JPH03262487A - ヒト血清アルブミンの安定な製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は成熟ヒト血清アルブミンの酵母による製造方法
、及びそのための遺伝子発現系に関する。

この方法によればヒト血清アルブミンｃＤＮＡが発現可
能な形で宿主染色体中に組み込まれるため、プラスミド
上に存在する場合に比べはるかに安定に宿主細胞内に保
持され、長時間培養や高密度培養による安定なヒト血清
アルブミンの工業的製造に極めて適している。またヒト
血清アルブミン遺伝子産物である成熟型のヒト血清アル
ブミンは、細胞外に効率よく分泌されるので、その回収
・精製が簡単であり、工業的製造のためにきわめて好ま
しい。

〔従来の技術〕

従来、ヒトの血液に依存せずにヒト血清アルブミンを製
造する方法としては、自律複製することのできるプラス
ミド上にヒト血清アルブミンｃＤＮＡを挿入し、これに
適当な発現調節シグナル（プロモーター、ターミネータ
−１等〉を隣接させた発現プラスミドを適当な宿主細胞
内に導入して、これを発現させるという方法がとられて
きた。この方法によれば、コピー数の多いプラスミドを
用いた場合、遺伝子量効果により高度の発現が見られる
という利点がある。しかし一方では、宿主染色体外複製
を行うプラスミドは、−１に細胞の増殖にともなって、
不均一な分離を受け、増殖の回数と共に、プラスミドの
脱落が見られるという欠点がある。従って、目的とする
蛋白質、ここではヒト血清アルブミンを得ようとする場
合、形質転換細胞の増殖と共にプラスミドを持たない、
即ち、ヒト血清アルブミンを産生できない細胞の比率が
高まることになる。このことは特に形質転換細胞を高度
に増殖させる必要がある高密度培養や連続培養などにお
いてきわめて重要Ｉ：問題となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

形質転換細胞を高度に増殖させる必要がある高密度培養
や連続培養などにおいて安定なヒト血清アルブミン産生
をはかるために、該蛋白質遺伝子（ｃＤＮＡ）を宿主細
胞内に安定に保持することが必要である。

目的とする蛋白質を産生ずるための遺伝子が宿主細胞の
増殖と共に脱落するという問題を解決する方法の一つは
、発現プラスミドの安定化をはかる方法であり、酵母菌
のプラスミドの場合は、酵母染色体由来の複製起点及び
セントロメアを同じＤＮＡ分子上に持つＹＣｐ型のプラ
スミドがこの目的のために利用され、非常に安定に酵母
細胞により保持されることが知られている。しかし、Ｙ
Ｃｐ型のプラスミドは、細胞内に多数コピーとしては存
在できず、普通、−個の半数体酵母細胞当り１コピーし
か存在しない。また、プラスミド上で同じ遺伝子配列を
タンデムに（数珠つなぎに）並べて、目的とする遺伝子
のコピー数を高めようとしても、そのプラスミドが導入
された細胞内で、プラスミド同士の間で組換えを起こし
、遺伝子の喪失が起きたり、欠失、挿入、そのほかの変
異も導入されることが報告されており、宿主細胞内で安
定に複数コピーの外来遺伝子をプラスミド上に保持する
ことは困難である。また、プラスミド上で外来遺伝子を
発現させる場合、強力なプロモーターを使用すると、用
いた発現プラスミドそのものが不安定となり、形質転換
体が得られなくなったり、脱落の頻度が高まるといった
現象がみられる。

〔課題を解決するための手段〕

従って本発明は、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝
子を宿主細胞の染色体に組込むことにより該遺伝子の安
定な維持を達成する。このため、酵母染色体上に存在す
るＤＮＡ配列と相同的なりＮＡ配列を持つプラスミドベ
クターに組み込ませるべき遺伝子をその相同ＤＮＡ配列
と隣接させる形で挿入し、構築された組換えプラスミド
（組込みのためのプラスミド）（環状または相同ＤＮＡ
内もしくはその近辺で切断をいれ線状化したもの）を宿
主細胞内に導入して形質転換体を得る。これにより高い
確率で染色体上のＤ　Ｎ　Ａ配列がプラスミド上の相同
的なりＮＡ配列で置き換わった形質転換体が得られる。

〔具体的な記載〕

１．遺伝子系 宿主 正常ヒト血清アルブミンは分子内に多くのジスルフィド
結合を含有しており、組換えＤＮＡ法によって天然物と
同じ立体構造を有する正常ヒト血清アルブミンを製造す
るには、これらのジスルフィド結合が生産宿主細胞中で
正しく形成されることが必須である。正常な立体構造の
形成にはプロティンジスルフィドイソメラーゼ、ペプチ
ジルプロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ等の酵素
が関与していることが最近明らかになり、多数のＳ−３
結合を有し複雑な立体構造をとる蛋白質を殆ど含まない
大腸菌や枯草菌のような原核生物細胞ではたとえあって
もこのような立体構造形成（フォールディング）関連酵
素系の働きは強くないことが予想される。一方、ヒトを
はじめとする真核高等生物の細胞は数多くの複雑な高次
構造を有する蛋白質（糖蛋白質や他の修飾蛋白質も含む
）を細胞外に分泌することが知られているが、下等真核
微生物である酵母菌でも、哺乳動物の細胞で蛋白質が分
泌されるのと非常によく似た経路により蛋白質が分泌さ
れることが知られている［Ｈｕｆｆａｋｅｒ、　Ｔ、Ｃ
。

