JPH07106153B2 - 変異型ａｏｘ２プロモーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋
白質の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性酵母はメタノールを炭
素源およびエネルギー源として増殖する。その際、メタ
ノール代謝経路において第１段階でアルコール酸化酵素
（ＡＯＸ、ＥＣ１．１．３．Ｂ）によりメタノールをホ
ルムアルデヒドに酸化する。

【０００３】メタノール資化性酵母の一種であるピキア
酵母（Pichia pastoris ）はゲノム中に二種のＡＯＸ遺
伝子（ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子）を有する。こ
の内ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ２プロモーターには
活性に大きな差があり、通常ピキア酵母で発現されてい
るＡＯＸはほとんどＡＯＸ１プロモーターによって転写
されたものであることが示されている。（Molecular an
d CellularBiology, vol.9, 1316(1989)）。

【０００４】ＡＯＸはグルコース含有培地ではほとんど
発現されないのに対し、メタノール含有培地では細胞中
の可溶化蛋白質の３０％を示すといわれている。ＡＯＸ
をコードする２種類のＡＯＸ遺伝子の内、ＡＯＸ１遺伝
子の制御領域であるＡＯＸ１プロモーターは強い活性を
持ち、メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現に用い
られ、高い産生量を示した。しかしながら、ＡＯＸ２プ
ロモーターは活性が弱く、異種蛋白質の発現には適当で
はなかった。メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現
系は大量に産物が得られるために、その発現系に強力な
プロモーターが求められていた。

【０００５】最近、そのＡＯＸ遺伝子の調節領域を用い
て異種蛋白質を産生する方法が研究されている（特開平
2-104290、特開平2-242694、特開平2-303497等）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高レ
ベルに異種蛋白質を産生する上で重要な働きを持つ新規
なプロモーターを提供すること及びそれを取得する方法
を示すことである。このプロモーターを担持したプラス
ミドを用いて形質転換体を取得し、異種蛋白質を産生す
る系を確立することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記〜記
載のものであり、これにより上記課題を解決できる。 配列表記載の配列番号１の天然型ＡＯＸ２プロモー
ターの塩基配列の一部を欠失、置換または新たな塩基配
列を付加してなる変異型ＡＯＸプロモーターにおいて、
少なくとも、配列番号１の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１
８７（Ｔ）を欠失、配列番号１の塩基番号１２７４
（Ｔ）を（Ｃ）に置換、または配列番号１の塩基番号１
３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号７を付加
してなり、かつ配列表記載の配列番号２、３または４に
示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーターのプロモー
ター活性と同等のプロモーター活性を有することを特徴
とする変異型ＡＯＸ２プロモーターを担持してなるプラ
スミド。 配列表記載の配列番号２、３または４に示す配列で
ある変異型ＡＯＸ２プロモーターを担持してなるプラス
ミド。 上記または記載のプラスミドを導入してなる形
質転換体。 上記記載の形質転換体を培養することにより異種
蛋白質を製造する方法。

【０００８】（１）変異型ＡＯＸ２プロモーター 本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは天然型（即ち、
野生型）ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の一部を欠
失、置換または新たな塩基配列を付加してなる。

【０００９】ａ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を欠失してなる場合 欠失部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載した天然
型ＡＯＸ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３
０〜１５２８に位置すればよい。欠失は一塩基でもそれ
以上でもよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的
には配列番号１の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７
（Ｔ）の４３９ｂｐを欠失したもの、即ち配列番号２に
記載のプロモーターが挙げられる。

【００１０】ｂ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を他の塩基配列で置換してなる場合 置換部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載したＡＯ
Ｘ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１
５２８に位置すればよい。置換は一塩基でもそれ以上で
もよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配
列番号１の塩基番号１２７４（Ｔ）を（Ｃ）に置換した
もの、即ち配列番号３に記載のプロモーターが挙げられ
る。

【００１１】ｃ．天然型ＡＯＸ２プロモーターに新たな
塩基配列を付加してなる場合 付加部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載したＡＯ
Ｘ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１
５２８に位置すればよい。付加は一塩基でもそれ以上で
もよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配
列番号１の塩基番号１３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の
間に配列番号７を付加したもの、即ち配列番号４に記載
したプロモーターが挙げられる。

【００１２】本発明において、上記配列番号２〜４の塩
基配列の例えば、塩基番号１〜７３０の領域は、簡明に
説明するため天然型と同一に記載したが、この領域は特
にこの配列に限定されないことは明白であり、適宜必要
に応じて塩基の欠失、置換、挿入を行うことができる。

【００１３】天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の
欠失、置換または付加処理は一般的な遺伝子工学的手法
を用いて行うことができるが、例えば、部位指定削除法
〔Site-directed deletion, Nucl. Acids Res., 11, 16
45(1983)〕、部位特異的変異法〔Site-directed Mutage
nesis 〕、制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法
等が挙げられる。

【００１４】また、ＡＯＸ１遺伝子によりＡＯＸが産生
されず、その染色体上において天然型（野生型）ＡＯＸ
２プロモーターを担持してなる菌株をメタノール含有培
地中で培養し、変異を起こして増殖良好となった菌株か
ら当該変異型ＡＯＸ２プロモーターを回収することがで
きる。

