DK175554B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i en filamentös fungusværtscelle - Google Patents

Description

DK 175554 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår ekspression og ekspression efterful|t\af> sekretion af proteiner fra filamentøse fungi.

Et formål med rekombinant DNA-teknologi er indsætning af DNA-segmenter, som koder 5 for kommercielt eller videnskabeligt værdifulde proteiner, i en værtscelle, som er let tilgængelig på økonomisk måde. De gener, der udvælges til indsætning, er normalt gener, der koder for proteiner, som kun produceres i begrænsede mængder af deres naturlige værter, eller gener, som er naturlige for værter, der er for kostbare at dyrke. Overførsel af genetisk information på reguleret måde til en vært, som er i stand til at producere 10 proteinet enten i stort udbytte eller på mere økonomisk måde i et lignende udbytte, giver et mere ønskeligt medium til proteinproduktion.

Gener, der koder for proteiner, indeholder promotorområder af DNA, som i det væsentlige er bundet til 5'-terminalen af det proteinkodende område. Promotorområderne indeholder 15 bindingsstedet for RNA-polymerase II. RNA-polymerase II katalyserer på effektiv måde samlingen af det messenger-RNA, der er komplementært med den relevante DNA-streng fra det kodende område. I de fleste promotorområder findes der en nukleotidbasesekvens, der er beslægtet med sekvensen, der normalt betegnes en MTATA-kasse", hvilken sekvens almindeligvis befinder sig i nogen afstand opstrøms for starten af det kodende område og 20 kræves til nøjagtig transkriptionsinitiering. Andre elementer, der er vigtige eller essentielle for, at det kodende område fungerer og regulerer på korrekt måde, er også indeholdt i promotorområdet opstrøms fra starten af det kodende område.

Filamentøse fungi, især de filamentøse ascomyceter såsom Aspergillus, fx Aspergillus 25 niger, udgør en klasse af mikroorganismer, der er egnede som modtagere af fremmede gener, der koder for værdifulde proteiner. Aspergillus piger og dermed beslægtede arter anvendes for tiden i stor udstrækning ved den industrielle produktion af enzymer, fx til anvendelse i levnedsmiddelindustrien. Deres anvendelse bygger på mikroorganismens sekretionsevne. Eftersom de er godt karakteriserede og på grund af deres brede 30 anvendelse og godkendelse, findes der både et industrielt og videnskabeligt incitament til at benytte genetisk modificerede og forbedrede celler af A. niger og beslægtede arter, herunder A. nidulans, for at opnå nyttige proteiner.

Ekspression og sekretion af fremmede proteiner fra filamentøse fungi er endnu ikke blevet 35 opnået. Det er på ingen måde klart, at de strategier, som har været anvendt med held i gær, vil være vellykkede i filamentøse fungi såsom Aspergillus. Det har vist sig, at gær er et uhensigtsmæssigt system til ekspression af filamentøse fungusgener (Pentilla et al.,

Molec. Gen. Genet. 194, 1984, s. 494-499), og at gærgener ikke udtrykkes i filamentøse fungi. Genetiske manipulationsteknikker er for nylig blevet udviklet for Aspergillus nidulans 40 og Aspergillus niger. Disse teknikker omfatter inkorporering af exogent tilføjede gener til Asperg/7/us-genomet i en form, i hvilken de er i stand til at blive udtrykt.

Indtil nu er ingen fremmede proteiner blevet udtrykt i og secerneret fra filamentøse fungi under anvendelse af disse teknikker. Dette har skyldtes mangel på hensigtsmæssige

I DK 175554 B1 I

I _________________________2 _ _ ....... . . _ _____________________ . _ _ I

ekspressionsvektorer og de bestanddele, der udgør dem. Disse bestanddele omfatter I

I Asperg/7/us-promotorsekvenser som beskrevet ovenfor, det område, som koder for det I

I ønskede produkt, samt de dermed forbundne sekvenser, der kan være tilføjet for at lede I

det ønskede produkt hen til det ekstracellulære medium. I

I 5 I

I Som nævnt ovenfor kræver værtscellens ekspression af det fremmede gen tilstedeværelse I

I af et promotorområde opstrøms for det område, der koder for proteinet. Dette I

I promotorområde er aktivt til regulering af transkriptionen af det kodende område, I

I hvormed det er forbundet, til messenger-RNA, som til slut translateres til det ønskede I

I 10 proteinprodukt. De således producerede proteiner kan kategoriseres i to klasser på basis af I

I deres skæbne i forhold til værten. I

I En første klasse af proteiner bevares intracellulært. Ekstraktion af det ønskede protein, når I

det er intracellulært, kræver, at den genetisk manipulerede vært åbnes eller lyseres for at I

I 15 frigøre produktet til endelig oprensning. Intracellulær produktion har flere fordele. I

I Proteinproduktet kan koncentreres, dvs. pelleteres, med cellemassen, og hvis produktet er I

I labilt under ekstracellulære betingelser eller er strukturelt ude af stand til at blive I

secerneret, er dette en ønskelig produktions- og oprensningsmetode. I

20 En anden klasse af proteiner er de proteiner, der secerneres fra cellen. I dette tilfælde I

I udføres der oprensning på det ekstracellulære medium og ikke på selve cellen. Produktet I

I kan ekstraheres ved metoder såsom affinitetschromatografi, og kontinuerlig I

I strømningsfermentering er mulig. Visse produkter ér også mere stabile ekstracellulært og I

I drager fordel af ekstracellulær oprensning. Forsøg har vist, at sekretion af proteiner i I

25 eukaryoter næsten altid dikteres af et sekretionssignalpeptid (i det følgende betegnet I

signalpeptid), der sædvanligvis befinder sig ved proteinets aminoterminal. Signalpeptider I

I har karakteristiske fordelinger, hvilket er beskrevet af G. Von Heijne i Eur. J. Biochem, I

I 1983, s. 17-21, og vil kunne genkendes af fagfolk. Når signalpeptidet genkendes af cellen, I

dirigerer det proteinet ind i cellens sekretionsbane. Under sekretionen spaltes I

I 30 signalpeptidet fra, hvilket gør det muligt at høste proteinet i moden form fra det I

I ekstracellulære medium. I

I Begge proteinklasser, intracellulær og ekstracellulær, indkodes af gener, som indeholder et I

I promotorområde koblet til et kodende område. Gener, der koder for ekstracellulært I

I 35 dirigerede proteiner, er forskellige fra gener, der koder for intracellulære proteiner, ved, at I

I i gener, der koder for ekstracellulære proteiner, koder den del af det kodende område, der I

I er tættest på promotoren (hvilket er den første del, der transkriberes af RNA-polymerase), I

I for et signalpeptid. Den nukleotidsekvens, der koder for signalpeptidet, og som i det I

I følgende betegnes det signalpeptid-kodende område eller signalsekvensen, er i sig selv I

I 40 operativt en del af det kodende område. I

I Der er nu udviklet et system, hvorved fi|amentøse fungi kan transformeres til at udtrykke I

I et ønsket protein. Med dette system kan transformation give en filamentøs fungus, der er i I

I stand til ikke blot at udtrykke proteinet, men også at secernere dette protein, uanset om I

3 DK 175554 B1 proteinet er et naturligt secerneret protein eller ej. Desuden kan den mængde, i hvilken . proteinet udtrykkes, reguleres ifølge visse aspekter af opfindelsen. Det vil være klart for fagfolk, at det omhandlede system gør det muligt, at filamentøse fungi fungerer som værdifulde proteinkilder og udgør et alternativ, som til mange anvendelser er bedre end 5 bakterie- og gærsystemer.

I den foreliggende opfindelse identificeres og isoleres glycoamylase-promotorområdet fra A. niger, og forbindes hensigtsmæssigt i et funktionelt forhold med et andet, forskelligt kodende område uden for cellen, hvorefter det igen indføres i en filamentøs værtsfungus 10 under anvendelse af en hensigtsmæssig vektor. Transformerede værtsceller udtrykker proteinet fra det andet kodende område under kontrol af det indsatte promotorområde.

Det andet kodende område kan være et område, som er fremmed for værtsarten, i hvilket tilfælde værten udtrykker og i nogle tilfælde secernerer et protein, der ikke naturligt udtrykkes af den givne vært. Alternativt kan det andet kodende område være et område, 15 som er naturligt for værten, i hvilket tilfælde det er forbundet med et promotorområde, der er forskelligt fra det promotorområde, hvormed det naturligt er forbundet i den givne vært, hvilket giver modificeret eller forøget proteinekspression og -sekretion.