ａｎｄ　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　Ｐ、　Ｗ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、　２５７．３２０３−３２１０（１９８
２）　；　５ｎｉｄｅｒ、Ｍ、　Ｄ、　ｉｎ　Ｇｉｎｓ
ｂｕｒｇ、　Ｖ、　＆　Ｒｏｂｂｉｎｓ。

Ｐ、Ｗ、　（ｅｄｓ、）　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、Ｖｏｌ、２゜Ｗｉｌｅｙ、　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９８４）、　ｐｐ、　１６３
−１９８〕、このため、本発明においては、酵母を宿主
として使用する。

組込みのためのプラスミドの構成要素 酵母染色体への組み込みのためのプラスミドとしては、
以下のような構成要素が必要となる。

１）発現可能な形となったヒト血清アルブミンｃＤＮＡ
、　２）プロモーター、ポリＡ付加シグナルなどのヒト
血清アルブミンｃＤＮＡを発現可能とさせるための転写
制御配列、３）酵母染色体中への組み込みのための酵母
染色体ＤＮＡ　（標的領域）と相同的な配列を有するＤ
ＮＡ　（遺伝子）で、望ましくは、形質転換効率を高め
るために上記相同的なりＮＡ配列の中に適当な制限酵素
で切断可能な認識配列を有するもの、４）望ましくは、
プラスミドＤＮＡの増幅が容易な大腸菌のような宿主細
胞で機能する複製起点と標識遺伝子、並びに５）好まし
くは、形質転換された宿主の選択のための標識遺伝子。

本発明ではこのような複製起点と標識遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を大腸菌組換えプラスミドｐＡ７１５３（Ｔｗｉ
ｇｇ、Ａ、Ｊ、＆　５ｈｅｒｒａｔｔ、Ｄ、、Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８３゜２１６−２１８．１９８０）から切り出
して使用した。この場合の標識遺伝子はトランスボゾン
Ｔｎ３由来のβ−ラククマーゼ遺伝子で形質転換細胞（
この場合大腸菌細胞）に抗生物質であるアンピシリンに
対する耐性を賦与する。

プレプロ配列 ヒト血清アルブミンは哺乳類の肝臓細胞ではプレプロ配
列をアミノ末端に有する前駆体蛋白質として合成され、
成熟ヒト血清アルブミンを効率よく分泌せしめるために
、このプレプロ配列が存在している必要がある。また、
このプレプロ配列は目的蛋白質の分泌の際に切除されて
該目的蛋白質が成熟型で分泌される必要があり、同じ真
核生物細胞である酵母菌を宿主として用いた場合も同様
の現象が起こることが期待される。このため本発明にお
いては、この様な条件を満たすプレプロ配列としてヒト
血清アルブミンの本来のプレプロ配列を使用する。そし
て、本発明においては、この様なプレプロ配列をコード
する遺伝子として、ヒト血清アルブミンをコードするｃ
ＤＮＡに本来リンクしているｃＤＮＡを使用する。この
ｃＤＮＡは次の配列を有する。

ヒト血清アルブミンＡをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）
はすでにクローン化されており、その塩基配列及び該塩
基配列から推定されるアミノ酸配列を第４図に示し、そ
のクローニング方法は特願昭６３−０３７４５３　（特
開平１−２１５２８９）に詳細に記載されている。従っ
て本発明においては、このｃＤＮＡを含有するプラスミ
ドｐ［ｌｃ　−Ｈ３Ａ　−［：Ｈ等をヒト血清アルブミ
ンＡをコードする遺伝子の供給源として使用することが
できる。

ポ＋Ｊ　Ａ配列及びＡＡＴＡ＾＾シグナルコード配列の
３′−末端の下流に存在するポリＡ配列及びＡＡＴ＾＾
＾シグナルが真核生物のｍＲＮＡの安定性に寄与すると
言われている［Ｂｅｒｇｍａｎｎ及びＢｒａｗｅｒｍａ
ｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６．２５９−２６
４（１９７７）　；Ｈｕｅｚら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８．９０８−９
１１（１９８１）〕。従って、本発明の好ましい態様に
おいては、ヒト血清アルブミンＡをコードするｃＤＮＡ
の下流にこれらの配列を配置する。ポリＡ配列及び＾＾
ＴＡＡ＾シグナルとしては、例えばヒト血清アルブミン
ＡｃＤＮＡに自然に付随しているこれらの配列を使用す
ることができる。これらの配列を含有するヒト血清アル
ブミンＡ遺伝子はすでにクローン化されており、特願昭
６３−０３７４５３　（特開平１−２１５２８９）に記
載されている。

プロモーター 本発明においては、酵母細胞中で機能するものであれば
いずれのプロモーターを使用することもできる。しかし
ながら本発明においては誘導可能なプロモーターではな
く構成的プロモーターを使用するのが好ましい。誘導可
能なプロモーターを使用して誘導操作を行った場合には
ヒト血清アルブミンが細胞内に急激に蓄積し、分子間ジ
スルフィド結合が形成されて非天然型の立体構造を有す
る分子が生成する可能性があるからである。