【００１５】（２）プラスミド 本発明のプラスミドは（１）の変異型ＡＯＸ２プロモー
ターを担持してなる。本発明のプラスミドはシグナルペ
プチド遺伝子、構造蛋白質遺伝子、ターミネーター、相
同領域、マーカー遺伝子、宿主中で複製可能な自律性複
製配列等を担持していてもよい。

【００１６】構造遺伝子は異種蛋白質（例えば、ヒト血
清アルブミン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター、Ｂ型肝炎表面抗原、各種インターフ
ェロン等）遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子等
が例示される。 ターミネーターはＡＯＸ１ターミネー
ターあるいはＡＯＸ２ターミネーター等が例示される。

【００１７】相同領域はＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４等が例示される。マーカー遺伝子は抗生物
質耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子等が用いられる。
抗生物質としてはシクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロ
ラムフェニコール、ブレオマイシン、ハイグロマイシン
等が例示される。栄養要求性相補遺伝子としては、ＨＩ
Ｓ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が挙げられる。

【００１８】転写ユニットは５′側から３′側に向かっ
て、変異型ＡＯＸ２プロモーター、シグナルペプチド遺
伝子、構造蛋白質遺伝子、ターミネーターの順に配置さ
れる。

【００１９】本発明のプラスミドは通常の遺伝子工学技
術を用いて調製することができる。 （３）形質転換体 本発明の形質転換体は（２）のプラスミドを導入してな
る。

【００２０】本発明の宿主は酵母が好ましく、より好ま
しくはピキア酵母（Pichia pastris）である。具体的に
はＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）等
が例示される。

【００２１】宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方
法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラスト
ポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法などが
使用でき、必要な形質転換体を選択する。

【００２２】プラスミドの宿主細胞中での存在の様式
は、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込
まれる。または、プラスミド状態で存在していてもよ
い。宿主に導入される外来遺伝子のコピー数は１コピー
でも複数コピーでもよい。

【００２３】また、他のプロモーターで異種遺伝子を発
現させるプラスミドと同じ菌株内に存在させても構わな
い。 （４）異種蛋白質の製造方法 （３）で得られた形質転換株は、宿主細胞の自体公知の
培地で培養する。培地としては０．０１〜５％メタノー
ルを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％ YeastNitrogen
Base(Difco 社) 〕、および０．０１〜５％メタノール
を含有したＹＰ培地〔１％イーストエキストラクト（Di
fco 社) 、２％ポリペプトン（大五栄養社）〕などが例
示される。

【００２４】培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０
℃程度）で２０〜３６０時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清を固定
し、自体公知の方法、例えばアフィニティクロマトグラ
フィー、ゲル濾過分画法などにより異種蛋白質を精製す
る。

【００２５】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。

【００２６】なお、本発明において多くの技法、反応お
よび分析方法は当業界においてよく知られている。特に
断らない限り、全ての酵素は商業的供給源、例えば、宝
酒造等から入手することができる。

【００２７】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５、ＰＣ４１３０、ＰＣ４１０５及びプラスミドｐＰＧ
Ｐ１、ｐＰＧＳ１はフィリップス・ペトロリウム社から
入手した。

【００２８】プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、
プラークハイブリダイゼーション法、及び電気泳動法は
「モレキュラークローニング」コールドスプリングハー
バーラボラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Sprin
g Harbor Laboratory(1982)に記載されている方法によ
り行った。

