JPH0829102B2 - 変異型ａｏｘ２プロモーター、当該プロモーターを担持する菌株、その取得方法およびその菌株を利用した異種蛋白質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異型ＡＯＸ２プロモ
ーター、当該プロモーターを担持する菌株、その取得方
法およびその菌株を利用した異種蛋白質の製造方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性酵母はメタノールを炭
素源およびエネルギー源として増殖する。その際、メタ
ノール代謝経路において第１段階でアルコール酸化酵素
（ＡＯＸ、ＥＣ１．１．３．Ｂ）によりメタノールをホ
ルムアルデヒドに酸化する。

【０００３】メタノール資化性酵母の一種であるピキア
酵母（Pichia pastoris ）はゲノム中に二種のＡＯＸ遺
伝子（ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子）を有する。こ
の内ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ２プロモーターには
活性に大きな差があり、通常ピキア酵母で発現されてい
るＡＯＸはほとんどＡＯＸ１プロモーターによって転写
されたものであることが示されている（Molecular and
CellularBioligy, vol.9, 1316(1989)）。ＡＯＸ１遺伝
子領域に異種遺伝子を置換して得られた菌株はメタノー
ルの資化をＡＯＸ２のみに任せているのでメタノール含
有培地中での増殖は悪く、長い培養時間が必要であっ
た。

【０００４】ＡＯＸはグルコース含有培地ではほとんど
発現されないのに対し、メタノール含有培地では細胞中
の可溶化蛋白質の３０％を示すといわれている。ＡＯＸ
をコードする２種類のＡＯＸ遺伝子の内、ＡＯＸ１遺伝
子の制御領域であるＡＯＸ１プロモーターは強い活性を
持ち、メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現に用い
られ、高い産生量を示した。しかしながら、ＡＯＸ２プ
ロモーターは活性が弱く、異種蛋白質の発現には適当で
はなかった。メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現
系は大量に産物が得られるために、その発現系に強力な
プロモーターが求められていた。

【０００５】最近、そのＡＯＸ遺伝子の調節領域を用い
て異種蛋白質を産生する方法が研究されている（特開平
2-104290、特開平2-242694、特開平2-303497等）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】宿主のＡＯＸ１遺伝子
領域に異種蛋白質をコードする遺伝子を置換した場合
は、メタノールの資化をＡＯＸ２のみでまかなうため、
メタノール含有培地中での増殖は宿主に比べて劣ってお
り、培地時間が長くなる欠点を持っている。本発明の目
的は、ＡＯＸ１遺伝子の存在しない異種蛋白質を発現す
る菌株から、メタノール含有培地中で増殖の良好になっ
た菌株を提供すること及びそれを容易に取得する方法を
見出すことにある。

【０００７】本発明の別の目的は、高レベルに異種蛋白
質を産生する上で重要な働きを持つ新規なプロモーター
を提供すること及びそれを取得する方法を示すことであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記〜記
載のものであり、これにより上記課題を解決できる。 配列表記載の配列番号１の天然型ＡＯＸ２プロモー
ターの塩基配列の一部を欠失、置換または新たな塩基配
列を付加してなる変異型ＡＯＸプロモーターにおいて、
少なくとも、配列番号１の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１
８７（Ｔ）を欠失、配列番号１の塩基番号１２７４
（Ｔ）を（Ｃ）に置換、または配列番号１の塩基番号１
３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号７を付加
してなり、かつ配列表記載の配列番号２、３または４に
示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーターのプロモー
ター活性と同等のプロモーター活性を有することを特徴
とする変異型ＡＯＸ２プロモーター。 配列表記載の配列番号２、３または４に示す配列で
ある変異型ＡＯＸ２プロモーター。 染色体上において上記または記載の変異型ＡＯ
Ｘ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担持してな
る菌株。 染色体上においてＡＯＸ１プロモーターの支配下で
ＡＯＸ１遺伝子によるＡＯＸ産生がなく、天然型ＡＯＸ
２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担持してなる
菌株をメタノール含有培地中で培養し、天然型ＡＯＸ２
プロモーターに変異を起こさせることを特徴とする上記
記載の菌株の取得方法。 上記記載の菌株に発現可能な異種蛋白質遺伝子を
組み込んでなる該菌株を培養することを特徴とする異種
蛋白質の製造方法。

【０００９】（１）変異型ＡＯＸ２プロモーター 本発明の変異型ＡＯＸ２プロモーターは天然型（即ち、
野生型）ＡＯＸ２プロモーターの塩基配列の一部を欠
失、置換または新たな塩基配列を付加してなる。

【００１０】ａ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を欠失してなる場合 欠失部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載した天然
型ＡＯＸ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３
０〜１５２８に位置すればよい。欠失は一塩基でもそれ
以上でもよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的
には配列番号１の塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７
（Ｔ）の４３９ｂｐを欠失したもの、即ち配列番号２に
記載のプロモーターが挙げられる。

【００１１】ｂ．天然型ＡＯＸ２プロモーターの塩基配
列の一部を他の塩基配列で置換してなる場合 置換部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載したＡＯ
Ｘ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１
５２８に位置すればよい。置換は一塩基でもそれ以上で
もよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配
列番号１の塩基番号１２７４（Ｔ）を（Ｃ）に置換した
もの、即ち配列番号３に記載のプロモーターが挙げられ
る。

【００１２】ｃ．天然型ＡＯＸ２プロモーターに新たな
塩基配列を付加してなる場合 付加部位は天然型ＡＯＸ２プロモーター領域内であれば
特に制限されない。例えば、配列番号１に記載したＡＯ
Ｘ２プロモーターを含む塩基配列の塩基番号７３０〜１
５２８に位置すればよい。付加は一塩基でもそれ以上で
もよく、また一ヵ所でも数ヵ所でもよい。具体的には配
列番号１の塩基番号１３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の
間に配列番号７を付加したもの、即ち配列番号４に記載
したプロモーターが挙げられる。

【００１３】本発明において、上記配列番号２〜４の塩
基配列の例えば、塩基番号１〜７３０の領域は、簡明に
説明するため天然型と同一に記載したが、この領域は特
にこの配列に限定されないことは明白であり、適宜必要
に応じて塩基の欠失、置換、挿入を行うことができる。

【００１４】（２）その染色体上において変異型ＡＯＸ
２プロモーターを担持してなる菌株 本発明の菌株はその染色体上において（１）の変異型Ａ
ＯＸ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担持して
なる。

