JP2868179B2

JP2868179B2 - 糸状菌類のプロモーターを用いるタンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP2868179B2
Application number: JP6214613A
Authority: JP
Inventors: デイビッド・アイヴォア・グウィン; フランシス・ポール・バクストン; マーク・ハドソン・ピケット; ロジャー・ウェイン・デイビス; クロディオ・スカゾキオ
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1985-04-15
Filing date: 1994-09-08
Publication date: 1999-03-10
Anticipated expiration: 2014-03-10
Also published as: AU5698686A; DE3650783D1; ATE161881T1; AU606033B2; DE3650664T2; DE3650664D1; WO1986006097A1; EP0284603A1; JPH07163389A; EP0284603B1; ATE253119T1; DE3650783T2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】この発明は、糸状菌類におけるタンパク
質の発現および分泌を伴なうタンパク質の発現に関する
ものである。

【０００２】

【発明の背景】組換えＤＮＡ技術のひとつの目標は、容
易にしかも経済的に入手できる宿主細胞に商業的にある
いは科学的に価値のあるタンパク質をコードしているＤ
ＮＡセグメントを挿入することである。一般に、挿入の
ために選ばれる遺伝子は、それら本来の宿主で限られた
量しか産生されないタンパク質をコードしているもの、
あるいは高価すぎて維持することのできない宿主に固有
のものである。より多くの収量で、あるいは同様の収量
でより経済的にタンパク質を産生することが可能な宿主
に、制御された方法で遺伝情報を転移することにより、
タンパク質産生のためのより望ましいビヒクルが得られ
る。

【０００３】タンパク質をコードしている遺伝子は、本
質的に、タンパク質コード(暗号)領域の５'末端に接し
ているＤＮＡのプロモーター領域を含んでいる。プロモ
ーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの結合部位を
含んでいる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、コード領域の
適当なＤＮＡ鎖と相補的なメッセンジャーＲＮＡの組立
てを効果的に触媒する。ほとんどのプロモーター領域に
は、“ＴＡＴＡボックス"として一般に知られている配
列に関係するヌクレオチド塩基配列が存在し、そして、
該配列は通常、コード領域の始まりから幾分離れた上流
に位置していて、正確な転写開始反応には必要なもので
ある。コード領域を正しく機能させ、制御するのに重要
な、あるいは必須であるそれ以外の特徴も、コード領域
の始まりの上流にあるプロモーター領域中に含まれてい
る。

【０００４】糸状菌類、特に、アスペルギルス属(Ａspe
rgillus)、たとえばアスペルギルス・ニーガー(Ａ．nig
er)のような糸状嚢子菌類は、有用なタンパク質をコー
ドしている外来遺伝子の受容体として適している微生物
群の一種である。現在、Ａ．ニーガーとその関連(近縁)
種は、たとえば食品業界において使用するような酵素の
工業生産に係る業界で広範に用いられている。それらの
用途は、微生物の分泌能力に基づくものである。微生物
は十分に特徴づけられていて、広範に利用され、受け入
れられているので、有用なタンパク質を得るために、
Ａ．ニーガーの細胞やＡ．ニデュランス(Ａ．nidulans)
を含むその関連種の細胞を遺伝的に修飾し増強するよう
な工業的でかつ科学的な誘因(動機)が存在する。

【０００５】糸状菌類由来の外来タンパク質を発現、分
泌させる方法は、いまだ完成されていない。酵母におい
て成功した試みが、アスペルギルス属のような糸状菌類
において成功するかどうかは決して自明のことでない。
酵母は、糸状菌類の遺伝子を発現させるのに適した組織
ではなく[ペンチラ(Ｐentilla)らのモレキュラー・ジー
ン・ジェネティック(Ｍolec．Ｇen．Ｇenet．)(１９８
４)１９４:４９４−４９９]、また酵母遺伝子は糸状菌
類中で発現しないことが明らかにされた。最近になっ
て、Ａ．ニデュランスおよびＡ．ニーガーにおける遺伝
子工学技術が発達してきた。これらの技術は、外来的に
加えられる遺伝子が、発現することのできる形態でアス
ペルギルス・ゲノムに組込まれることと関連している。

【０００６】現在までのところ、これらの技術を用いて
も、外来タンパク質は糸状菌類中で発現されず、該菌類
から分泌されなかった。これは、適当な発現ベクターや
その組立て構成要素がないことによっていた。これらの
構成要素には、上述したアスペルギルス・プロモーター
配列、所望の生産物をコードしている領域、および所望
の生産物を細胞外媒質に導くために加えられる関連配列
が含まれる。

【０００７】上記のように、宿主細胞によって外来遺伝
子が発現するには、タンパク質をコードしている領域の
上流に位置するプロモーター領域が存在することが必要
である。このプロモーター領域は、それと関連するコー
ド領域が、最後には所望のタンパク質生産物に翻訳され
るメッセンジャーＲＮＡに転写されることの制御におい
て活性である。このようにして産生されるタンパク質
は、宿主に関する運命に基づいて２つの種類に分類され
る。

【０００８】第一の種類のタンパク質は、細胞内に残
る。細胞内にある場合、所望のタンパク質を抽出するに
は、生産物を放出させて、最終的に精製するために、遺
伝子的に操作された宿主を破壊あるいは溶解する必要が
ある。細胞内生産物は、いくつかの点で都合がよい。こ
のタンパク質生産物は、濃縮することができ、すなわち
細胞塊とともにペレットにすることができ、もし、生産
物が細胞外状況で不安定、あるいは構造的に分泌するこ
とができない場合には、これは、産生および精製の望ま
しい方法である。

【０００９】２番目の種類のタンパク質は、細胞から分
泌されるものである。この場合、精製は、細胞自身より
も細胞外媒質上で行われる。生産物は、アフィニティー
クロマトグラフィーのような方法で抽出することがで
き、連続液中発酵が可能である。また、特定の生産物
は、細胞外でより安定であり、細胞外精製が有利であ
る。真核生物におけるタンパク質の分泌は、通常、タン
パク質のアミノ基末端に位置している分泌シグナルペプ
チド(以下、シグナルペプチドと呼ぶ)によって、ほとん
ど常に指令を受けていることが実験的に明らかとなって
いる。シグナルペプチドは、ジー・ボンヘイジン
(Ｇ．Ｖon Ｈeijin)のヨーロピアン・ジャーナル・バ
イオケム(Ｅur．Ｊ．Ｂiochem)１７−２１(１９８３)に
よって記述されているように、特徴的な分布を有してい
て、当業者によりそのことは理解されている。シグナル
ペプチドは、細胞に認識された時点で、タンパク質を分
泌経路へと導びく。分泌の間に、シグナルペプチドは開
裂して除かれ、タンパク質は、細胞外媒質から成熟した
形で収穫することができるようになる。

【００１０】細胞内および細胞外の両種のタンパク質は
ともに、コード領域と連結しているプロモーター領域を
含む遺伝子によってコードされている。細胞外へ導かれ
るタンパク質をコードしている遺伝子は、細胞内のタン
パク質をコードしている遺伝子と、細胞外タンパク質を
コードしている遺伝子では、シグナルペプチドをコード
しているプロモーター(それは、ＲＮＡポリメラーゼに
よって最初に転写される部分である)に最も近いコード
領域部分がシグナルペプチドをコードしているという点
で異なっている。シグナルペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列は、以下ではシグナルペプチドのコード
領域あるいはシグナル配列と表わされるが、それ自体コ
ード領域の機能的な部分である。

【００１１】

【発明の概要】所望のタンパク質を発現するために糸状
菌類を形質転換する方法(システム)が、ここに開発され
た。この方法によれば、形質転換によって、そのタンパ
ク質が天然に分泌されるものであるかどうかに関係な
く、該タンパク質を発現するばかりでなく、そのタンパ
ク質を分泌することのできる糸状菌類を得ることができ
る。その上、本発明のある面においては、発現されるタ
ンパク質の濃度レベルを、コントロールすることができ
る。当業者には、本明細書で示される方法によって、糸
状菌類がタンパク質の貴重な産生源として機能し、多く
の適用例で、細菌や酵母による方法(系)よりも秀れてい
る代替系がもたらされることを理解できるであろう。

【００１２】このように一般的な態様では、本発明は、
糸状菌類細胞の遺伝子構成を改良し、これらの細胞によ
って発現されるタンパク質の性質または量を変えるため
の糸状菌類の形質転換方法(系)を提供するものである。
本発明のより具体的な態様を以下に記述する。本発明に
おけるひとつの態様では、Ａ．ニーガー、Ａ．ニデュラ
ンスあるいはその関連(近縁)種のような糸状菌類におけ
るコード領域と関連するプロモーター領域を、同定、分
離し、細胞外で２番目の異なるコード領域と機能的な関
係の下で適当に結合させ、そして、適当なベクターを用
いて、宿主糸状菌類に再び導入する形質転換された宿主
細胞は、導入されたプロモーター領域のコントロールの
下で、２番目のコード領域のタンパク質を発現する。特
定の宿主が天然では発現しないタンパク質を発現する場
合、および該タンパク質を分泌するいくつかの場合に
は、この２番目のコード領域は、宿主種にとって外来の
ものであるかもしれない。他方、２番目のコード領域が
タンパク質発現を改良または増強するために特定の宿主
内でそのタンパク質が自然の状態で関連しているプロモ
ーター領域とは異なるプロモーター領域と関連している
場合には、第２の暗号領域は宿主本来のものであるかも
しれない。

【００１３】第２のコード領域が、通常分泌されるタン
パク質をコードしているものである場合にはその配列
は、転写および翻訳後、タンパク質生産物のアミノ基末
端にシグナルペプチドを存在せしめるようなヌクレオチ
ド配列を、５'末端、すなわちシグナルペプチドのコー
ド領域に含んでいるだろう。そのシグナルペプチドは、
菌類宿主によって認識され得、そして、タンパク質生産
物は、細胞の分泌経路へと導びかれ、分泌され得る。