【００２９】実施例１．ＧＣＰ１０１の取得（図１参
照） 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ１
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００３０】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３ｍｌに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ = １と
なるように２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（１％イーストエキ
ストラクト、２％バクトペプトン、２％メタノール）５
０ｍｌに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ
₅₄₀ = １となるようにＹＰＤ２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地５
０ｍｌに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返
した。継代毎に菌体を１０⁷ cell/plateになるように滅
菌水で希釈して2%MeOH-YNBw/oa.a. プレート(0.7% イー
ストナイトロジェンベースウイズアウトアミノアシッ
ド、2%メタノール、1.5%寒天末) に塗布し、30℃5 日間
培養してコロニーの有無を判断した。その結果、12日間
継代後に塗布した2%MeOH-YNBw/oa.a. プレートから20個
のコロニーが生じた。このプレートではMut-株はほとん
ど成育できず、Mut+株は成育できる。即ち、このプレー
トでコロニーが生じるということはメタノールの資化性
が上昇し、Mut+に変換した株が得られたことを示してい
る。生じたコロニーの内の1 つを適当に滅菌水で希釈し
て2%MeOH-YNBw/oa.a. プレートに拡げシングルコロニー
に単離した。その一つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００３１】ＰＣ４１３０とＧＣＰ１０１との各種培地
における増殖度の比較を行った。YNBw/oa.a.プレート
(0.7% イーストナイトロジェンベースウイズアウトアミ
ノアシッド、2%グルコース、1.5%寒天末) に4 ℃に保存
していた菌体をYPD メディウム3ml/試験管に1 白金耳と
り、24時間30℃で培養する。初期OD₅₄₀ =0.1となるよう
に50ml各種培地/ フラスコに植え、30℃で培養し、24時
間毎の増殖度を測定した（表１）。用いた培地はＹＰＤ
培地、２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（１％イーストエキスト
ラクト、２％バクトペプトン、２％メタノール）、４％
ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（１％イーストエキストラクト、２
％バクトペプトン、４％メタノール）の３種類を使用し
た。その結果、グルコースを炭素源にした培地では２つ
の株に差はなかったが、メタノールを炭素源とした培地
ではＧＣＰ１０１はＰＣ４１３０よりも増殖が良好にな
った（Ｍｕｔ＋株に変換した）ことが観察された。 表１ ＧＣＰ１０１とＰＣ４１３０の各種培地での菌体増殖（ＯＤ₅₄₀ ） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 培地 株 0 24 48 72 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＹＰＤ培地 PC4130 0.1 67 80 78 GCP101 0.1 63 78 79 2%MeOH-YP 培地 PC4130 0.1 16 36 46 GCP101 0.1 24 63 63 4%MeOH-YP 培地 PC4130 0.1 9 20 28 GCP101 0.1 10 57 84 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 実施例２．ＡＯＸ２遺伝子のクローニング ＡＯＸ２遺伝子付近の配列及び制限酵素地図はCregg ら
Mol. Cell. Biol, 9,1316-1323(1989) 及びKoutz らYEA
ST, 5, 167-177(1989) によって報告されており、それ
らを参考にしてＡＯＸ２遺伝子のクローニングを計画し
た。ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を図２に示し
た。まず、PC4130とGCP101両株よりCameron らの方法Nu
cleic Acids Res., 4, 1429(1977) により染色体DNA を
抽出精製した。両染色体DNA をＡＯＸ２プロモーター領
域・ＡＯＸ２構造遺伝子・ＡＯＸ２ターミネーターが完
全に含まれるXbaIとPstIでの完全な消化を行った。エタ
ノール沈殿を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶かした。
EcoRI メチラーゼ( 宝酒造製) を加え、反応させた。TE
飽和フェノール・クロロホルム抽出、続いてクロロホル
ム抽出を行い、水層についてエタノール沈殿を行い、遠
心、乾燥後に滅菌水に溶かした。DNA ブランティングキ
ット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化し、そこにEcoR
I リンカーd(pG-G-A-A-T-T-C-C) （宝酒造製）をDNA ラ
イゲーションキット（宝酒造製）を用いてライゲーショ
ンした。再度エタノール沈殿を行い、遠心、乾燥後に滅
菌水に溶かし、EcoRI を加え37℃1 時間インキュベーシ
ョンした。1%アガロース電気泳動で4 〜5kb に相当する
領域を切り出し、GENE CLEAN II(BIO 101 社製) による
溶出精製を行ってDNA を回収し、滅菌水にとかした。λ
gt10 arms(Protoclone ^TM System)(プロメガ社製) とラ
イゲーションし、Gigapack-GOLD3( ストラタジーン社
製) を用いてインビトロパッケイジングを行った。A
₆₀₀ =2に調製しておいたE.coli C600 株とC600hfl 株に
吸着させ、NZY プレート(1%NZ アミン、0.5%塩化ナトリ
ウム、0.5%イーストエクストラクト、0.02% 硫酸マグネ
シウム、1.5%寒天末) に播きライブラリーを作成し、タ
イターを測定した。組み換えファージをE.coli C600hfl
株に吸着させ、1 プレートに約500 個ずつプラークが生
じるようにNZY プレートに播いた。PC4130とGC101 両株
由来共に4 枚のナイロンメンブラン Colony/Plaque Scr
een ^TM( NEN 製) を用い、プラークをメンブランに移行
し、変成・中和・固定処理を行った。Pichia pastoris
IFo1013 株由来ＡＯＸ1 構造遺伝子前半分に当たるEcoR
V とBglII で消化して得られる断片をランダムプライマ
ーラベリングキット（宝酒造製）を用いて³²P 標識し、
プローブとした。プレハイブリダイゼーションは１％Ｂ
ＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨ₂ ＰＯ
₄ （ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ溶液中６５℃、５分行っ
た。ハイブリダイゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．５ＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．２）、７％
ＳＤＳ、³²Ｐ−プローブ溶液中６５℃、一夜行った。洗
浄は０．５Ｍ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．２）溶液中で
室温１０分間インキュベートし、０．５％ＢＳＡ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、４０ｍＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．
２）、５％ＳＤＳ溶液中で３７℃３０分間３回インキュ
ベートした。フィルターを風乾し、Ｘ線フィルム露光カ
セット中Ｘ線フィルムと合わせて−８０℃１６時間放置
し、オートラジオグラフィーを行った。それぞれの株由
来共に２個ずつのポジティブクローンが得られた。その
内の１クローンずつについてファージの増殖を行い、フ
ァージＤＮＡを抽出した。ＥｃｏＲＩで切断し、アガロ
ース電気泳動で目的の断片（１．５ｋｂと２．９ｋｂ）
が生じていることを確かめた。ｐＵＣ１９（ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリー社製）をＥｃｏＲＩで切断し、
アルカリフォスファターゼ処理した断片を回収し、ファ
ージから回収してＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡとをライゲ
ーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を形質転換し、４
０μｇ／ｍＬアンピシリン含有Ｌプレート（トリスベー
ス０．６２ｇ、ポリペプトン１０ｇ、イーストエキスト
ラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水に溶解し、１Ｌ
（リットル）とした後に１５ｇの寒天末を加えてオート
クレーブ滅菌し、プラスチックシャーレに分注固化す
る。アンピシリンはオートクレーブ後、培地が冷えてか
ら添加する。）に播き、３７℃、一夜培養した。生じた
コロニーについてミニプレップを行いプラスミドを抽出
し、ＥｃｏＲＩ消化によるスクリーニングを行った。そ
の結果、ＰＣ１３０とＧＣＰ１０１両株由来共１．５ｋ
ｂと２．９ｋｂの断片がｐＵＣ１９に挿入されたクロー
ンが得られた。それらのクローンを４０μｇ／ｍＬアン
ピシリン含有スーパーブロス（バクトトリプトン１２
ｇ、イーストエキストラクト２４ｇ、グリセロール５ｍ
Ｌを水に溶解し９００ｍＬとしてオートクレーブ滅菌し
たＡ液、及びリン酸２水素カリウム３．８１ｇ、リン酸
１水素カリウム１２．５ｇを水に溶解して１００ｍＬと
してオートクレーブ滅菌したＢ液とを９：１（ｖ／ｖ）
の割合で混合したもの）中、３７℃、一夜振盪培養し、
アルカリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを大量に抽出
精製した。ＰＣ４１３０由来ＡＯＸ２プロモーター領域
を含むプラスミドをｐＭＭ０３０、ＡＯＸ２構造遺伝子
を含むプラスミドをｐＭＭ０３１、ＧＣＰ１０１由来Ａ
ＯＸ２プロモーター領域を含むプラスミドをｐＭＭ０３
４、ＡＯＸ２構造遺伝子を含むプラスミドをｐＭＭ０３
５と命名した（図３、図４参照）。これらのプラスミド
の各種制限酵素消化により生じる断片の大きさは報告さ
れているパターンと一致した。