Hvis det andet kodende område er et område, der koder for et protein, som normalt 20 secerneres, indeholder det en sekvens af nukleotider ved sin 5'-terminal, dvs. et signalpeptid-kodende område, som efter transkription og translation vil resultere i tilstedeværelse af et signalpeptid ved proteinproduktets aminoterminal. Signalpeptidet kan genkendes af fungusværten, og proteinproduktet kan derefter styres ind i cellens sekretionsbane og secerneres.

25

Den foreliggende opfindelse giver mulighed for at indføre fremmede kodende områder i filamentøse fungi sammen med promotorer, hvilket gør det muligt, at værtsfungusen udtrykker forskellige proteiner, Den giver også mulighed for at regulere transkription af de individuelle gener, som naturligt forekommer deri, eller fremmede gener, der indføres deri, 30 via det promotorområde, der er blevet indført i værten sammen med genet.

Ifølge opfindelsen induceres det promotorområde, der naturligt er forbundet med glycoamylase-genet i Aspergillus niger positivt ved hjælp af stivelse og andre sukkere.

35 Foretrukne værter ifølge opfindelsen er filamentøse fungi af ascomycetes-klassen, især Aspergillus sp., herunder A. niger, A. nidulans og lignende.

Den foreliggende opfindelse anvender promotorområdet fra Aspergillus niger-glucoamylase-genet til fremstilling af et hensigtsmæssigt vektorplasmid.

40

Destinationen for proteinproduktet fra det kodende område, som er blevet udvalgt til ekspression under kontrol af den ovenfor beskrevne promotor, bestemmes af dette kodende områdes nukleotidsekvens. Hvis proteinproduktet naturligt ledes til det ekstracellulære miljø, vil det som nævnt iboende indeholde et sekretionssignalpeptid-

I DK 175554 B1 I

I _____ ___________4 _________ __________________ I

I kodende område. Proteinprodukter, der normalt befinder sig intraceilulært, mangler dette I

I signalpeptid. I

I I nærværende beskrivelse er det derfor klart, at et "kodende område” koder for et protein, I

I 5 der enten bevares intraceilulært eller secerneres. (Dette "kodende område" betegnes I

I undertiden inden for teknikken et strukturgen, dvs. den del af et gen, som koder for et I

I protein.) Hvis proteinet bevares inde i den celle, som producerer det, mangler det kodende I

I område sædvanligvis et signalpeptid-kodende område. Sekretion af det protein, der I

I indkodes inden for det kodende område, kan være en naturlig konsekvens af I

I 10 cellemetabolisme, i hvilket tilfælde det kodende område iboende indeholder et I

I signalpeptid-kodende område, der er forbundet naturligt i translationslæseramme med et I

I segment fra det kodende område, der koder for det secernerede protein. I dette tilfælde I

I kræves der ikke indsætning af et signalpeptid-kodende område. I

I 15 Opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor I

I fig. 1A viser basesekvensen af det DNA, der udgør det kodende område og I

I promotorområdet i alkohol·dehydrogenase I- (a/cA)-genet fra Aspergillus nidulans, I

I fig. IB viser basesekvensen af det DNA, der udgør det kodende område og promotor I

I området i aldehyd-dehydrogenase- (a/c/A)-genet fra Aspergillus nidulans, I

I 20 fig. 2 viser i diagram en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pDG6, der er I

I nyttigt ved transformation af en filamentøs funguscelle, I

fig. 3 viser lineært en del af det i fig. 2 viste plasmid pDG6, I

I fig. 4 viser i diagram plasmidkortene over pGLl og pGL2, I

I fig. 5 viser et udvalg af syntetiske linker-sekvenser til indsætning i plasmidet pGL2, I

25 fig. 6 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGL2, I

fig. 7 viser plasmidkortet over pGL2B og pGL2BIFN, I

I fig. 8 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGU2BIFN, I

I fig. 9 viser plasmidet pALCAlS og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, I

I fig. 10 viser plasmidkortet over pALCAlSIFN og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, I

I 30 fig. 11 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pALCAlSIFN, I

I fig. 12 viser plasmidkortet over pGL2CENDO, I

I fig. 13 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGL2CENDO, I

I fig. 14 viser plasmidkortet over pALCAISENDO, I

I fig. 15 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pALCAlSENDO, I

I 35 fig. 16 viser plasmidet pALCAlAMY og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, og I

I fig. 17 viser nukleotidsekvensen af et segment af det i fig. 16 viste plasmid pALCAlAMY. I

I I den foreliggende opfindelse identificeres et promotorområde fra A. n/ger-glycoamylase- I

genet. Fremgangsmåder til identifikation af hvert af de gener, som indeholder de ønskede I

40 promotorområder, er ens, og af denne grund beskrives den måde, hvorpå afcA-genet og I

I promotoren deri lokaliseres og identificeres. Til dette formål induceres celler af den valgte I

I art til at udtrykke det udvalgte protein, fx alcA, og ud fra disse celler isoleres messenger- I

I RNA’et. En del deraf, som endnu ikke er identificeret, koder for alcA. Komplementært DNA I

I til fragmenterne fremstilles ud fra mRNA-fragmenterne og klones i en vektor. Messenger- I

5 DK 175554 B1 RNA isoleret fra induceret A. nidulans størrelsesfraktioneres for at beriges med alcA-sekvenser, endemærkes og hybridiseres til de cDNA-kloner, der er fremstillet ud fra alcA+-stammen. Den klon, der indeholder det cDNA, som hybridiserer til alcA+ mRNA, indeholder DNA-kopien af alcA mRNA'et. Dette stykke hybridiseres til en total DNA-genbank fra den 5 valgte Aspergillus-art for at isolere det valgte kodende område, fx alcA og de tilgrænsende områder. Det a/dA-kodende område blev isoleret ved analoge fremgangsmåder.

Det kodende område starter ved 5'-enden med en kodon ATG, der koder for methionin sammen med andre kodende områder og proteiner. Hvis det udtrykte proteins 10 aminosekvens er kendt, kan det kodende områdes DNA-sekvens let genkendes.

Umiddelbart "opstrøms" for ATG-kodonen findes den kodende del af messenger-RNA’et, foran hvilken promotorområdet ligger.

I ftg. 1A og IB er vist disse dele af den totale DNA-sekvens fra A. nidulans med 15 konventionéllé basenotationer. Den i Fig. 1A viste del indeholder promotorområdet og det kodende område fra a/cA-genet, som koder for enzymet alkohol-dehydrogenase I. Den i fig. IB viste del indeholder promotorområdet og det område, der koder for enzymet aldehyd-dehydrogenase, dvs. aldA. (I begge tilfælde betegner udtrykket "IVS" intervenerende sekvenser.) Aminosyresekvenserne for disse to enzymer er kendte i andre 20 arter. Ud fra disse er områderne 10 og 10' genkendelige som de kodende områder. Hvert kodende område starter ved 5'-enden ("opstrøms") med methionin-kodonen ATG ved 12.

De relevante aminosyresekvenser, der indkodes af det protein-kodende område, er indsat under de respektive rækker i fig. 1A og IB med de konventionelle forkortelser.

Umiddelbart opstrøms for kodon 12 findes det område, der koder for messenger-RNA-25 leder- og promotor-området, hvis længde nu skal bestemmes eller i hvert fald bedømmes for at indeholde alle de essentielle strukturelementer, der gør det muligt for det at fungere som promotor. I hver af fig. 1A og IB er vist en sekvens på ca. 800 baser i hvert tilfælde opstrøms for ATG-kodonen 12.

30 Det kan véd analogi med andre kendte promotorer forudsiges, at alle de funktionelle essentielle elementer sandsynligvis er indeholdt inden for en sekvens med en længde på ca. 1000 baser, formodentlig inden for de viste 800 baser, og mest sandsynligt inden for de første 200-300 baser, dvs. tilbage til omkring stilling 14 i fig. 1A og IB. En essentiel funktion for et promotorområde er at tilvejebringe et sted for nøjagtig 35 transkriptionsinitiering, hvilket vides at være en TATA-kassesekvens. En sådan sekvens findes ved 16 på a/cA-promotorsekvensen i fig. 1A og ved 16' på aldA - promotorsekvensen i fig. IB. En anden funktion for et promotorområde er at tilvejebringe en hensigtsmæssig DNA-sekvens, der er aktiv til regulering af gentranskriptionen, fx et bindingssted for et regulerende molekyle, som forøger gentranskriptionen, eller for at gøre genet aktivt eller 40 inaktivt. Sådanne regulerende områder findes inden for det i fig. 1A og IB viste promotorområde for henholdsvis alcA- og a/dA-generne.