【００１４】もうひとつの態様では、本発明は、シグナ
ルペプチド、すなわちシグナルペプチドのコード領域を
コードしているＤＮＡ配列であって、コード領域内でコ
ードされているタンパク質の分泌を促すように、糸状菌
類、好ましくは嚢子菌類種、たとえばＡ．ニーガーや
Ａ．ニデュランスによって、認識されるＤＮＡ配列を提
供するものである。これらのシグナルペプチドのコード
領域は、天然状態では細胞内に保持されるタンパク質の
分泌を誘導するために該タンパク質をコードしているコ
ード領域と連結することができる。一方、通常分泌され
るタンパク質は、普通、これらのシグナルペプチドのコ
ード領域を天然に含んでいるので、シグナルペプチドを
コードしている領域を挿入することは通常必要としない
が、それでも、所望により、本発明のシグナルペプチド
のコード領域で、天然に存在するこのような配列を置換
してもよい。従って、シグナルペプチドのコード領域
が、非分泌性のタンパク質をコードしている領域と連結
されている場合には、そのものは上記コード領域にとっ
て、外来性であるだろう。

【００１５】本発明は、菌類宿主が異種タンパク質を発
現するように配列されたプロモーターを伴った外来性の
コード領域を糸状菌類中に導入し得る方法(性能)を提供
するものである。また、本発明は、そこに、天然に存在
する個々の遺伝子、あるいはそこに導入された外来遺伝
子の転写を、その遺伝子と共に宿主に導入されたプロモ
ーター領域を介して調節することのできる方法をも提供
する。たとえば、Ａ．ニデュランスのアルコール・デヒ
ドロゲナーゼＩ(alc Ａ)遺伝子やアルデヒド・デヒド
ロゲナーゼ(ald Ａ)遺伝子と天然で連なっているプロ
モーター領域は、細胞外媒質のエタノール、スレオニ
ン、あるいは他の誘導物質によって調節できる。この効
果は、alcＲとして知られる遺伝子の保全に依存してい
る。alcＡあるいはaldＡプロモーター領域が、アスペル
ギルスなどにおいて、外来タンパク質をコードしている
媒質と連なっている時には、本発明に従って、エタノー
ルあるいはその他の誘導物質によって、異なる遺伝子の
発現を同様に調節することができる。

【００１６】さらなる例として、Ａ．ニーガーにおいて
グルコアミラーゼ遺伝子と天然で連なっていて、本発明
の態様において使用されるプロモーター領域は、デンプ
ンおよび他の糖類によって正に誘導される。本明細書で
用いる「誘導性プロモーター」は、例えば、エタノー
ル、トレオニン、デンブンならびに他の糖、および他の
誘導物質のような誘導因子に反応して転写を誘導するこ
とができるプロモーターを意味する。

【００１７】もうひとつの態様では、本発明は、シグナ
ルペプチドをコードしている領域と機能的に連なるプロ
モーター領域であって、その３'側に位置し、シグナル
配列と同じ解読枠内に所望のタンパク質をコードしてい
る領域を導入させ得る領域を含むＤＮＡ構築物を提供す
るものである。プロモーター／シグナル構築物は、タン
パク質コード領域をシグナルペプチドのコード領域に正
確に連結させ得る制限部位をその側面に有している。

【００１８】他の態様では、本発明は、プロモーターや
シグナルペプチドのコード領域を含むセグメントを、完
全なタンパク質のコード領域と共に、糸状菌類宿主のゲ
ノムに導入することのできる遺伝子ベクターを提供する
ものである。そのタンパク質をコードしている領域は、
宿主の糸状菌類にとって、固有のものであって、外来の
ものであってもよい。

【００１９】このように、本発明は、アスペルギルス・
ニーガー、アスペルギルス・ニデュランスなどの糸状菌
類細胞において、プロモーター領域として活性なＤＮＡ
配列、およびシグナルペプチドのコード領域として活性
なＤＮＡ配列を提供するものである。

【００２０】更に、本発明は、糸状菌類細胞においてプ
ロモーター領域として活性なＤＮＡ配列、および該ＤＮ
Ａ配列と機能的な関連性を持って化学的に結合している
コード領域(つまり、該コード領域は糸状菌類宿主にお
いて、前記ＤＮＡ配列の影響下で発現することができ
る)からなる新規な構築物を提供するものでもある。

【００２１】更に、本発明は、形質転換されたアスペル
ギルス宿主細胞において発現することのできるコード領
域、および形質転換されたアスペルギルス宿主細胞にお
いて活性であるプロモーター領域(コード領域とプロモ
ーターとは化学的に結合し、互いに機能的に関連してい
る)を、適当なベクターによって宿主細胞に導入するこ
とからなる、糸状菌類宿主細胞を遺伝子的に修飾する方
法を提供する。

【００２２】この方法は、遺伝子発現の水準を上げるた
めに、選択された構築物の多数のコピーを宿主に導入す
ることも包含している。要すれば、あるいは所望ならば
複数の構築物のコピーの導入に伴なって、構築物に対し
て調節作用を有する生産物をコードしている遺伝子の多
数のコピーを導入する。本発明は、本発明の構築物によ
って形質転換された糸状菌類細胞をも含むものである。

【００２３】

【好ましい態様の説明】本発明において好ましい宿主
は、子嚢菌種の糸状菌類で、最も好ましくは、Ａ．ニー
ガー、Ａ．ニデュランスなどを含むアスペルギルス属で
ある。発明の好ましい態様においては、Ａ．ニーガー・
グルコアミラーゼ遺伝子、あるいは、Ａ．ニデュランス
のアルコール、デヒドロゲナーゼＩ遺伝子またはアルデ
ヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子と関連しているプロモー
ター領域、のいずれかと関連しているプロモーター領域
を、適当なベクター・プラスミドを製造する上で使用す
る。

【００２４】これらプロモーター領域のうちいずれか、
あるいは全ては、適当な誘導物質を加えることで宿主細
胞内で調節することができる。alcＡとaldＡにおいて
は、この誘導は、第３の遺伝子のタンパク質生産物であ
る、プロモーターを介してコントロールされるalcＲに
よって調節される。alcＡプロモーターあるいはaldＡプ
ロモーターを含む構築物の多数のコピーを、対応するal
cＲ遺伝子の多数のコピーの導入を伴なわずに宿主に導
入した場合、alcＲ生産物の利用可能性によって、alcＡ
およびaldＡプロモーターのプロモーター機能を制限し
得ることが明らかにされている。このような場合、宿主
が産生することのできるalcＲ生産物の量は、alcＲ生産
物による誘導を必要とするいくつかのプロモーターの要
求量に応ずるのに不十分であることがある。従って、al
cＡあるいはaldＡプロモーターを含む構築物の多数のコ
ピーによる糸状菌類の形質転換には、本発明の好ましい
態様に従がってalcＲ遺伝子の多数のコピーの導入を併
わせて行う。他方、たとえば、高濃度のグルコース(お
よび、いくつかの他の炭素源)を、宿主の増殖に用いる
培地中に使用することによって、転写を抑制することが
できる。そして、コード領域によりコードされていて、
プロモーターによって制御されている生産物の発現は、
細胞生育相の終了の後、つまり、グルコースの全てが消
費され、その遺伝子の抑制が解除される時まで遅延す
る。この時に、プロモーターの活性を増強するために誘
導物質を添加する。

【００２５】上述したプロモーターの制御のもとで、発
現するように選択されたコード領域のタンパク質生産物
の運命は、該コード領域のヌクレオチド配列によって決
定される。既述したように、もし、タンパク質生産物が
天然で細胞外環境に導びかれるものならば、生来、分泌
性のシグナルペプチドのコード領域を含んでいるであろ
う。通常、細胞内に存在するタンパク質生産物には、こ
のシグナルペプチドが欠如している。

【００２６】このように本明細書の目的においては、
“コード領域"は、細胞内に残っているか、分泌されて
いるかのいずれかのタンパク質をコードしていると解す
べきである。(この“コード領域"とは、当業界では、時
に構造遺伝子すなわち遺伝子の、タンパク質をコードし
ている部分を指して呼ばれることがある。)タンパク質
が、それを産生する細胞内に残っている場合には、通
常、コード領域は、シグナルペプチドのコード領域を欠
如しているだろう。コード領域が本来、分泌タンパク質
をコードしているコード領域のセグメントと翻訳解読フ
レームにおいて天然で連結しているシグナルペプチドの
コード領域を含んでいる場合には、コード領域内でコー
ドされているタンパク質は、細胞代謝における当然の結
果として分泌され得る。この場合、シグナルペプチドの
コード領域を挿入する必要はない。一方、分泌タンパク
質をコードしているコード領域部分にとって外来のシグ
ナルペプチドのコード領域を導入するように操作するこ
ともある。コード領域が、シグナルペプチドのコード領
域を天然で含んでいない場合、あるいは天然のシグナル
ペプチドと通常連結している所望のタンパク質の分泌を
増強するために天然のシグナルペプチドのコード領域と
単に置換する場合には、この外来性シグナルペプチドの
コード領域が必要となる。

【００２７】従って、本発明の他の好ましい態様におい
ては、要すれば、すなわち、上述したプロモーターの制
御のもとで発現するために選択されたコード領域が、そ
れ自身シグナルペプチドのコード領域を含んでいない時
には、シグナルペプチドのコード領域を供給する。使用
されるシグナルペプチドのコード領域は、Ａ．ニーガー
のグルコアミラーゼ遺伝子に伴なっているもの、あるい
はin vitroで作られる合成シグナルペプチドのコード
領域であることが好ましく、適当なベクター・プラスミ
ドの作成に使用する。他のベクターの他の成分とライゲ
イトできるように、これらシグナルペプチドのコード領
域の片方あるいは両方の末端が修飾されていることが最
も好ましい。シグナルペプチドのコード領域が、コード
領域の、成熟した機能的タンパク質をコードしているセ
グメントと同一フレーム中にあるように、シグナルペプ
チドのコード領域をプロモーター領域とコード領域のタ
ンパク質をコードしているセグメントの間に挿入するよ
うな方法で行うと、このライゲイションは効果的であ
る。

