ｇを水に溶解し、１Ｌ（リットル）とした後に１
５ｇの寒天末を加えてオートクレーブ滅菌し、プラスチ
ックシャーレに分注固化する。アンピシリンはオートク
レーブ後、培地が冷えてから添加する。）に播き、３７
℃、一夜培養した。生じたコロニーについてミニプレッ
プを行いプラスミドを抽出し、ＥｃｏＲＩ消化によるス
クリーニングを行った。その結果、ＰＣ１３０とＧＣＰ
１０１両株由来共１．５ｋｂと２．７ｋｂの断片がｐＵ
Ｃ１９に挿入されたクローンが得られた。それらのクロ
ーンを４０μｇ／ｍＬアンピシリン含有スーパーブロス
（バクトトリプトン１２ｇ、イーストエキストラクト２
４ｇ、グリセロール５ｍＬを水に溶解し９００ｍＬとし
てオートクレーブ滅菌したＡ液、及びリン酸２水素カリ
ウム３．８１ｇ、リン酸１水素カリウム１２．５ｇを水
に溶解して１００ｍＬとしてオートクレーブ滅菌したＢ
液とを９：１（ｖ／ｖ）の割合で混合したもの）中、３
７℃、一夜振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法にてプラス
ミドＤＮＡを大量に抽出精製した。ＰＣ４１３０由来Ａ
ＯＸ２プロモーター領域を含むプラスミドをｐＭＭ０３
０、ＡＯＸ２構造遺伝子を含むプラスミドをｐＭＭ０３
１、ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロモーター領域を含む
プラスミドをｐＭＭ０３４、ＡＯＸ２構造遺伝子を含む
プラスミドをｐＭＭ０３５と命名した（図３、図４参照
）。これらのプラスミドの各種制限酵素消化により生じ
る断片の大きさは報告されているパターンと一致した。

【００３２】 実施例３．ＡＯＸ２プロモーター領域の塩基配列決定ｐ
ＭＭ０３０及びｐＭＭ０３４をＥｃｏＲＩで消化し、１
．５ｋｂ断片を回収し、ＤＮＡプランティングキット（
宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。一方、ｐＵＣ１
９をＸｂａＩで消化しマングビーンヌクレアーゼ（宝酒
造製）処理の後、アリカリフォスファターゼ処理をおこ
なった断片とライゲーションし、形質転換体からプラス
ミドＤＮＡを調製した。この操作によりＰＣ４１３０由
来ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来ＡＯ
Ｘ２プロモーター領域ＤＮＡがｐＵＣ１９のＸｂａＩサ
イトにサブクローニングされた。これらのプラスミドを
キロシークエンス用デレーションキット（宝酒造製）を
用いて１５０〜３００ｂｐずつインサートサイズが異な
るデレーションミュータントを両方から５〜６クローン
ずつ作製した。これらのデレーションミュータントをＭ
１３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を使用
して塩基配列を決定した。その結果、ＰＣ４１３０由来
ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ
２プロモーター領域のＡＴＧ上流１．５ｋｂの全塩基配
列が決定された。両株由来の配列を比較したところ、Ｐ
Ｃ４１３０由来ではＡＯＸ２構造遺伝子の開始コドンＡ
ＴＧ（配列番号１の１５２８以降の不記載の１５２９〜
１５３１番目）の上流２５５ｂｐ、即ち配列番号１の１
２７４はＴであるのに、ＧＣＰ１０１由来ではＣ（即ち
、配列番号３の１２７４番目）となっており１塩基異な
っていることが明らかとなった。

【００３３】実施例４．他のＭｕｔ＋変異株のＡＯＸ２
プロモーターの変異部位の探索 ＨＳＡ産生ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　ＰＣ
４１０５株はｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ　　ＧＴＳ
１１５株のＡＯＸ１領域にＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧ
Ｓ１を置換して得られた株である。ｐＰＧＳ１と実施例
１のｐＰＧＰ１との違いは、ｐＰＧＰ１はＨＳＡ３′側
にポリＡ領域が存在するがｐＰＧＳ１では除去されてい
ることのみ異なっている。

【００３４】ＰＣ４１０５株について７つの独立したフ
ラスコで実施例１で行ったことと同様の継代実験を行っ
た。その結果、７つのフラスコ由来共にメタノール含有
培地での増殖が良好となった株（Ｍｕｔ＋株）が得られ
た。それらをシングルコロニーに単離し、ＳＨＧ４１０
５−４、ＳＨＧ４１０５−８、ＳＨＧ４１０５−９、Ｓ
ＨＧ４１０５−１０、ＳＨＧ４１０５−１１、ＳＨＧ４
１０５−１６、ＳＨＧ４１０５−１８と名付けた（図５
参照）。これら７つの株及びＰＣ４１０５についてＣａ
ｍｅｒｏｎ　らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．，　４，　１４２９　（１９７７））により染色
体ＤＮＡを抽出精製した。実施例２で得たＰＣ４１３０
、ＧＣＰ１０１両株の染色体ＤＮＡと共にＡＯＸ２プロ
モーター領域ＤＮＡの増幅をＰＣＲ法により行った。詳
細を説明すると、まず、プライマーの合成を行った。前
記実施例３で決定した塩基配列、配列番号１を基にＡＯ
Ｘ２遺伝子のＡＴＧより上流１４３塩基〜１６０塩基（
配列番号１の１３６９〜１３８６番）にＥｃｏＲＩ部位
を付けた逆鎖の配列を３′側のプライマー（配列番号５
）とし、ＡＴＧより上流７８６塩基〜８０３塩基（配列
番号１の７２６〜７３３番）にＢａｍＨＩ部位を付けた
主鎖の配列を５′側のプライマー（配列番号６）とした
。