弱い誘発性を示すか又は構成性の酵母プロモーターの内
、強力な活性を持つものとしては、例えハ、アルコール
デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ　）プロモーター、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）
プロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧ
Ｋ）プロモーターがあり、本発明においては、ＡＤＨＩ
プロモーターを例にとって具体的に説明する。

酵母＾叶Ｉ遺伝子（ＡＤＣＩ）を含む約２．１００塩基
対の領域の塩基配列が既に決定されており、ＡＤＨＩを
コードする約１，１００塩基対の配列の他に７５０塩基
対の５′側非翻訳配列と３２０塩基対の３′側非翻訳配
列が判明している（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、　Ｊおよび）
ｔａｌｌ、　Ｂｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７．３０
１８−３０２５（１９ｇ２）　〕。

転写においてＲＮＡポリメラーゼによる認識配列と考え
られているＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックス
（ＴＡＴＡボックス）は翻訳開始コドンＡＴＧの１２８
塩基上流（−１２８の位置）にあり、ＡＤＩ（Ｉプロモ
ーター活性は−４１０の位置にあるＳｐｈ　Ｉ　Ｈ１ｍ
部位より上流を欠失させても失われないといわれている
［：Ｂｅ１ｅｒ。

Ｄ、及びＹｏｕｎｇ、　Ｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３００
．７２４−７２８　（１９８２）　］。

八へＨＩプロモーターによる転写物は通常の酵母菌で全
ボ’Ｊ　　（Ａ）ＲＮＡの少な（とも１％に達する［：
Ａｍｍｅｒｅｒ、　ＧｌＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、　１０１．１９２−２０１　（１９８３）　Ｅ標的
領域 ヒト血清アルブミン遺伝子を組込むための酵母染色体上
の標的領域としては、例えば酵母イソプロピルリンゴ酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＥｔ１２）領域、酵母ヒス
チジン合成系酵素（ホスホリボシル−ＡＭＰシクロヒド
ロラーゼ、ＨｒＳ４Ａ　；ホスホリボシル−ＡＴＰピロ
ホスホヒドロラーゼ、旧５４Ｂ；ヒスチジノールデヒド
ロゲナーゼ、旧５４Ｃ）遺伝子（ＨＩＳ４）が挙げられ
る。

標識遺伝子 ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを宿主染色体中の適当な位
置に組み込み、得られた組み込み酵母株を選択する必要
があるが、この際には適当な標識を利用すると便利であ
る。組み込ませるべきヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含
む発現カセットに隣接させるＤＮＡ配列と、それと相同
的な配列を有する酵母染色体上のＤＮＡ領域の間の配列
相同性を利用して組み込みを起こさせるわけであるから
、これら相同的なりＮＡ配列の発現により示される宿主
細胞の表現型の変化を指標にして効率よく形質転換体（
組み込み体）を選択することができる。または、これと
は別の標識遺伝子をこの発現カセットと酵母相同ＤＮＡ
配列に連結させてもよい。例えば、宿主細胞がある栄養
要求性を示している場合、その要求性の原因となってい
る変異を起こした遺伝子を標的ＤＮＡ配列として利用し
、それと相同的なりＮＡ配列−但し変異を起こしていな
い野生型の遺伝子−を組み込ませるべきＤＮＡとして利
用すると、その栄養要求性を示さなくなった細胞株を選
択すれば、目的とするヒト血清アルブミンｃＤＮＡが紐
み込まれたＨ胞株である可能性がきわめて高いことにな
る。このような標；１ｉｋＤＮＡ配列（遺伝子）として
は、栄養要求性に関するものだけでなく、ある特定の遺
伝子の変異により選別可能な表現型を示すようなもので
あれば何でも利用できる。これらの表現型としては例え
ば、薬剤感受性、温度感受性、形態変化、糖などの資化
能、特定の酵素やタンパク質の分泌、二次代謝産物の合
成、特定の基質に対する分解能、等が含まれる。

標識遺伝子として酵母のイソプロピルリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（ＬＥＵ２）またはヒスチジン合成系酵
素遺伝子（ＨＩＳ４）を利用した例を実施例に記載する
。

２、形質転換 本発明のプラスミドによる宿主酵母の形質転換は常法に
従って行うことができ、その具体例を実施例２に記載す
る。

３、形質転換酵母菌の培養及びヒト血清アルブミンの回
収 ヒト血清アルブミンｃＤＮＡを含んだ組込み用線状プラ
スミドにより形質転換された宿主酵母菌は通常の酵母の
培養法により培養できる。たとえばＹＰＤのような天然
完全培地やＳＤ培地に１％の酵母エキスを加えたような
不完全合成培地でも培養できる。

培養後細胞外に分泌されたヒト血清アルブミンの回収は
種々の方法で可能である。エタノーノベアセトン、硫酸
アンモニウムなどによる分別沈澱、等電点沈澱、限外ろ
過などによる濃縮及び部分精製を行った後に各種クロマ
トグラフィーや上記部分精製法を組み合わせれば高度に
分泌ヒト血清アルブミンが精製されることが期待できる
。