【００２８】

【好ましい態様の詳細な説明】本発明において、Ａ．ニ
ーガーあるいはＡ．ニデュランスなどにおいて機能的な
遺伝子のプロモーター領域が同定された。所望のプロモ
ーター領域を含む各々の遺伝子を同定する方法は同様で
あるため、alcＡ遺伝子およびそれに含まれているプロ
モーターの位置を決め、同定する方法について概説す
る。この目的のために、選択したタンパク質、たとえば
alcＡを発現するように、選択種の細胞を誘導し、これ
らの細胞から、メッセンジャーＲＮＡを分離する。それ
らの一部は、未だ同定されていないが、alcＡをコード
している。フラグメントの相補的ＤＮＡを、mＲＮＡフ
ラグメントより作成し、ベクターにクローン化する。誘
導されたＡ．ニデュランスより分離されたメッセンジャ
ーＲＮＡをサイズ分画してalcＡ配列を豊富化し、末端
を標識してalcＡ ⁺菌株より調製されたcＤＮＡクローン
ーとハイブリダイズする。alcＡ ⁺ mＲＮＡとハイブリダ
イズするcＤＮＡを含むクローンは、alcＡ mＲＮＡのＤ
ＮＡコピーを含んでいる。この切片を、選択したアスペ
ルギルス菌株由来の全ＤＮＡ遺伝子バンクとハイブリダ
イズし、選択したコード領域たとえばalcＡおよびその
非翻訳領域を分離する。aldＡコード領域も同様の方法
を用いて分離した。

【００２９】そのコード領域は、他のコード領域および
タンパク質と同様に、メチオニンをコードしているコド
ンＡＴＧを伴った５'末端より始まる。発現されるタン
パク質のアミノ酸配列が知られている場合には、コード
領域のＤＮＡ配列は、容易にわかる。ＡＴＧコドンのす
ぐ“上流"は、プロモーター領域に発行されるメッセン
ジャーＲＮＡのリーダー部分である。

【００３０】図１〜７では、Ａ．ニデュランス由来の全
ＤＮＡ配列を、従来からの塩基表示法によって図示して
いる。図１、図２及び図３に示した部分は、プロモータ
ー領域およびアルコールデヒドロゲナーゼＩ酵素をコー
ドしているalcＡ遺伝子のコード領域を含んでいる。図
４、図５、図６及び図７に示した部分は、プロモーター
領域およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素、すなわち
aldＡをコードしている領域を含んでいる。(両方とも
に、“ＩＶＳ"の用語は、介在配列を表わす。)これら２
つの酵素のアミノ酸配列は、他の種において公知であ
る。これらより、領域１０および１０'がコード領域で
あると認められる。コード領域は各々、１２位のメチオ
ニン・コドンＡＴＧを有する５'(“上流")末端より開始
する。タンパク質のコード領域によってコードされる相
応のアミノ酸配列を、図１〜図７のそれぞれの列の下
に、従来からの省略法によって付記する。コドン１２の
すぐ上流は、メッセンジャーＲＮＡのリーダー領域およ
びプロモーター領域をコードしている領域で、長さは、
プロモーターとして機能する上で必須の構造的特徴を全
て含ませるために決定するか、あるいは少なくとも概算
しておく必要がある。図１〜図７の各々には、ＡＴＧコ
ドン１２より上流の約８００塩基の配列をそれぞれ示
す。

【００３１】機能するのに必須なものは全て、約１００
０塩基の長さの配列中に、おそらく図示した８００塩基
配列中含まれているだろうし、さらには、最初の２００
〜３００塩基配列、すなわち図１〜図７における約１４
の位置よりも後にあるだろうことは、他の既知のプロモ
ーターとの類似性によって予測できる。プロモーター領
域の本質的な機能は、転写の正確な開始のための部位を
提供することで、それはＴＡＴＡボックス配列として知
られている。このような配列は、図１、図２及び図３の
alcＡプロモーター配列上の１６、および図４、図５、
図６及び図７のaldＡプロモーター配列上の１６'部に見
出される。プロモーター領域のもうひとつの機能は、た
とえば遺伝子の転写を増強する調節分子のためのあるい
は遺伝子を活性または不活性にするための結合部位のよ
うな遺伝子転写の調節において活性な、適当なＤＮＡ配
列を提供することである。このような調節領域は、図１
〜図７に、それぞれalcＡおよびaldＡ遺伝子として図示
したプロモーター領域中にある。

【００３２】本発明でプロモーター領域として使用され
るＤＮＡ配列の正確な上流５'末端は、それが本明細書
で記述するような必須の機能的な配列を含んでいるなら
ば、決定的なものではない。５'末端の上流にある余分
なＤＮＡ配列は、必要なものではないが、本発明におい
て有害なものではないようである。

【００３３】本明細書記載の操作によって、ある遺伝子
のプロモーター領域を組立てるのに必須の機能的特徴全
てを含む配列の大きさを決定したなら、次の工程では、
プロモーター領域の末端の下流の都合よい位置でＤＮＡ
鎖を切断し、タンパク質のコード領域を取り除き、基本
的に、プロモーター領域および、時にメッセンジャーＲ
ＮＡのリーダー領域をコードしている領域部分を含む配
列を残す。この目的のためには、適当な位置に制限部位
が存在していなければならず、次いで、適当な制限酵素
でＤＮＡを処理して有効に切断する。切断部位は、図
１、図２及び図３に図示されるalcＡ配列によってわか
る。上流の切断には、プロモーター領域にとって必須の
機能部位の全てを保持される部分に含めるように、十分
な距離をもって上流に部位を選択する。下流の開裂部位
に関しては、alcＣの場合、正確にＡＴＧコドン１２の
位置にある、制限部位は存在していない。該部分に最も
近い下流の制限部位は、１３における配列ＧＧＧＣＣＣ
で、そこでは、その鎖を制限酵素ＡpaＩによって切断す
ることができる。もし所望ならば、このような開裂の
後、位置１３から位置１２までの残ったヌクレオチド
は、エキソヌクレアーゼを用いて段階的に取り除くこと
ができる。このような取り除かれるヌクレオチドの数が
わかっているなら、エキソヌクレアーゼの作用を、位置
１２を過ぎる時に適当に停止させることができる。図
４、図５、図６及び図７に示すaldＡコード領域のメチ
オニン・コドン１２の下流に同様の制限部位を位置決め
することによって、このプロモーター領域をもその後の
使用のために同様に切り出す。多くの場合、プロモータ
ー領域の５'末端上で残ったヌクレオチドは、塩基トリ
プレットの解読フレームが維持される限りは、プロモー
ター領域の機能に害を与えることはなく、該機能を有意
に妨げることもない。

【００３４】添付の図４、図５、図６及び図７は、本発
明に従ってアスペルギルス形質転換体を形成するのに使
用できるプラスミドpＤＧ６を作成する方法の工程を概
略的に示したものである。図４、図５、図６及び図７に
おいては、１８は、最近セルロモナス・フィミ(Ｃellul
omonas fimi)由来のエンドグルコナーゼ(セルラーゼ)
のコード領域３０すなわち既知のベクターＭ１３ＭＰ８
におけるＣ．フィミ由来のＢamＨＩエンドグルカナーゼ
・フラグメントを含む組換えプラスミドである。それ
は、図示した適切なＥcoＲＩ、Ｈind ＩＩＩおよびＢam
ＨＩ制限部位、並びに、図示されていない、本発明にと
って問題外の他の制限部位を含んでいる。項目２０は、
p５と名付けられた組換えプラスミドで、既知の大腸菌
(Ｅ．coli)プラスミドpＢＲ３２２より組立てられ、開
始コドンＡＴＧをも含む、alcＡコード領域の一部分と
ともに、上述のようにして作成されたalcＡプロモータ
ー領域を含むＡ．ニデュランスのＥcoＲＩフラグメント
を含有している。それは、図示した制限部位、並びに本
発明では使用されないために図示されていない他の制限
部位を有している。プラスミドp５は、ＥcoＲＩ部位
(３')からＨind ＩＩＩ(５')に至るＤＮＡ配列２２を有
しており、該部分は事実上、図１、図２及び図３で示し
ている配列の一部で、それは配列の上部に位置１５(Ｅc
oＲＩ制限部位の構成部位である配列ＧＡＡＴＴＣ)から
位置１７と表わされている部分に相当する。プラスミド
２０における配列２２は、約２kbの長さである。

【００３５】次に、プラスミド１８と２０を制限酵素Ｅ
coＲＩおよびＨindＩＩＩで切断して、alcＡプロモータ
ー領域と、エンドグルカナーゼのコード領域３０とを切
り取り、ＨindＩＩＩ切断プラスミドpＵＣ１２とライゲ
イトして、pＵＣ１２上にこれらの配列を含む、図８に
示すような新規な構築物pＤＧ５Ａを作成する。プラス
ミドpＵＣ１２は公知で、市販されている大腸菌プラス
ミドであり、該プラスミドは大腸菌内において効率的に
複製するので、所望ならば、pＤＧ５Ａのコピーを豊富
に産することができる。新規な構築物pＤＧ５Ａを、構
築物調製における他の生産物より分離する。次いで、構
築物pＤＧ５Ａに選択マーカーを付ければ、続いて得ら
れる首尾よく構築物を導入されたアスペルギルスの形質
転換体を選別、分離することができる。ＡrgＢ^- アスペ
ルギルス宿主の場合、この目的のために、一般にＡ．ニ
デュランス由来のＡrgＢ遺伝子を適当に使用することが
できる。ＡrgＢ遺伝子は、酵素オルニチン・トランスカ
ルバミラーゼをコードしていて、この遺伝子を含む菌株
は、通常の平板培養法および培養技術によって、ＡrgＢ
^- 菌株より容易に選別、分離することができる。ＡrgＢ^-
菌株は、アルギニン欠損の培地で発育できない。

【００３６】図８に示すように本発明のこの態様におい
て、選択マーカーを組込むには、ＸbaＩを使用してＡ．
ニデュランス由来のＡrgＢ ⁺遺伝子を含むプラスミドpＤ
ＧＡＴＣＣ５３００６のＸbaＩフラグメント３２(ブク
ストン(Ｂuxton)らの米国特許出願、通し番号０６／６
７８,５７８、１９８４年１２月５日出願を参照)と構築
物pＤＧ５Ａをライゲイトし、エンドグルカナーゼのコ
ード領域とalcＡプロモーター配列およびＡrgＢ遺伝子
を含有する新規な構築物pＤＧ６を形成する。そして、
実施例１において、より詳細に記述するが、プラスミド
pＤＧ６を形質転換に使用し、alcＡプロモーターの制御
下にあるエンドグルカナーゼのコード領域を含む新規な
アスペルギルス突然変異体菌株を作成する。