【００１５】より詳細にはＡＯＸ１遺伝子によるＡＯＸ
が産生されず、染色体において（１）の変異型ＡＯＸ２
プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担持してなる。
具体的には、染色体上においてＡＯＸ１プロモーターお
よび（１）の変異型ＡＯＸ２プロモーターを有し、ＡＯ
Ｘ１プロモーターの支配下に異種蛋白質遺伝子を、変異
型ＡＯＸ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を各々
担持してなる。

【００１６】このような菌株としてＧＣＰ１０１株、Ｓ
ＨＧ４１０５−４株が挙げられる。 （３）その染色体上において変異型ＡＯＸ２プロモータ
ーを担持する菌株の取得方法。

【００１７】 出発菌株 本発明の出発菌株はその染色体上において天然型（野生
型）ＡＯＸ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担
持してなる。

【００１８】詳しくはその染色上においてＡＯＸ１プロ
モーターおよびＡＯＸ２プロモーターを有し、ＡＯＸ１
プロモーターの支配下にＡＯＸ１遺伝子を、ＡＯＸ２プ
ロモーターの支配下にＡＯＸ２遺伝子を各々担持してな
る。

【００１９】このような菌株としてはピキア酵母（野生
型）が例示され、具体的にはＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ寄
託番号Ｙ−１５８５１，Gene 59 , 115-125 (1987)) 等
が挙げられる。

【００２０】 異種蛋白質遺伝子の導入 の出発菌株に異種蛋白質遺伝子を導入してＡＯＸ１遺
伝子領域を異種蛋白質遺伝子に置換する。

【００２１】異種蛋白質として、ヒト血清アルブミン、
Ｂ型肝炎ウィルス抗原、ウロキナーゼまたはインターフ
ェロン等が例示される。特開平２−１０４２９０号公報
に記載のように、ＡＯＸ１遺伝子の５′側及び３′側相
同領域の間に異種蛋白質遺伝子転写ユニット及びマーカ
ーなどを有する線状組み込み部位特異的ベクターにより
ＡＯＸ１遺伝子と置換する（図１参照）。の出発菌株
の形質転換は公知の方法により行う。

【００２２】このような菌株をしては具体的にはＰＣ４
１３０、ＰＣ４１０５等が挙げられる。また、他の形態
としてＡＯＸ１遺伝子領域に異種蛋白質遺伝子を挿入す
る方法、ＡＯＸ１遺伝子を部分的に修飾（欠失、置換、
付加）してＡＯＸ１遺伝子によるＡＯＸが産生されない
状況下で変異を行い、後に異種蛋白質遺伝子を導入する
方法等が挙げられる。

【００２３】 変異菌株の取得 の菌株（ＡＯＸ１遺伝子によるＡＯＸが産生されない
形質転換体）をメタノール含有培地中で培養することに
よりＡＯＸ２プロモーター領域に変異を起こさせる。

【００２４】メタノール濃度としては１−５％程度が例
示される。培地は天然培地、人工培地のいずれでもよ
い。天然培地としては、ＹＰ培地（１％イーストエキス
トラクト＋２％ポリペプトン）等が例示される。培養
は、通常１５〜４３℃（好適には３０℃程度）で２０〜
１２０時間程度行い、必要により通気や攪拌を加えるこ
ともできる。培養終了後一部あるいは全部を採取し、新
しいメタノール含有培地に継代しさらに培養を続ける。
継代の際に一部を採取し、栄養源の乏しいメタノール含
有プレート、例えば、2%MeOH-YNB w/o a.a. プレート
（０．７％イーストナイトロジェンベースウィズアウト
アミノアシッド、２％メタノール、１．５％寒天末）に
希釈して塗布し、３０℃程度でインキュベーションし、
３〜１４日後に生じるコロニーから変異菌株を取得する
ことができる。

【００２５】 変異型ＡＯＸ２プロモーターの回収 の変異株から遺伝子工学的手法を用い、ＡＯＸ２プロ
モーター領域からクローニングを行うことにより当該変
異型ＡＯＸ２プロモーターを回収することができる。

【００２６】回収したプロモーターは公知の手法により
塩基配列を解析することができる。 （４）（２）の菌株を用いて異種蛋白質を製造する方法 （２）の菌株（変異株）を宿主細胞の自体公知の培地で
培養する。培地はメタノール含有培地が好ましい。メタ
ノール濃度は０．０１〜５％程度が例示される。培地は
天然培地、人工培地のいずれでもよい。天然培地として
はＹＮＢ培地（０．７％ Yeast Nitrogen Base) 、YP培
地(1%Yeast Extract + 2% ポリペプトン) 等が例示され
る。

【００２７】培養は、通常15〜43℃( 好適には30℃程
度) で20〜360 時間程度行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。培養後、培養上清を回収し、自体
公知の方法、例えば、アフィニティクロマト、ゲル濾過
分画法等により異種蛋白質を精製できる。

【００２８】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。

【００２９】なお、本発明において多くの技法、反応お
よび分析方法は当業界においてよく知られている。特に
ことわらない限り、全ての酵素は商業的供給源、例え
ば、宝酒造等から入手することができる。

【００３０】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５、ＰＣ４１３０、ＰＣ４１０５及びプラスミドｐＰＧ
Ｐ１、ｐＰＧＳ１はフィリップス・ペトロリウム社から
入手した。

【００３１】プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、
プラークハイブリダイゼーション法、及び電気泳動法は
「モレキュラークローニング」コールドスプリングハー
バーラボラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Sprin
g Harbor Laboratory(1982)に記載されている方法によ
り行った。