Den nøjagtige opstrøms 5'-terminal af den DNA-sekvens, der her anvendes som promotorområde, er ikke kritisk, forudsat den omfatter de essentielle funktionelle

I DK 175554 B1 I

I____________ __________________ 6 . ______________________________ - I

I sekvenser som beskrevet. Overskydende DNA-sekvenser opstrøms for 5’-terminalen er I

I unødvendige, men er sandsynligvis ikke skadelige ved den foreliggende opfindelse. I

I Nar udstrækningen af den sekvens, der indeholder alle de essentielle funktionelle I

I 5 elementer til at udgøre et promotorområde i et givet gen, er blevet bestemt ved de i I

I nærværende beskrivelse beskrevne teknikker, er næste trin at spalte DNA-kæden på et I

I passende sted nedstrøms for promotorområde-terminalen og at fjerne det protein-kodende I

I område, hvilket hovedsageligt efterlader en sekvens, der omfatter promotorområdet og I

I undertiden en del af det område, der koder for messenger-RNA-lederen. Til dette formål I

I 10 skal der lokaliseres hensigtsmæssigt anbragte restriktionssteder, hvorefter DNA'et I

I behandles med de hensigtsmæssige restriktionsenzymer til udførelse af spaltning. I

I Restriktionssteder er genkendelige fra den i fig. 1A viste a/cA-sekvens. Til opstrøms I

I spaltning vælges der et sted tilstrækkeligt langt opstrøms til, at der i den bevarede del er I

I omfattet alle de essentielle funktionelle steder for promotorområdet. Hvad angår I

I 15 nedstrøms spaltning, findes der ikke noget restriktionssted nøjagtigt ved ATG-kodonen 12 i I

I tilfælde af alcA: Det nedstrøms restriktionssted, der er tættest derpå, er sekvensen I

I GGGCCC ved 13, ved hvilket kæden kan spaltes med restriktionsenzymet Apal. Om ønsket I

I kan de tilbageværende nukleotider fra stilling 13 til stilling 12 efter en sådan skæring I

I trinvis fjernes under anvendelse af en exonuklease. Da antallet af sådanne nukleotider, der I

I 20 skal fjernes, kendes, kan exonukleasens virkning standses på hensigtsmæssig måde, når I

stilling 12 er passeret. Ved at lokalisere et lignende restriktionssted nedstrøms for I

I methionin-kodonen 12 i det a/dA-kodende område vist i fig. IB udskæres dette I

I promotorområde på lignende måde til efterfølgende anvendelse. I mange tilfælde er I

resterende nukleotider ved promotorområdets 5'-terminal ikke skadelige for og griber ikke I

I 25 væsentligt ind i promotorområdets funktion, når blot basetripletternes læseramme er I

I bevaret. I

I I fig. 2 på tegningen er i diagram vist trinnene i en fremgangsmåde til fremstilling af I

I plasmidet pDG6, som kan anvendes til at danne Asperg/7/us-transformanter ifølge den I

I 30 foreliggende opfindelse. I fig. 2 er 18 et rekombinant plasmid indeholdende det I

I endogluconase-kodende (cellulase) område 30 fra bakterien Cellulomonas fimi, nemlig et I

I SamHI-endoglucanase-fragment fra C. fimi i den kendte vektor M13MP8. Det indeholder I

I relevante restriktionssteder for fcoRI, HindlU og Sam HI som vist samt andre, der ikke er I

I vist og ikke har betydning for nærværende fremgangsmåde. Henvisningsbetegnelse 20 er I

I 35 et rekombinant plasmid betegnet p5, der er konstrueret ud fra det kendte E co//-plasmid I

I pBR322 og indeholder et EcoRI-fragment fra A. nidulans indeholdende a/cA- I

I promotorområdet, der er fremstillet som beskrevet ovenfor, sammen med en lille del af I

I det a/cA-kodende område, herunder startkodonen ATG. Det har restriktionssteder som vist I

I samt andre restriktionssteder, der ikke anvendes ved den foreliggende fremgangsmåde og I

I 40 derfor ikke er vist. Plasmidet p5 indeholder en DNA-sekvens 22 fra EcoRI-stedet (3’) til I

I /7/ndIII-stedet (5’), som faktisk er en del af den i fig. 1A i den øverste række viste sekvens I

I fra stilling 15 (sekvensen GAATTC derved udgør et EcoRI-restriktionssted) til stilling 17. I

I " Sekvensen 22 i plasmidet 20 har en længde på ca. 2 kb. I

7 DK 175554 B1

Plasmiderne 18 og 20 skæres dernæst med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll for at udskære a/cA-promotorområdet og det endoglucanase-kodende område 30, som ligeres til det med Hindlll spaltede plasmid pUC12 til dannelse af en ny konstruktion, pDG5A, der indeholder disse sekvenser på pUCl2 som vist i fig. 2. Plasmidet pUC12 er et kendt, 5 kommercielt tilgængeligt E. co//-plasmid, som replikerer effektivt i E. coli, således at der kan fremstilles rigelige kopier af pDG5A, hvis dette ønskes. Den nye konstruktion pDG5A isoleres fra de øvrige produkter i konstruktionspræparationen. Dernæst forsynes konstruktionen pDG5A med en selekterbar markør, således at senere vundne transformanter af Aspergillus, i hvilke konstruktionen med held er blevet indført, kan 10 selekteres og isoleres. I titfælde af ArgB'- Aspergillus-værter kan der til dette formål hensigtsmæssigt anvendes et ArgB-gen fra A. nidulans. ArgB-genet koder for enzymet ornithin-transcarbamylase, og stammer indeholdende dette gen kan let selekteres og isoleres fra ArgS'-stammer ved standardteknikker for udpladning og dyrkning. ArgB -stammer kan ikke gro på et medium uden arginin.

15

Til inkorporering af en selekterbar markør kan konstruktionen pDG5A i denne udførelsesform for opfindelsen som vist i fig, 2 ligeres med Xbal-fragmentet 32 fra plasmidet pDG3 ATCC 53006 (jfr. USA-patentansøgning nr. 06/678.578, Buxton et al., indleveret 5. december 1984), som indeholder Arg8+-genet fra A. nidulans, under 20 anvendelse af Xbal, hvilket giver den nye konstruktion pDG6, som indeholder det endoglucanase-kodende område, a/cA-promotorsekvensen og ArgS-genet. Plasmidet pDG6 anvendes derefter ved transformationen til fremstilling af nye Aspergillus-mutantstammer, der indeholder et endoglucanase-kodende område, under kontrol af a/cA-promotoren, hvilket er beskrevet nærmere i eksempel 1.

25 I fig. 3 er i lineær form vist den diagrammatiske sekvens af den funktionelle del af konstruktionen pDG6 fra Hindlll-stedet 24 til HindHI-stedet 26. Det indeholder a/cA-promotorområdet 22, ATG-kodonen 12 og en lille resterende del af det a/cA-kodende område nedstrøms for ATG-kodonen so’m vist i fig. 1, efterfulgt af det cellulase-kodende 30 område 30 fra plasmidet 18.

Plasmidet pDG6 er blot ét eksempel på en vektor, som indeholder en filamentøs funguspromotor bundet til et protein-kodende område, som er fremmed for fungusen. I en anden vektor, der er eksemplificeret heri under henvisning til fig. 16, og som betegnes 35 pALCAlAMY, er den filamentøse funguspromotor fra a/cA-genet koblet til den naturligt forekommende sekvens, der koder for o-amylaseenzymet, et produkt, som er fremmed for den transformerede fungusvært. Proteinprodukterne fra vektorerne pDG6 og pALCAlAMY udtrykkes i begge tilfælde af de respektive transformerede værter. Da det a-amylase-kodende område naturligt indeholder et signalpeptid-kodende område, kan dette produkt 40 yderligere secerneres af den transformerede vært under anvendelse af værtens sekretionsmaskineri på trods af dets fremmede forhold til værten.