【００３２】実施例３．ＡＯＸ２プロモーター領域の塩
基配列決定 ｐＭＭ０３０及びｐＭＭ０３４をＥｃｏＲＩで消化し、
１．５ｋｂ断片を回収し、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。一方、ｐＵＣ
１９をＸｂａＩで消化しマングビーンヌクレアーゼ（宝
酒造製）処理の後、アルカリフォスファターゼ処理をお
こなった断片とライゲーションし、形質転換体からプラ
スミドＤＮＡを調製した。この操作によりＰＣ４１３０
由来ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来Ａ
ＯＸ２プロモーター領域ＤＮＡがｐＵＣ１９のＸｂａＩ
サイトにサブクローニングされた。これらのプラスミド
をキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造製）
を用いて１５０〜３００ｂｐずつインサートサイズが異
なるデレーションミュータントを両方から５〜６クロー
ンずつ作製した。これらのデレーションミュータントを
Ｍ１３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を使
用して塩基配列を決定した。その結果、ＰＣ４１３０由
来ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来ＡＯ
Ｘ２プロモーター領域のＡＴＧ上流１．５ｋｂの全塩基
配列が決定された。両株由来の配列を比較したところ、
ＰＣ４１３０由来ではＡＯＸ２構造遺伝子の開始コドン
ＡＴＧ（配列番号１の１５２８以降の不記載の１５２９
〜１５３１番目）の上流２５５ｂｐ、即ち配列番号１の
１２７４はＴであるのに、ＧＣＰ１０１由来ではＣ（即
ち、配列番号３の１２７４番目）となっており１塩基異
なっていることが明らかとなった。

【００３３】実施例４．他のＭｕｔ＋変異株のＡＯＸ２
プロモーターの変異部位の探索 ＨＳＡ産生ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＣ４１
０５株はｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５
株のＡＯＸ１領域にＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＳ１を
置換して得られた株である。ｐＰＧＳ１と実施例１のｐ
ＰＧＰ１との違いは、ｐＰＧＰ１はＨＳＡ３′側にポリ
Ａ領域が存在するがｐＰＧＳ１では除去されていること
のみ異なっている。

【００３４】ＰＣ４１０５株について７つの独立したフ
ラスコで実施例１で行ったことと同様の継代実験を行っ
た。その結果、７つのフラスコ由来共にメタノール含有
培地での増殖が良好となった株（Ｍｕｔ＋株）が得られ
た。それらをシングルコロニーに単離し、ＳＨＧ４１０
５−４、ＳＨＧ４１０５−８、ＳＨＧ４１０５−９、Ｓ
ＨＧ４１０５−１０、ＳＨＧ４１０５−１１、ＳＨＧ４
１０５−１６、ＳＨＧ４１０５−１８と名付けた（図５
参照）。これら７つの株及びＰＣ４１０５についてCame
ron らの方法(Nucleic AcidsRes., 4, 1429 (1977))に
より染色体ＤＮＡを抽出精製した。実施例２で得たＰＣ
４１３０、ＧＣＰ１０１両株の染色体ＤＮＡと共にＡＯ
Ｘ２プロモーター領域ＤＮＡの増幅をＰＣＲ法により行
った。詳細を説明すると、まず、プライマーの合成を行
った。前記実施例３で決定した塩基配列、配列番号１を
基にＡＯＸ２遺伝子のＡＴＧより上流１４３塩基〜１６
０塩基（配列番号１の１３６９〜１３８６番）にＥｃｏ
ＲＩ部位を付けた逆鎖の配列を３′側のプライマー（配
列番号５）とし、ＡＴＧより上流７８６塩基〜８０３塩
基（配列番号１の７２６〜７３３番）にＢａｍＨＩ部位
を付けた主鎖の配列を５′側のプライマー（配列番号
６）とした。