【００３２】 実施例１．ＧＣＰ１０１の取得（図１参照） 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ１
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００３３】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３ｍｌに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ = １と
なるように２％ＭｅＰＨ−ＹＰ培地１％イーストエキス
トラクト、２％バクトペプトン、２％メタノール）５０
ｍｌに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀=
１となるように２％ＭｅＰＨ−ＹＰ培地５０ｍｌに植
菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代
毎に菌体を１０⁷ cell/plateになるように滅菌水で希釈
して2%MeOH-YNBw/oa.a. プレート(0.7% イーストナイト
ロジェンベースウイズアウトアミノアシッド、2%メタノ
ール、1.5%寒天末) に塗布し、30℃5 日間培養してコロ
ニーの有無を判断した。その結果、12日間継代後に塗布
した2%MeOH-YNBw/oa.a. プレートから20個のコロニーが
生じた。このプレートではMut-株はほとんど成育でき
ず、Mut+株は成育できる。即ち、このプレートでコロニ
ーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、
Mut+に変換した株が得られたことを示している。生じた
コロニーの内の1 つを適当に滅菌水で希釈して2%MeOH-Y
NBw/oa.a. プレートに拡げシングルコロニーに単離し
た。その一つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００３４】ＰＣ４１３０とＧＣＰ１０１との各種培地
における増殖度の比較を行った。YNBw/oa.a.プレート
(0.7% イーストナイトロジェンベースウイズアウトアミ
ノアシッド、2%グルコース、1.5%寒天末) に4 ℃に保存
していた菌体をYPD メディウム3ml/試験管に1 白金耳と
り、24時間30℃で培養する。初期OD₅₄₀ =0.1となるよう
に50ml各種培地/ フラスコに植え、30℃で培養し、24時
間毎の増殖度と培養上清に存在するヒト血清アルブミン
濃度を測定した（表１）。ヒト血清アルブミン濃度はRP
HA法(EP 特許第122620号) にて測定した。用いた培地は
ＹＰＤ培地、２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（１％イーストエ
キストラクト、２％バクトペプトン、２％メタノー
ル）、４％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地（１％イーストエキスト
ラクト、２％バクトペプトン、４％メタノール）の３種
類を使用した。その結果、グルコースを炭素源にした培
地では２つの株に差はなかったが、メタノールを炭素源
とした培地ではＧＣＰ１０１はＰＣ４１３０よりも増殖
が良好になった（Ｍｕｔ＋株に変換した）ことが観察さ
れた。また、HSA 産生量はGCP101でもPC4130に比べ大き
な差はなかった。 表１ GCP101とPC4130の各種培地での菌体増殖とHSA 産生量 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 培地 株 0 24 48 72 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＹＰＤ培地 PC4130 0.1 67 80 78 PC4130 -- -- -- GCP101 0.1 63 78 79 GCP101 -- -- -- 2%MeOH-YP 培地 PC4130 0.1 16 36 46 PC4130 10 60 100 GCP101 0.1 24 63 63 GCP101 10 70 80 4%MeOH-YP 培地 PC4130 0.1 9 20 28 PC4130 1 30 80 GCP101 0.1 10 57 84 GCP101 2 60 120 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 注) 上段：増殖度（ＯＤ₅₄₀ ) 、下段：ＨＳＡ産生量
（ｍｇ／Ｌ）-- は検出できなかったことを示す。

【００３５】実施例２．ＡＯＸ２遺伝子のクローニング ＡＯＸ２遺伝子付近の配列及び制限酵素地図はCregg ら
Mol. Cell. Biol 9, 1316-1323(1989)及びKoutz らYEAS
T 5 167-177(1989) によって報告されており、それらを
参考にしてＡＯＸ２遺伝子のクローニングを計画した。
ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を図２に示した。ま
ず、PC4130とGCP101両株よりCameron らの方法NucleicA
cids Res. 4 1429(1977)により染色体DNA を抽出精製し
た。両染色体DNA をＡＯＸ２プロモーター領域・ＡＯＸ
２構造遺伝子・ＡＯＸ２ターミネーターが完全に含まれ
るXbaIとPstIでの完全な消化を行った。エタノール沈殿
を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶かした。EcoRI メチ
ラーゼ( 宝酒造製) を加え、反応させた。TE飽和フェノ
ール・クロロホルム抽出、続いてクロロホルム抽出を行
い、水層についてエタノール沈殿を行い、遠心、乾燥後
に滅菌水に溶かした。DNA ブランティングキット（宝酒
造製）を用いて末端を平滑化し、そこにEcoRI リンカー
d(pG-G-A-A-T-T-C-C) （宝酒造製）をDNA ライゲーショ
ンキット（宝酒造製）を用いてライゲーションした。再
度エタノール沈殿を行い、遠心、乾燥後に滅菌水に溶か
し、EcoRI を加え37℃1 時間インキュベーションした。
1%アガロース電気泳動で4 〜5kb に相当する領域を切り
出し、GENE CLEAN II(BIO101社製) による溶出精製を行
ってDNA を回収し、滅菌水にとかした。λgt10 arms(Pr
otoclone ^TM System)( プロメガ社製) とライゲーショ
ンし、Gigapack-GOLD3( ストラタジーン社製) を用いて
インビトロパッケイジングを行った。A ₆₀₀ =2に調製し
ておいたE.coli C600 株とC600hfl 株に吸着させ、NZY
プレート(1%NZアミン、0.5%塩化ナトリウム、0.5%イー
ストエクストラクト、0.02% 硫酸マグネシウム、1.5%寒
天末) に播きライブラリーを作成し、タイターを測定し
た。組み換えファージをE.coli C600hfl株に吸着させ、
1 プレートに約500 個ずつプラークが生じるようにNZY
プレートに播いた。PC4130とGC101 両株由来共に4 枚の
ナイロンメンブラン Colony/Plaque Screen ^TM( NEN
製) を用い、プラークをメンブランに移行し、変成・中
和・固定処理を行った。Pichia pastoris IF01013 株由
来ＡＯＸ1 構造遺伝子前半分に当たるEcoRV とBglII で
消化して得られる断片をランダムプライマーラベリング
キット（宝酒造製）を用いて³²P 標識し、プローブとし
た。プレハイブリダイゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．
２）、７％ＳＤＳ溶液中６５℃、５分行った。ハイブリ
ダイゼーションは１％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
５ＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、³²Ｐ
−プローブ溶液中６５℃、一夜行った。洗浄は０．５Ｍ
ＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．２）溶液中で室温１０分間
インキュベートし、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、４０ｍＭ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ７．２）、５％Ｓ
ＤＳ溶液中で３７℃３０分間３回インキュベートした。
フィルターを風乾し、Ｘ線フィルム露光カセット中Ｘ線
フィルムと合わせて−８０℃で１６時間放置し、オート
ラジオグラフィーを行った。それぞれの株由来共に２個
ずつのポジティブクローンが得られた。その内の１クロ
ーンずつについてファージの増殖を行い、ファージＤＮ
Ａを抽出した。ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳
動で目的の断片（１．５ｋｂと２．９ｋｂ）が生じてい
ることを確かめた。ｐＵＣ１９（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリー社製）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリフ
ォスファターゼ処理した断片を回収し、ファージから回
収してＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡとをライゲーション
し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、４０μｇ
／ｍＬアンピシリン含有Ｌプレート（トリスベース０．
６２ｇ、ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラクト
５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水に溶解し、１Ｌ（リット
ル）とした後に１５ｇの寒天末を加えてオートクレーブ
滅菌し、プラスチックシャーレに分注固化する。アンピ
シリンはオートクレーブ後、培地が冷えてから添加す
る。）に播き、３７℃、一夜培養した。生じたコロニー
についてミニプレップを行いプラスミドを抽出し、Ｅｃ
ｏＲＩ消化によるスクリーニングを行った。その結果、
ＰＣ４１３０とＧＣＰ１０１両株由来共１．５ｋｂと
２．９ｋｂの断片がｐＵＣ１９に挿入されたクローンが
得られた。それらのクローンを４０μｇ／ｍＬアンピシ
リン含有スーパーブロス（バクトトリプトン１２ｇ、イ
ーストエキストラクト２４ｇ、グリセロール５ｍＬを水
に溶解し９００ｍＬとしてオートクレーブ滅菌したＡ
液、及びリン酸２水素カリウム３．８１ｇ、リン酸１水
素カリウム１２．５ｇを水に溶解して１００ｍＬとして
オートクレーブ滅菌したＢ液とを９：１（ｖ／ｖ）の割
合で混合したもの）中、３７℃、一夜振盪培養し、アル
カリ−ＳＤＳ法にてプラスミドＤＮＡを大量に抽出精製
した。ＰＣ４１３０由来ＡＯＸ２プロモーター領域を含
むプラスミドをｐＭＭ０３０、ＡＯＸ２構造遺伝子を含
むプラスミドをｐＭＭ０３１、ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ
２プロモーター領域を含むプラスミドをｐＭＭ０３４、
ＡＯＸ２構造遺伝子を含むプラスミドをｐＭＭ０３５と
命名した（図３、４参照）。これらのプラスミドの各種
制限酵素消化により生じる断片の大きさは報告されてい
るパターンと一致した。