I DK 175554 B1 I

I _____________________8 _____________________ ________I

I Identifikation og isolering af promotorområderne i fllamentøse fungi gør det således muligt I

I at manipulere værten ved transformation med vektorer, der indeholder disse I

I promotoromrider koblet til et ønsket kodende område. I

I 5 Hvis det kodende område på vektoren kræver et signalpeptid-kodende område, eller den I

I eksisterende signalsekvens skal erstattes med et andet, fortrinsvis mere effektivt I

I signalpeptid-kodende område, kan sådanne signalpeptid-kodende områder integreres I

mellem promotoren og det segment, der koder for det secernerede protein. Plasmiderne I

I pGL2 (fig. 4) og pALCAlS (fig. 9) udgør mellem-kloningsvektorer, der er særligt egnede til I

I 10 dette formål. Hver kan fungere som en kassette og tilvejebringe en promotor, en I

I signalsekvens og et restriktionssted nedstrøms for signalsekvensen, hvilket muliggør I

I indsætning af et protein-kodende område i korrekt transkriptionslæseramme med I

I signalsekvensen. I

I 15 Det i fig. 4 viste plasmid pGL2 er dannet ud fra pGLl, der indeholder promotoren 40, I

I signalsekvensen 42 og en indledende det 46 af glucoamylase-genet, som alle blev afledt i I

I ét segment fra A. niger-DNA ifølge heri eksemplificerede metoder. I dette segment findes I

I der et SssHII-restriktionssted nær enden af, men dog inden for, glucoamylase- I

I signalsekvensen 42, hvis nukleotidsekvens er vist nedenfor i diagram 1. I

I 20 I

I ~ Diagram 1 I

I 5' ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC I

25« met set phe arg ser leu leu ala leu ser gly ley val cys I

I BssH II I

I I

ACA GGG TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC 3* I

I 30 thr gly leu ala asn val ile ser lys arg I

I For at tilvejebringe et segment nedstrøms for signalsekvensen, dvs. en linker 44, som er i I

I 35 stand til at modtage et protein-kodende område i læseramme med signalsekvensen 42, I

udnyttes tilstedeværelsen af SssHII-stedet inde i signalsekvensen og Sstl-stedet I

I nedstrøms derfor. I denne specifikke udførelsesform skæres segmentet 46 ud af pGLl og I

erstattes med én udvalgt linker ud af tre vist i fig. 5 og betegnet med A, B eller C. Hver I

I linker er i stand til at ligere med BssHll-enden og Sstl-enden. Linkerne er også udformet I

40 til at gendanne de terminale kodoner af signalsekvensen, som er gået tabt ved udskæring I

I af segmentet 46 med SssHII. Endvidere definerer hver linker unikke fcoRV- og I

BgliJ/Xho/J-steder inden for sin nukleotidsekvens, hvilket muliggør indsætning af det I

I ønskede kodende område i vektoren pGL2. I

9 DK 175554 B1

Selektion af den egnede linker foretages med kendskab til i det mindste de første fi kodoner af det protein-kodende område, der skal indsættes i linkeren. For at det proteinkodende område kan translateres mærkbart, skal starten af det protein-kodende område enten være direkte koblet til eller være et specifikt antal nukleotider, dvs. i tripletter, fra 5 starten af signalsekvensen. Hvis det protein-kodende område, der skal indsættes, har ét eller to ikke-essentielle nukleotider (eller en ikke-tripletfaktor deraf) ved sit 5’-område, hvilket kan skyldes rutinemæssig udskæring, kan én af de i fig. 5 viste linkere følgelig kompensere for tilstedeværelsen af de ekstra, overflødige nukleotider og anbringe starten af det protein-kodende område i translationslæseramme med signalsekvensen.

10

De aminosyrerester, der indkodes af linkerne A, B og C, er vist under deres nukleotidsekvenser i fig. 5, hvoraf ses virkningen af tilsætning af et yderligere nukleotid til linkersekvensen på læserammen af linkeren og slutteligt på det indsatte protein-kodende område. Ved at udforme linkeme således, at restriktionsstedet altid er nedstrøms for 15 læserammemodifikationen, dvs. én, to eller tre adeninrester i linkerne henholdsvis A, B og C, kan læserammen af det kodende område, der indsættes i restriktionsstedet, bevares ved hensigtsmæssig linkerselektion.

Eksempler på plasmider, der benytter plasmidet pGL2 og specifikke linkersegmenter A, B 20 eller C, er pGL2BIFN, der anvender B-linkeren og resulterer i interferon α-2-sekretion, når det anvendes i filamentøse fungi, fx Aspergillus sp., transformation og pGL2CENDO, der anvender C-linkeren og resulterer i endoglucanase-sekretion, når sådanne filamentøse fungi transformeres med det.

25 Medens plasmidet pGL2 anvender en naturligt forekommende signalsekvens, ligger det inden for den foreliggende opfindelses rammer også at anvende vektorer, der indeholder syntetiske signalsekvenser. Et eksempel på en sådan vektor er pALCAlS, som i lighed med plasmidet pGL2 udgør en mellemvektor, i hvilken der kan indsættes et protein-kodende område til dannelse af en vektor, der kan transformere filamentøse fungi. I modsætning til 30 pGL2 anvender pALCAlS imidlertid a/oA-promotoren og benytter en syntetisk signalsekvens koblet til denne promotor. pALCAlS er vist i fig. 9, der viser et skema over dets fremstilling, og hvortil der henvises yderligere i eksemplerne. Eksempler på plasmider, der er dannet ud fra pALCAlS, er pALCAlSIFN, som resulterer i sekretion af · interferon a-2 fra en filamentøs fungus transformeret dermed, og pALCAlSENDO, som 35 resulterer i sekretion af endoglucanase fra en filamentøs fungusvært. I begge tilfælde opnås der sekretion på trods af, at det secernerede protein er fremmed i forhold til værten.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående, ikke-begrænsénde eksempler.

40

Hvert af nedenstående eksempler 1 og 2 er eksempler på vellykket transformation af en filamentøs fungusvært under anvendelse af vektorer, som har en fra en filamentøs fungus stammende promotor koblet til naturligt forekommende kodende områder, der ikke er fungale.

I DK 175554 B1 I

I __________________ io___________ _________________________ _____________ I

I EKSEMPEL 1 I

I Transformation af A nidulans under anvendelse af pDG6 ATCC 53169 {referenceeksempel) I

I 5 Den i fig. 2 viste vektorkonstruktion pDG6 blev først fremstillet ved at følge det i fig. 2 I

viste fremgangsmådeskema under anvendelse af standardteknikker til ligation og I

I restriktion. Derefter blev konstruktionen pDG6 indført i argS'-mutantceller fra Aspergillus I

nidulans som følger: ^ I

I 10 500 ml komplet medium (Cove 1966) + 0,02% arginin + 10'5% biotin i en 2 liters konisk I

kolbe blev inokuleret med 105konidier/ml af en A. nidulans argB'-stamme og inkuberet I

I ved 30eC og med omrystning ved 250 omdr./minut i 20 timer. Myceliet blev høstet I

gennem Whatman-filterpapir nr. 54, vasket med sterilt deioniseret vand og suget tørre. I

I Myceliet blev sat til 50 ml filtersterilt 1,2M MgSO„, 10 mM kaliumphosphat, pH 5,8, i en I

I 15 250 ml's kolbe, hvortil var sat 20 mg Novozym 234 (Novo Enzyme Industries), 0,1 ml I

I (=15.000 enheder) β-glucuronidase (Sigma) og 3 mg bovint serumalbumin for hvert gram I

I mycelium. Spaltningen lodes forløbe ved 37°C under let omrystning i 50-70 minutter, idet I

I der periodisk blev kontrolleret for sfæroplast-dannelse ved hjælp af et lysmikroskop. 50 ml I

I sterilt deioniseret vand blev tilsat, og sfaeroplasterne blev skilt fra ikke-spaltede I

I 20 fragmenter ved filtrering gennem 30 pm nylonsigter og høstet ved centrifugering ved 2500 I

I x g i 5 minutter i en udsvingsrotor ("swing out rotor") i 50 ml’s reagensglas med konisk I

I bund og ved stuetemperatur. Sfaeroplasterne blev vasket ved resuspendering og I

I centrifugering 2 gange i 10 ml 0,6M KCI. Antallet af sfæroplaster blev bestemt med et I

hæmocytometer, og de blev resuspenderet i en slutkoncentration pi 108/ml i ι,2Μ I

I 25 sorbitol, 10 mM Tris/HCI, 10 mM CaCI2, pH 7,5. Alikvoter på 0,4 ml blev anbragt i plastrør, I

I hvortil der sattes DNA fra pDG6 (samlet volumen 40 μ! i 10 mM Tris/HCI, l mM EDTA, pH I

8), og der blev inkuberet ved stuetemperatur i 25 minutter. Alikvoter på 0,4 ml, 0,4 ml og I

I derefter 1,6 ml 60%’s PEG4000, 10 mM Tris/HCI, 10 mM CaCI2, pH 7,5, blev sat til hvert I

rør sekventielt under let, men grunding blanding mellem hver tilsætning, efterfulgt af I