【００３５】以上２つの配列をアプライドバイオシステ
ム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホアミ
ダイド法にて合成した。上記１０種類の染色体ＤＮＡを
鋳型として、２種類のプライマーを用い、GeneAmp ^TMキ
ット（宝酒造製）を用いて添付の説明書のとおりにＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応にはパーキン・エルマー・
シータス・ＤＮＡサーマル・サーキュラー（ＰＪ２００
０）を用い、ＤＮＡ鎖の熱変成は９４℃１分、プライマ
ーとのアニーリングは３７℃２分、ポリメラーゼによる
伸長反応は７２℃２分を１サイクルとして３５サイクル
行った。アガロース電気泳動により約６５０ｂｐに相当
する大きさのＤＮＡをSUPREC^TM-01 （宝酒造製）により
回収・精製した。SHG4105-16については約250bp に相当
する大きさのＤＮＡが増幅されたので、それを回収・精
製した。一方、pUC19 をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消
化し、２．７ｋｂ断片を回収し、アルカリフォスファタ
ーゼ処理を行った。増幅されたＤＮＡとライゲーション
し、E.coliコンピテントセルDH5(東洋紡製) を形質転換
し、得られた形質転換体より目的のプラスミドを持つ菌
を選んだ。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製
した。これら１０種類のプラスミドについてＭ１３ジデ
オキシシークエンスキット（宝酒造製）を用いてＥｃｏ
ＲＩ側から約２００塩基の配列を決定した。SHG4105-16
については増幅された全塩基配列を決定した。その結
果、PC4130・PC4105は従来の報告(KoutzらYEAST, 5, 16
7-177(1989))と同じ配列番号１の塩基配列であった。ま
た、GCP101は項３で示したようにATG から上流255bp の
T がC に変異していることが追試された（配列番号
３）。SHG4105-4 、SHG4105-9 、SHG4105-10、SHG4105-
11、SHG4105-18はGCP101と全く同じ変異であり、配列番
号３のプロモーター配列を示した。SHG4105-8 はATGか
ら上流255bpのT はそのままであったが、ATG から上流2
15bp 付近と234bp 付近のGGAGA を介してその間の配列
番号７に示す19塩基の繰り返し配列の挿入が見られた
（配列番号１の塩基番号１３１４（Ａ）と１３１５
（Ｃ）の間に配列番号７を付加した配列番号４に示すプ
ロモーター配列が得られる。）。SHG4105-16はATG から
上流255bp のT はそのままであったが、ATG から上流34
2bp 〜780bp の間の439bp の欠失（配列番号１の塩基番
号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ）の欠失）が見られた
（配列番号２) 。

【００３６】実施例５．ＧＣＰ１０１由来のＡＯＸ２プ
ロモーター活性 ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロモーターとＰＣ４１３０
由来ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現するベ
クターを作製し、そのプロモーター活性を確認した。

【００３７】ｐＰＧＰ１をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡブ
ランティングキット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化
した。そこにＥｃｏＲＩリンカーd(pG-G-A-A-T-T-C-C)
（宝酒造製）をライゲーションした。SphIによる完全な
消化及びＥｃｏＲＩによる部分消化を行い、6.5kb 断片
を回収・精製した。pUC19 をＥｃｏＲＩ及びSphIで消化
しアルカリフォスファターゼ処理の後、前記断片をライ
ゲーションし、pUC19にＡＯＸ１プロモーター支配下に
ＨＳＡが発現し、ＨＩＳ４を選択マーカーに持つプラス
ミドｐＰＧ００１を得た（図６参照）。ｐＰＧ００１を
ＥｃｏＲＩで部分消化し、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。一方、アプラ
イドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを
用いてホスホアミダイド法によてＧＧＧＡＴＣＣＣの配
列を持つＢａｍＨＩリンカーを合成した。これをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）によりリン酸化
し、先に平滑化処理した断片とライゲーションした。Ａ
ｓｕＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、7.1kb 断片を精製し
た。一方、pPGP1 をHindIII で消化し、ＤＮＡブランテ
ィングキット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。
そこにBamHI リンカーd(pG-G-G-A-T-C-C-C) をライゲー
ションし、AsuII 及びBamHI で消化し、1.9bp断片を精
製した。前出の7.1kb 断片とライゲーションし、pPG002
を得た。