【００３５】以上２つの配列をアプライドバイオシステ
ム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホアミ
ダイド法にて合成した。上記１０種類の染色体ＤＮＡを
鋳型として、２種類のプライマーを用い、ＧｅｎｅＡｍ
ｐ　ＴＭキット（宝酒造製）を用いて添付の説明書のと
おりにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはパーキン・
エルマー・シータス・ＤＮＡサーマル・サーキュラー（
ＰＪ２０００）を用い、ＤＮＡ鎖の熱変成は９４℃１分
、プライマーとのアニーリングは３７℃２分、ポリメラ
ーゼによる伸長反応は７２℃２分を１サイクルとして３
５サイクル行った。アガロース電気泳動により約６５０
ｂｐに相当する大きさのＤＮＡをＳＵＰＲＥＣＴＭ−０
１　（宝酒造製）により回収・精製した。ＳＨＧ４１０
５−１６については約２５０ｂｐ　に相当する大きさの
ＤＮＡが増幅されたので、それを回収・精製した。一方
、ｐＵＣ１９　をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、
２．７ｋｂ断片を回収し、アルカリフォスファターゼ処
理を行った。増幅されたＤＮＡとライゲーションし、Ｅ
．ｃｏｌｉコンピテントセルＤＨ５（東洋紡製）　を形
質転換し、得られた形質転換体より目的のプラスミドを
持つ菌を選んだ。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミド
を調製した。これら１０種類のプラスミドについてＭ１
３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を用いて
ＥｃｏＲＩ側から約２００塩基の配列を決定した。ＳＨ
Ｇ４１０５−１６については増幅された全塩基配列を決
定した。その結果、ＰＣ４１３０・ＰＣ４１０５は従来
の報告（ＫｏｕｔｚらＹＥＡＳＴ，　５，　１６７−１
７７（１９８９））と同じ配列番号１の塩基配列であっ
た。また、ＧＣＰ１０１は項３で示したようにＡＴＧ　
から上流２５５ｂｐ　のＴ　がＣ　に変異していること
が追試された（配列番号３）。ＳＨＧ４１０５−４　、
ＳＨＧ４１０５−９　、ＳＨＧ４１０５−１０、ＳＨＧ
４１０５−１１、ＳＨＧ４１０５−１８はＧＣＰ１０１
と全く同じ変異であり、配列番号３のプロモーター配列
を示した。ＳＨＧ４１０５−８　はＡＴＧから上流２５
５ｂｐのＴ　はそのままであったが、ＡＴＧ　から上流
２１５ｂｐ　付近と２３４ｂｐ　付近のＧＧＡＧＡ　を
介してその間の配列番号７に示す１９塩基の繰り返し配
列の挿入が見られた（配列番号１の塩基番号１３１４（
Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号７を付加した配列
番号４に示すプロモーター配列が得られる。）。ＳＨＧ
４１０５−１６はＡＴＧ　から上流２５５ｂｐ　のＴ　
はそのままであったが、ＡＴＧ　から上流３４２ｂｐ　
〜７８０ｂｐ　の間の４３９ｂｐ　の欠失（配列番号１
の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ）の欠失）が見
られた（配列番号２）　。

【００３６】実施例５．ＧＣＰ１０１由来のＡＯＸ２プ
ロモーター活性 ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロモーターとＰＣ４１３０
由来ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現するベ
クターを作製し、そのプロモーター活性を確認した。

【００３７】ｐＰＧＰ１をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡブ
ランティングキット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化
した。そこにＥｃｏＲＩリンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ａ−Ａ
−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ）　（宝酒造製）をライゲーションし
た。ＳｐｈＩによる完全な消化及びＥｃｏＲＩによる部
分消化を行い、６．５ｋｂ　断片を回収・精製した。ｐ
ＵＣ１９　をＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで消化しアルカリ
フォスファターゼ処理の後、前記断片をライゲーション
し、ｐＵＣ１９にＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡ
が発現し、ＨＩＳ４を選択マーカーに持つプラスミドｐ
ＰＧ００１を得た（図６参照）。ｐＰＧ００１をＥｃｏ
ＲＩで部分消化し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒
造製）を用いて末端を平滑化した。一方、アプライドバ
イオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いて
ホスホアミダイド法によてＧＧＧＡＴＣＣＣの配列を持
つＢａｍＨＩリンカーを合成した。これをＴ４ポリヌク
レオチオキナーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、先に
平滑化処理した断片とライゲーションした。ＡｓｕＩＩ
及びＢａｍＨＩで消化し、７．１ｋｂ　断片を精製した
。一方、ｐＰＧＰ１　をＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、Ｄ
ＮＡブランティングキット（宝酒造製）を用いて末端を
平滑化した。 そこにＢａｍＨＩ　リンカーｄ（ｐＧ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ
−Ｃ−Ｃ−Ｃ）　をライゲーションし、ＡｓｕＩＩ　及
びＢａｍＨＩ　で消化し、１．９ｂｐ断片を精製した。 前出の７．１ｋｂ　断片とライゲーションし、ｐＰＧ０
０２を得た。