I 30 yderligere inkubation ved stuetemperatur i 20 minutter. De transformerede sfæroplaster I

blev derefter sat til hensigtsmæssigt berigede minimalmedier 1%’s agaroverlejringer, plus I

eller minus 0,6M KCI ved 45°C, og blev umiddelbart hældt ud i identiske (men kolde) I

I medier på plader. Efter 3-5 dage ved 37°C blev antallet af voksende kolonier talt (F. I

I Buxton et al., "Gene 37, 1985, s. 207-214). Fremgangsmåden beskrevet af Yelton et al. I

35 ("Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1980, s. 1370-1374) blev også anvendt. I

I Kolonierne blev opdelt i to grupper. Threonin (11,9 g/liter) og fructose (1 g/liter) blev sat I

I til inkubationsmediet i den ene gruppe til induktion af det deri inkorporerede cellulasegen. I

I Der blev ikke sat inducer til den anden gruppe, som blev deaktiveret ved dyrkning på I

I 40 minimalmedier med glucose som den eneste carbonkilde. Begge grupper blev analyseret I

I for generel proteinproduktion ved hjælp af et BioRad-Assay efterfulgt af dyrkning, filtrering I

I for at skille myceliet fra, frysetørring, formaling og proteinekstraktion med 20 mM Tris/HCI I

I ved pH 7. I

11 DK 175554 B1

For at teste for cellulasedannelse blev der fremstillet plader af agarmedium indeholdende cellulase (9 g/liter, carboxymethylcellulose), og små stykker af glasfiberfiltermateriale, der var isoleret fra hinanden, og 75 μ9 totalt protein fra én af transkonjuganterne blev sat til hvert af filtrene. Pladerne blev inkuberet natten over ved 37°C. Filtrene blev derpå jernet 5 og pladerne farvet med congo-rødt for at bestemme de steder, hvor cellulase havde været til stede i det totale protein på filtrene, hvilket fremgår ved nedbrydning af cellulase i agarmediet nedenunder. Pladerne blev affarvet ved vask med 5M NaCI i vand for på synlig mide at detektere forskellene.

10 Af fire transformanter, der var Induceret med threonin og fructose, viste tre klart tilstedeværelse af cellulase i det totale proteinprodukt. De ikke-inducerede, glucose-deaktiverede transformanter viste ikke tegn på cellulaseproduktion.

Tre kontroltransformanter blev også fremstillet af samme vektorsystem og stammer, men 15 under udeladelse af promotorsekvensen. Ingen af dem producerede cellulase med eller uden inducere. Tilstedeværelsen af det C. /7m/-endoglucanase-kodende område blev verificeret ved, at medium fra threonin-inducerede transformerede stammer udviste reaktivitet med et monoklonalt antistof dyrket mod C. ffm/-endoglucanase. Dette monoklonale antistof udviste ingen krydsreaktivitet med endogene A. nidulans-proteiner i 20 kontrolstammer.

EKSEMPEL 2 25 Transformation af A. nidulans under anvendelse af pALCAlAMY ATCC 53380 (referenceeksempel)

Vektorkonstruktionen pALCAlAMY blev fremstillet som vist i fig. 16 under anvendelse af rutinemæssige standardteknikker til ligation og restriktion. Under henvisning til fig. 16 blev 30 vektoren indeholdende et W/ncflll-EcoRI-segment, hvori A. nidulans-alkohol- dehydrogenase I-promotoren 22 befinder sig (som beskrevet tidligere), skåret ved EcoRl-stedet til indsætning af det kodende område af hvede-a-amylasegenet 72, der er indeholdt i et EcoRI-EcoRI-fragment defineret på plasmidet p501 (jfr. S J. Rothstein et al., "Nature 308, 1984, s. 662-665). Eftersom hvede-a-amylase er et naturligt secerneret protein, 35 indeholder dets kodende område 72 et signalpeptid-kodende område 76 og et segment 78, der koder for modent, secerneret a-amylase. Ligation af det kodende område 72 indeholdt i EcoRl-EcoRI-segmentet fra p501 inden for det med EcoRI spaltede sted i pALCAl giver plasmidet pALCAlAMY, i hvilket "AlcA-promotoren 22 er operativt forbundet med det a-amylase-kodende område. Den korrekte orientering af det fra p50l stammende a-40 amyiase-kodende område i pALCAlAMY bekræftes ved sekventering hen over ligationsstedet ifølge standardprocedurer. Nukleotidsekvensen af forbindelsen mellem promotorområdet og det kodende område er vist i fig. 17.

i

I DK 175554 B1 I

I _____________________12 ____________________________ I

I A. nidulans kan transformeres ved den i eksempel 1 beskrevne procedure, idet prøver af I

I ekstracellulært medium tages fra og påføres pi glasfiberfilterpapirer anbragt på 1%'s I

I opløseligt stivelsesagar. Filtrene fjernes efter 8 timer ved 37°C og vendes om på I

I bægerglas indeholdende fast iod {i et 50°C varmt vandbad). Klare pletter er tegn på I

I 5 stivelsesnedbrydning, medens den øvrige stivelse bliver dybt purpurrød, hvilket bekræfter I

I tilstedeværelsen af secerneret α-amylase. I

I I nedenstående eksempel 3-12 tilvejebringes der vektorer, i hvilke der i vektoren indføres I

I et sekretionssignalpeptid-kodende område for at opnå sekretion af et fremmed protein fra I

I 10 en filamentøs fungus transformeret med hele vektoren. I

I EKSEMPEL 3 I

I 15 Fremstilling af plasmidet pGL2, en mellemvektor I

I A) Kilde til promotor og signalpeptidsekvens I

Giucoamylase-genet fra A. niger blev isoleret ved undersøgelse af en genbank stammende I

I 20 fra DNA, der var tilgængeligt i en stamme af denne mikroorganisme, der er deponeret hos I

I ATCC under deponeringsnummeret 22343. Undersøgelsen blev udført under anvendelse af I

I oligonukleotidprober fremstillet med Biosearch-oligonukleotidsyntese-udstyr og med I

I kendskab til den publicerede aminosyresekvens af glucoamylase-proteinet. Dataene for I

I aminosyresekvensen blev "tilbagetranslateret" til nukleotidsekvensdata, og proberne blev I

I 25 syntetiseret. Den bestemte genbank, der blev undersøgt, var et med Sau3A delvis spaltet I

I produkt fra det ovenfor beskrevne A. niger-DNA klonet i SamHI-stedet på det kommercielt I

I tilgængelige plasmid pUC12, som både er levedygtigt i og replikerbart i E. coti. I

I Et tf/ncflll-fig/II-DNA-stykke indeholdende giucoamylase-genet blev subklonet i pUC12. I

I 30 Derefter blev placeringen af det ønskede promotorområde, det signalpeptid-kodende I

I område og det protein-kodende område for glucoamylase identificeret i pUC12 I

I indeholdende det subklonede fragment. £coRI/£coRI-fragmentet (se fig. 4) viste sig at I

I indeholde en lang, åben translationslæseramme, når det blev sekventeret, og I

I sekvensdataene blev analyseret under anvendelse af sekvensanalyseprogrammer fra I

I 35 Wisconsin Universitet. I

I I fig. 6 er vist resultater af analyse af nukleotidsekvensen af en del af området af I

I giucoamylase-genet mellem 5' EcoRI-stedet og 3' SssHII-stedet inden for Hindlll-BgUl- I

I fragmentet. Dette område indeholder glucoamylase-promotoren og det signalpeptid- I

I 40 kodende område. I

I Inden for dette fragment, dvs. ved nukleotiderne 97-102, findes en "TATA-kasse" 48, der I

I tilvejebringer et sted, som kræves af mange eukaryote promotorområder til nøjagtig I

I transkriptionsinitiering (formodentlig et RNA-polymerase Il-bindingssted). Følgelig I

13 DK 175554 B1 bekræftes tilstedeværelsen af i det mindste en del af promotorområdet. Det kan endvidere ved analogi med andre kendte promotorområder forudsiges, at alle de funktionelle essentielle elementer sandsynligvis er indeholdt inden for en sekvens med en længde pi ca. 1000 baser og mest sandsynligt inden for de første 200 baser opstrøms for 5 startkodonen for det kodende område, dvs. nukleotiderne 206-208 eller "ATG" 49, kodonen for methionin. Promotoren og transkript-lederen ender således ved nukleotid 205. Identiteten af begyndelsen af promotorområdet er mindre vigtig, selv om promotorområdet skal indeholde RNA-polymerase Π-bindingsstedet og alle de øvrige elementer, der kræves, for at det fungerer. Medens £coRI-£?coRI-segmentet antages at 10 udgøre hele promotorområdet i glucoamylase-genet, indeholder det i plasmidet pGL2 anvendte plasmid således dette fragment i det meget større H/ncflll-SamHI/Bg/II-segment, hvilket sikrer, at hele promotoromridet korrekt inkluderes i det resulterende plasmid.