【００３７】図９には、ＨindＩＩＩ部位２４からＨind
ＩＩＩ部位２６までの構築物pＤＧ６の機能部である配
列の概略を、線状で示す。それは、図１〜図７で示した
ようにalcＡプロモーター領域２２とＡＴＧコドン１２
およびＡＴＧコドンの下流にあるalcＡコード領域の残
余部分の一部を含んでいて、それに続いてプラスミド１
８由来のセルラーゼのコード領域３０を含んでいる。

【００３８】プラスミドpＤＧ６は、糸状菌類にとって
外来のタンパク質のコード領域と結合した糸状菌類プロ
モーターを含むベクターの１例にすぎない。図２７に示
した本明細書中でpＡＬＣＡ１ＡＭＹと呼ぶもうひとつ
のベクターにおいては、alcＡ遺伝子の糸状菌類プロモ
ーターと、天然に存在するα−アミラーゼ酵素、つまり
形質転換された菌類宿主にとって外来の生産物をコード
している配列とが連結されている。ベクターpＤＧ６お
よびpＡＬＣＡ１ＡＭＹのタンパク質生産物は、両方と
も、それぞれの形質転換された宿主によって発現する。
さらに、α−アミラーゼのコード領域は、天然でシグナ
ルペプチドのコード領域を含んでいるので、この生産物
は、宿主にとっては外来性であるにもかかわらず、宿主
の分泌機序を用いて、形質転換される宿主によって分泌
され得る。

【００３９】このように、糸状菌類のプロモーター領域
を同定、分離することによって、所望の暗号領域と連結
したこれらのプロモーター領域を含むベクターで、形質
転換することによって宿主を操作し得る。

【００４０】もし、ベクターのコード領域がシグナルペ
プチドのコード領域を必要とするか、あるいは存在する
シグナル配列を、別の、好ましい、より効率的なシグナ
ルペプチドのコード領域によって置き換えられるなら、
このようなシグナルペプチドのコード領域は、プロモー
ターと、分泌タンパク質をコードしているセグメントと
の間に挿入することができる。プラスミドpＧＬ２(図１
０)およびpＡＬＣＡ１Ｓ(図１５)は、特にこの目的に達
した中間体クローニングベクターを例示している。各々
は、カセットとして機能することができ、プロモータ
ー、シグナル配列および、シグナル配列と一緒に、正し
い転写解読フレームに、タンパク質のコード領域を挿入
することを可能ならしめる、シグナル配列下流の制限部
位を提供するものである。

【００４１】図１０において示すプラスミドpＧＬ２
は、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター４０、シグ
ナル配列４２および開始部分４６を含むpＧＬ１より作
成することができ、それらすべては本明細書で示す方法
に従い、Ａ．ニーガーＤＮＡ由来の１つのセグメントか
ら導かれる。このセグメントにおいては、以下のチャー
ト１に再現するヌクレオチド配列の末端(しかし、グル
コアミラーゼのシグナル配列４２の内部にある)に向け
て、ＢssＨＩＩ制限部位が得られる。

【００４２】

【化１】

【００４３】シグナル配列４２をもった解読フレーム
に、タンパク質のコード領域を受け入れることのできる
セグメント、すなわちリンカー４４を該シグナル配列の
下流に供給するためには、シグナル配列中に存在するＢ
ssＨＩＩ部位およびその下流のＳstＩ部位を利用する。
この特別な態様においては、セグメント４６をpＧＬ１
から取り出し、図１１に示すＡ、ＢあるいはＣと表示し
た３つのリンカーのうちひとつを選んでそれにより置き
換える。各々のリンカーは、ＢssＨＩＩ末端およびＳst
Ｉ末端とライゲイトすることができる。ＢssＨＩＩによ
るセグメント４６の開裂に際して欠損されたシグナル配
列の末端コドンを修復するためにもリンカーを操作でき
る。さらに、所望のコード領域をベクターpＧＬ２に挿
入できるようにするために、各々のリンカーを、そのヌ
クレオチド配列中のＥcoＲＶおよびＢglＩＩ／ＸhoＩＩ
部位を唯一に限定する。

【００４４】適当なリンカーの選択は、リンカーに挿入
されるタンパク質のコード領域の少なくとも最初の２、
３のコドンについての知見に基づいて行われる。有意に
翻訳されるべきタンパク質のコード領域のためには、タ
ンパク質のコード領域の開始部位は、シグナル配列の開
始点に直接結合しているか、開始点から特定の数のヌク
レオチド(即ち、トリプレット)をもって結合しているべ
きである。従って、もし、挿入されるタンパク質のコー
ド領域が一つあるいは二つの不必要なヌクレオチド(あ
るいは、それらの非トリプレット因子)をその５'領域に
通常の開裂により生じるように有していれば、図１１に
示す三つのリンカーのうちのひとつで、余分で不必要な
ヌクレオチドの存在に対処することができ、シグナル配
列をもつ転写解読フレームに、タンパク質のコード領域
の始まりを位置せしめることができる。

【００４５】リンカーＡ、ＢおよびＣによってコードさ
れるアミノ酸残基は、図１１に示すようにヌクレオチド
配列の下に示されており、このことから、リンカーの解
読フレームに及ぼす、さらに最終的には、挿入されるタ
ンパク質のコード領域に及ぼす、余分なヌクレオチドの
リンカー配列への付加の影響がわかるであろう。制限部
位が常に解読フレームの修飾部より下流にあるようにリ
ンカーを設計し(つまり、リンカーＡ、Ｂ、あるいはＣ
におけるそれぞれ一つ、二つあるいは三つのアデニン残
基)そうすることによって、制限部位に挿入されるコー
ド領域の解読フレームを、適当なリンカーを選択するこ
とで維持することができる。

【００４６】プラスミドpＧＬ２や、特定のリンカーセ
グメントＡ、ＢあるいはＣを使用するプラスミドには、
例えば、Ｂリンカーを用いたpＧＬ２ＢＩＦＮがあり、
これを用いて糸状菌類たとえばアスペルギルス菌種を形
質転換するとインターフェロンα−２が分泌され、さら
には、Ｃリンカーを用いたpＧＬ２ＣＥＮＤＯがあり、
これを用いてこのような糸状菌類を形質転換すると、エ
ンドグルカナーゼが分泌される。

【００４７】プラスミドpＧＬ２は天然に存在するシグ
ナル配列を利用しているが、合成シグナル配列を含むベ
クターを利用することも、本発明の範囲内に属する。こ
のようなベクターの１例は、pＡＬＣＡ１Ｓで、それは
糸状菌類を形質転換することのできるベクターを形成す
るためにタンパク質のコード領域を挿入できるプラスミ
ドpＧＬ２と同様の中間型ベクターである。しかし、pＧ
Ｌ２と異なり、pＡＬＣＡ１Ｓは、alcＡプロモーターを
利用し、プロモーターと連結した合成シグナル配列を利
用している。pＡＬＣＡ１Ｓを図１５に示し、その組立
て模式図を表わし、さらに実施例を参考に挙げる。pＡ
ＬＣＡ１Ｓから作られるプラスミドには、例えば、形質
転換された糸状菌類にインターフェロンα−２を分泌さ
せるpＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ、および糸状菌類宿主にエン
ドグルカナーゼを分泌させるpＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯが
ある。両方の場合とも、宿主にとって分泌タンパク質が
外来性であっても分泌できる。

【００４８】さらに、以下の実施例によって、本発明を
さらに詳細に説明、例示する。しかし、それは本発明を
限定するものではない。

【００４９】以下に挙げる実施例１および２の各々によ
って、天然で存在するが非菌類のコード領域と連結され
た糸状菌類から導かれたプロモーターを有するベクター
を用いて、糸状菌類宿主を首尾よく形質転換できること
を示す。

【００５０】

【実施例】実施例１ pＤＧ６ＡＴＣＣ５３１６９を使用する
Ａ．ニデュランスの形質転換まず、図８に示すベクター構築物pＤＧ６を、標準的な
通常のライゲイションおよび制限技術を用いて図８に示
した設計方法に従って製造した。次いで、以下のように
構築物pＤＧ６をアスペルギルス・ニデュランスＡrgＢ^-
変異体細胞に導入した:２l の円錐形フラスコ中に０.０
２％アルギニンと１０^-5％ビオチンを含有する完全培地
(Ｃove １９６６)５００mlを入れ、Ａ．ニデュランス
ＡrgＢ^- 菌株の分生胞子１０⁵個／mlを植え付け、２０時
間２５０rpmで攪拌しながらインキュベートした。ワッ
トマンＮo.５４濾紙を通して菌糸を収穫し、無菌脱イオ
ン水で洗浄して、吸引乾燥した。菌糸１g当たり２０mg
のノボザイム２３４(ノボ・エンザイム・インダストリ
ーズ(Ｎovo Ｅnzyme Ｉndustries))、０.１ml(＝１５
０００単位)のβ−グルクロニダーゼ(シグマ(Ｓigma))
および３mgの牛血清アルブミンを添加した、２５０mlフ
ラスコ中の濾過滅菌した１.２ＭＭgＳＯ₄・１０mＭリ
ン酸カリウム(pＨ５.８)に菌糸を加えた。光学顕微鏡に
よってスフェロプラストの生成を周期的に確認しなが
ら、ゆっくりと攪拌して、５０−７０分間、３７℃で消
化を行なった。５０mlの無菌イオン交換水を加え、３０
umのナイロンメッシュに通して濾過することでスフェロ
プラストを未消化のフラグメントから分離し、室温で５
０mlの円錐底管に入れ、振盪ローター(swing out rot
or)で５分間２５００gで遠心分離して収穫した。０.６
ＭＫＣl １０ml中で再懸濁と遠心分離を行ない、スフ
ェロプラストを２回洗浄した。スフェロプラストの数を
血球計算器を用いて計測し、最終濃度が１０⁸個／mlと
なるように、pＨ７.５の１.２Ｍソルビトール、１０mＭ
トリス／ＨＣl、１０mＭＣaＣl₂中に再懸濁した。ＤＮ
Ａ pＤＧ６(pＨ８の、１０mＭトリス／ＨＣl・１mＭＥ
ＤＴＡ中、全量４０μl)を加えたプラスチック管に、
０.４mlの部分標本を入れ、室温で２５分間、インキュ
ベートした。pＨ７.５の６０％ＰＥＧ４０００、１０m
Ｍトリス／ＨＣl、１０mＭＣaＣl₂の部分標本０.４m
l、０.４ml、そして１.６mlを、添加の都度おだやか
に、しかし完全に混合しながら、各々のチューブに順次
加え、次いで２０分間室温でインキュベートした。そし
て、形質転換されたスフェロプラストを、適当に補充し
た最小培地１％寒天上層(overlay)に加え、４５℃で０.
６ＭＫＣlを加えるか減じるかして、直ちに、プレート
内の同一の(冷えてはいるが)培地上に注ぎ入れた。３７
℃で３〜５日培養し、増殖しているコロニーの数を計測
した(エフ・ブクストン(Ｆ．Ｂuxton)らのジーン(Ｇen
e)３７、２０７−２０４(１９８５))。エルトン(Ｙelto
n)らの方法[プロナス(Ｐroc．Ｎat'l Ａcad．Ｓci．)
アメリカ(Ｕ.Ｓ.Ａ)８１;１３７０−１３７４(１９８
０)]も使用した。