【００３８】ｐＭＭ０３０及びｐＭＭ０３４をＥａｅＩ
で消化し、１．５ｋｂ　の断片を回収した。マングビー
ンヌクレアーゼ（宝酒造製）処理により末端を平滑化し
た。そこにアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機
モデル３８１Ａを用いてホスホアミダイド法にてＣＴＴ
ＣＧＡＡＧの配列を持つＡｓｕＩＩ　リンカーを合成し
た。これをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）
によりリン酸化し、先に平滑化処理した断片とライゲー
ションした。それをＥｃｏＲＩ　及びＡｓｕＩＩ　で消
化し、１．５ｋｂ　のＡＯＸ２プロモーター領域断片を
回収した。一方、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡ
が発現し、ＨＩＳ４領域を持つプラスミドｐＰＧ００２
をＥｃｏＲＩ　及びＡｓｕＩＩ　で消化し、ＡＯＸ１プ
ロモーター領域を除いた８．１ｋｂ断片をアルカリフォ
スファターゼ処理を行った後に回収した。ＡＯＸ２プロ
モーター領域１．５　ｋｂ断片とライゲーションし、Ｐ
Ｃ４１３０由来（天然型）ＡＯＸ２プロモーター支配下
にＨＳＡ　が発現するプラスミドｐＭＭ０４１、ＧＣＰ
１０１由来（変異型）ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨ
ＳＡ　が発現するプラスミドｐＭＭ０４２を作製した（
図７参照）。

【００３９】ｐＰＧ００２、ｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４
２をＨＩＳ４領域に１　ヵ所切断部位が存在する酵素で
あるＳｔｕＩで消化し、線状にした後ＧＴＳ１１５に導
入した。これらのプラスミドはＧＴＳ１１５のｈｉｓ４
領域に相同的組み換えを介して組み込まれる。ピキア酵
母の形質転換の方法は実施例４で行った方法と同じであ
る。形質転換の後、生じたコロニーはヒスチジン要求性
のプレートであるので全てが形質転換体と考えられる。 ３Ｇ１グラスフィルターで濾過して寒天を除き、濾液の
一部をＹＰＤ培地に植え３０℃一夜培養した。その培養
液をもとに初期濃度Ａ５４０　＝０．１となるように５
０ｍＬの各種培地に植えた。２４時間毎に培養液の一部
を採取し、培養上清に存在するヒト血清アルブミン濃度
をＲＰＨＡ法（ＥＰ　特許第１２２６２０号）　にて測
定した。その結果、ＰＣ４１３０由来ＡＯＸ２プロモー
ターではヒト血清アルブミンを産生する活性が低いのに
対し、ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロモーターではＡＯ
Ｘ１プロモーター並のヒト血清アルブミンを産生する活
性を示すことがわかった。表２に結果を示す。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表２　
　　　培養上清中のＨＳＡ産生量（ｍｇ／Ｌ）――――
―――――――――――――――――――――――――
――――――　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
培養時間（時間）　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　株　　　　　　　　　　　　　　　　　　培地　　
　　　　　　　　　　　２４　　　　　　　４８　　　
　　　　１２０　　　　　　　　――――――――――
―――――――――――――――――――――――――
　　　　ｐＰＧ００２／ＧＴＳ１１５　　　　　　　　
　２％ＭｅＯＨ−ＹＰ　　　　　　　　　８　　　　　
　　３０　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　
　（ＡＯＸ１　プロモーター）　　　４％ＭｅＯＨ−Ｙ
Ｐ　　　　　　　　　２　　　　　　　６０　　　　　
　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｐＭＭ０４１／ＧＴＳ１
１５　　　　　　　　　２％ＭｅＯＨ−ＹＰ　　　　　
　　　　−　　　　　　　　−　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　　（ＰＣ４１３０　由来天然型　
　　　４％ＭｅＯＨ−ＹＰ　　　　　　　　　−　　　
　　　　　１　　　　　　　　　１　　　　　　　　　
　　　ＡＯＸ２プロモーター）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｐＭＭ０４２／ＧＴ
Ｓ１１５　　　　　　　　　２％ＭｅＯＨ−ＹＰ　　　
　　　　　　８　　　　　　　２０　　　　　　　　４
０　　　　　　　　　　　　（ＰＣＰ１０１　由来変異
型　　　　４％ＭｅＯＨ−ＹＰ　　　　　　　　　１　
　　　　　　６０　　　　　　　１２０　　　　　　　
　　　　　ＡＯＸ２プロモーター）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　――――――――
―――――――――――――――――――――――――
――　−は検出できなかったことを示す。

【００４０】実施例６．変異型ＡＯＸ２プロモーターを
用いたＨＳＡ産生株の取得 実施例５のようにｐＭＭ０４２をＳｔｕＩで消化した後
、ＧＴＳ１１５株に導入した。ＧＴＳ１１５株のｈｉｓ
４領域と相同的組み換えを介して組み込まれるが、一度
の形質転換の操作で複数コピー組み込まれる場合もある
。形質転換の後に生じたコロニーを３Ｇ１グラスフィル
ターで濾過して寒天を除き、濾液をさらに１００ｃｅｌ
ｌｓ／ｐｌａｔｅになるように滅菌水で希釈してＹＮＢ
　Ｗ／Ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロ
ジェンベースウイズアウトアミノアシッド、２％グルコ
ース、１．５％寒天末）に塗布した。３０℃、３日間培
養し、シングルコロニーを生じさせた。

