DK176017B1 - Promotorer fra filamentöse fungi samt anvendelse deraf - Google Patents

Description

i DK 176017 B1

Den foreliggende opfindelse angår ekspression af proteiner fra filamentøse fungi.

Et formål med rekombinant DNA-teknologi er indsætning af DNA-segmenter, som koder for kommercielt eller videnskabeligt værdifulde proteiner, i en værtscelle, 5 som er let tilgængelig på økonomisk måde. De gener, der udvælges til indsætning, er normalt gener, der koder for proteiner, som kun produceres i begrænsede mængder af deres naturlige værter, eller gener, som er naturlige for værter, der er for kostbare at dyrke. Overførsel af genetisk information på reguleret måde til en vært, som er i stand til at producere proteinet enten i stort udbytte eller på mere 10 økonomisk måde i et lignende udbytte, giver et mere ønskeligt medium til proteinproduktion.

Gener, der koder for proteiner, indeholder promotorområder af DNA, som i det væsentlige er bundet til 5’-terminalen af det proteinkodende område.

15 Promotorområderne indeholder bindingsstedet for RNA-polymerase II. RNA- polymerase II katalyserer på effektiv måde samlingen af det messenger-RNA, der er komplementært med den relevante DNA-streng fra det kodende område. I de fleste promotorområder findes der en nukleotidbasesekvens, der er forbundet med sekvensen, der normalt betegnes en 'TATA-kasse”, hvilken sekvens almindeligvis 20 befinder sig i nogen afstand opstrøms for starten af det kodende område og kræves til nøjagtig transkriptionsinitiering. Andre elementer, der er vigtige eller essentielle for, at det kodende område fungerer og regulerer på korrekt måde, er også indeholdt i promotorområdet opstrøms for starten af det kodende område.

25 Filamentøse fungi, især de filamentøse ascomyceter såsom Aspergillus, fx Aspergillus niger, udgør en klasse af mikroorganismer, der er egnede som modtagere af fremmede gener, der koder for værdifulde proteiner. Aspergillus niger og dermed beslægtede arter anvendes for tiden i stor udstrækning ved den industrielle produktion af enzymer, fx til anvendelse i levnedsmiddelindustrien.

30 Deres anvendelse bygger på mikroorganismens sekretionsevne. Eftersom de er godt karakteriserede og på grund af deres brede anvendelse og godkendelse, findes der både et industrielt og videnskabeligt incitament til at benytte genetisk modificerede og forbedrede celler af A. niger og beslægtede arter, herunder A. nidulans, for at opnå nyttige proteiner.

35 _ - DK 176017 B1 2

Ekspression og sekretion af fremmede proteiner fra filamentøse fungi er endnu ikke blevet opnået. Det er pi ingen måde klart, at de strategier, som har været anvendt med held i gær, vil være vellykkede i filamentøse fungi såsom Aspergillus. Det har vist sig, at gær er et uhensigtsmæssigt system til ekspression af filamentøse 5 fungusgener (Pentilla et al., Molec. Gen. Genet. 194, 1984, s. 494-499), og at gærgéner ikke udtrykkes i filamentøse fungi. Genetiske manipulationsteknikker er for nylig blevet udviklet for Aspergillus nidulans og Aspergillus niger. Disse i teknikker omfatter inkorporering af exogent tilføjede gener til Aspergillus-genomet i en form, i hvilken de er i stand til at blive udtrykt.

10

Indtil nu er ingen fremmede proteiner blevet udtrykt i og secerneret fra filamentøse fungi under anvendelse af disse teknikker. Dette har skyldtes mangel på hensigtsmæssige ekspressionsvektorer og de bestanddele, der udgør dem.

Disse bestanddele omfatter Aspergillus-promotorsekvenser som beskrevet ovenfor, 15 det område, som koder for det ønskede produkt, samt de dermed forbundne sekvenser, der kan være tilføjet for at lede det ønskede produkt hen til det ekstracellulære medium.