【００３８】pMM030及びpMM034をEaeIで消化し、1.5kb
の断片を回収した。マングビーンヌクレアーゼ（宝酒造
製）処理により末端を平滑化した。そこにアプライドバ
イオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル381Aを用いてホス
ホアミダイド法にてCTTCGAAGの配列を持つAsuII リンカ
ーを合成した。これをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造製）によりリン酸化し、先に平滑化処理した断片と
ライゲーションした。それをEcoRI 及びAsuII で消化
し、1.5kb のＡＯＸ２プロモーター領域断片を回収し
た。一方、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現
し、ＨＩＳ４領域を持つプラスミドｐＰＧ００２をEcoR
I 及びAsuII で消化し、ＡＯＸ１プロモーター領域を除
いた８．１kb断片をアルカリフォスファターゼ処理を行
った後に回収した。ＡＯＸ２プロモーター領域1.5 kb断
片とライゲーションし、PC4130由来（天然型）ＡＯＸ２
プロモーター支配下にHSA が発現するプラスミドpMM04
1、GCP101由来（変異型）ＡＯＸ２プロモーター支配下
にHSA が発現するプラスミドpMM042を作製した（図７参
照）。

【００３９】pPG002、pMM041、pMM042をHIS4領域に1 ヵ
所切断部位が存在する酵素であるStuIで消化し、線状に
した後GTS115に導入した。これらのプラスミドはGTS115
のhis4領域に相同的組み換えを介して組み込まれる。ピ
キア酵母の形質転換の方法は実施例４で行った方法と同
じである。形質転換の後、生じたコロニーはヒスチジン
要求性のプレートであるので全てが形質転換体と考えら
れる。３Ｇ１グラスフィルターで濾過して寒天を除き、
濾液の一部をＹＰＤ培地に植え３０℃一夜培養した。そ
の培養液をもとに初期濃度Ａ₅₄₀ =0.1となるように50ｍ
Ｌの各種培地に植えた。24時間毎に培養液の一部を採取
し、培養上清に存在するヒト血清アルブミン濃度をRPHA
法(EP 特許第122620号) にて測定した。その結果、PC41
30由来ＡＯＸ２プロモーターではヒト血清アルブミンを
産生する活性が低いのに対し、GCP101由来ＡＯＸ２プロ
モーターではＡＯＸ１プロモーター並のヒト血清アルブ
ミンを産生する活性を示すことがわかった。表２に結果
を示す。 表２ 培養上清中のＨＳＡ産生量（ｍｇ／Ｌ） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 株 培地 24 48 120 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― pPG002/GTS115 2%MeOH-YP 8 30 40 (AOX1 プロモーター) 4%MeOH-YP 2 60 120 pMM041/GTS115 2%MeOH-YP - - 1 (PC4130 由来天然型 4%MeOH-YP - 1 1 AOX2プロモーター) pMM042/GTS115 2%MeOH-YP 8 20 40 (GCP101 由来変異型 4%MeOH-YP 1 60 120 AOX2プロモーター) ――――――――――――――――――――――――――――――――――― -は検出できなかったことを示す。

【００４０】実施例６．変異型ＡＯＸ２プロモーターを
用いたＨＳＡ産生株の取得 実施例５のようにｐＭＭ０４２をＳｔｕＩで消化した
後、ＧＴＳ１１５株に導入した。ＧＴＳ１１５株のｈｉ
ｓ４領域と相同的組み換えを介して組み込まれるが、一
度の形質転換の操作で複数コピー組み込まれる場合もあ
る。形質転換の後に生じたコロニーを３Ｇ１グラスフィ
ルターで濾過して寒天を除き、濾液をさらに１００ｃｅ
ｌｌｓ／ｐｌａｔｅになるように滅菌水で希釈してYNB
W/Oa.a.プレート（０．７％イーストナイトロジェンベ
ースウイズアウトアミノアシッド、２％グルコース、
１．５％寒天末）に塗布した。３０℃、３日間培養し、
シングルコロニーを生じさせた。

【００４１】上記クローン１０種類について、実施例２
で行ったように、染色体ＤＮＡを抽出した。さらに、ピ
キア染色体ＨＩＳ４領域をプローブとしたサザン解析
（Southern, E.M. J. Mol. Biol., 98:503 (1975))を行
い、組み込まれたpMM042のコピー数を決定した。詳細に
説明すると、５μｇの染色体ＤＮＡをＢｇｌIIで消化し
た。アガロース電気泳動の後、ゲルを0.2N HCl溶液で30
分処理した。ゲルをアルカリ変成液（０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ、０．６Ｍ ＮａＣｌ）に移し、３０分反応させた。
次にゲルを中和液（０．２Ｍトリス（ｐＨ７．４）、
０．６ＭＮａＣｌ）に移し、３０分間、２回処理した。
常法の通りHybond-N（アマーシャム社製) にブロッティ
ングした。プローブはピキアHIS4のKpnI断片(0.6kb) を
標識した。プローブの調製、ハイブリダイゼーション及
び洗浄は、DIG-ELISA 法DNA ラベリング＆ ディテクシ
ョンキット( ベーリンガーマンハイム山之内社製）を使
用し、添付の説明書の通り行った。ＧＴＳ１１５は図８
（ａ）に示すように２．７kbのHIS4領域を有するため、
２．７kbのバンドが出現する。pMM042がGTS115のhis4領
域に1 コピー組み込まれたならば、7.8kb と4.5kb のバ
ンドが出現する。pMM042が同じく2 コピー組み込まれた
ならば、9.6kb と7.8kb と4.5kb のバンドが出現する。
同じく3 コピー組み込まれたならば、7.8kb と4.5kb の
バンドと9.6kb のバンドが2 倍の濃さで検出される。4
コピーならば3 倍の濃さで検出される。サザン解析の結
果、pMM042がGTS115のhis4領域に組み込まれたことがわ
かり、1 コピーから4 コピーまでのコピー数を持つ株が
得られた。その内、1 コピー組み込まれた株の1 つをUH
G42-15、2 コピー組み込まれた株の1 つをUHG42-3、3
コピー組み込まれた株の1 つをUHG42-12と名付けた（図
８（ｂ）〜（ｄ））。