４、　発明の効果 ヒト血清アルブミンコーディング配列の５′末端側に強
力なプロモーターを、また３′末端側にヒト血清アルブ
ミンｃＤＮＡのポリＡ付加シグナルを連結させた発現カ
セットを酵母相同ＤＮＡ配列（場合によっては他の標識
遺伝子を含む）と隣接させたＤＮＡ配列を含む線状化プ
ラスミドで酵母を形質転換することにより、ヒト血清ア
ルブミンＣＯ〜Ａが酵母染色体中に発現可能な形で安定
に保持された細胞株を得ることができる。この形質転換
株は長時間培養及び高密度培養に適している。この形質
転換株は長時間培養によってもヒト血清アルブミンｃＤ
ＮＡを失うことはほとんどないので、これを培養するこ
とにより安定にヒト血清アルブミンを製造することがで
きる。ヒト血清アルブミンｃＤＮＡとして、リーダー配
列を持ったプレプロヒト血清アルブミンｃＤＮＡを用い
ているために、形質転換細胞の染色体上で発現されたヒ
ト血清アルブミンｃＤＮＡの遺伝情報に基づいて合成さ
れたヒト血清アルブミン前駆体からリーダー配列がプロ
センングを受けて除去された成熟ヒト血清アルブミンが
細胞外に分泌され、これは容易に回収される。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。以下の実施例において、特にことわらない限り、酵
素反応は次の条件下で行った。

バクテリアアルカリ性ホスファターゼ処理：ＤＮＡ　１
　ｗ：、制限酵、１ＥｃｏＲＩ及び）ｌｉｎｄＩＩＩ各
々１１及びＩＯＸ　ＥｃｏＲＩ緩衝液２ｕ１に滅菌蒸留
水を加えて２０１とし、３７℃で１時間保温した後、９
０℃、５分間加熱して酵素を失活させる。次に滅菌蒸留
水３８１１１、バクテリアアルカリ性ホスファターゼ２
Ｉｌ！（宝酒造０．５ユニツト／Ｉｌりを加えて３７℃
、１時間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた
水層をエタノール沈殿に用いる。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理：たとえばベクターＤＮＡ　
１犀、ベクターＤＮＡと等モル量のＤＮＡフラグメント
、ＩＯＸリガーゼ緩衡液［６６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）、６６ｍＭ　ＭｇＣ１□、１０ｈ＋Ｍ
ジチオスライトール、１ｍＭ　ＡＴＰ）　３ｄ及びＴ４
　ＤＮＡリガーゼ１パ（宝酒造、約４００ユニツト／ｄ
＞に滅菌蒸留水を加えて３０１１１とし１６℃で一晩保
温する。

大腸菌ＤＮＡポリポリーゼ１反応：　ＯＮＡ　ｌ　ｌ１
ｇ。

ＤＮＡポリポリーゼＩ　　（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント
、宝酒造３．５ユニツト／１ｔｌ）　　１　ｕｌＳ１＋
ｎＭ　ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ＴＴＰの混合物）１ｕ１及び
１０Ｘ緩衝液［７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７
，５）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　２００ｍＭＮａＣ１
，７０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ：］　３ｕｌに滅菌蒸留水を加
えて全量を３０４とし、３７℃で３０分間保温する。

ハイブリダイゼーション： ＤＮＡを固定した膜をノ＼イブリダイゼーション液Ｃ６
Ｘ５ＳＣ（Ｉ　Ｘ５ＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）、５×デン
ハート液（０，１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィ
コール、０．１％ポリビニルピロリドン）、０．５％Ｓ
Ｏ３、５０，ｇ変性サケ精子ＤＮＡ〕１０ｒｎｆ！中で
、４２℃、３時間保温する。液を捨て、プローブを１　
ｘｌｏ’ｃｐｍ／−加えたハイブリダイゼーション液１
ｈｔｌ！を加え、８０℃、３分保温する。次に、４２℃
で一夜保温する。液を捨て、膜を２　Ｘ５ＳＣにより室
温で５分洗い、さらに２　Ｘ５ＳＣにより６０℃で３０
分洗う。

なお、酵素反応によりプラスミドを作製する場合には、
その酵素反応混合物を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩを常法に
従って形質転換し、大腸菌標識遺伝子に依存して適切な
常法により形質転換体を選択し、目的とするプラスミド
を含有するクローンを例えばミニプレバレージョン法に
より形質転換体から抽出したＤＮＡを種々の制限酵素で
切断して電気泳動法により分析する方法（たとえばＭａ
ｎｉａｔｉｓ。

Ｔ　Ｆｒ１ｒｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、　＆　Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ＋ｎｇＡ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　１９８２＞により選択した。そして選択
されたクローンを培養し、菌体から常法に従ってプラス
ミドＤＮＡを抽出することにより、所望の組換えプラス
ミドを増幅・回収した。この方法は組換え操作の各段階
により必要に応じて行った。

実施例１．酵母旧Ｓ４遺伝子のクローニング酵母ＨＩＳ
４遺伝子を含むクローンを得るため、米国ＣＬＯＮＴＥ
Ｃ社のλｇｔｌｌをベクターとして作成された酵母染色
体ＤＮＡライブラリーを用いた。λｇｔ１１組換え体フ
ァージ１×１０５個を大腸菌Ｙ１０９０株の一晩培養液
〔ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０
．５％ＮａＣ１）　＋　Ｑ、　２％マルトース〕５０１
１１に加え、３７℃で２０分インキュベートさせた後、
３ｒｎｌのＬ−Ｔｏｐ−Ａｇａｒｏｓｅ　（Ｌ　Ｂ培地
↓０．７％アガロース）と共に直径９０ｍｍのＬ−プレ
ート（ＬＢ培培地上１５％寒天）１０枚にまいた。