Da aminosyresekvensen for moden glucoamylase er kendt (jfr. Svensson et al., 15 Characterization of two forms of glucoamylase from Aspergillus niger, Carlsberg Res.

Commun. 47, 1982, s. 55-69), kan en nukleotidsekvens for signalpeptidet bestemmes nøjagtigt. Det signalpeptid-kodende område i gener, der koder for secernerede proteiner, vides at starte med methioninresten, der indkodes af ATG-kodonen 49. Bestemmelse af en tilstrækkelig stor indledende del af nukleotidsekvensen 3' efter ATG-kodonen, giver 20 informationer, ud fra hvilke aminosyresekvensen af denne del kan bestemmes. Ved sammenligning af denne aminosyresekvens med den publicerede aminosyresekvens kan signalpeptidet identificeres som den del af glucoamylase-genet, som ikke har noget modstykke i den publicerede sekvens, hvormed den blev sammenlignet. Det heri definerede glucoamylase-signalpeptid-kodende område er tidligere blevet bekræftet ved 25 denne metode.

Ved ovennævnte metoder blev det bekræftet, at W/nc/III-BamHI/Bg/II-fragmentet, der resulterede fra delvis Sau3A-spaltning og var inkorporeret i pUC12, indeholdt følgende elementer fra glucoamylase-genet: en indledende, måske irrelevant, sektion, 30 promotorområdet, det signalpeptid-kodende område og den resterende del af det kodende område. Dette fragment, indsat i plasmidet pUC12 ved spaltning med Hindlll og Bamhl/Bgltl og ligation, er vist skematisk i fig. 4 som plasmidet pGLl. Dette plasmid indeholder alle de elementer, der er nødvendige til replikation og lignende, således at det forbliver selekterbart og replikerbart i E. coli.

35 B) Konstruktion af plasmidet pGL2

Under anvendelse af pGLl som precursor kan der som vist i fig. 4 fremstilles plasmidvektoren pGL2. Restriktionsstedet SssHII nær ved 3'-enden af signalsekvensen 42 40 anvendes sammen med det unikke nedstrøms Ssfl-sted til indsætning af en syntetisk linkersekvens A, B eller C som defineret i fig. 5. pGLl spaltes således med både BssHII og Sst, hvilket fjerner den indledende del af det giucoamylase-kodende område 46, der er indeholdt deri. Derefter indsættes og ligeres en udvalgt sekvens af de syntetiske linkersekvenser A-C, som er udformet således, at de er omgivet af BssHIl/Sstl-kompatible ____

I DK 175554 B1 I

I _____________14 _______________________________ I

ender, hvilket frembringer plasmidet pGL2. Afhængigt af, hvilken af de tre linkersekvenser, I

I der anvendes, dvs. A, B eller C, identificeres det resulterende plasmid som henholdsvis I

I pGL2A, pGL2B eller pGL2C. I

I 5 De heri identificerede syntetiske linkersekvenser er hver forsynet med unikke EcoRV- og I

I Eg/II-restriktionssteder som vist i fig. 5, i hvilke der kan indsættes et ønsket protein- I

I kodende område. Efter indsætningen kan det resulterende plasmid anvendes til at I

I transformere en vært, fx A. niger, A. nidulans og lignende. Tilstedeværelsen af I

I promotorområdet og det signalpeptid-kodende område, som begge genkendes af værten, I

I 10 giver et middel, ved hjælp af hvilket ekspression af det protein-kodende område og I

I sekretion af det således udtrykte protein gøres mulig. I

I EKSEMPEL 4 I

I 15 I

I Anvendelse af plasmidet pGL2 til fremstilling af pGL2BIFN I

I Et eksempel på anvendeligheden af plasmidet pGL2 er beskrevet nedenfor under I

I henvisning til fig. 7, der skematisk viser konstruktionen af plasmidet pGL2BIFN ud fra I

I 20 pGL2B. I

I Plasmidet pGL2B fremstilles som beskrevet generelt ovenfor for pGL2 med den undtagelse, I

I at den i fig. 5 viste syntetiske linkersekvens "B" indsættes specifikt. I

I Henvisningsbetegnelsen 44 er følgelig ændret i fig. 7 til "44B'\ For at tilvejebringe en I

I 25 åbning i vektoren pGL2B skæres plasmidet med EcoRV ved stedet inde i linkeren 44B. I

I Skæringen medfører stumpe ender, som kan ligeres med et fragment, der flankeres af I

I stumpe ender, under anvendelse af ligaser, der vides at være nyttige til dette specifikke I

I formål. I

I 30 I den i fig. 7 viste udførelsesform indsættes et fragment 60 indeholdende det kodende I

I område for humant interferon a-2 til dannelse af pGL2BIFN. Et Ddel-BamHI-fragment 60 I

I indeholdende det kodende område for humant interferon a-2 blev specifikt skåret ud fra I

I plasmidet pN5H8 (ikke vist) på basis af dette gens kendte sekvens og restriktionskort. I

I 35 Plasmidet pN5H8 kombinerer det kendte plasmid pAT153 med interferon-genet ved et I

I SamHI-sted. Interferon-genet deri er beskrevet af Siocomb et al., "High level expression of I

I an interferon a-2 gene cloned in phage M13mp7 and subsequent purification with a I

monoclonal antibody”, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 79, 1982, s. I

I 5455-5459. I

I 40 I

I For at sammenføje hæfteenderne af interferon-fragmentet i det spaltede EcoRV-sted i I

I pGL2B udfyldes Odel- og SamHI-hæfteenderne under anvendelse af revers transkriptase I

I og ligeres ved hjælp af en hensigtsmæssig ligase under anvendelse af standardteknikker. I

15 DK 175554 B1

Fordelen ved at vælge linkersekvensen B til indsætning i pGL2 fremgår af fig. 8, som viser læserammen af det interferon α-2-kodende område og dets forhold til den genskabte signalpeptidsekvens med hensyn til nukleotidsekvens og aminosyresekvens, hvis det er hensigtsmæssigt.

5

Fig. 8 viser en del af promotorområdet 40 5' i forhold til signalsekvensen forbundet til en I

del af glucoamylase-signalpeptidsekvensen 42, der begynder med methionlnkodonen ATG ved 49 og ender med lysinkodonen AAG ved 50. Selv om det signalpeptid-kodende område strækker sig én rest længere, dvs. til CGC-kodonen for arginin ved 52, er denne 10 sidstnævnte rest i realiteten omfattet af den syntetiske linkersekvens 44B, der er manipuleret således, at der kompenseres for tabet af argininresten under skæring og ligation til indsætning af linkersekvensen. På denne måde forstyrres den genetiske sekvens af signalet ikke.

15 På lignende måde sørger linkersekvensen for indsætning af det interferon α-2-kodende område uden at ændre dets læseramme. Under henvisning til fig. 7 og 8 resulterer spaltning af linkersekvensen 44B med EcoRV i linkerfragmenterne 44B' og 44B", der har stumpe ender. Udskæring af det interferon α-2-kodende område ved Odel-stedet resulterer efter udfyldning af de af enzymet dannede hæfteender i den ønskede 20 nukleotidsekvens uden at skade dette kodende områdes sekvens. Ligation inden for den med EcoRV spaltede linkersekvens af interferonsekvensen udfyldt ved Odel-stedet bevarer den naturlige læseramme af det interferon-kodende område, hvilket ses ved tripletkodon-tilstanden mellem linkerdelen 44B’ og det interferon-kodende område 60. Hvis den i fig. 5 viste linker A var blevet valgt, hvilken linker bærer ét nukleotid mindre end linkeren B, ville 25 hele læserammen være blevet forskudt med ét nukleotid, hvilket ville medføre en meningsløs sekvens. Ved at vælge den syntetiske linker B gøres kodoner tilgængelige mellem signal peptidsekvensen og det interferon-kodende område, hvilket ikke ændrer læserammen for det kodende område, når IF α-2-fragmentet med stumpe ender er orienteret korrekt. Den korrekte orientering selekteres ved at sekventere kloner med 30 indsætninger tværs over ligationsforbindelsen.