【００４２】クローンに分離した後のHSA 産生能を測定
した。UHG42-15、UHG42-3 、UHG42-12についてYPD 培地
に植え、30℃一夜培養した。その培養液をもとに初期濃
度OD₅₄₀ =1になるように50ｍＬの2% MeOH-YP培地に植え
た。24時間毎に培養液の一部を採取し、培養上清に存在
するヒト血清アルブミン濃度をRPHA法(EP 特許第122620
号）にて測定した。その結果、表３のように最高でＵＨ
Ｇ４２−１５では８０ｍｇ／Ｌ、ＵＨＧ４２−３では１
００ｍｇ／Ｌ、ＵＨＧ４２−１２では１６０ｍｇ／Ｌの
ＨＳＡ産生量を示し、クローン化することにより産生量
の高い株が得られ、また、コピー数の増加に伴い産生量
も増加した。ＧＣＰ１０１由来（変異型）ＡＯＸ２プロ
モーターを用いてＨＳＡを発現させるプラスミドｐＭＭ
０４２を用いて、ＨＳＡを高産生する株が取得できた。

【００４３】 表３ クローンの培養上清中のＨＳＡ産生量（ｍｇ／Ｌ） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 株 ２４ ４８ ７２ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＵＨＧ４２−１５ １５ ８０ ８０ （１コピー） ＵＨＧ４２−３ ３０ １００ １００ （２コピー） ＵＨＧ４２−１２ ４０ １６０ １６０ （３コピー） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地、３０℃で培養した。実施例７：変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡ
を発現するプラスミドベクターの構築 実施例４で得られた３タイプ（配列表の配列番号２〜
４）の変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下でＨＳＡを発
現するベクターの構築を行った。 まず、実施例４におい
て得られる、各種の変異型ＡＯＸ２プロモーター領域の
ＤＮＡが挿入されたプラスミドベクターｐＵＣ１９をそ
れぞれＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡブランティングキッ
ト（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した。そこにＥ
ｃｏＲＩリンカーd(pG-G-A-A-T-T-C-C) （宝酒造社製）
をライゲーションした。その後、ＳｓｐＩによる完全消
化及びＥｃｏＲＩによる部分消化を行い、１．５ｋｂ断
片を回収、精製した。 一方、実施例５で得られた、天然
型ＡＯＸ２プロモーターの支配下でＨＳＡを発現させ、
選択マーカーとしてＨＩＳ４をもつプラスミドｐＭＭ０
４１のプロモーター部位を同様にＳｓｐＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化しアルカリフォスファターゼ処理をした。その
切断部位に先の各種変異型ＡＯＸ２プロモーターＤＮＡ
断片（ＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ）をそれぞれライゲーショ
ンして組み入れ、天然型ＡＯＸ ２プロモーター（配列表
の配列番号１）の塩基番号７２６より下流域の塩基配列
を有する組換え発現ベクターｐＨＯ０６０、塩基番号７
２６より下流域の塩基配列を有しかつ塩基番号１２７４
のＴがＣに置換してなる変異型ＡＯＸ２プロモーターを
含有する組換え発現ベクターｐＨＯ０５９、塩基番号７
２６より下流域の塩基配列を有しかつ塩基番号１３１４
（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号７を付加してな
る変異型ＡＯＸ２プロモーターを含有する組換え発現ベ
クターｐＨＯ０６１、塩基番号７２６より下流域の塩基
配列を有しかつ塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ）
が欠失してなる変異型ＡＯＸ２プロモーターを含有する
組換え発現ベクターｐＨＯ０６２を構築した（図９参
照）。 実施例８：変異型ＡＯＸ２プロモーターの活性比較 実施例５のようにｐＨＯ０５９、ｐＨＯ０６０、ｐＨＯ
０６１、ｐＨＯ０６２をそれぞれＧＴＳ１１５株に導入
し、これらのベクターが１コピー組み込まれた形質転換
体を選択し、それらの株のプロモーター活性をそのＨＳ
Ａ産生量から比較検討した。 各１コピー形質転換体をＹ
ＰＭ培地で７２時間培養した後、培地上清中のＨＳＡ産
生量（ＲＰＨＡ法使用）を測定した。また同様に追試を
行い、得られた培地上清中のＨＳＡ産生量を別の方法で
あるマンシニ（Ｍａｎｃｉｎｉ）法にて測定した。結果
を図１０に示す。