【００４１】上記クローン１０種類について、実施例２
で行ったように、染色体ＤＮＡを抽出した。さらに、ピ
キア染色体ＨＩＳ４領域をプローブとしたサザン解析（
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　Ｅ．Ｍ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉ
ｏｌ．，　９８：５０３　（１９７５））を行い、組み
込まれたｐＭＭ０４２のコピー数を決定した。詳細に説
明すると、５μｇの染色体ＤＮＡをＢｇｌＩＩで消化し
た。アガロース電気泳動の後、ゲルを０．２Ｎ　ＨＣｌ
溶液で３０分処理した。ゲルをアルカリ変成液（０．２
Ｎ　　ＮａＯＨ、０．６Ｍ　　ＮａＣｌ）に移し、３０
分反応させた。 次にゲルを中和液（０．２Ｍトリス（ｐＨ７．４）、０
．６ＭＮａＣｌ）に移し、３０分間、２回処理した。 常法の通りＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマーシャム社製）　に
ブロッティングした。プローブはピキアＨＩＳ４のＫｐ
ｎＩ断片（０．６ｋｂ）　を標識した。プローブの調製
、ハイブリダイゼーション及び洗浄は、ＤＩＧ−ＥＬＩ
ＳＡ　法ＤＮＡ　ラベリング＆　ディテクションキット
（　ベーリンガーマンハイム山之内社製）を使用し、添
付の説明書の通り行った。ＧＴＳ１１５は図８（ａ）に
示すように２．７ｋｂのＨＩＳ４領域を有するため、２
．７ｋｂのバンドが出現する。ｐＭＭ０４２がＧＴＳ１
１５のｈｉｓ４領域に１　コピー組み込まれたならば、
７．８ｋｂ　と４．５ｋｂ　のバンドが出現する。ｐＭ
Ｍ０４２が同じく２　コピー組み込まれたならば、９．
６ｋｂ　と７．８ｋｂ　と４．５ｋｂ　のバンドが出現
する。 同じく３　コピー組み込まれたならば、７．８ｋｂ　と
４．５ｋｂ　のバンドと９．６ｋｂ　のバンドが２　倍
の濃さで検出される。４　コピーならば３　倍の濃さで
検出される。サザン解析の結果、ｐＭＭ０４２がＧＴＳ
１１５のｈｉｓ４領域に組み込まれたことがわかり、１
　コピーから４　コピーまでのコピー数を持つ株が得ら
れた。その内、１　コピー組み込まれた株の１　つをＵ
ＨＧ４２−１５、２　コピー組み込まれた株の１　つを
ＵＨＧ４２−３、３　コピー組み込まれた株の１　つを
ＵＨＧ４２−１２と名付けた（図８（ｂ）〜（ｄ））。

【００４２】クローンに分離した後のＨＳＡ　産生能を
測定した。ＵＨＧ４２−１５、ＵＨＧ４２−３　、ＵＨ
Ｇ４２−１２についてＹＰＤ　培地に植え、３０℃一夜
培養した。その培養液をもとに初期濃度ＯＤ５４０　＝
１になるように５０ｍＬの２％　ＭｅＯＨ−ＹＰ培地に
植えた。２４時間毎に培養液の一部を採取し、培養上清
に存在するヒト血清アルブミン濃度をＲＰＨＡ法（ＥＰ
　特許第１２２６２０号）にて測定した。その結果、表
３のように最高でＵＨＧ４２−１５では８０ｍｇ／Ｌ、
ＵＨＧ４２−３では１００ｍｇ／Ｌ、ＵＨＧ４２−１２
では１６０ｍｇ／ＬのＨＳＡ産生量を示し、クローン化
することにより産生量の高い株が得られ、また、コピー
数の増加に伴い産生量も増加した。ＧＣＰ１０１由来（
変異型）ＡＯＸ２プロモーターを用いてＨＳＡを発現さ
せるプラスミドｐＭＭ０４２を用いて、ＨＳＡを高産生
する株が取得できた。

【００４３】 　　　　表３　　クローンの培養上清中のＨＳＡ産生量
（ｍｇ／Ｌ）―――――――――――――――――――
――――――――――――――――　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　培養時間（時間）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　株　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２４　　　　　　　　　　４８　　　　　
　　　　　７２　　　　　　　　　　　　　　――――
―――――――――――――――――――――――――
――――――　　ＵＨＧ４２−１５　　　　　　　　１
５　　　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　８０
　　　　　　　　　　　　　　　　（１コピー） 　　ＵＨＧ４２−３　　　　　　　　　　３０　　　　
　　　　１００　　　　　　　　１００　　　　　　　
　　　　　　　　　（２コピー） 　　ＵＨＧ４２−１２　　　　　　　　４０　　　　　
　　　１６０　　　　　　　　１６０　　　　　　　　
　　　　　　　　（３コピー） ―――――――――――――――――――――――――
――――――――――２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地、３０℃
で培養した。

【００４４】

【発明の効果】本発明により得られた変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターは天然型（野生型）のものに比べてプロモー
ター活性が格段に増強されている。このプロモーターを
使うことにより、異種蛋白質を大量に発現させることが
可能になった。