Som nævnt ovenfor kræver værtscellens ekspression af det fremmede gen 20 tilstedeværelse af et promotorområde opstrøms for det område, der koder for proteinet. Dette promotorområde er aktivt til regulering af transkriptionen af det kodende område, hvormed det er forbundet, til messenger-RNA, som til slut translateres til det ønskede proteinprodukt. De således producerede proteiner kan kategoriseres i to klasser på basis af deres skæbne i forhold til værten.

25

En første klasse af proteiner bevares intracellulært. Ekstraktion af det ønskede protein, når det er intracellulært, kræver, at den genetisk manipulerede vært åbnes eller lyseres for at frigøre produktet til endelig oprensning. Intracellulær j produktion har flere fordele. Proteinproduktet kan koncentreres, dvs. pelleteres, 30 med cellemassen, og hvis produktet er labilt under ekstracellulære betingelser eller er strukturelt ude af stand til at blive secerneret, er dette en ønskelig produktions-og oprensningsmetode.

En anden klasse af proteiner er de proteiner, der secerneres fra cellen. I dette 35 tilfælde udføres der oprensning på det ekstracellulære medium og ikke på selve L.

3 DK 176017 B1 cellen. Produktet kan ekstraheres ved metoder såsom affinitetschromatografi, og kontinuerlig strømningsfermentering er mulig. Visse produkter er også mere stabile ekstracellulært og drager fordel af ekstracellulær oprensning. Forsøg har vist, at sekretion af proteiner i eukaryoter næsten altid dikteres af et |· 5 sekretionssignalpeptid (i det følgende betegnet signalpeptid), der sædvanligvis i befinder sig ved proteinets aminoterminal. Signalpeptider har karakteristiske fordelinger, hvilket er beskrevet af G. Von Heijne i Eur. J. Biochem, 1983, s. 17-21, og vil kunne genkendes af fagfolk. Når signalpeptidet genkendes af cellen, dirigerer det proteinet ind i cellens sekretionsbane. Under sekretionen spaltes signalpeptidet 10 fra, hvilket gør det muligt at høste proteinet i moden form fra det ekstracellulære medium.

Begge proteinklasser, intracellulær og ekstracellulær, indkodes af gener, som indeholder et promotorområde koblet til et kodende område. Gener, der koder for 15 ekstracellulært dirigerede proteiner, er forskellige fra gener, der koder for intracellulære proteiner, ved, at i gener, der koder for ekstracellulære proteiner, koder den del af det kodende område, der er tættest på promotoren (hvilket er den første del, der transkriberes af RNA-polymerase), for et signalpeptid. Den nukleotidsekvens, der koder for signalpeptidet, og som i det følgende betegnes det 20 signalpeptid-kodende område eller signalsekvensen, er i sig selv operativt en del af det kodende område.

Der er nu udviklet et system, hvorved filamentøse fungi kan transformeres til at udtrykke et ønsket protein. Med dette system kan transformation give en 25 filamentøs fungus, der er i stand til ikke blot at udtrykke proteinet, men også at secernere dette protein, uanset om proteinet er et naturligt secerneret protein eller ej. Desuden kan den mængde, i hvilken proteinet udtrykkes, reguleres ifølge visse aspekter af opfindelsen. Det vil være klart for fagfolk, at det omhandlede system gør det muligt, at filamentøse fungi fungerer som værdifulde proteinkilder og udgør 30 et alternativ, som til mange anvendelser er bedre end bakterie- og gærsystemer.

I et generelt aspekt angår opfindelsen et transformationssystem for filamentøse fungi, hvorved disse funguscellers genetiske struktur kan modificeres således, at enten arten eller mængden af de af disse celler udtrykte proteiner ændres. Mere 35 specifikke aspekter af opfindelsen defineres nedenfor.