【００５１】コロニーを２つの群に分けた。組み込まれ
たセルラーゼ遺伝子を誘導するために、ひとつの群のイ
ンキュベート培地に、スレオニン(１１.９g／リットル)
とフルクトース(１g／リットル)を加えた。他の群に
は、誘導物質を加えないで、炭素源としてグルコースだ
けを使用した最小培地上で発育させることで抑制した。
培養した後に、菌糸を濾過して分離し、凍結乾燥して、
すりつぶし、pＨ７の２０mＭトリス／ＨＣlでタンパク
質を抽出し、両群ともにバイオラド分析(ＢioＲad Ａs
say)によって全タンパク質生産を検定した。

【００５２】セルラーゼの生産を調べるために、セルロ
ース(９g／リットル、カルボキシメチルセルロース)含
有の寒天培地のプレートを作成し、ガラス繊維のフィル
ター物質の小片を用意し、お互いを分離して、形質転換
体のひとつからの全タンパク質７５μgを各々フィルタ
ーに加えた。プレートを一晩３７℃でインキュベートし
た。そして、フィルターを取り除き、下の寒天培地にお
けるセルロースの破壊で明らかになるように、プレート
をコンゴーレッドで着色して、フィルター上の全タンパ
ク質にどこにセルラーゼが存在しているかを確認した。
プレートを５ＭＮaＣl水溶液で洗浄してよごれを取り除
き、肉眼で様相の違いを検定した。

【００５３】スレオニンとフルクトースによって誘導さ
れた４つの形質転換体のうち３つが、全タンパク質生産
物中のセルラーゼの存在を明らかに示した。誘導されな
かった、グルコース抑制形質転換体は、セルラーゼ産生
を示さなかった。

【００５４】同じベクター系および菌株より３つのコン
トロール(対照)形質転換体を作成したが、この場合はプ
ロモーター配列を除いた。それらはどれも、誘導物質が
あろうとなかろうとセルラーゼを産生しなかった。スレ
オニン誘導された、形質転換菌株由来の媒地が、Ｃ．フ
ィミのエンドグルカナーゼに対して惹起したモノクロー
ナル抗体と反応を示す事実によって、Ｃ．フィミ・エン
ドグルカナーゼのコード領域の存在を確認した。このモ
ノクローナル抗体は、コントロール菌株の細胞内Ａ．ニ
デュランスタンパク質とは交差反応を示さなかった。

【００５５】実施例２ pＡＬＣＡ１ＡＭＹＡＴＣＣ
５３３８０を使用したＡ．ニデュランスの形質転換ベクター構築物pＡＬＣＡ１ＡＭＹを図２７に示すよう
に、標準的な通常のライゲイションおよび制限技術を用
いて調製した。図２７を参照しながら具体的に説明する
と、プラスミドp５０１[Ｓ.Ｊ．ロスステイン(Ｓ.Ｊ.Ｒ
othstein)ら、ネイチャー(Ｎature)、３０８、６６２−
６５５(１９８４)を参照]上に規定されたＥcoＲＩ−Ｅc
oＲＩフラグメント中に含まれている小麦α−アミラー
ゼ遺伝子７２のコード領域を挿入するために、Ａ．ニデ
ュランス・アルコールデヒドロゲナーゼ１のプロモータ
ー２２が位置している(上述)ＨindＩＩＩ−ＥcoＲＩセ
グメントを含有するベクターpＡＬＣＡ１を、そのＥco
ＲＩ部位で切断した。小麦α−アミラーゼは、自然に分
泌されるタンパク質であるのでそのコード領域７２は、
シグナルペプチドのコード領域７６と、成熟型の分泌さ
れたα−アミラーゼをコードしているセグメント７８を
含有している。p５０１のＥcoＲＩ−ＥcoＲＩセグメン
ト中に含有されているコード領域７２を、pＡＬＣＡ１
のＥcoＲＩ切断部位とライゲイトすることで、ＡlcＡプ
ロモーター２２がα−アミラーゼのコード領域と機能的
に連結しているプラスミドpＡＬＣＡ１ＡＭＹが得られ
る。pＡＬＣＡ１ＡＭＹ中でのp５０１起源のα−アミラ
ーゼコード領域の正しい方向性は、常法によりライゲイ
ション部位の配列を決定することで確認する。プロモー
ター／コード領域の結合部のヌクレオチド配列を図２８
に示す。

【００５６】Ａ．ニデュランスを実施例１に記載の方法
で形質転換し、細胞外媒質の試料を取り出して、１％溶
解性でんぷん寒天上に置かれたガラス繊維濾過紙に適用
する。そして、３７℃で８時間後、濾過紙を取り出し、
固体ヨードの入ったビーカー(５０℃の水浴中)上で裏返
す。きれいなはん点は、でんぷんの減成を表わしてい
て、一方残ったでんぷんは、深い紫色に変わり、これに
より、分泌されたα−アミラーゼの存在を確認する。

【００５７】以下に挙げる実施例３−１２においては、
完全なベクターによって形質転換された糸状菌類から、
外来性タンパク質を分泌させるために、分泌シグナルペ
プチドのコード領域を導入したベクターを提供する。

【００５８】実施例３中間型ベクター、プラスミドp
ＧＬ２の産生Ａ) プロモーターおよびシグナルペプチド配列の供給
源ＡＴＣＣにカタログ番号２２３４３で寄託されている
Ａ．ニーガー株から得られるＤＮＡから誘導された遺伝
子バンクをプローブして、Ａ．ニーガーのグルコアミラ
ーゼ遺伝子を分離した。このプローブは、バイオサーチ
・オリゴヌクレオチド合成装置とグルコアミラーゼ・タ
ンパク質の公開されているアミノ酸配列の情報を用いて
調製したオリゴヌクレオチド・プローブを用いて行っ
た。アミノ酸配列のデータをヌクレオチド配列データに
“逆翻訳"して、プローブを合成した。プローブされた
特定の遺伝子バンクは、大腸菌内で生存でき、複製し得
る市販のプラスミドpＵＣ１２のＢamＨＩ部位にクロー
ンされた、上述のＡ．ニーガーＤＮＡのＳav３Ａ部分消
化物であった。

【００５９】グルコアミラーゼ遺伝子を含むＨindＩＩ
Ｉ−ＢglＩＩのＤＮＡ断片を、pＵＣ１２にサブクロー
ンした。次いで、所望のプロモーター領域、シグナルペ
プチドのコード領域およびグルコアミラーゼタンパク質
のコード領域の位置を、サブクローンしたフラグメント
を含有するpＵＣ１２中に確認した。

【００６０】ＥcoＲＩ／ＥcoＲＩフラグメント(図１０
参照)の配列を決定し、その配列データをウイスコンシ
ン(Ｗisconsin)大学の配列分析プログラムを用いて分析
した結果、該フラグメントは長く、オープン翻訳解読フ
レームを含んでいることがわかった。

【００６１】ＨindＩＩＩ−ＢglＩＩフラグメント内の
５'ＥcoＲＩ部位とＢssＨＩＩ３'部位の間のグルコアミ
ラーゼ遺伝子の領域部分であるヌクレオチド配列の分析
結果を図１２に示す。この領域には、グルコアミラーゼ
プロモーターおよびシグナルペプチドのコード領域を含
んでいる。

【００６２】このフラグメント内、すなわちヌクレオチ
ド９７−１０２はタータボックス(ＴＡＴＡ box)４８
であり、これは正確な転写開始のために、多くの真核生
物のプロモーター領域に必要とされる部位(多分ＲＮＡ
ポリメラーゼＩＩ結合部位)である。従って、プロモー
ター領域の少なくとも一部分が存在することが確認され
る。さらに、機能的必須部の全てが約１０００塩基の長
さの配列内に含まれているらしく、特にコード領域の開
始コドン、すなわちヌクレオチド２０６−２０８、即ち
メチオニンに対応するコドン“ＡＴＧ"４９の上流の最
初の２００塩基内にあるらしいことを他の既知のプロモ
ーター領域との類似性から予言できる。このように、プ
ロモーターと転写リーダー配列は、ヌクレオチド２０５
で終了する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩ結合部位およびその機能に必要な他の全ての特徴を
含んでいるにちがいないが、プロモーター領域の始まり
を確認することは、それ程重要なことではない。このよ
うに、ＥcoＲＩ−ＥcoＲＩ配列は、グルコアミラーゼ遺
伝子の完全なプロモーター領域を表わしていると考えら
れるがプラスミドpＧＬ２に使用するフラグメントは、
完全なプロモーター領域が、得られたプラスミド中に適
切に含まれることを確実にするために、もっと大きいＨ
indＩＩＩ−ＢamＩ／ＢglＩＩセグメント中にこのフラ
グメントをまぜたものである。