【００４５】従って、本発明の内容は遺伝子工学の分野
において新規な発現系として極めて有用と考えられる。

【００４６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　プラスミドＤＮＡ配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴ　ＡＴＧ
ＡＣＣＧＧＴＣ　ＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣ　ＧＧＧＧＧＧ
ＡＴＴＡ　ＴＣＴＡＴＧＣＴＴＴ　　　　　６０ＧＡＣ
ＣＴＣＴＡＴＣ　ＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴ　ＴＡＴＧＡＴ
ＴＣＡＡ　ＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡ　ＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
Ｔ　ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧ　　　　１２０ＴＴＡＴＴＴ
ＡＣＴＴ　ＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴ　ＣＴＧＡＡＡＡＡＣ
Ａ　ＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣ　Ｇ
ＧＣＡＣＴＣＴＣＡ　　　　１８０ＡＡＣＡＣＧＡＣＡ
Ｇ　ＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ　Ａ
ＣＡＡＴＣＡＣＣＡ　ＣＴＡＡＧＧＴＴＧＣ　ＡＣＡＴ
ＴＴＧＡＧＣ　　　　２４０ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣ　Ｃ
ＴＡＡＴＡＧＡＧＧ　ＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴ　ＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴ　ＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＣＴ　　　　３００ＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴ　ＣＡＡＴ
ＡＣＴＣＴＣ　ＴＣＧＴＴＣＴＴＣＧ　ＴＣＴＣＧＴＣ
ＡＧＣ　ＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧ
　　　　３６０ＴＡＡＧＡＴＡＣＧＣ　ＣＣＡＡＴＴＧ
ＡＡＧ　ＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴ　ＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴ
　ＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ　ＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴ　　　
　４２０ＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣ　ＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡ
　ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＣ　ＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴ　ＴＡ
ＣＣＴＴＣＣＴＴ　ＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧ　　　　４８
０ＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ　ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＴ　ＧＡ
ＡＡＡＴＣＣＣＣ　ＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧ　ＴＴＴＴＧ
ＴＣＡＧＣ　ＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴ　　　　５４０ＣＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡ　ＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧ　ＣＡＧＴＣ
ＣＴＣＴＣ　ＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＣ　ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣ　　　　６００ＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＴＣ　ＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣ　ＣＡＧＣＣＴＴＣ
ＴＣ　ＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡ　ＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣ　
ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣ　　　　６６０ＡＧＧＴＴＡＣＡ
ＡＣ　ＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧ　
ＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴ　ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡ　ＴＡＴ
ＣＧＡＡＣＡＧ　　　　７２０ＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡ　
ＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣ　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣ　ＡＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＧ　ＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡ　ＡＧＣＡＴＡ
ＧＡＴＴ　　　　７８０ＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴ　ＧＴＡ
ＴＧＧＣＡＣＴ　ＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣ　ＡＴＴＡＧＡ
ＧＴＴＴ　ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧ　ＧＧＴＡＡＴＡＣＡ
Ｔ　　　　８４０ＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡ　ＡＣＴＧＡＴ
ＣＣＣＡ　ＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣ　ＡＴＡＴＧＣＡＡＡ
Ｇ　ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴ　ＡＣＣＣＣＧＴＡＡＡ　　
　　９００ＣＴＧＣＴＣＧＧＡＴ　ＴＡＴＣＧＴＴＧＣ
Ａ　ＡＴＴＣＡＴＣＧＴＣ　ＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡ　Ｃ
ＡＡＧＡＡＡＣＴＴ　ＴＡＴＴＣＡＴＧＧＧ　　　　９
６０ＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴ　ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧ　Ｇ
ＣＡＣＡＴＴＴＣＣ　ＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴ　ＴＴＴＧ
ＧＧＡＡＡＧ　ＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡ　　　１０２０Ｇ
ＡＧＧＡＣＡＧＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＡＡＧＡ　ＧＡＣＡ
ＡＧＡＣＡＡ　ＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡ　ＡＡＧＴＧＡＣ
ＡＧＣ　ＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣ　　　１０８０ＣＴＡＧ
ＴＧＧＡＣＡ　ＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴ　ＴＣＣＡＡＴＴ
ＧＧＴ　ＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡ　ＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡ
　ＴＧＴＴＧＡＧＴＴＧ　　　１１４０ＴＣＣＴＴＧＣ
ＴＴＣ　ＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡ　ＣＡＡＴＧＣＡＡＧＴ
　ＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡ　ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡ　ＡＧ
ＡＴＧＡＧＣＴＡ　　　１２００ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣ
　ＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴ　ＧＴＣＴＣＧＧＡＧＴ　ＧＡ
ＡＡＡＣＣＣＣＴ　ＴＴＴＡＴＧＴＧＡＡ　ＣＡＧＡＴ
ＴＡＣＡＧ　　　１２６０ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＡ　ＣＣ
ＣＴＴＣＡＣＣＧ　ＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧ　ＧＧＡＧＡ
ＡＡＡＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　ＧＡＧＡＣＧＡＴ
ＴＡ　　　１３２０ＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡ　ＡＧＡＡＧ
ＣＡＡＣＣ　ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴ　ＡＴＴＧＴＣＣＴ
ＴＴ　ＴＣＴＧＡＴＣＡＧＣ　ＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴ　
　　１３８０ＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡ　ＡＡＣＧＧＧＣＴ
ＴＴ　ＴＡＡＣＴＡＣＡＴＴ　ＧＴＴＣＴＴＡＣＡＣ　