これらのプレートを３７℃で一晩培養し、プラークを形
成させた後、４℃に１時間置いた。組換え体ファージを
メンブレンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｈｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ）　　に移し、その７　イ）’ｖツタ−Ｑ、５
Ｎ　ＮａＯＨ。

ＩＭ　ＮａＣ１を浸した３ＭＭ０紙（Ｗｈａｔｍａｎ社
）上に５分間置き、さらに０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　（ｐＨ７，２）、１．５Ｍ　ＮａＣｌを浸した口紙上
に５分静置した。フィルターを２　ｘＳＳＣ（２０ｘＳ
ＳＣは、３Ｍ　Ｎａ（：ｌ、　０．３Ｍクエン酸三ナト
リウム）溶液で洗い、風乾させた後、サランラップで包
み、ＵＶ照射することによりファージＤＮＡをフィルタ
ーに固定した。そのフィルターを用いてプラークハイブ
リダイゼーション〔Ｂｅｎｔｏｎ＆　Ｄａｖｉｓ　５ｃ
ｉｅｎｃｅ　１９６．１８０〜１８２（１９７７）　〕
を行うことにより酵母ＨＩＳ４遺伝子クローンをスクリ
ーニングした。用いたプローブは酵母旧Ｓ４遺伝子［Ｄ
ｏｎａｈｕｅ、　Ｔ、Ｆ、、Ｆａｒａｂａｕｇｈ、　Ｐ
、Ｊ、　＆　Ｆｉｎｋ、Ｇ、ＲＧｅｎｅ、　１８．４７
〜５９　（１９８２）　）の塩基配列の３９４から４３
２番目に対応するＤＮＡ配列５　’　−ＡＡＧ　ＧＡＴ
　ＡＴＧＴＴＧ　ＡＣＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴ
Ｔ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　−３’で、Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓら［Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　ｉＬ　Ｄ、
　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｍ、　ＨｌＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　
２１．７１９　（１９８０）　）により開発されたホス
ホアミダイト法を応用した自動ＤＮＡ合或合成Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）を用い
て合成した。

合成Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖（２１ｐｍｏｌｅｓ）　　を５Ｑｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７、６）　１０ｍＭ　Ｒ
１ｇＣ１２，５ｍＭジチオスライトール、１００μＣｉ
　Ｃｒ　−”　ｐ：］　ＡＴＰ（３０００［：ｉ／ｍｍ
ｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）及び１ｚ単位のＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（宝酒造）を含有する溶液５０ｕ１
中で、３７℃６０分処理することにより、５′端をリン
酸化標識した。

６ＸＳＳＣ１５ｘデンハルト溶液（１００Ｘデンノスル
ト溶液は２％ウシ血清アルブミン、２％フィコール、２
％ポリビニルピロリドン）、０．５％ＳＤＳ　、　５０
Ｊ！ｇ／ｍｊ２の超音波処理したサケ精子ＤＮＡ及びｌ
Ｑ６ｃｐｍ／−プローブＤＮＡ　（比活性≧１０’ｃｐ
ｍ／ｉ）を含む溶液を用い、３７℃１６時間フィルター
のハイブリダイゼーションを行った。そのフィルターを
２×ＳＳＣ３７℃で洗浄し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ
社、ＭＡＲ−５）に−７０℃で１０時間露光させた。

現像後、陽性のシグナルを与えたプラーク１個をパスツ
ールピペットの先でかきとり、１００ｕ１のＴＭ液〔ｌ
ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
　ＭｇＣｌ２〕に！ｖｉ濁し、室温に２０分間静置させ
た。懸濁液０．５μを１−のＴＭ液で希釈し、そのうち
５バを前述した方法で大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ、
Ｌ−プレート上にまき、プラークを形成させた。形成さ
れたプラークは再度上記のようにプラークハイブリダイ
ゼーションを行い単一プラークからなるポジティブクロ
ーンを得た。ポジティブプラークをパスツールピペット
の先でかきとり、５０１！！のＹ１０９０細胞に加えて
、３７℃で２０分間静置した後、ｌＱｍＭ　ＭｇＳＯ４
を含む２−のＬＢ培地に加え、３７℃で６時間振とう培
養した。クロロホルムを１００ｕ！加え、ポルテックス
ミキサーにかけて完全に溶菌させ、５０００ｒｐｍで５
分遠心し、上清を得た。この上清中に１０１０オーダー
のファージが含まれていた。

この上清８００１に１００ｄの５Ｍ　ＮａＣｌを加え、
次に５４０１１１のインプロパツールを加えてよくまぜ
、−２０℃で２０分間静置した。１５Ｋ　ｒｐｍ　５分
間遠心し、得た沈澱を５００ｔｔ！の７０％エタノール
で洗い、２００１のＴＥ溶液Ｃｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（Ｉ］Ｈ８，Ｏ）、１ｍＭＥＤＴＡ〕に溶解させ
た。ｌｄ　（６０ｕｎｉｔ／ＩＬｌ）のＤ〜ａｓｅ■　
（宝酒造）と２ｕ１のＬＭ　ＭｇＣ１ｚを加え、３７℃
、３０分反応させ、１００　ｄのＴＥ飽和フェノールを
加え、ポルテックスミキサーで処理した。１２Ｋ　ｒｐ
ｍ　５分遠心し、水層をさらにフェノール／クロロホル
ム（１：　１）で−回抽出し、得られた水層に２０ｄの
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２＞を５００ｄのエタノ
ールを加え、遠心してＤＮＡを沈澱させた。その沈澱を
７０％エタノールで洗った後、減圧乾燥させ、５０１１
１のＴＥに溶解した。この操作でＩＫ相当のファージＤ
ＮＡが得られた。