【００６３】成熟グルコアミラーゼのアミノ酸配列が既
知であることに基いて(スベンソン(Ｓvensson)らの“ア
スペルギルス・ニーガー由来の２形態のグルコアミラー
ゼの特徴付け"、カールスベルグ・リサーチ・コミユン
(Ｃarlsberg Ｒes．Ｃommun)、４７、５５−６９(１９
８２)を参照)、シグナルペプチドのヌクレオチド配列を
正確に決定することができる。分泌タンパク質をコード
している遺伝子のシグナルペプチドのコード領域は、Ａ
ＴＧコドン４９によってコードされているメチオニン残
基によって開始することで知られている。ヌクレオチド
配列の開始部分以外、すなわちＡＴＧコドン３'側を確
認することにより、該部分のアミノ酸配列を決定するこ
とのできる情報が得られる。このアミノ酸配列を発表さ
れているアミノ酸配列と比較することによって、その比
較した、発表されている配列に対応する部分が存在しな
いグルコアミラーゼの部分的遺伝子として、シグナルペ
プチドを同定することができる。本明細書で定義されて
いるグルコアミラーゼのシグナルペプチド・コード領域
は、先にこの方法によって確認された。

【００６４】上記の方法により、Ｓau３Ａ部分消化によ
り生成され、pＵＣ１２に組込まれたＨindＩＩＩ−Ｂam
ＨＩ／ＢglＩＩフラグメントが、グルコアミラーゼ遺伝
子の以下の特徴を含むことを確認した:開始部、たぶん
無関係な部分、プロモーター領域、シグナルペプチドの
コード領域、およびコード領域の残りの部分。ＨindＩ
ＩＩ−ＢamＨＩ／ＢglＩＩによる開裂およびライゲイシ
ョンで、pＵＣ１２プラスミドに挿入されたこのフラグ
メントは、図１０にプラスミドpＧＬ１として模式的に
示されている。このプラスミドは、大腸菌中でも依然と
して選択でき、複製できるような、複製などに必要な全
ての特徴を含んでいる。

【００６５】Ｂ) プラスミドpＧＬ２の組立て前駆体としてpＧＬ１を使用して、プラスミドベクターp
ＧＬ２を図１０に示すように形成することができる。本
明細書図１１に示した合成リンカー配列Ａ、Ｂあるいは
Ｃを挿入するために、シグナル配列４２の３'末端近く
の制限部位ＢssＨＩＩを、唯一の下流のＳstＩ部位とと
もに利用する。このように、pＧＬ１をＢssＨＩＩとＳs
tＩのふたつで開裂し、それによって、そこに含まれて
いるグルコアミラーゼのコード領域４６の開始部分を取
り除く。その後、ＢssＨＩＩ／ＳstＩに適合した末端を
持つ様に設計した合成リーダー配列ＡからＣまでのうち
のひとつを選んで挿入し、ライゲイトし、プラスミドp
ＧＬ２を作成する。３つのリンカー配列、即ちＡ、Ｂあ
るいはＣのいずれを使用するかにより、得られたプラス
ミドを、以下、それぞれpＧＬ２Ａ、pＧＬ２Ｂあるいは
pＧＬ２Ｃと呼ぶ。

【００６６】本明細書に示した合成リンカー配列は、図
１１に示す様に単一のＥcoＲＶおよびＢglＩＩ制限部位
を備えており、そこへ所望のタンパク質のコード領域を
挿入する。挿入すれば、得られたプラスミドは、宿主、
たとえばＡ．ニーガー、Ａ．ニデュランスなどを形質転
換するのに使用できる。宿主に認識されるプロモーター
領域およびシグナルペプチドのコード領域が存在するこ
とによって、タンパク質のコード領域を発現させ、その
発現されたタンパク質を分泌させることができる。

【００６７】実施例４ pＧＬ２ＢＩＦＮ作成時のプラ
スミドpＧＬ２の使用プラスミドpＧＬ２の使用例を以下に図１３を参照して
述べる。図１３では、pＧＬ２Ｂ由来のプラスミドpＧＬ
２ＢＩＦＮの組立てを図示している。図１１に示される
合成リンカー配列“Ｂ"を挿入することを除いて、pＧＬ
２に関して一般的に述べた方法に従ってプラスミドpＧ
Ｌ２Ｂを作成する。従って、図１３においては、参照番
号４４を“４４Ｂ"と置き換えた。ベクターpＧＬ２Ｂに
開裂部を設けるために、プラスミドをリンカー４４Ｂの
内部のＥcoＲＶ部位で切断する。開裂によって平滑末端
が生じるが、これは、この目的のために有用であると知
られているリガーゼを使用して、平滑末端を両端に持つ
フラグメントとライゲイトできる。

【００６８】図１３に記載する態様においては、ヒトイ
ンターフェロンα−２のコード領域を含有するフラグメ
ント６０を挿入してpＧＬ２ＢＩＦＮを作成する。具体
的には、ヒトインターフェロンα−２をコードしている
コード領域を含むＤdeＩ−ＢamＨＩフラグメント６０
を、既知であるこの遺伝子の配列および制限地図に基づ
いて、プラスミドpＮ５Ｈ８(表示していない)より取り
出した。

【００６９】プラスミドpＮ５Ｈ８は、既知のプラスミ
ドpＡＴ１５３をＢamＨＩ部位でインターフェロン遺伝
子と結合させたものである。そのインターフェロン遺伝
子は、スロコンブ(Ｓlocomb)らによるプロナス(Ｐrocee
dings of the ＮationalＡcademy of Ｓcience
s)、ＵＳＡ、７９巻、５４５５−５４５９頁(１９８２)
の“ファージＭ１３mp７におけるクローンされたインタ
ーフェロンα−２遺伝子の高レベルの発現およびモノク
ローナル抗体によるその精製"において開示されてい
る。

【００７０】インターフェロン・フラグメントの粘着末
端をpＧＬ２ＢのＥcoＲＶ切断部位にアニールするため
に、逆転写酵素を用いてＤdeＩおよびＢamＨＩ粘着末端
を充填し、常法に従って適当なリガーゼでライゲイトす
る。インターフェロンα−２のコード領域の解読フレー
ムおよび、そのヌクレオチド配列、および適当な場合に
はアミノ酸配列についての再生されたシグナルペプチド
配列との関係を示している図１４により、pＧＬ２の挿
入のためにリンカー配列Ｂを選ぶのが都合よいことは明
らかであろう。

【００７１】図１４は、４９におけるメチオニンコドン
ＡＴＧから始まり、５０におけるリジンコドンＡＡＧで
終わるグルコアミラーゼのシグナルペプチド配列４２部
分に連結した、シグナル配列の５'部にあるプロモータ
ー領域４０の部分を表わしている。実際には、シグナル
ペプチドのコード領域は、さらにひとつの残基、つまり
５２におけるアルギニンに対応するＣＧＣコドンまで延
びているが、この残基は、リンカー配列を挿入するため
の開裂およびライゲイションの間に欠損したアルギニン
残基を補うように操作された合成リンカー配列４４Ｂに
よって構成されている。この様にすれば、シグナルの遺
伝子配列は、もとのままである。

【００７２】同様にリンカー配列は、解読フレームを変
更することなく、インターフェロンα−２のコード領域
の挿入を可能にする。図１３および図１４は、ＥcoＲＶ
によるリンカー配列４４Ｂの開裂により、平滑末端を有
するリンカー・フラグメント４４Ｂ'および４４Ｂ"が得
られることを示している。インターフェロンα−２コー
ド領域をＤdeＩ部位で切り取り、その酵素によって形成
した粘着末端を充填すると、コード領域の配列をきずつ
けずに所望のヌクレオチド配列がつくられる。ＤdeＩ部
位を充填したインターフェロン配列をＥcoＲＶで開裂し
たリンカー配列内にライゲイションしたものは、リンカ
ーの４４Ｂ'部とインターフェロンのコード領域６０の
間のトリプレット・コドン状態で明らかのように、イン
ターフェロンコード領域の本来の解読フレームを維持し
ている。万一、リンカーＢよりもヌクレオチドがひとつ
少ない図１１に示すリンカーＡを選ぶと、ひとつのヌク
レオチドによって全解読フレームがシフトし、ナンセン
ス配列となってしまうだろう。合成リンカーＢを選ぶこ
とによって、平滑末端にしたＩＦα−２フラグメントを
正しく方向づける時に、コード領域の解読フレームを変
えないシグナルペプチド配列とインターフェロンのコー
ド領域の間のコドンを使用することができる。正しい方
向性は、ライゲイション結合部にまたがる挿入体をもっ
たクローンの塩基配列を決めることによって選択する。

【００７３】実施例５ pＧＬ２ＢＩＦＮＡＴＣＣ
５３３７１で形質転換されたＡ．ニデュランスからの発
現および分泌プラスミドpＧＬ２ＢＩＦＮを同時形質転換した。すな
わち、米国特許出願通し番号６７８,５７８(１９８４年
１２月５日出願)により詳しく記載されているＡrgＢ ⁺遺
伝子を含有するプラスミドでＡ．ニデュランスのＡrgＢ
^-菌株を、argＢ選択マーカーを含有する別のプラスミド
といっしょに同時形質転換した。ＡrgＢ ⁺形質転換体を
選択すると、その２０個のうち１８個が１−１００のコ
ピー数のヒトインターフェロンα−２のコード領域を含
有していた。

【００７４】いくつかの形質転換体をでんぷん培地上で
培養し、グルコアミラーゼ・プロモーターを誘導して、
セルテック(ＣellＴech)ＩＦα−２分析キットを用い
て、細胞外媒質を定量してヒトＩＦα−２を分析した。
全ての形質転換体が、あるレベルの合成と、定量可能な
タンパク質の分泌を示した。２つのコントロール(対
照)、つまり宿主菌株(形質転換されていないもの)およ
び検出可能なヒトＩＦα−２ＤＮＡを持たないひとつの
argＢ⁺形質転換体については、ＩＦα−２タンパク質の
合成を検出できなかった。別の実験では、必要な変更を
加えた上記と同様の方法で、pＧＬ２ＢＩＦＮを用い
て、Ａ．ニデュランスの代りにＡ．ニーガーを形質転換
すると、ＩＦα−２分泌能力を有するＡ．ニーガーが観
察された。

【００７５】プロモーターとpＧＬ２ＢＩＦＮのシグナ
ル領域は、Ａ．ニーガー由来であるけれど、それらは
Ａ．ニデュランスおよびＡ．ニーガーの両方において機
能し得ることがわかる。本発明においては、グルコアミ
ラーゼのプロモーター領域以外のプロモーター領域も使
用できる。図１〜図７に示したアルコールデヒドロゲナ
ーゼＩ遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子
のプロモーター領域を使用するのが適当である。