【００３６】実施例３．ＡＯＸ２プロモーター領域の塩
基配列決定 ｐＭＭ０３０及びｐＭＭ０３４をＥｃｏＲＩで消化し、
１．５ｋｂ断片を回収し、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。一方、ｐＵＣ
１９をＸｂａＩで消化しマングビーンヌクレアーゼ（宝
酒造製）処理の後、アルカリフォスファターゼ処理をお
こなった断片とライゲーションし、形質転換体からプラ
スミドＤＮＡを調製した。この操作によりＰＣ４１３０
由来ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来Ａ
ＯＸ２プロモーター領域ＤＮＡがｐＵＣ１９のＸｂａＩ
サイトにサブクローニングされた。これらのプラスミド
をキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造製）
を用いて１５０〜３００ｂｐずつインサートサイズが異
なるデレーションミュータントを両方から５〜６クロー
ンずつ作製した。これらのデレーションミュータントを
Ｍ１３ジデオキシシークエンスキット（宝酒造製）を使
用して塩基配列を決定した。その結果、ＰＣ４１３０由
来ＡＯＸ２プロモーター領域及びＧＣＰ１０１由来ＡＯ
Ｘ２プロモーター領域のＡＴＧ上流１．５ｋｂの全塩基
配列が決定された。両株由来の配列を比較したところ、
ＰＣ４１３０由来ではＡＯＸ２構造遺伝子の開始コドン
ＡＴＧ（配列番号１の１５２８以降の不記載の１５２９
〜１５３１番目）の上流２５５ｂｐ、即ち配列番号１の
１２７４はＴであるのに、ＧＣＰ１０１由来ではＣ（即
ち、配列番号３の１２７４番目）となっており１塩基異
なっていることが明らかとなった。

【００３７】実施例４．ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロ
モーターとＰＣ４１３０由来ＡＯＸ２プロモーターとの
交換（特開昭60-41488号公報参照) ｐＭＭ０３０とｐＭＭ０３４のＳｐｅＩ部位に酵母由来
インベルターゼ（ＳＵＣ２）遺伝子を挿入し、ＡＯＸ２
プロモーター置換用プラスミドを構築した。ｐＭＭ０３
０・ｐＭＭ０３４をＳｐｅＩで消化し、アルカリフォス
ファターゼ処理後４．２ｋｂの断片を回収した。ＳＵＣ
２遺伝子をｐＵＣ１９にクローニングしたプラスミドｐ
ＹＩ０５６をEcoRI とSalIで消化し、ＤＮＡブランティ
ングキット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化し、そこ
にSpeIリンカーd(pG-A-C-T-A-G-T-C)(NEB 製) をＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造製）を用いてライゲーシ
ョンした。SpeIで消化し、2.9kb の断片を回収した。pM
M030・pMM034の断片とライゲーションし、PC4130由来Ａ
ＯＸ２プロモーター上流領域にSUC2が存在するプラスミ
ドpYI066とGCP101由来ＡＯＸ２プロモーター上流領域に
SUC2が存在するプラスミドpYＩ068 を作製した（図５参
照）。

【００３８】この2 つのプラスミドをPC4130及びGCP101
を宿主として形質転換した。これらのプラスミドをEcoR
I で消化すると4.4kb の断片が得られる。ＡＯＸ２プロ
モーター領域との相同領域がSUC2の両側に存在するため
に、これらの断片がピキア酵母に導入されると、ＡＯＸ
２遺伝子プロモーター領域で相同的組み換えが生じ、両
株由来のＡＯＸ２プロモーターが交換されることが予想
される。