得られた溶液２０ｄに、２．５ＡＩＩの１０倍濃度Ｅｃ
ｏＲｉ緩衝液（：０．５Ｍ　ＮａＣ１、ＩＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、７０　ｍ　ＭＭｇＣＩｚ）を
加え、ｌＩｔ！（２０単位）のＥｃｏＲＩにッポンジー
ン〉と１バの１０ｍｇ／ｍｆのＲＮａｓｅＡ　（Ｓｉｇ
ｍａ社）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応後０
．７％アガロース電気泳動を行い。サチンプロット法［
５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅｌ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８，５
０３〜５１７（１９７５）　〕に従って、ＤＮＡバンド
をＨｙｂｏｎｃｌ−Ｎフィルターにブロッティングさせ
た。ＤＮＡの結合したフィルターを用いて前述のプラー
クハイブリダイゼーションと同一の条件でハイブリダイ
ゼーションを行った。こうして得られたクローンはプロ
ーブＤＮＡとハイブリダイズする約３．２ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片を有し、アガロースゲル中で分離したこの断片
をグラスハウグー法（Ｇｅｎｅ　ＣＩｅａｎ”、Ｂｌｏ
−１０１社）によりアガロースゲルから分離・精製し、
ｐＵｃ１９ベクターにサブクローニングした。

すなわち、ＥＣＯＲＩで消化したｐＵｃ１９ベクター（
３０ｎｇ）　と回収された３、　２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断
片（２０ｎｇ）とを２．８単位のＴ４　　Ｄｌ’ｌＡ　
　！Ｊガーゼ（宝酒造）を含む計３０ハの反応溶液Ｃ６
６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）、６，６ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭジチオスライトール、１ｍＭ
　ＡＴＰ）中で１６℃、４時間処理し、両者が連結した
組換えプラスミドを得た。この反応液の１０ｍを宿主菌
の大腸菌ＪＭ１０７株を形質転換するのに用いた。形質
転換に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法［Ｍ
ａｎｄｅｌ、　Ｍ、及びＨｉｇａ、　Ａ、ＪｌＭｏｌ、
Ｂｉｏｌ、　５３．１５９〜１６２（１９７０）　）に
より作成した。具体的には、大腸菌ＪＭ１０７株の一晩
培養液（ＬＢ培地）を同じ培地で１００倍希釈し、００
６００が０．６になるまで３７℃で振こう培養し、１．
５−を５０００ｒｐｍ　５分遠心して集菌した。これを
７５０１の５０ｍＭ　Ｃａ［：］、に懸濁し、氷上に２
０分放置した後、遠心により集菌した。得られた沈澱を
１００Ｉ１１の５０ｍＭ　ＣａＣｌ２に再懸濁し、前記
のＤＮＡ！Ｊガーゼ反応液を加え、氷上に４０分放置し
た。４２℃で１分保温した後、１ｍｆのＬＢ培地を加え
、３７℃で３０分保温した。このうち０，１−を、Ｘ−
Ｇａ１プレー）　（１５５，Ｉ／ｇ／　ｍｆ！　５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラ
ノシド、８０　ｌｔｇ／　ｒｒｄ！イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド、２５１Ｉｇ／−アンピシ
リンを含むＬ−プレート〉上に塗布し、３７℃に一晩保
温した。

プレート上に生じたコロニーのうち白色を呈するコロニ
ーを選抜し、菌体を一白金耳とり、２５．ｉ／−アンピ
シリンを含むＬＢ培地に移し、−晩培養液を作成した。

１．５ｍｊ！の一晩培養液を遠心して集菌し、プラスミ
ドＤＮＡのミニプレパレーションを常法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　らＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　１９ｇ２）　　
により行った。得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ
により切断し、アガロースゲル電気泳動を行い３．２ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片がｐＵＣベクターに挿入されている
ことを確めた。

さらに、サザンプロット法により、この断片がプローブ
ＤＮＡと結合することも確認した。

Ｄｏｎａｈｕｅらの報告（Ｄｏｎａｈｕｅ、　Ｔ、　Ｆ
、　、　Ｆａｒａｂａｕｇｈ。

Ｐ、　Ｊ、　＆　Ｆｉｎｋ、　Ｇ、　Ｒ，Ｇｅｎｅ　１
８．４７−５９．１９８２）　　に基づき、ＨｒＳ４遺
伝子のプロモーターとＮ東側２４１アミノ酸を含むｐｖ
ｕ　■とＥｃｏＲＩ断片約１．４ｋｂをｐＵｃ１９のＥ
ｃｏＲＩと３ｍａ　ｒで消化したベクターの部位に連結
し、ｐｉ、ＩＣ−ＨＩ５４を構築した。