【００７６】実施例６プラスミドpＡＬＣＡＩＳ、Ａ
ＴＣＣ５３３６８中間型ベクターの組立て本実施例では、受託番号５３１６９の下、宿主、Ｅ．Ｃ
oli(大腸菌)ＪＭ８３に入れてＡＴＣＣに保管されてい
る１０．３kbプラスミドpＤＧ６中に含まれているalcＡ
プロモーターを使用した。pＤＧ６のプラスミド地図を
図８に示す。尚、alcＡプロモーターを使用するもうひ
とつの態様の例示を容易にするために、ここで参照する
図１５にもこのプラスミドを示す。

【００７７】pＤＧ６は、そのＨindＩＩＩ−ＥcoＲＩ
(最初のもの)セグメント中に、alcＡ遺伝子のプロモー
ター領域２２および開始コドンの３'側にあるalcＡコー
ド領域の５'部分も一部含んでいる(エンドグルカナーゼ
のコード領域３０と結合している)。さらにpＤＧ６は、
Ｃ．フィミのエンドグルカナーゼのコード領域２０の下
流に多数のクローン部位６２を含んでいる。

【００７８】alcＡプロモーター領域２２を得るため、p
ＤＧ６をＰstＩおよびＸhoＩで切断し、エンドグルカナ
ーゼのコード領域の大部分を除去した。第２の工程で
は、この直線化したプラスミド６４を、エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ(これはＸhoＩ−切断ＤＮＡ末端から切除し
て行くが、ＰstＩ末端からは切除しない)を用いる制御
された方法で１方向から切除し、次いでＳ１ヌクレアー
ゼで仕上げた。酵素がalcＡＡＴＧコドンの５'側５０塩
基の位置までヌクレオチドを除去し、ＴＡＴＡボックス
を残し、メッセンジャーＲＮＡの開始部位を無傷のまま
残す様に切断を調節した。

【００７９】切除した後、ベクター６６を再ライゲート
(再環状化)し、プロモーター領域２２のすぐ下流に，Ｓ
alＩ−ＸbaＩ制限部位を有するベクター６８を創製し
た。ＳalＩ／ＸbaＩによるベクター６８の切断により、
ベクター内の適切な位置にシグナルペプチドのコード領
域を導入することが可能になる。

【００８０】本実施例で用いる特定のシグナルペプチド
のコード領域を合成してヘイジン[Ｇ．Ｖon Ｈeijne,
Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．,１７−２１(１９８３)]が開示し
ている常法に従って同定される特徴あるシグナルペプチ
ドのコード領域を作成した。ＳalＩ切断部位に相補的な
５'側配列、およびＸbaＩ制限配列とライゲーションし
うる３'側配列を供するようにこの合成シグナルを設計
した。

【００８１】この合成分泌シグナル６８の配列は以下の
式で示される。

【化２】

【００８２】この分泌シグナル自身はＭetで始まり、矢
印で示した４回目のＡlaで終わる。シグナルとして作用
するこの合成配列６８が得られたなら、これをベクター
７０のＳalＩ−ＸbaＩ部位にクローニングし、alcＡプ
ロモーター領域２２および合成ペプチドシグナルのコー
ド領域６８を含有するプラスミドpＡＬＣＡ１Ｓを得
る。このシグナルペプチドのコード領域が多重クローニ
ング部位６２の上流に挿入されているということは、こ
の部位６２が、種々のタンパク質のコード化セグメント
をこのプラスミド内にクローニングすることを可能にし
ている部位であるという点で重要である。従って、pＡ
ＬＣＡ１Ｓは本発明の重要な具体例である。

【００８３】実施例７プラスミドpＡＬＣＡ１ＳＩＦ
Ｎの構築 pＡＬＣＡ１Ｓの有用性の例として、pＡＬＣＡ１ＳＩＦ
Ｎの創製を示す図１６について言及する。このプラスミ
ドは、alcＡ遺伝子のプロモーター領域２２および合成
シグナルペプチドのコード領域６８[この両者はpＡＬＣ
Ａ１Ｓ(図１５)由来である]を含有する。さらに、この
プラスミドはpＧＬ２ＢＩＦＮ由来のヒトインターフェ
ロンα−２をコードしているコード領域６０を含有して
いる。

【００８４】タンパク質のコード化セグメントを得るた
めに、pＧＬ２ＢＩＦＮをＥcoＲＩで切断し、そしてＢg
lＩＩで部分的に切断する(内部にＢglＩＩ部位が存在す
るので)。このタンパク質のコード領域の挿入は、pＡＬ
ＣＡ１ＳをＢamＨＩおよびＥcoＲＩで切断し(この両者
は、多重クローニング部位６２中に存在する)、そこへ
該コード領域をライゲートすることによって行なわれ、
こうしてpＡＬＣＡ１ＳＩＦＮが創製される。

【００８５】得られたプラスミドのヌクレオチド配列、
すなわちＨindＩＩＩの１１７０ヌクレオチド下流の部
位からＥcoＲＩまでを、制限エンドヌクレアーゼ消化の
関連部位を表示する図１７〜図２１に示す。図１９か
ら、このＩＦα−２コード領域６０が合成シグナルペプ
チドのコード領域６８の適切な解読フレーム内に存在す
ることがわかるであろう。

【００８６】実施例８プラスミドＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ
で形質転換したＡ．ニデュランスからの発現および分泌上記のようにして調製したプラスミドpＡＬＣＡ１ＳＩ
ＦＮをＡ．ニデュランスといっしょにして同時形質転換
してargＢ選択マーカーを付与し、このargＢ＋形質転換
体を選別し、ヒトインターフェロンα−２のコード領域
の存在についてチェックし、次いでスレオニン含有培地
で増殖させてalcＡプロモーターを誘起した(すべて前記
実施例３の記載と同様にして)。セル・テク(Ｃell Ｔe
ch)ＩＦα−２検定キットを用いて、この細胞外培地を
ヒトＩＦ−２について検定した。形質転換体２０個のう
ち１１個が、スレオニンの存在下で誘起され、そしてグ
ルコースの存在下で抑制されるインターフェロンの分泌
を示した。

【００８７】実施例９ pＧＬ２ＣＥＮＤＯＡＴＣＣ
５３３７２リンカー配列“Ｂ"のかわりに合成リンカー配列“Ｃ"
(図１１)を用い、図１３で示されるpＧＬ２ＢＩＦＮに
類似しているが、インターフェロン２コード領域のかわ
りにエンドグルカナーゼコード領域を含有する、pＧＬ
２ＣＥＮＤＯと命名したベクタープラスミドを、プラス
ミドpＧＬ２ＣＡＴＣＣ５３３６７から、前記実施
例に記載の方法に従って構築した。Ｃ．フミイ(Ｃ．fim
i)エンドグルカナーゼコード領域３０を含有するＢamＨ
ＩフラグメントをpＧＬ２ＣのＢglＩＩ部位に挿入し
た。Ａ．ニデュランス形質転換体はこのベクタープラス
ミドから調製され、この形質転換体はデンプン調節性の
セルラーゼ分泌を示した(実施例１の記載のようにして
検定して)。ベクタープラスミドpＧＬ２ＣＥＮＤＯの地
図を添付の図２２に示すが、ここで３０はエンドグルカ
ナーゼコード領域(図８および実施例１に関連して記載
した、セルロモナス・フィミのエンドグルカナーゼコー
ド領域)を、４２はグルコアミラーゼ遺伝子のシグナル
ペプチドのコード領域を、そして４０はグルコアミラー
ゼ遺伝子のプロモーター領域を示す。このヌクレオチド
配列を図２３に示すが、これは、リンカー配列Ｃ(図１
１)の使用によってシグナルペプチドコード化領域４２
およびエンドグルカナーゼコード化領域３０の解読フレ
ームが保持されていることを例証している。

【００８８】実施例１０プラスミドpＡＬＣＡ１ＳＥ
ＮＤＯＡＴＣＣ５３３７０の構築前記実施例に記載の方法に従い、実施例５(図１５）に
記載したようにしてＥcoＲＩで直線化したプラスミドp
ＡＬＣＡ１Ｓを、プラスミドpＤＧ５Ｂ(pＵＣ１２が逆
向きであるＨindＩＩＩフラグメントの配向を有するpＤ
Ｇ５;図８参照)由来であり、かつエンドグルカナーゼコ
ード化領域３０を含有するＥcoＲＩフラグメントと結合
させることによって、pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯと命名し
たベクタープラスミドを構築した。pＡＬＣＡ１ＳＥＮ
ＤＯの地図を図２４に示し、その関連領域のヌクレオチ
ド配列を図２５及び図２６に示す。これらの図におい
て、alcＡ由来のプロモーター領域は数字２２で、合成
シグナルペプチドコード化領域は６８で、そしてエンド
グルカナーゼコード化領域は３０で表示する。

【００８９】実施例１１ pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯおよ
びpＧＬ２ＣＥＮＤＯで形質転換したＡ．ニデュランス
からの発現および分泌前記のようにして調製したプラスミドpＡＬＣＡ１ＳＥ
ＮＤＯまたはpＧＬ２ＣＥＮＤＯおよびargＢ＋選別可能
マーカーで、Ａ．ニデュランスを同時形質転換した。得
られた同時形質転換体のうち数個が、実施例１に記載し
たものと同じモノクローナル抗体試験系およびカルボキ
シメチルセルロースプレートで検定したとき、レベルの
異なるセルラーゼ(すなわちエンドグルカナーゼ)の分泌
を示した。両プラスミドの形質転換体は、結合させたプ
ロモーターによって制御される分泌を示した。プラスミ
ドpＧＬ２ＣＥＮＤＯはデンプンで誘起し、pＡＬＣＡ１
ＳＥＮＤＯはスレオニンで誘起した。

【００９０】実施例１２ pＧＬ２ＣＥＮＤＯで形質転
換したＡ．ニーガーからの発現および分泌Ａ．ニーガーをargＢ＋選択マーカーおよびプラスミドp
ＧＬ２ＣＥＮＤＯで同時形質転換した。形質転換体のい
くつかがレベルの異なるエンドグルカナーゼの分泌を示
した(実施例１に記載のように検定して)。この分泌は培
地中にデンプンを存在させることによって誘起した。