【００４４】

【発明の効果】本発明により得られた変異型ＡＯＸ２プ
ロモーターは天然型（野生型）のものに比べてプロモー
ター活性が格段に増強されている。このプロモーターを
使うことにより、異種蛋白質を大量に発現させることが
可能になった。

【００４５】従って、本発明の内容は遺伝子工学の分野
において新規な発現系として極めて有用と考えられる。

【００４６】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 配列番号：２ 配列の長さ：１０８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AAGATGAGCT ATTTTTGTCG CATAAATTTT 780 TGTCTCGGAG TGAAAACCCC TTTTATGTGA ACAGATTACA GAAGCGTCCT ACCCTTCACC 840 GGTTGAGATG GGGAGAAAAT TAAGCGATGA GGAGACGATT ATTGGTATAA AAGAAGCAAC 900 CAAAATCCCT TATTGTCCTT TTCTGATCAG CATCAAAGAA TATTGTCTTA AAACGGGCTT 960 TTAACTACAT TGTTCTTACA CATTGCAAAC CTCTTCCTTC TATTTCGGAT CAACTGTATT 1020 GACTACATTG ATCTTTTTTA ACGAAGTTTA CGACTTACTA AATCCCCACA AACAAATCAA 1080 CTGAGAAAA 1089 配列番号：３ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCCTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 配列番号：４ 配列の長さ：１５４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGAAAATTA 1320 AGCGATGAGG AGACGATTAT TGGTATAAAA GAAGCAACCA AAATCCCTTA TTGTCCTTTT 1380 CTGATCAGCA TCAAAGAATA TTGTCTTAAA ACGGGCTTTT AACTACATTG TTCTTACACA 1440 TTGCAAACCT CTTCCTTCTA TTTCGGATCA ACTGTATTGA CTACATTGAT CTTTTTTAAC 1500 GAAGTTTACG ACTTACTAAA TCCCCACAAA CAAATCAACT GAGAAAA 1547 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer bind 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGAATTCGACAATATTCTTTGATGC 26 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer bind 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGGATCCACTAAGCGAGTCATCATC 26 配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 付加ＤＮＡ 配列の種類 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATTAAGCGATGAGGAGA 19

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣ４１３０の構築手順およびＧＣＰ１０１の
取得方法を説明する図である。

【図２】ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を示す図で
ある。尚、かっこ内の数字は、XbaIを０とした時の距離
（×１００塩基）を示す。 （×１００塩基）を示す。

【図３】ＡＯＸ２プロモーターをクローニングしたプラ
スミドｐＭＭ０３０またはｐＭＭ０３４およびその制限
酵素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃ
ｏＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図４】ＡＯＸ２構造遺伝子をクローニングしたプラス
ミドｐＭＭ０３１またはｐＭＭ０３５およびその制限酵
素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃｏ
ＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図５】変異型ＡＯＸ２プロモーターを有する各株の取
得過程を示す図である。

【図６】ｐＰＧ００１の構築を説明する図である。

【図７】ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４２の構築を説明
する図である。

【図８】実施例６を説明する図である。 図

【図９】実施例７の各種変異型ＡＯＸ２プロモーター
を含有する組換えベクターの構築を説明する図である。
尚、比較のためあわせてｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４２も
示した。

【図１０】実施例８の結果を示すグラフであり、縦軸に
ＨＳＡ産生量、横軸に各種形質転換体を示した。なお、
４１−３は、ｐＭＭ０４１形質転換体、４２−５は、ｐ
ＭＭ０４２形質転換体、６０−４はｐＨＯ０６０形質転
換体、５９−３はｐＨＯ０５９形質転換体、６１−３は
２−４はｐＨＯ０６２形質転換体を培養して７２時間目
のＨＳＡ産生量を示す。 換

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 村上 弘次 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 中川 幸光 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−53489（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−501827（ＪＰ，Ａ)

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表記載の配列番号１の天然型ＡＯＸ
   ２プロモーターの塩基配列の一部を欠失、置換または新
   たな塩基配列を付加してなる変異型ＡＯＸプロモーター
   において、少なくとも、配列番号１の塩基番号７４９
   （Ｃ）〜１１８７（Ｔ）を欠失、配列番号１の塩基番号
   １２７４（Ｔ）を（Ｃ）に置換、または配列番号１の塩
   基番号１３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号
   ７を付加してなり、かつ配列表記載の配列番号２、３ま
   たは４に示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーターの
   プロモーター活性と同等のプロモーター活性を有するこ
   とを特徴とする変異型ＡＯＸ２プロモーターを担持して
   なるプラスミド。
2. 【請求項２】 配列表記載の配列番号２、３または４に
   示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーターを担持して
   なるプラスミド。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のプラスミドを導
   入してなる形質転換体。
4. 【請求項４】 請求項３記載の形質転換体を培養するこ
   とにより異種蛋白質を製造する方法。