【００３９】ピキア酵母の形質転換は、Cregg らの方法
(Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385(1985)) を参考にして
行った。即ち、YPD 培地5 ｍＬ中30℃、一夜培養したPC
4130およびGCP101を0.01% 植菌した。16〜20時間培養後
Ａ₆₀₀ ＝１〜５になったところで５０ｍＬ容コーニング
テューブに移し、遠心し、得られた細胞を滅菌水２０ｍ
Ｌに懸濁後、再度遠心して細胞を得た。１０ｍＬ ＳＥ
Ｄ緩衝液（１Ｍソルビトール、２５mM EDTA 、50mMジチ
オスレイトール) に懸濁後遠心する。1Mソルビトール溶
液で2 回洗浄した。10ｍＬのザイモリアーゼ溶液(Zymol
yase 100T 50μｇ／ｍＬの濃度でSED 緩衝液に溶解す
る) に懸濁し、30℃30分インキュベートした。顕微鏡で
10%SDSを1/10量加えることにより破壊することを確認し
た。遠心により細胞を集め、1Mソルビトール溶液で2 回
洗浄した。CaS 緩衝液(1M ソルビトール、10mM塩化カル
シウム) に懸濁後遠心により細胞を集めた。1 ｍＬのCa
S 緩衝液に懸濁し、そのスフェロプロスト懸濁液100 μ
Ｌをポリプロピレンチューブに移した。そこに10μｇの
EcoRI 消化したpYI066とpYI068の4.4kb 断片のＤＮＡを
添加し、20分室温に置いた。1 ｍＬPEG 溶液(20%ポリエ
チレングリコール3350、10mM塩化カルシウム、10mMトリ
スベース ｐＨ7.4)を添加し、15分室温に置いた。遠心
により細胞を集め、150 μＬのＳＯＳ溶液(1M ソルビト
ール、10mM塩化カルシウム、0.3 ×YPD)に懸濁し、30分
室温に置いた。850 μＬの1Mソルビトールを添加し、1
0、100 、500 μＬのスフェロプラスト懸濁液を45℃に
保温したトップアガー10ｍＬ(1M ソルビトール、1.35%
イーストナイトロジェンベースウイズアウトアミノアシ
ッド、400 μｇ／Ｌビオチン、2%グルコース、1%寒天
末) に加えて攪拌後、ボトムプレート( トップアガーと
同じ組成でシャーレに固化した。) に拡げた。30℃4 日
間インキュベートした。菌が一面に生じたトップアガー
を滅菌した薬さじでかきとり、3G1 グラスフィルターで
濾過して寒天を除いた。菌体が含まれる濾液をMSu プレ
ート(0.7% イーストナイトロジェンベースウイズアウト
アミノアシッド、400 μｇ／Ｌビオチン、0.5%サッカロ
ース、1%寒天末)に適当量希釈して播いた。生じたシン
グルコロニーの内大きなものを選び、さらに滅菌水に懸
濁して適当量播いた。比較的大きなシングルコロニーを
2%MeOH-YNBw/oa.a. プレートに植え、5 日間後に増殖の
有無(Mut±) を判断した。その結果、表２のようにＰＣ
４１３０(Mut- 株) にｐＹＩ０６８（変異型ＡＯＸ２プ
ロモーター）を導入した２０％がこのプレートで増殖し
た。逆にＧＣＰ１０１(Mut+株) にｐＹＩ０６６（天然
型ＡＯＸ２プロモーター）を導入した６％がこのプレー
トで増殖することができなかった。

【００４０】このことは、天然型ＡＯＸ２プロモーター
が変異型ＡＯＸ２プロモーターに変換するとプロモータ
ー活性が上昇し、Ｍｕｔ−株がＭｕｔ＋株に変化するこ
とを示している。

【００４１】 表２ Mut+の株の割合 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 導入したプラスミド 宿主 ｐＹＩ０６６ ｐＹＩ０６８ （PC4130由来) (GCP101 由来) (天然型AOX2プロモーター) （変異型AOX2プロモーター) ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＰＣ４１３０ ０％ ２０％ (Mut-) ＧＣＰ１０１ ９４％ １００％ (Mut+) ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 実施例５．他のＭｕｔ＋変異株のＡＯＸ２プロモーター
の変異部位の探索 ＨＳＡ産生ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＣ４１
０５株はｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５
株のＡＯＸ１領域にＨＳＡ発現プラスミドｐＰＧＳ１を
置換して得られた株である。ｐＰＧＳ１と実施例１のｐ
ＰＧＰ１との違いは、ｐＰＧＰ１はＨＳＡ３′側にポリ
Ａ領域が存在するがｐＰＧＳ１では除去されていること
のみ異なっている。

【００４２】ＰＣ４１０５株について７つの独立したフ
ラスコで実施例１で行ったことと同様の継代実験を行っ
た。その結果、７つのフラスコ由来共にメタノール含有
培地での増殖が良好となった株（Ｍｕｔ＋株）が得られ
た。それらをシングルコロニーに単離し、ＳＨＧ４１０
５−４、ＳＨＧ４１０５−８、ＳＨＧ４１０５−９、Ｓ
ＨＧ４１０５−１０、ＳＨＧ４１０５−１１、ＳＨＧ４
１０５−１６、ＳＨＧ４１０５−１８と名付けた（図６
参照）。これら７つの株及びＰＣ４１０５についてCame
ron らの方法(Nucleic Acids Res. 4 1429 (1977))によ
り染色体ＤＮＡを抽出精製した。実施例２で得たＰＣ４
１３０、ＧＣＰ１０１両株の染色体ＤＮＡと共にＡＯＸ
２プロモーター領域ＤＮＡの増幅をＰＣＲ法により行っ
た。詳細を説明すると、まず、プライマーの合成を行っ
た。実施例３で決定した塩基配列、配列番号１を基にＡ
ＯＸ２遺伝子のＡＴＧより上流１４３塩基〜１６０塩基
（配列番号１の１３６９〜１３８６番）にＥｃｏＲＩ部
位を付けた逆鎖の配列を３′側のプライマー（配列番号
５）とし、ＡＴＧより上流７８６塩基〜８０３塩基（配
列番号１の７２６〜７３３番）にＢａｍＨＩ部位を付け
た主鎖の配列を５′側のプライマー（配列番号６）とし
た。

【００４３】以上２つの配列をアプライドバイオシステ
ム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホアミ
ダイド法にて合成した。上記１０種類の染色体ＤＮＡを
鋳型として、２種類のプライマーを用い、GeneAmp ^TMキ
ット（宝酒造製）を用いて添付の説明書のとおりにＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応にはパーキン・エルマー・
シータス・ＤＮＡサーマル・サーキュラー（ＰＪ２００
０）を用い、ＤＮＡ鎖の熱変成は９４℃１分、プライマ
ーとのアニーリングは３７℃２分、ポリメラーゼによる
伸長反応は７２℃２分を１サイクルとして３５サイクル
行った。アガロース電気泳動により約６５０ｂｐに相当
する大きさのＤＮＡをSUPREC^TM-01 （宝酒造製）により
回収・精製した。SHG4105-１６については約250bp に相
当する大きさのＤＮＡが増幅されたので、それを回収・
精製した。一方、pUC19 をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
消化し、２．７ｋｂ断片を回収し、アルカリフォスファ
ターゼ処理を行った。増幅されたＤＮＡとライゲーショ
ンし、E.coliコンピテントセルDH5(東洋紡製) を形質転
換し、得られた形質転換体より目的のプラスミドを持つ
菌を選んだ。アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調
製した。これら１０種類のプラスミドについてＭ１３ジ
デオキシシークエンスキット（宝酒造製）を用いてＥｃ
ｏＲＩ側から約２００塩基の配列を決定した。SHG4105-
16については増幅された全塩基配列を決定した。その結
果、PC4130・PC4105は従来の報告(KoutzらYEAST 5 167-
177(1989))と同じ配列番号１の塩基配列であった。ま
た、GCP101は項３で示したようにATG から上流255bp の
T がC に変異していることが追試された（配列番号
３）。SHG4105-4 、SHG4105-9 、SHG4105-10、SHG4105-
11、SHG4105-18はGCP101と全く同じ変異であり、配列番
号３のプロモーター配列を示した。SHG4105-8 はATG か
ら上流255bp のTはそのままであったが、ATG から上流2
15bp 付近と234bp 付近のGGAGA を介してその間の配列
番号７に示す19塩基の繰り返し配列の挿入が見られた
（配列番号１の塩基番号１３１４（Ａ）と１３１５
（Ｃ）の間に配列番号７を付加した配列番号４に示すプ
ロモーター配列が得られる。）。SHG4105-16はATG から
上流255bpのT はそのままであったが、ATG から上流342
bp 〜780bp の間の439bp の欠失（配列番号１の塩基番
号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ）の欠失）が見られた
（配列番号２) 。