【００９１】実施例１３増加させたコピー数の調節遺
伝子アスペルギルス・ニデュランスにおいて適切な誘導物質
(たとえばエタノール)の存在下、alcＲ(alcＡのための
陽性調節遺伝子)の遺伝子産物の作用によって、alcＡプ
ロモーターを作動させる。多重コピー形質転換体(多数
のalcＡプロモーターを含有する)を有する証拠は、alc
Ｒ遺伝子産物が、数個のalcＡプロモーター(刺激を必要
とする)のプロモーター機能を制限していることを示唆
する。alcＲ遺伝子のコピー数の増加はalcＲの発現を増
加させ、このような状況を改善する。この証拠は以下の
ようである。

【００９２】多重のalcＲという状況下(alcＲメッセン
ジャーＲＮＡを過剰生産することがわかっている)で
は、それ自身のコード領域(ＡＤＨＩ)と融合した多重
コピーalcＡプロモーターを有する形質転換体は、エタ
ノール上では十分に増殖しない。これは、おそらくエタ
ノールのＡＤＨ分解の産物であるアルデヒドの急速な蓄
積によるものであろう。これらの菌株中のＡＤＨ活性は
高い。コピー数の増加によりＡＤＨ活性が増加したとい
うのが、おそらくこれらの観察結果の説明となろう。

【００９３】多重alcＲという状況下では、インターフ
ェロンα−２と融合した多重コピーalcＡプロモーター
を有する形質転換体は、かなり高レベルの分泌インター
フェロンを産生する。これらの菌株においては、単一コ
ピーalcＲを有する菌株と異なり、より多数のalcＡプロ
モーターがalcＲ調節タンパク質を利用することができ
る。

【００９４】すなわち、本発明の好ましい態様は、形質
転換されたときには所望のタンパク質を分泌するであろ
う糸状菌類宿主に、コード領域を導入するための手段を
提供するものである。この目的のための特に有用な中間
型プラスミドはpＡＬＣＡ１ＳおよびpＧＬ２(Ａ、Ｂま
たはＣ)である。

【００９５】これらのプラスミドから創製された有用な
形質転換ベクターには、pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ、pＧＬ２
ＢＩＦＮ、pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯおよびpＧＬ２ＣＥＮ
ＤＯが含まれる。これらのプラスミドおよび本明細書に
挙げたその他のプラスミドそれぞれの培養物は、現在永
久生存しうる状態でアレリックス社(Ａllelix Ｉnc．,
６８５０Ｇoreway Ｄrive,Ｍississauga,Ｏntario,
Ｃanada)の研究室に保管されている。これらのプラスミ
ドは、本特許出願が継続している間じゅうこの状態で保
管し、許可を与えられた者が利用できるようにする。本
出願について特許が付与された後は、ブダペスト条約に
基づいて認められたＡＴＣＣ寄託機関から制限されるこ
となく利用することができるようにする。寄託物および
それぞれの受託番号を以下の表に挙げる。

【００９６】

【表１】プラスミド宿主受託番号寄託日 pＤＧ６Ｅ.コリＪＭ83 53169 1985年6月7日 pＧＬ２Ａ〃 53365 1985年12月16日 pＧＬ２Ｂ〃 53366 〃 pＧＬ２Ｃ〃 53367 〃 pＡＬＣＡ１Ｓ〃 53368 〃 pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯ〃 53370 〃 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮ〃 53369 〃 pＧＬ２ＢＩＦＮ〃 53371 〃 pＧＬ２ＣＥＮＤＯ〃 53372 〃 pＡＬＣＡ１ＡＭＹ〃 53380 1985年12月20日

【図面の簡単な説明】

【図１】アスペルギルス・ニデュランスのアルコール
デヒドロゲナーゼＩ(alcＡ)遺伝子におけるコード領域
およびプロモーター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列
の前段の模式図である。かかるＤＮＡ塩基配列の模式図
は図１〜図３まで連続的である。

【図２】アスペルギルス・ニデュランスのアルコール
デヒドロゲナーゼＩ(alcＡ)遺伝子におけるコード領域
およびプロモーター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列
の中段の模式図である。

【図３】アスペルギルス・ニデュランスのアルコール
デヒドロゲナーゼＩ(alcＡ)遺伝子におけるコード領域
およびプロモーター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列
の後段の模式図である。

【図４】Ａ．ニデュランスのアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ(aldＡ)遺伝子におけるコード領域およびプロモー
ター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列の一部の模式図
である。かかるＤＮＡ塩基配列の模式図は図４〜図７ま
で連続的である。

【図５】Ａ．ニデュランスのアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ(aldＡ)遺伝子におけるコード領域およびプロモー
ター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列の一部の模式図
である。

【図６】Ａ．ニデュランスのアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ(aldＡ)遺伝子におけるコード領域およびプロモー
ター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列の一部の模式図
である。

【図７】Ａ．ニデュランスのアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ(aldＡ)遺伝子におけるコード領域およびプロモー
ター領域を構成しているＤＮＡ塩基配列の一部の模式図
である。

【図８】糸状菌類細胞を形質転換するのに有効なプラ
スミドpＤＧ６を組立てる方法の概略的模式図である。

【図９】図８のプラスミドpＤＧ６の一部分の線状表
示図である。

【図１０】 pＧＬ１およびpＧＬ２のプラスミド地図の
概略的模式図である。

【図１１】プラスミドpＧＬ２への挿入のための合成
リンカー配列の選択性の模式図である。

【図１２】 pＧＬ２のフラグメントのヌクレオチド配
列の模式図である。

【図１３】 pＧＬ２ＢおよびpＧＬ２ＢＩＦＮのプラス
ミド地図の模式図である。

【図１４】 pＧＬ２ＢＩＦＮのフラグメントのヌクレ
オチド配列の模式図である。

【図１５】プラスミドpＡＬＣＡ１Ｓおよびその作成
方法の模式図である。

【図１６】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのプラスミド地図お
よびその作成方法の模式図である。

【図１７】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのフラグメントのヌ
クレオチド配列の一部の模式図である。かかる配列の模
式図は図１７〜図２１まで連続的である。

【図１８】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのフラグメントのヌ
クレオチド配列の一部の模式図である。

【図１９】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのフラグメントのヌ
クレオチド配列の一部の模式図である。

【図２０】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのフラグメントのヌ
クレオチド配列の一部の模式図である。

【図２１】 pＡＬＣＡ１ＳＩＦＮのフラグメントのヌ
クレオチド配列の一部の模式図である。

【図２２】 pＧＬ２ＣＥＮＤＯのプラスミド地図の模
式図である。

【図２３】 pＧＬ２ＣＥＮＤＯのフラグメントのヌク
レオチド配列の模式図である。

【図２４】 pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯのプラスミド地図
である。

【図２５】 pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯのフラグメントの
ヌクレオチド配列の一部の模式図である。かかる配列の
模式図は図２５〜図２６まで連続的である。

【図２６】 pＡＬＣＡ１ＳＥＮＤＯのフラグメントの
ヌクレオチド配列の模式図である。

【図２７】プラスミドpＡＬＣＡ１ＡＭＹおよびその
作成方法の模式図である。

【図２８】図２７に示すpＡＬＣＡ１ＡＭＹのセグメ
ントのヌクレオチド配列の模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者フランシス・ポール・バクストンカナダ国オンタリオ、トロント、インディアン・ロード727番 (72)発明者マーク・ハドソン・ピケットカナダ国オンタリオ、ブランプトン、アプト1105、ナイツブリッジ・ロード３番 (72)発明者ロジャー・ウェイン・デイビスカナダ国オンタリオ、ライムハウス、アール・アールナンバー１番 (72)発明者クロディオ・スカゾキオフランス国ビュール・シュール・イベット91440、リュ・ドゥ・ロワヨーム14、パルク・ドゥ・ビュール６番 (56)参考文献特表昭59−501694（ＪＰ，Ａ) ＥＭＢＯ．Ｊ，1984［３］ｐ．1581− 1586 ＧＥＮＥ，1985［33］ｐ．137−149

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．アスペルギルス遺伝子由来の、アスペルギルスの構
造遺伝子の上流に位置する少なくとも約８００ヌクレオ
チドからなる誘導性プロモーター及び、そのプロモータ
ーにとって外来性であるポリペプチドをコードする、そ
のプロモーターと作動可能に連結されたＤＮＡフラグメ
ントを含有するＤＮＡ構築物、を含有する形質転換され
たアスペルギルス株の細胞中でタンパク質を発現させる
方法。２．形質転換されたアスペルギルス株の細胞が該ＤＮＡ
構築物の多重コピーを含有している、請求項１に記載の
方法。３．形質転換されたアスペルギルス株が形質転換された
アスペルギルス・ニデュランス株である請求項１又は請
求項２に記載の方法。４．形質転換されたアスペルギルス株が形質転換された
アスペルギルス・ニーガー株である請求項１又は請求項
２に記載の方法。５．該プロモーターがアスペルギルス・ニデュランスの
遺伝子由来のものである、請求項１から請求項４までの
いずれかに記載の方法。６．該プロモーターがアスペルギルス・ニデュランスの
アルコールデヒドロゲナーゼ又はアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子由来のものである、請求項５に記載の方
法。７．該プロモーターがアスペルギルス・ニーガーの遺伝
子由来のものである、請求項１から請求項４までのいず
れかに記載の方法。８．該プロモーターがアスペルギルス・ニーガーのグル
コアミラーゼ遺伝子由来のものである、請求項１から請
求項４までのいずれかに記載の方法。９．該ポリペプチドがアスペルギルスにとって外来性で
ある、請求項１から請求項８までのいずれかに記載の方
法。１０．シグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメン
トが該プロモーターとポリペプチドをコードする該ＤＮ
Ａフラグメントとの間に存在しており、そのシグナルペ
プチド及びポリペプチドをコードする両ＤＮＡフラグメ
ントが作動可能に連結され、それによりアスペルギルス
にて発現させた場合にそのポリペプチドが分泌されるこ
とを特徴とする、請求項１から請求項９までのいずれか
に記載の方法。１１．該シグナルペプチドが該ポリペプチドに本来のも
のである請求項１０に記載の方法。１２．該シグナルペプチドが該プロモーターに本来のも
のである請求項１０に記載の方法。１３．該シグナルペプチドが該プロモーター及び該ポリ
ペプチドにとって外来性である請求項１０に記載の方
法。