EKSEMPEL 5 35 Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med pGL2BIFN ATCC 53371

Plasmidet pGL2BIFN blev cotransformeret, dvs. med et plasmid indeholdende arg£J+-genet som beskrevet mere detaljeret i USA-patentansøgning nr. 678.578 af 5. december 1984, i en argS'-stamme af A. nidulans med et separat plasmid indeholdende en selekterbar argB-40 markør. arg8*-transformanter blev selekteret, hvoraf 18 ud af 20 indeholdt 1-100 kopier af det humant interferon α-2-kodende område (detekteret ved Southern-blotanalyse).

I DK 175554 B1 I

I ____ _______16 _______________________________________ I

I Flere transformanter blev dyrket pi stivelsesmedium for at inducere glucoamylase- I

I promotoren, og det ekstracellulære medium blev analyseret for humant IF α-2 under I

I anvendelse af et CellTech IF α-2-assaykit. I

I 5 Alle transformanter udviste nogen grad af syntese og sekretion af analyserbart protein. To I

I kontroller, værtsstammen (ikke transformeret) og én argB+-transformant uden I

I detekterbart humant IF α-2-DNA, udviste ingen detekterbar syntese af IF α-2-protein. I et I

separat forsøg viste transformation af A niger og ikke A nidulans med pGL2BIFN under I

I anvendelse af mutatis mutandis samme procedure som beskrevet ovenfor, at A. niger var i I

I 10 stand til at secernere IF α-2. I

I Selv om promotor- og signalområderne på pGL2BIFN. stammer fra A. niger, påvises de I

således at være operative i bide A. nidulans og A. niger. I

I 15 I den foreliggende opfindelse kan der anvendes andre promotorområder end I

I glucoamylase-promotorområdet. Egnede til anvendelse er promotorområderne for alkohol- I

I dehydrogenase I-genet og aldehyd-dehydrogenase-genet, vist i fig. 1A og IB. I

I 20 EKSEMPEL 6 I

I Konstruktion af plasmidet pALCAlS, ATCC 53368, en mellemvektor (reference eksempel) I

I Til anvendelse i nærværende eksempel blev a/cA-promotoren anvendt, hvilken promotor I

25 var indeholdt i et 10,3 kb langt plasmid pDG6, der er deponeret hos ATCC i værten E. coli I

I JM83 under deponeringsnummeret 53169. Et plasmidkort over pDG6 er vist i fig. 2 og for I

I nemheds skyld i fig. 9, hvortil der henvises, til belysning af endnu en udførelsesform under I

I anvendelse af a/cA-promotoren. I

30 pDG6 omfatter i sit W/ndlll-fcoRI-segment (første forekomst) promotorområdet 22 af I

a/cA-genet samt en lille 5’ del af det a/cA-kodende område 3' af startkodonen, hvilken del I

I er ligeret til det endoglucanase-kodende område 30. pDG6 omfatter endvidere et multipelt I

I kloningssted 62 nedstrøms for det C. f/m/’-endoglucanase-kodende område 20. I

I 35 For at genvinde a/cA-promotorområdet 22 blev pDG6 skåret med "Pstl og "Xhol, hvilket I

I fjernede det meste af det endoglucanase-kodende område 30.1 et andet trin blev det I

I lineariserede plasmid 64 tilbageskåret i én retning på kontrolleret måde med exonuklease I

I III (som vil tilbageskære fra Xhol, men ikke Pstt-spaltede DNA-ender), efterfulgt af I

I beskæring med nukleasen SI. Tilbageskæringen blev tilrettelagt således, at enzymet I

I 40 fjernede nukleotider indtil en stilling 50 baser 5' i forhold til alcA ATG-kodonen, hvilket I

I efterlader TATA-kassen og messenger-RNA-startstedet intakt. I

I Efter tilbageskæring blev vektoren 66 religeret (recirkulariseret), hvilket gav vektoren 68, I

der bærer Sa/I-Xbal-restriktionssteder umiddelbart nedstrøms for promotorområdet 22. I

17 DK 175554 B1

Spaltning af vektoren 68 med Safl/Xbal gør det muligt at indføre et signalpeptid-kodende område på et passende sted i vektoren.

Det bestemte signalpeptid-kodende område, der anvendes i nærværende eksempel, blev 5 syntetiseret til gendannelse af et karakteristisk signalpeptid-kodende område, der er identificeret i henhold til standardprocedurer som beskrevet af G. Von Heijne i fur. J.

Biochem., 1983, s. 17-21. Det syntetiske signal blev manipuleret til at give en 5‘ flankerende sekvens komplementær med et Sa/I-spaltningssted og en 3* flankerende sekvens, hvilket muliggjorde ligation med Xbal-restriktionssekvensen.

10

Sekvensen af det syntetiske sekretionssignal 68 er vist nedenfor:

Sal I j

TCGACATGTACCGGTTCCTCGCCGTCATCTCGGCCTTCCTCGCCACTGCCTTCGCCAAG

1---------+---------+·---i-----+---------+---------+---------+ 59 GTACATGGCCAAGGAGCGGCAGTAGAGCCGGAAGGAGCGGTGACGGAAGCGGTTC Me tTy r Ar gPh eLe uAl a Va 1 II eSe r Al aPh eLe uAl alti r Al aPh eAl aLy s

Xba I T

oO------64

AGATC

SerArg

Sekretionssignalet i sig selv begynder med Met og ender med den fjerde forekomst af Ala, hvilket er vist med pilen.

30 Efter frembringelse klones den syntetiske sekvens 68, der fungerer som signal, i Sa/I-Xbal-stedet på vektoren 70, hvilket giver plasmidet pALCAlS, som indeholder a/cA-promotorområdet 22 og det syntetiske peptidsignal-kodende område 68. Det forhold, at det signalpeptid-kodende område er indsat opstrøms for det multiple kloningssted 62, er signifikant, idet stedet 62 muliggør kloning af en række protein-kodende segmenter i dette 35 plasmid.

pALCAlS udgør således en værdifuld udførelsesform for den foreliggende opfindelse. 1 EKSEMPEL 7

Konstruktion af plasmidet pALCAlSIFN

I DK 175554 B1 I

I _________________ ________________18__. ____ _____________________________ I

I Som et eksempel på anvendeligheden af pALCAlS henvises der til fig. 10, der viser I

I fremstilling af pALCAlSIFN. Dette plasmid omfatter promotorområdet 22 for a/cA-genet og I

I det syntetiske signalpeptid-kodende område 68, som begge stammer fra pALCAlS (fig. 9). I

Desuden indeholder det det kodende område 60, der koder for humant interferon α-2 I

I 5 stammende fra pGL2BIFN. I

I Til opnåelse af det protein-kodende segment spaltes pGL2BIFN med EcoRI og spaltes I

I delvist med BglU (på grund af tilstedeværelsen af indre Bg/11-sted er). Indsætning af det I

I protein-kodende område udføres ved spaltning af pALCAlS med BamHl og EcoRI, der I

10 begge er tilgængelige i det multiple kloningssted 62, samt ligation af dette kodende I

I område deri, hvilket giver pALCAlSIFN. I

I Nukleotidsekvensen af det resulterende plasmid fra et sted 1170 nukleotider nedstrøms for I

I Hindlll til EcoRI er vist i .fig. 11, idet de relevante steder for restriktionsendonuklease- I

I 15 spaltning er vist. Det fremgår af ark 3 af fig. 11, at det IP α-2-kodende område 60 er i I

I korrekt læseramme med det syntetiske signalpeptid-kodende område 68. I

I EKSEMPEL 8 I

I 20 I

I Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med plasmidet pALCAlSIFN I

I Plasmidet pALCAlSIFN, der var fremstillet som beskrevet ovenfor, blev cotransformeret I

I med A. nidulans for at tilvejebringe en selekterbar argB-markør, arg5+-transformanterne I

I 25 blev selekteret og undersøgt for tilstedeværelsen af det humant interferon α-2-kodende I

I område, hvorefter de blev dyrket på et threoninholdigt medium for at inducere alcA- I

I promotoren på samme måde som beskrevet i eksempel 3. Det ekstraceilulære medium I

I blev analyseret for humant IF-2 under anvendelse af et CellTech IF α-2-assaykit. 11 ud af I

I 20 transformanter udviste sekretion af interferon induceret i nærværelse af threonin og I

I 30 deaktiveret i nærværelse af glucose. I

I EKSEMPEL 9 I

I 35 pGL2CENDO - ATCC 53372 I

I I overensstemmelse med de i de foregående eksempler beskrevne fremgangsmåder blev I

I der konstrueret et vektorplasmid med betegnelsen pGL2CENDO ud fra plasmidet pGL2C I