【００４４】実施例６．ＧＣＰ１０１由来のＡＯＸ２プ
ロモーター活性 ＧＣＰ１０１由来ＡＯＸ２プロモーターとＰＣ４１３０
由来ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現するベ
クターを作製し、そのプロモーター活性を確認した。 ｐ
ＰＧＰ１をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡブランティングキ
ット（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこにＥ
ｃｏＲＩリンカーd(pG-G-A-A-T-T-C-C) （宝酒造製）を
ライゲーションした。SphIによる完全な消化及びＥｃｏ
ＲＩによる部分消化を行い、6.5kb 断片を回収・精製し
た。pUC19 をＥｃｏＲＩ及びSphIで消化しアルカリフォ
スファターゼ処理の後、前記断片をライゲーションし、
pUC19にＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現
し、ＨＩＳ４を選択マーカーに持つプラスミドｐＰＧ０
０１を得た（図７参照）。ｐＰＧ００１をＥｃｏＲＩで
部分消化し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造製）
を用いて末端を平滑化した。一方、アプライドバイオシ
ステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを用いてホスホ
アミダイド法によってＧＧＧＡＴＣＣＣの配列を持つＢ
ａｍＨＩリンカーを合成した。これをＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造製）によりリン酸化し、先に平滑
化処理した断片とライゲーションした。ＡｓｕＩＩ及び
ＢａｍＨＩで消化し、7.1kb 断片を精製した。一方、pP
GP1 をHindIII で消化し、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した。そこにBamHI
リンカーd(pG-G-G-A-T-C-C-C) をライゲーションし、As
uII 及びBamHI で消化し、1.9kp 断片を精製した。前出
の7.1kb 断片とライゲーションし、pPG002を得た。 pMM0
30及びpMM034をEaeIで消化し、1.5kb の断片を回収し
た。マングビーンヌクレアーゼ（宝酒造製）処理により
末端を平滑化した。そこにアプライドバイオシステム社
製ＤＮＡ合成機モデル381Aを用いてホスホアミダイド法
にてCTTCGAAGの配列を持つAsuII リンカーを合成した。
これをT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）により
リン酸化し、先に平滑化処理した断片とライゲーション
した。それをEcoRI 及びAsuII で消化し、1.5kb のＡＯ
Ｘ２プロモーター領域断片を回収した。一方、ＡＯＸ１
プロモーター支配下にＨＳＡが発現し、ＨＩＳ４領域を
持つプラスミドｐＰＧ００２をEcoRI 及びAsuII で消化
し、ＡＯＸ１プロモータ ー領域を除いた８．１kb断片を
アルカリフォスファターゼ処理を行った後に回収した。
ＡＯＸ２プロモーター領域1.5 kb断片とライゲーション
し、PC4130由来（天然型）ＡＯＸ２プロモーター支配下
にHSA が発現するプラスミドpMM041、GCP101由来（変異
型）ＡＯＸ２プロモーター支配下にHSA が発現するプラ
スミドpMM042を作製した（図８参照）。 pPG002、pMM04
1、pMM042をHIS4領域に1 ヵ所切断部位が存在する酵素
であるStuIで消化し、線状にした後GTS115に導入した。
これらのプラスミドはGTS115のhis4領域に相同的組み換
えを介して組み込まれる。ピキア酵母の形質転換の方法
は実施例４で行った方法と同じである。形質転換の後、
生じたコロニーはヒスチジン要求性のプレートであるの
で全てが形質転換体と考えられる。３Ｇ１グラスフィル
ターで濾過して寒天を除き、濾液の一部をＹＰＤ培地に
植え３０℃一夜培養した。その培養液をもとに初期濃度
Ａ ₅₄₀ =0.1となるように50ｍＬの各種培地に植えた。24
時間毎に培養液の一部を採取し、培養上清に存在するヒ
ト血清アルブミン濃度をRPHA法(EP 特許第122620号) に
て測定した。その結果、PC4130由来ＡＯＸ２プロモータ
ーではヒト血清アルブミンを産生する活性が低いのに対
し、GCP101由来ＡＯＸ２プロモーターではＡＯＸ１プロ
モーター並のヒト血清アルブミンを産生する活性を示す
ことがわかった。表３に結果を示す。 表３ 培養上清中のＨＳＡ産生量（ｍｇ／Ｌ） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 株 培地 24 48 120 ――――――――――――――――――――――――――――――――――― pPG002/GTS115 2%MeOH-YP 8 30 40 (AOX1 プロモーター) 4%MeOH-YP 2 60 120 pMM041/GTS115 2%MeOH-YP - - 1 (PC4130 由来天然型 4%MeOH-YP - 1 1 AOX2プロモーター) pMM042/GTS115 2%MeOH-YP 8 20 40 (GCP101 由来変異型 4%MeOH-YP 1 60 120 AOX2プロモーター) ―――――――――――――――――――――――――――――――――――-は検出できなかったことを示す。 実施例７．変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いたＨＳＡ
産生株の取得 実施例６のようにｐＭＭ０４２をＳｔｕＩで消化した
後、ＧＴＳ１１５株に導入した。ＧＴＳ１１５株のｈｉ
ｓ４領域と相同的組み換えを介して組み込まれるが、一
度の形質転換の操作で複数コピー組み込まれる場合もあ
る。形質転換の後に生じたコロニーを３Ｇ１グラスフィ
ルターで濾過して寒天を除き、濾液をさらに１００ｃｅ
ｌｌｓ／ｐｌａｔｅになるように滅菌水で希釈してYNB
W/O a.a.プレート（０．７％イーストナイトロジェンベ
ースウイズアウトアミノアシッド、２％グルコース、
１．５％寒天末）に塗布した。３０℃、３日間培養し、
シングルコロニーを生じさせた。 上記クローン１０種類
について、実施例２で行ったように、染色体ＤＮＡを抽