ＡＴＴＧＣＡＡＡＣＣ　ＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴ　　　１
４４０ＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣ　ＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧ　
ＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡ　ＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡ　ＣＧＡ
ＡＧＴＴＴＡＣ　ＧＡＣＴＴＡＣＴＡＡ　　　１５００
ＡＴＣＣＣＣＡＣＡＡ　ＡＣＡＡＡＴＣＡＡＣ　ＴＧＡ
ＧＡＡＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５２８配列番
号：２ 配列の長さ：１０８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　プラスミドＤＮＡ配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴ　ＡＴＧ
ＡＣＣＧＧＴＣ　ＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣ　ＧＧＧＧＧＧ
ＡＴＴＡ　ＴＣＴＡＴＧＣＴＴＴ　　　　　６０ＧＡＣ
ＣＴＣＴＡＴＣ　ＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴ　ＴＡＴＧＡＴ
ＴＣＡＡ　ＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡ　ＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
Ｔ　ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧ　　　　１２０ＴＴＡＴＴＴ
ＡＣＴＴ　ＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴ　ＣＴＧＡＡＡＡＡＣ
Ａ　ＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣ　Ｇ
ＧＣＡＣＴＣＴＣＡ　　　　１８０ＡＡＣＡＣＧＡＣＡ
Ｇ　ＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ　Ａ
ＣＡＡＴＣＡＣＣＡ　ＣＴＡＡＧＧＴＴＧＣ　ＡＣＡＴ
ＴＴＧＡＧＣ　　　　２４０ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣ　Ｃ
ＴＡＡＴＡＧＡＧＧ　ＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴ　ＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴ　ＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＣＴ　　　　３００ＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴ　ＣＡＡＴ
ＡＣＴＣＴＣ　ＴＣＧＴＴＣＴＴＣＧ　ＴＣＴＣＧＴＣ
ＡＧＣ　ＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧ
　　　　３６０ＴＡＡＧＡＴＡＣＧＣ　ＣＣＡＡＴＴＧ
ＡＡＧ　ＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴ　ＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴ
　ＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ　ＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴ　　　
　４２０ＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣ　ＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡ
　ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＣ　ＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴ　ＴＡ
ＣＣＴＴＣＣＴＴ　ＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧ　　　　４８
０ＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ　ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＴ　ＧＡ
ＡＡＡＴＣＣＣＣ　ＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧ　ＴＴＴＴＧ
ＴＣＡＧＣ　ＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴ　　　　５４０ＣＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡ　ＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧ　ＣＡＧＴＣ
ＣＴＣＴＣ　ＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＣ　ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣ　　　　６００ＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＴＣ　ＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣ　ＣＡＧＣＣＴＴＣ
ＴＣ　ＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡ　ＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣ　
ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣ　　　　６６０ＡＧＧＴＴＡＣＡ
ＡＣ　ＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧ　
ＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴ　ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡ　ＴＡＴ
ＣＧＡＡＣＡＧ　　　　７２０ＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡ　
ＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣ　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣ　ＡＡＧ
ＡＴＧＡＧＣＴ　ＡＴＴＴＴＴＧＴＣＧ　ＣＡＴＡＡＡ
ＴＴＴＴ　　　　７８０ＴＧＴＣＴＣＧＧＡＧ　ＴＧＡ
ＡＡＡＣＣＣＣ　ＴＴＴＴＡＴＧＴＧＡ　ＡＣＡＧＡＴ
ＴＡＣＡ　ＧＡＡＧＣＧＴＣＣＴ　ＡＣＣＣＴＴＣＡＣ
Ｃ　　　　８４０ＧＧＴＴＧＡＧＡＴＧ　ＧＧＧＡＧＡ
ＡＡＡＴ　ＴＡＡＧＣＧＡＴＧＡ　ＧＧＡＧＡＣＧＡＴ
Ｔ　ＡＴＴＧＧＴＡＴＡＡ　ＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣ　　
　　９００ＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴ　ＴＡＴＴＧＴＣＣＴ
Ｔ　ＴＴＣＴＧＡＴＣＡＧ　ＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡ　Ｔ
ＡＴＴＧＴＣＴＴＡ　ＡＡＡＣＧＧＧＣＴＴ　　　　９
６０ＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴ　ＴＧＴＴＣＴＴＡＣＡ　Ｃ
ＡＴＴＧＣＡＡＡＣ　ＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣ　ＴＡＴＴ
ＴＣＧＧＡＴ　ＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴ　　　１０２０Ｇ
ＡＣＴＡＣＡＴＴＧ　ＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡ　ＡＣＧＡ
ＡＧＴＴＴＡ　ＣＧＡＣＴＴＡＣＴＡ　ＡＡＴＣＣＣＣ
ＡＣＡ　ＡＡＣＡＡＡＴＣＡＡ　　　１０８０ＣＴＧＡ
ＧＡＡＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０８９配列番号：３ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　プラスミドＤＮＡ配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴ　ＡＴＧ
ＡＣＣＧＧＴＣ　ＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣ　ＧＧＧＧＧＧ
ＡＴＴＡ　ＴＣＴＡＴＧＣＴＴＴ　　　　　６０ＧＡＣ
ＣＴＣＴＡＴＣ　ＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴ　ＴＡＴＧＡＴ
ＴＣＡＡ　ＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡ　ＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
Ｔ　ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧ　　　　１２０ＴＴＡＴＴＴ
ＡＣＴＴ　ＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴ　ＣＴＧＡＡＡＡＡＣ
Ａ　ＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣ　Ｇ
ＧＣＡＣＴＣＴＣＡ　　　　１８０ＡＡＣＡＣＧＡＣＡ
Ｇ　ＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ　Ａ
ＣＡＡＴＣＡＣＣＡ　ＣＴＡＡＧＧＴＴＧＣ　ＡＣＡＴ
ＴＴＧＡＧＣ　　　　２４０ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣ　Ｃ
ＴＡＡＴＡＧＡＧＧ　ＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴ　ＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴ　ＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＣＴ　　　　３００ＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴ　ＣＡＡＴ
ＡＣＴＣＴＣ　ＴＣＧＴＴＣＴＴＣＧ　ＴＣＴＣＧＴＣ
ＡＧＣ　ＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧ
　　　　３６０ＴＡＡＧＡＴＡＣＧＣ　ＣＣＡＡＴＴＧ
ＡＡＧ　ＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴ　ＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴ
　ＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ　ＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴ　　　
　４２０ＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣ　ＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡ
　ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＣ　ＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴ　ＴＡ
ＣＣＴＴＣＣＴＴ　ＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧ　　　　４８
０ＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ　ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＴ　ＧＡ
ＡＡＡＴＣＣＣＣ　ＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧ　ＴＴＴＴＧ
ＴＣＡＧＣ　ＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴ　　　　５４０ＣＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡ　ＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧ　ＣＡＧＴＣ
ＣＴＣＴＣ　ＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＣ　ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣ　　　　６００ＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＴＣ　ＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣ　ＣＡＧＣＣＴＴＣ
ＴＣ　ＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡ　ＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣ　
ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣ　　　　６６０ＡＧＧＴＴＡＣＡ
ＡＣ　ＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧ　
ＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴ　ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡ　ＴＡＴ
ＣＧＡＡＣＡＧ　　　　７２０ＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡ　
ＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣ　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣ　ＡＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＧ　ＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡ　ＡＧＣＡＴＡ
ＧＡＴＴ　　　　７８０ＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴ　ＧＴＡ
ＴＧＧＣＡＣＴ　ＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣ　ＡＴＴＡＧＡ
ＧＴＴＴ　ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧ　ＧＧＴＡＡＴＡＣＡ
Ｔ　　　　８４０ＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡ　ＡＣＴＧＡＴ
ＣＣＣＡ　ＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣ　ＡＴＡＴＧＣＡＡＡ
Ｇ　ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴ　ＡＣＣＣＣＧＴＡＡＡ　　
　　９００ＣＴＧＣＴＣＧＧＡＴ　ＴＡＴＣＧＴＴＧＣ
Ａ　ＡＴＴＣＡＴＣＧＴＣ　ＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡ　Ｃ
ＡＡＧＡＡＡＣＴＴ　ＴＡＴＴＣＡＴＧＧＧ　　　　９
６０ＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴ　ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧ　Ｇ
ＣＡＣＡＴＴＴＣＣ　ＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴ　ＴＴＴＧ
ＧＧＡＡＡＧ　ＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡ　　　１０２０Ｇ
ＡＧＧＡＣＡＧＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＡＡＧＡ　ＧＡＣＡ
ＡＧＡＣＡＡ　ＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡ　ＡＡＧＴＧＡＣ
ＡＧＣ　ＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣ　　　１０８０ＣＴＡＧ
ＴＧＧＡＣＡ　ＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴ　ＴＣＣＡＡＴＴ
ＧＧＴ　ＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡ　ＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡ
　ＴＧＴＴＧＡＧＴＴＧ　　　１１４０ＴＣＣＴＴＧＣ
ＴＴＣ　ＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡ　ＣＡＡＴＧＣＡＡＧＴ
　ＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡ　ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡ　ＡＧ
ＡＴＧＡＧＣＴＡ　　　１２００ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣ
　ＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴ　ＧＴＣＴＣＧＧＡＧＴ　ＧＡ
ＡＡＡＣＣＣＣＴ　ＴＴＴＡＴＧＴＧＡＡ　ＣＡＧＡＴ
ＴＡＣＡＧ　　　１２６０ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＡ　ＣＣ
ＣＣＴＣＡＣＣＧ　ＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧ　ＧＧＡＧＡ
ＡＡＡＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　ＧＡＧＡＣＧＡＴ
ＴＡ　　　１３２０ＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡ　ＡＧＡＡＧ
ＣＡＡＣＣ　ＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴ　ＡＴＴＧＴＣＣＴ
ＴＴ　ＴＣＴＧＡＴＣＡＧＣ　ＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴ　
　　１３８０ＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡ　ＡＡＣＧＧＧＣＴ
ＴＴ　ＴＡＡＣＴＡＣＡＴＴ　ＧＴＴＣＴＴＡＣＡＣ　
ＡＴＴＧＣＡＡＡＣＣ　ＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴ　　　１
４４０ＡＴＴＴＣＧＧＡＴＣ　ＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧ　
ＡＣＴＡＣＡＴＴＧＡ　ＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡ　ＣＧＡ
ＡＧＴＴＴＡＣ　ＧＡＣＴＴＡＣＴＡＡ　　　１５００
ＡＴＣＣＣＣＡＣＡＡ　ＡＣＡＡＡＴＣＡＡＣ　ＴＧＡ
ＧＡＡＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５２８配列番
号：４ 配列の長さ：１５４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　プラスミドＤＮＡ配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴ　ＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴ　ＡＴＧ
ＡＣＣＧＧＴＣ　ＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣ　ＧＧＧＧＧＧ
ＡＴＴＡ　ＴＣＴＡＴＧＣＴＴＴ　　　　　６０ＧＡＣ
ＣＴＣＴＡＴＣ　ＴＴＧＡＴＴＣＴＴＴ　ＴＡＴＧＡＴ
ＴＣＡＡ　ＡＴＣＡＣＴＴＴＴＡ　ＣＧＴＴＡＴＴＴＡ
Ｔ　ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧ　　　　１２０ＴＴＡＴＴＴ
ＡＣＴＴ　ＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴ　ＣＴＧＡＡＡＡＡＣ
Ａ　ＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡ　ＡＴＣＡＴＡＣＡＴＣ　Ｇ
ＧＣＡＣＴＣＴＣＡ　　　　１８０ＡＡＣＡＣＧＡＣＡ
Ｇ　ＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡ　ＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧ　Ａ
ＣＡＡＴＣＡＣＣＡ　ＣＴＡＡＧＧＴＴＧＣ　ＡＣＡＴ
ＴＴＧＡＧＣ　　　　２４０ＣＡＧＴＡＧＧＣＴＣ　Ｃ
ＴＡＡＴＡＧＡＧＧ　ＴＴＣＧＡＴＡＣＴＴ　ＡＴＴＴ
ＴＧＡＴＡＡ　ＴＡＣＧＡＣＡＴＡＴ　ＴＧＴＣＴＴＡ
ＣＣＴ　　　　３００ＣＴＧＡＡＴＧＴＧＴ　ＣＡＡＴ
ＡＣＴＣＴＣ　ＴＣＧＴＴＣＴＴＣＧ　ＴＣＴＣＧＴＣ