実施例２、ＨＩ５４組込み型ベクターの構築及び形質転
換 天然配列を有するプレプロヒト血清アルブミンｃＤＮＡ
を酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（ＡＤＨ−■）
遺伝子のプロモーターの支配下に酵母宿主細胞内で発現
させるために構築されたプラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−
ｎＨ３Δ−ＡをＳａｌ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消化して、
ＡＤＨ−Ｉ遺伝子プロモーター及びプレプロヒト血清ア
ルブミンｃＤＮＡを含む３．５ｋｂ断片を得た。前記プ
ラスミドｐｌｊ［ニーＨＩＳ４をＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化してＨＩ３４遺伝子を含むｌ、　４ｋｂ断片
を得た。他方、ｐＡＴ１５３（アマジャム社）をＥｃｏ
Ｒ１及’ｗ”　Ｓａｌ　Ｉにより消化して、形質転換宿
主にアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝
子及び大腸菌で機能する複製起点を含有する大きい方の
断片を得た。これら３断片を連結して組込み型プラスミ
ドｐｌ−ＨＩＳ４ｎＨ５Ａを構築した。

なお、前記プラスミドｐＪＤＢ−ＡＤＨ−ｎＨ３Ａ−Ａ
を含有する大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
ＨＢＩＯＩ／ｐＪＤＢ−ＡＤＩ（−ｎＨ５Ａ−Ａは、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第２４５４
号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４５４）として、１９８９年６
月８日にブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

次に、このプラスミドをＨｒＳ４遺伝子内に存在するＣ
ｌａＩ部位で切断し、低融点アガロース抽出法（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　１９８
２）により直鎮ＤＮＡを精製した。次に、この直鎮ＤＮ
Ａを用いて、基本的には橋本英明、木材光〔発酵と工業
４３．６３０−６３７　（１９８５）　〕のＫＬＩＲ法
に従い、少し改良した方法によってヒスチジン要求性を
示す酵母菌Ａ３２２株（ａ、　１ｅｕ２−２．　Ｌｅｕ
２−１１２゜ｈｉｓ４−５１９．　Ｃａｎ１）を形質転
換した。

まずＹＰＤ培地（２％ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、１
％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）　、２％グルコース）５−
にＡ３２２株（ＭＡＴａ、　１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−
１１２．　ｈｉｓ４−５１９．　Ｃａｎ１）のＹＰＤ培
地による一晩培養液０．１ｍｌを加え３０℃で約４時間
（濁度が００６００で０．５に達するまで）振盪培養を
行った。４℃で２．ＯＯＯｒｐｍ　、５分間の遠心を行
い集菌し、菌体を５．０ｍｌの０．１　ＭＬ＋ＳＣＮに
懸濁し、そのうち１．５−を分取し、２．００Ｏｒｐｍ
、５分間または１０．００Ｏｒｐｍ　、　１分間の遠心
で集菌した。

得られた菌体を２　ＭＬｉＳＣＮ　１０ｕ！、５０％Ｐ
ＥＧ４０００４６μに再懸濁し、そこに１ＯＩＬｌのＤ
ＮＡ溶液（５〜１０だのＤＮＡを含む）を加え、３０℃
で一晩保温した。

その懸濁液に１ｍｌの滅菌蒸留水を加えゆるくポルテッ
クスミキサーにて振盪した。次に２．００Ｏｒｐｍ。

５分間または１０，０００ｒｐｍ　、　１分間の遠心を
行い、得られた菌体を１００ｕ１の滅菌蒸留水に再懸濁
し、選択用の寒天培地［ＳＤ培地＝２０■／−アデニン
硫酸塩、２０ｇ／−アルギニン塩酸塩、２０■／−メチ
オニン、２０　ｎ　／　ｍｌヒスチジン塩酸塩、２０■
／ｒｄトリプトフアン、２０ｇ／−ウラシノペ３０■／
−イソロイシン、３０■／ｉＩ！リジン塩酸塩、３０　
ｔｔｇ　／−チロシン、５０　ｐｇ　／−フェニルアラ
ニン、１５０■／−バリン、０．１５％アミノ酸不含イ
ースト・ニトロゲン・ベース（Ｄｉｆｃｏ）　、０．５
％硫酸アンモニウム、２％デキス）ロースに１．５％の
寒天を加えたもの２にまいた。ヒスチジンを含有しない
ＳＤプレート上で増殖する形質転換体酵母を取得し、こ
れらが実際にヒト血清アルブミンを生産・分泌すること
を確認するためにこれらの酵母菌株の培養液を用いて培
地中の蛋白質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った後、クマシー・ブＩＪ　ｊｌアント・ブルー
染色、又は抗−ヒト血清アルブミン抗体を用いるウェス
タンブロッティングにより分泌ヒト血清アルブミンを検
出し、定量した。

これにより、効率よくヒト血清アルブミンを分泌しＴイ
ルＡＨ２２Ｈ５Ａ　ＨＩＳ−２３株を得た。

この酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　Ａ）ＩＺＺＨ５ＡＨＩＳ−２３は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１Ｂ５１号（ＦＥ
Ｒｉ、Ｉ　Ｐｉ１３５１）として寄託された。