出した。さらに、ピキア染色体ＨＩＳ４領域をプローブ
としたサザン解析（Southern, E.M. J. Mol. Biol., 9
8:503 (1975))を行い、組み込まれたpMM042のコピー数
を決定した。詳細に説明すると、５μｇの染色体ＤＮＡ
をＢｇｌIIで消化した。アガロース電気泳動の後、ゲル
を0.2N HCl溶液で30分処理した。ゲルをアルカリ変成液
（０．２Ｎ ＮａＯＨ、０．６Ｍ ＮａＣｌ）に移し、
３０分反応させた。次にゲルを中和液（０．２Ｍトリス
（ｐＨ７．４）、０．６ＭＮａＣｌ）に移し、３０分
間、２回処理した。常法の通りHybond-N（アマーシャム
社製) にブロッティングした。プローブはピキアHIS4の
KpnI断片(0.6kb) を標識した。プローブの調製、ハイブ
リダイゼーション及び洗浄は、DIG-ELISA 法DNA ラベリ
ング＆ ディテクションキット( ベーリンガーマンハイ
ム山之内社製）を使用し、添付の説明書の通り行った。
ＧＴＳ１１５は図９（ａ）に示すように２．７kbのHIS4
領域を有するため、２．７kbのバンドが出現する。pMM0
42がGTS115のhis4領域に1 コピー組み込まれたならば、
7.8kb と4.5kb のバンドが出現する。pMM042が同じく2
コピー組み込まれたならば、9.6kb と7.8kb と4.5kb の
バンドが出現する。同じく3 コピー組み込まれたなら
ば、7.8kb と4.5kb のバンドと 9.6kb のバンドが2 倍の
濃さで検出される。4 コピーならば3 倍の濃さで検出さ
れる。サザン解析の結果、pMM042がGTS115のhis4領域に
組み込まれたことがわかり、1 コピーから4 コピーまで
のコピー数を持つ株が得られた。その内、1 コピー組み
込まれた株の1 つをUHG42-15、2 コピー組み込まれた株
の1 つをUHG42-3、3 コピー組み込まれた株の1 つをUHG
42-12と名付けた（図９（ｂ）〜（ｄ））。 クローンに
分離した後のHSA 産生能を測定した。UHG42-15、UHG42-
3 、UHG42-12についてYPD 培地に植え、30℃一夜培養し
た。その培養液をもとに初期濃度OD ₅₄₀ =1になるように
50ｍＬの2% MeOH-YP培地に植えた。24時間毎に培養液の
一部を採取し、培養上清に存在するヒト血清アルブミン
濃度をRPHA法(EP 特許第122620号）にて測定した。その
結果、表４のように最高でＵＨＧ４２−１５では８０ｍ
ｇ／Ｌ、ＵＨＧ４２−３では１００ｍｇ／Ｌ、ＵＨＧ４
２−１２では１６０ｍｇ／ＬのＨＳＡ産生量を示し、ク
ローン化することにより産生量の高い株が得られ、ま
た、コピー数の増加に伴い産生量も増加した。ＧＣＰ１
０１由来（変異型）ＡＯＸ２プロモーターを用いてＨＳ
Ａを発現させるプラスミドｐＭＭ０４２を用いて、ＨＳ
Ａを高産生する株が取得できた。 表４ クローンの培養上清中のＨＳＡ産生量（ｍｇ／Ｌ） ――――――――――――――――――――――――――――――――――― 培養時間（時間) 株 ２４ ４８ ７２ ――――――――――――――――――――――――――――――――――― ＵＨＧ４２−１５ １５ ８０ ８０ （１コピー） ＵＨＧ４２−３ ３０ １００ １００ （２コピー） ＵＨＧ４２−１２ ４０ １６０ １６０ （３コピー） ―――――――――――――――――――――――――――――――――――２％ＭｅＯＨ−ＹＰ培地、３０℃で培養した。 実施例８：変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡ
を発現するプラスミドベクターの構築 実施例５で得られた３タイプ（配列表の配列番号２〜
４）の変異型ＡＯＸ２プロモーター支配下でＨＳＡを発
現するベクターの構築を行った。 まず、実施例５におい
て得られる、各種の変異型ＡＯＸ２プロモーター領域の
ＤＮＡが挿入されたプラスミドベクターｐＵＣ１９をそ
れぞれＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡブランティングキッ
ト（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した。そこにＥ
ｃｏＲＩリンカーd(pG-G-A-A-T-T-C-C) （宝酒造社製）
をライゲーションした。その後、ＳｓｐＩによる完全消
化及びＥｃｏＲＩによる部分消化を行い、１．５ｋｂ断
片を回収、精製した。 一方、実施例６で得られた、天然
型ＡＯＸ２プロモーターの支配下でＨＳＡを発現させ、
選択マーカーとしてＨＩＳ４をもつプラスミドｐＭＭ０
４１のプロモーター部位を同様にＳｓｐＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化しアルカリフォスファターゼ処理をした。その
切断部位に先の各種変異型ＡＯＸ２プロモーターＤＮＡ
断片（ＳｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ）をそれぞれライゲーショ
ンして組み入れ、天然型ＡＯＸ２プロモーター（配列表
の配列番号１）の塩基番号７２６より下流域の塩基配列
を有する組換え発現ベクターｐＨＯ０６０、塩基番号７
２６より下流域の塩基配列を有しかつ塩基番号１２７４
のＴがＣに置換してなる変異型ＡＯＸ２プロモーターを
含有する組換え発現ベクターｐＨＯ０５９、塩基番号７
２６より下流域の塩基配列を有しかつ塩基番号１３１４
（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号７を付加してな
る変異型ＡＯＸ２プロモーターを含有する組換え発現ベ
クターｐＨＯ０６１、塩基番号７２６より下流域の塩基
配列を有しかつ塩基番号７４９（Ｃ）〜１１８７（Ｔ）
が欠失してなる変異型ＡＯＸ２プロモーターを含有する
組換え発現ベクターｐＨＯ０６２を構築した（図１０参
照）。 実施例９：変異型ＡＯＸ２プロモーターの活性比較 実施例６のようにｐＨＯ０５９、ｐＨＯ０６０、ｐＨＯ
０６１、ｐＨＯ０６２をそれぞれＧＴＳ１１５株に導入
し、これらのベクターが１コピー組み込まれた形質転換
体を選択し、それらの株のプロモーター活性をそのＨＳ
Ａ産生量から比較検討した。 各１コピー形質転換体をＹ
ＰＭ培地で７２時間培養した後、培地上清中のＨＳＡ産
生量（ＲＰＨＡ法使用）を測定した。また同様に追試を
行い、得られた培地上清中のＨＳＡ産生量を別の方法で
あるマンシニ（Ｍａｎｃｉｎｉ）法にて測定した。結果
を図１１に示す。