ＡＧＣ　ＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡ　ＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧ
　　　　３６０ＴＡＡＧＡＴＡＣＧＣ　ＣＣＡＡＴＴＧ
ＡＡＧ　ＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴ　ＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴ
　ＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡ　ＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴ　　　
　４２０ＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣ　ＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡ
　ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＣ　ＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴ　ＴＡ
ＣＣＴＴＣＣＴＴ　ＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧ　　　　４８
０ＡＡＧＧＣＡＴＧＡＡ　ＡＡＡＧＣＴＡＣＡＴ　ＧＡ
ＡＡＡＴＣＣＣＣ　ＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧ　ＴＴＴＴＧ
ＴＣＡＧＣ　ＴＴＡＡＡＧＧＡＣＴ　　　　５４０ＣＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＡ　ＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧ　ＣＡＧＴＣ
ＣＴＣＴＣ　ＡＡＣＴＡＡＡＴＴＴ　ＴＴＴＴＣＣＡＴ
ＴＣ　ＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣ　　　　６００ＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＴＣ　ＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣ　ＣＡＧＣＣＴＴＣ
ＴＣ　ＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡ　ＴＧＴＡＡＧＴＡＧＣ　
ＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣ　　　　６６０ＡＧＧＴＴＡＣＡ
ＡＣ　ＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ　ＴＣＣＡＴＣＣＡＡＧ　
ＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴ　ＡＣＡＡＡＧＴＴＡＡ　ＴＡＴ
ＣＧＡＡＣＡＧ　　　　７２０ＣＡＧＡＧＡＣＴＡＡ　
ＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣ　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣ　ＡＡＣ
ＧＡＴＧＧＴＧ　ＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡ　ＡＧＣＡＴＡ
ＧＡＴＴ　　　　７８０ＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴ　ＧＴＡ
ＴＧＧＣＡＣＴ　ＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣ　ＡＴＴＡＧＡ
ＧＴＴＴ　ＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧ　ＧＧＴＡＡＴＡＣＡ
Ｔ　　　　８４０ＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡ　ＡＣＴＧＡＴ
ＣＣＣＡ　ＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣ　ＡＴＡＴＧＣＡＡＡ
Ｇ　ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴ　ＡＣＣＣＣＧＴＡＡＡ　　
　　９００ＣＴＧＣＴＣＧＧＡＴ　ＴＡＴＣＧＴＴＧＣ
Ａ　ＡＴＴＣＡＴＣＧＴＣ　ＴＴＡＡＡＣＡＧＴＡ　Ｃ
ＡＡＧＡＡＡＣＴＴ　ＴＡＴＴＣＡＴＧＧＧ　　　　９
６０ＴＣＡＴＴＧＧＡＣＴ　ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧ　Ｇ
ＣＡＣＡＴＴＴＣＣ　ＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴ　ＴＴＴＧ
ＧＧＡＡＡＧ　ＡＡＡＧＣＣＧＴＡＡ　　　１０２０Ｇ
ＡＧＧＡＣＡＧＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＡＡＧＡ　ＧＡＣＡ
ＡＧＡＣＡＡ　ＣＧＡＡＣＡＧＣＡＡ　ＡＡＧＴＧＡＣ
ＡＧＣ　ＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣ　　　１０８０ＣＴＡＧ
ＴＧＧＡＣＡ　ＧＴＴＧＧＧＡＧＴＴ　ＴＣＣＡＡＴＴ
ＧＧＴ　ＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡ　ＴＴＴＴＴＡＣＣＣＡ
　ＴＧＴＴＧＡＧＴＴＧ　　　１１４０ＴＣＣＴＴＧＣ
ＴＴＣ　ＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡ　ＣＡＡＴＧＣＡＡＧＴ
　ＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡ　ＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡ　ＡＧ
ＡＴＧＡＧＣＴＡ　　　１２００ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣ
　ＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴ　ＧＴＣＴＣＧＧＡＧＴ　ＧＡ
ＡＡＡＣＣＣＣＴ　ＴＴＴＡＴＧＴＧＡＡ　ＣＡＧＡＴ
ＴＡＣＡＧ　　　１２６０ＡＡＧＣＧＴＣＣＴＡ　ＣＣ
ＣＴＴＣＡＣＣＧ　ＧＴＴＧＡＧＡＴＧＧ　ＧＧＡＧＡ
ＡＡＡＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧ　ＧＡＧＡＡＡＡＴ
ＴＡ　　　１３２０ＡＧＣＧＡＴＧＡＧＧ　ＡＧＡＣＧ
ＡＴＴＡＴ　ＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡ　ＧＡＡＧＣＡＡＣ
ＣＡ　ＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡ　ＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴ　
　　１３８０ＣＴＧＡＴＣＡＧＣＡ　ＴＣＡＡＡＧＡＡ
ＴＡ　ＴＴＧＴＣＴＴＡＡＡ　ＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴ　
ＡＡＣＴＡＣＡＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＡＣＡＣＡ　　　１
４４０ＴＴＧＣＡＡＡＣＣＴ　ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＡ　
ＴＴＴＣＧＧＡＴＣＡ　ＡＣＴＧＴＡＴＴＧＡ　ＣＴＡ
ＣＡＴＴＧＡＴ　ＣＴＴＴＴＴＴＡＡＣ　　　１５００
ＧＡＡＧＴＴＴＡＣＧ　ＡＣＴＴＡＣＴＡＡＡ　ＴＣＣ
ＣＣＡＣＡＡＡ　ＣＡＡＡＴＣＡＡＣＴ　ＧＡＧＡＡＡ
Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　１５４７配列番
号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄ特徴を決定し
た方法：Ｅ 配列 ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧ
Ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６配列番
号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄ特徴を決定し
た方法：Ｅ 配列 ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＴ
Ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６配列番
号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸　　付加ＤＮＡ 配列の種類 配列の特徴 特徴を表す記号：ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｅｑ特徴を決
定した方法：Ｅ 配列 ＡＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＧＡＧＡ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣ４１３０の構築手順およびＧＣＰ１０１の
取得方法を説明する図である。

【図２】ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を示す図で
ある。尚、かっこ内の数字は、ＸｂａＩを０とした時の
距離（×１００塩基）を示す。

【図３】ＡＯＸ２プロモーターをクローニングしたプラ
スミドｐＭＭ０３０またはｐＭＭ０３４およびその制限
酵素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃ
ｏＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図４】ＡＯＸ２構造遺伝子をクローニングしたプラス
ミドｐＭＭ０３１またはｐＭＭ０３５およびその制限酵
素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃｏ
ＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図５】変異型ＡＯＸ２プロモーターを有する各株の取
得過程を示す図である。

【図６】ｐＰＧ００１の構築を説明する図である。

【図７】ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４２の構築を説明
する図である。

【図８】実施例６を説明する図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
   列の一部を欠失、置換または新たな塩基配列を付加して
   なる変異型ＡＯＸ２プロモーターを担持してなるプラス
   ミド。
2. 【請求項２】　　請求項１記載のプラスミドを導入して
   なる形質転換体。
3. 【請求項３】　　請求項２記載の形質転換体を培養する
   ことにより異種蛋白質を製造する方法。