実施例３．　　Ｌｅｕ２組み込み型ベクターの構築と形
質転換 ｐＪＤＢ−ＡＤＨｎＨ３Ａ−Ａから、ＨｉｎｄＩＩＩと
Ｘｈｏ　Ｉで消化することにより生ずる酵母アルコール
デヒドロゲナーゼ■遺伝子のプロモータ一部分を含む約
１．６ｋｂの断片をｐＵｃ１９の巳ｃｏＲＩ部位にＸｈ
ｏ　Ｉリンカ−を挿入して作製したプラスミドｐ［Ｉｃ
１９−ＸのＸｈＯＩＨｉｎｄＤＩＢ位に挿入して組換え
プラスミドｐＵＣＡＤＨｐｒｏ、を構築した。このプラ
スミドをＳａｌ　ｌで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ　７ラグメ
ント（ＴＡＫＡＲＡ）により制限酵素切断部位を平滑末
端とし、ＤＮＡ’Ｊガーゼにより自己運繕させ、Ｓａｌ
、Ｉサイトが消失したｐｔｌｃ−ＡＤＨｐｒｏ△Ｓａｌ
を構築した。そして、Ｈｉｎ＋ｊＩＩＩとＸｈＯＩで消
化し生ずる酵母アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロ
モーターを含む１．５ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＪＤＢ　
＋　ＡＤＨ−ｎＨ３Ａ−ＡをＸｈｏ　ＩとＢａｍＨＩで
消化し生じる全長のプレプロヒト血清アルブミンｃＤＮ
Ａを含む２ｋｂ断片と、ｐＡＴ１５３ベクターをＨｉｎ
ｄＩ［［とＢａｍＨＩで消化し生ずる大きい断片（β−
ラクタマーゼ遺伝子とＤＮＡ複製起点を含む〉を連結す
ることでｐＡＴ　−ＡＤＨ−ｎＨ３Ａを構築した。

またＬＥＬ１２遺伝子を有するコスミドベクターｐＢＴ
Ｉ−１（ベーリンガー社）約１１．１ｋｂから、Ｐｓｔ
　Ｊ消化により、ＬＥ［Ｉ２遺伝子を含むＰｓｔ　Ｉ断
片４．２ｋｂを切り出し、これをｐｌｊｃ１８のＰｓｔ
　Ｉ部位に挿入し、ｐＵｃ−Ｌｅｕ２を構築した。この
プラスミドをＸｈＯＩ及び１３ａｍＨＩで消化し生ずる
Ｌｅｕ２遺伝子を含む３．７ｋｂの断片と前述したｐＡ
Ｔ−ＡＤＨ−ｎＨ５Ａを１３ａｍＨＩとＳａｌ　Ｉで消
化し、生ずる大きな断片を連結し、組込み型ベクターｐ
ｌ−Ｌｅｕ２−ｎｔｌｓＡを構築した。

このＤＮＡを用いて前述のｐｉ−ＨＩＳ４−ｎＨ３Ａの
場合と同様に木材るの改良法により酵母菌Ａ３２２株の
形質転換を行い、ロイシンを含まないＳＤプレート上で
増殖し、Ｈ３Ａを分泌しているＡＨ２ＺＨ３Ａ　ＬＥＬ
１２−８株を得た。

この酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　５ｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ　ＡＨ２２Ｈ５ＡＬＥＵ２−８は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第１１３５２号（ＦＥＲ
ｌ、４　Ｐ−１＋３５２）として寄託された。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｒ−ｈｉｓ４・ｎＨ３Ａの構築過
程を示す。 第２図はプラスミドｐＡＴ　−ＡＤＨ−ｎＨ３Ａの構築
過程を示す。 第３図はプラスミドｐＩ・シｅｕ２・ｎＨ５＾の構渠過
程を示す。 第４−１図〜第４−３図はヒト血清アルブミンのアミノ
酸配列及びそれをコードする塩基配列を示す。 ＧＣＣＴＴＴ　ＧＣＴ　（：ＡＧ　　ＴＡＴ　ＣＴＴ　
ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＴＴτ朶４−１回 第４−２■ 第４−３瞬

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡを酵母の染
   色体に組込むためのプラスミドであって、該染色体上の
   標的領域の塩基配列と相同な塩基配列を有するＤＮＡ領
   域、酵母細胞中で機能するプロモーター及び該プロモー
   ターの制御下にあるヒト血清アルブミンをコードするＤ
   ＮＡを含んで成るプラスミド。 ２、前記標的領域の塩基配列と相同な塩基配列を有する
   ＤＮＡ領域が酵母イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナー
   ゼ遺伝子（ＬＥＵ２）もしくはその部分、又は酵母ヒス
   チジン合成系酵素の遺伝子（ＨＩＳ４）もしくはその部
   分である、請求項１に記載のプラスミド。 ３、前記プロモーターが酵母アルコールデヒドロゲナー
   ゼ遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載のプラ
   スミド。 ４、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子及び該遺伝
   子の発現のための真核性プロモーターが染色体の標的領
   域に挿入されている酵母。 ５、前記標的領域が酵母イソプロピルリンゴ酸デヒドロ
   ゲナーゼ遺伝子（ＬＥＵ２）領域又は酵母ヒスチジン合
   成系酵素遺伝子領域（ＨＩＳ４）である請求項４に記載
   の酵母。 ６、前記プロモーターが酵母アルコールデヒドロゲナー
   ゼ遺伝子のプロモーターである請求項４に記載の酵母。 ７、請求項４〜６のいずれか１項に記載の酵母を培養し
   てヒト血清アルブミンを生産せしめ、そして培養物から
   該ヒト血清アルブミンを採取することを特徴とするヒト
   血清アルブミンの製造方法。