【発明の効果】本発明によれば、容易にかつ比較的温和
な条件でＡＯＸ２プロモーター領域にのみ変異を起こす
ことができる。こうして得られた変異型ＡＯＸ２プロモ
ーターは強力なプロモーター活性を有する。また、本発
明の変異菌株はメタノール含有培地中で良好な増殖を有
しており、メタノール含有培地中で高レベルで異種蛋白
質を産生することができる。

【００４５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 配列番号：２ 配列の長さ：１０８９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AAGATGAGCT ATTTTTGTCG CATAAATTTT 780 TGTCTCGGAG TGAAAACCCC TTTTATGTGA ACAGATTACA GAAGCGTCCT ACCCTTCACC 840 GGTTGAGATG GGGAGAAAAT TAAGCGATGA GGAGACGATT ATTGGTATAA AAGAAGCAAC 900 CAAAATCCCT TATTGTCCTT TTCTGATCAG CATCAAAGAA TATTGTCTTA AAACGGGCTT 960 TTAACTACAT TGTTCTTACA CATTGCAAAC CTCTTCCTTC TATTTCGGAT CAACTGTATT 1020 GACTACATTG ATCTTTTTTA ACGAAGTTTA CGACTTACTA AATCCCCACA AACAAATCAA 1080 CTGAGAAAA 1089 配列番号：３ 配列の長さ：１５２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCCTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 配列番号：４ 配列の長さ：１５４７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGAAAATTA 1320 AGCGATGAGG AGACGATTAT TGGTATAAAA GAAGCAACCA AAATCCCTTA TTGTCCTTTT 1380 CTGATCAGCA TCAAAGAATA TTGTCTTAAA ACGGGCTTTT AACTACATTG TTCTTACACA 1440 TTGCAAACCT CTTCCTTCTA TTTCGGATCA ACTGTATTGA CTACATTGAT CTTTTTTAAC 1500 GAAGTTTACG ACTTACTAAA TCCCCACAAA CAAATCAACT GAGAAAA 1547 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer bind 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGAATTCGACAATATTCTTTGATGC 26 配列番号：６ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：primer bind 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGGATCCACTAAGCGAGTCATCATC 26 配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 付加ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：insertion seq 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AAATTAAGCGATGAGGAGA 19

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣ４１３０の構築手順およびＧＣＰ１０１の
取得方法を説明する図である。

【図２】ＡＯＸ２遺伝子付近の制限酵素地図を示す図で
ある。尚、かっこ内の数字は、XbaIを０とした時の距離
（×１００塩基）を示す。

【図３】ＡＯＸ２プロモーターをクローニングしたプラ
スミドｐＭＭ０３０またはｐＭＭ０３４およびその制限
酵素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃ
ｏＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図４】ＡＯＸ２構造遺伝子をクローニングしたプラス
ミドｐＭＭ０３１またはｐＭＭ０３５およびその制限酵
素地図を示す図である。尚、かっこ内の数字は、Ｅｃｏ
ＲＩを０とした時の距離（×１００塩基）を示す。

【図５】ＡＯＸ２プロモーターの配列を変換するための
組み込み型ベクターｐＹＩ０６６またはｐＹＩ０６６の
構築を説明する図である。

【図６】変異型ＡＯＸ２プロモーターを有する各株の取
得過程を示す図である。ロ

【図７】ｐＰＧ００１の構築を説明する図である。

【図８】ＡＯＸ２プロモーター支配下にＨＳＡが発現す
るプラスミドｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４２の構築を説明
する図である。

【図９】実施例７を説明する図である。

【図１０】実施例８の各種変異型ＡＯＸ２プロモーター
を含有する組換えベクターの構築を説明する図である。
尚、比較のためあわせてｐＭＭ０４１、ｐＭＭ０４２も
示した。

【図１１】実施例９の結果を示すグラフであり、縦軸に
ＨＳＡ産生量、横軸に各種形質転換体を示した。なお、
４１−３は、ｐＭＭ０４１形質転換体、４２−５は、ｐ
ＭＭ０４２形質転換体、６０−４はｐＨＯ０６０形質転
換体、５９−３はｐＨＯ０５９形質転換体、６１−３は
ｐＨＯ０６１形質転換体、６２−４はｐＨＯ０６２形質
転換体を培養して７２時間目のＨＳＡ産生量を示す。 換

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 村上 弘次 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 中川 幸光 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−53489（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−501827（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表記載の配列番号１の天然型ＡＯＸ
   ２プロモーターの塩基配列の一部を欠失、置換または新
   たな塩基配列を付加してなる変異型ＡＯＸプロモーター
   において、少なくとも、配列番号１の塩基番号７４９
   （Ｃ）〜１１８７（Ｔ）を欠失、配列番号１の塩基番号
   １２７４（Ｔ）を（Ｃ）に置換、または配列番号１の塩
   基番号１３１４（Ａ）と１３１５（Ｃ）の間に配列番号
   ７を付加してなり、かつ配列表記載の配列番号２、３ま
   たは４に示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーターの
   プロモーター活性と同等のプロモーター活性を有するこ
   とを特徴とする変異型ＡＯＸ２プロモーター。
2. 【請求項２】 配列表記載の配列番号２、３または４に
   示す配列である変異型ＡＯＸ２プロモーター。
3. 【請求項３】 染色体上において請求項１または２記載
   の変異型ＡＯＸ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子
   を担持してなる菌株。
4. 【請求項４】 染色体上においてＡＯＸ１プロモーター
   の支配下でＡＯＸ１遺伝子によるＡＯＸ産生がなく、天
   然型ＡＯＸ２プロモーターの支配下にＡＯＸ遺伝子を担
   持してなる菌株をメタノール含有培地中で培養し、天然
   型ＡＯＸ２プロモーターに変異を起こさせることを特徴
   とする請求項３記載の菌株の取得方法。
5. 【請求項５】 請求項３記載の菌株に発現可能な異種蛋
   白質遺伝子を組み込んでなる該菌株を培養することを特
   徴とする異種蛋白質の製造方法。