I ATCC 53367 på analog måde med pGL2BIFN vist i fig. 7, men indeholdende det I

I 40 endoglucanase-kodende område i stedet for det interferon α-2-kodende område og under I

I anvendelse af den syntetiske linkersekvens "C” (fig. 5) i stedet for linkersekvensen "B". Et I

I BamHI-fragment indeholdende det C. fimi endoglucanase-kodende område 30 blev indsat i I

I Bg/II-stedet på pGL2C. A. nidulans-transformanter blev fremstillet med dette I

I vektorplasmid og udviste stivelsesreguleret sekretion af cellulase, analyseret som I

19 DK 175554 B1 beskrevet i eksempel 1. Kortet over vektorplasmidet pGL2CEND0 er vist i fig. 12 på tegningen, hvor 30 betegner det endoglucanase-kodende område (det endoglucanase-kodende område fra Cellulomonas fimi, beskrevet i forbindelse med fig. 2 og eksempel 1), 42 betegner det signalpeptid-kodende område af glucoamylase-genet, og 40 betegner 5 promotorområdet fra glucoamylase-genet. Nukleotidsekvensen er vist i fig. 13 og eksemplificerer, at anvendelse af linkersekvensen C (fig. 5) bevarer læserammen for det signalpeptid-kodende område 42 og det endoglucanase-kodende område 30.

10 EKSEMPEL 10

Konstruktion af plasmidet pALCAlSENDO ATCC 53370 ( I overensstemmelse med de i de foregående eksempler beskrevne fremgangsmåder blev 15 der konstrueret et vektorplasmid betegnet pALCAlSENDO ved at kombinere det med EcoRI lineariserede plasmid pALCAlS som beskrevet i eksempel 5 (fig. 9) med et EcoRI-fragment fra plasmidet pDG5B (se fig. 2) (pDG5 med den omvendte orientering af Hindlll-fragmentet i pUC12) og indeholdende det endoglucanase-kodende område 30. Kortet over pALCAlSENDO er vist i fig. 14, og nukleotidsekvensen af dets relevante område er vist i 20 fig. 15. I disse figurer har promotorområdet stammende fra alcA henvisningsbetegnelsen 22, det syntetiske signalpeptid-kodende område har henvisningsbetegnelsen 68, og det endoglucanase-kodende område har henvisningsbetegnelsen 30.

25 EKSEMPEL 11

Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med pALCAlSENDO og pGL2CENDO

A. nidulans blev cotransformeret med en selekterbar argB*-markør og plasmidet 30 pALCAlSENDO eller pGL2CENDO, der var fremstillet som beskrevet ovenfor. Af de vundne cotransformanter udviste flere varierende niveauer af cellulase-sekretion (dvs. endoglucanase), hvilket blev bedømt på carboxymethylcelluloseplader og de monoklonale antistof-testsystemer som beskrevet i eksempel 1. Begge plasmidtransformanter udviste sekretion, som blev reguleret af den bundne promotor. Pfasmidet pGL2CENDO blev 35 induceret med stivelse, og pALCAlSENDO blev induceret med threonih.

EKSEMPEL 12

40 Ekspression og sekretion fra A. niger transformeret med pGL2CENDO

A. niger blev cotransformeret med en selekterbar argB*-markør og plasmidet pGL2CENDO.

Flere af transformanterne udviste varierende niveauer af endoglucanase-sekretion, hvilket

I DK 175554 B1 I

I ________________________ 20. ________________________ I

I blev bedømt som beskrevet i eksempel 1. Denne sekretion blev induceret af I

I tilstedeværelsen af stivelse i mediet. I

I 5 EKSEMPEL 13 I

I Forøget kopital af regulerende gener I

I I Aspergillus niduians aktiveres a/cA-promotoren i nærværelse af den hensigtsmæssige I

I 10 inducer såsom ethanol under indvirkning af genproduktet fra alcR, det positive regulerende I

I gen for alcA. I

Forsøg med flerkopi-transformanter (indeholdende flere a/cA-promotorer) antyder, at alcR- I

I genproduktet begrænser promotorfunktionen af de forskellige a/cA-promotorer, der kræver I

15 stimulering. I

I Forøgelse af kopitallet for alcR-genet forøger ekspressionen af alcR og afhjælper denne I

I situation. Beviset herpå er som følger: I

I 20 Transformanter med flere kopier af a/cA-promotoren fusioneret til sit eget kodende område I

I (ADH I) på en flerkopi-a/cfl-baggrund (hvilket har vist sig at overproducere alcR- I

I messenger-RNA) vokser ikke godt på ethanol. Dette skyldes formodentlig den hurtige I

I akkumulering af aldehyder, produktet fra ADH-nedbrydning af ethanol. ADH-aktivitet i I

I disse stammer er høj. Den forøgede ADH-aktivitet på grund af forøget kopital er formentlig I

I 25 grunden til disse iagttagelser. I

I Transformanter med flere kopier af a/cA-promotoren fusioneret til interferon a-2 på en I

I flerkopi-a/cR-baggrund giver signifikant højere niveauer af secerneret interferon. I disse I

I stammer har mange flere af a/cA-promotorerne, til forskel fra dem med enkelt-kopi alcR, I

I 30 adgang til det a/cR-regulerende protein. I

I Foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse giver således midler til I

I indføring af et kodende område i en filamentøs fungusvært, som, når den transformeres, I

vil secernere det ønskede protein. Særlig nyttige meliemplasmider til dette formål er I

I 35 pALCAlS og pGL2 (A, B eller C). I

I Nyttige transformationsvektorer, der er dannet ud fra disse plasmider, omfatter I

pALCAlSIFN, pGL2BIFN, pALCAlSENDO og pGL2CENDO. Kulturer af disse og andre, heri 1

I nævnte plasmider holdes for tiden i en permanent levedygtig tilstand i laboratorierne hos I

40 Allelix Inc., 6850 Goreway Drive, Mississauga, Ontario, Canada. Plasmiderne vil blive holdt I

I i denne tilstand under hele behandlingsperioden af nærværende patentansøgning og vil i I

I denne periode være tilgængelige for eksperter. Efter udstedelse af patent på nærværende I

I ansøgning vil disse plasmider uden begrænsninger være tilgængelige fra ATCC- I

5 DK 175554 B1 21 deponeringsmyndigheden, anerkendt under Budapest-traktaten. De forskellige deponeringers deponeringsnumre fremgår af nedenstående tabel:

Plasmid Vært Deponerings # Deponeringsdato pDG6 E. coli JM83 53169 7. juni 1985 pGL2A " 53365 16. december 1985 10 pGL2B " 53366 16. december 1985 pGL2C " 53367 16. december 1985 pALCAlS " 53368 16. december 1985 pALCAlSENDO " 53370 16. december 1985 pALCAlSIFN “ 53369 16. december 1985 15 pGL2BIFN " 53371 16. december 1985 PGL2CENDO " 53372 16. december 1985 pALCAlAMY " 53380 20. december 1985

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid i en filamentøs fungusværtscelle, I I hvilken fremgangsmåde omfatter I I 5 I I (a) dyrkning af en værtscelle i et kulturmedium, der omfatter stivelse; I I (b) hvor værtscellen indeholder én eller flere kopier af en DNA-konstruktion; I I (c) hvor DNA-konstruktionen omfatter: I 10 (i) et reguleret DNA-promotorområde stammende fra glycoamylase-genet fra I I Aspergillus niger, hvilket promotorområde indeholder en DNA-sekvens, der er aktiv I I i regulering af gentranskriptionen, hvor DNA-sekvensen gør genet positivt I I induceret med stivelse; og I I (ii) et DNA, der koder for et polypeptid i operativ forbindelse med promotoren, hvor I I 15 DNA'et koder for et polypeptid, som er fremmed for promotoren; I I (d) hvor værtscellen dyrkes under betingelser, under hvilke tilstedeværelsen af stivelse I inducerer den transkriptionsfremmende funktion af promotoren; og eventuelt I I (e) genvinding af polypeptidet fra mediet. I I 20 I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor værtscellen er Aspergillus nidulans. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor værtscellen er Aspergillus niger. I I 25

4. Anvendelse af en DNA-konstruktion som defineret i et hvilken som helst af de I I foregående krav til transformation af en filamentøs fungusværtscelle og ekspression af et I I protein under betingelser, hvor værtscellen dyrkes under betingelser, under hvilke I I tilstedeværelsen af stivelse inducerer den transkriptionsfremmende funktion af I I promotoren, som er indeholdt i DNA-konstruktionen. I I 30 I