4 DK 176017 B1 I ét aspekt af den foreliggende opfindelse identificeres og isoleres et promotorområde, der er forbundet med et kodende område i filamentøse fungi såsom A. niger, A. nidulans eller beslægtede arter, og forbindes hensigtsmæssigt i 5 et funktionelt forhold med et andet, forskelligt kodende område uden for cellen, hvorefter det igen indføres i en filamentøs værtsfungus under anvendelse af en hensigtsmæssig vektor. Transformerede værtsceller udtrykker proteinet fra det andet kodende område under kontrol af det indsatte promotorområde. Det andet kodende område kan være et område, som er fremmed for værtsarten, i hvilket 10 tilfælde værten udtrykker og i nogle tilfælde secernerer et protein, der ikke naturligt udtrykkes af den givne vært. Alternativt kan det andet kodende område være et område, som er naturligt for værten, i hvilket tilfælde det er forbundet med et promotorområde, der er forskelligt fra det promotorområde, hvormed det naturligt er forbundet i den givne vært, hvilket giver modificeret eller forøget 15 proteinekspression og -sekretion.

Hvis det andet kodende område er et område, der koder for et protein, som normalt secerneres, indeholder det en sekvens af nukleotider ved sin 5’-terminal, dvs. et signalpeptid-kodende område, som efter transkription og translation vil 20 resultere i tilstedeværelse af et signalpeptid ved proteinproduktets aminoterminal.

Signalpeptidet kan genkendes af fungusværten, og proteinproduktet kan derefter styres ind i cellens sekretionsbane og secerneres.

Den foreliggende opfindelse giver mulighed for at indføre fremmede kodende 25 områder i filamentøse fungi sammen med promotorer, hvilket gør det muligt, at værtsfungusen udtrykker forskellige proteiner. Den giver også mulighed for at regulere transkription af de individuelle gener, som naturligt forekommer deri, eller fremmede gener, der indføres deri, via det promotorområde, der er blevet indført i værten sammen med genet. Fx kan det promotorområde, der naturligt er 30 forbundet med alkohol-dehydrogenase 1 (a/cA)-genet og aldehyd-dehydrogenase (a/dA)-genet i A. nidulans, reguleres ved hjælp af ethanol, threonin eller andre inducerende stoffer i det ekstracellulære medium. Denne effekt afhænger af integriteten af et gen betegnet alcR. Hvis alcA- eller a/dA-promotorområdet er forbundet med et kodende område for et fremmed protein i Aspergillus eller i - ---------- DK 176017 B1 5 lignende, kan der ifølge den foreliggende opfindelse opnas lignende regulering af ekspressionen af de forskellige gener ved hjælp af ethanol eller andre inducere.

Som et yderligere eksempel induceres det promotorområde, der naturligt er 5 forbundet med glycoamylase-genet i Aspergillus niger, og som anvendes ved udførelsesformer for den foreliggende opfindelse, positivt ved hjælp af stivelse og andre sukkere.

Den foreliggende opfindelse angår således DNA-sekvenser, der er aktive som 10 promotorområder i celler fra filamentøse fungi såsom Aspergillus niger, Aspergillus nidulans og lignende.

Den foreliggende opfindelse angår således også en hidtil ukendt konstruktion, der omfatter en DNA-sekvens, der er aktiv som promotorområde i celler fra 15 filamentøse fungi, samt et kodende område, der er kemisk bundet til denne DNA-sekvens i operativ forbindelse dermed, idet dette kodende område er i stand til at blive udtrykt i en filamentøs fungusvært under indflydelse af DNA-sekvensen.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til genetisk 20 modifikation af en filamentøs fungusværtscelle, hvilken fremgangsmåde omfatter, at der ved hjælp af en hensigtsmæssig vektor i værtscellen indføres et kodende område, der er i stand til at blive udtrykt i den transformerede AspergiHus-værtscelle, og et promotorområde, der er aktivt i den transformerede Aspergillus-værtscelle, idet det kodende område og promotoren er bundet sammen kemisk og 25 er i operativ forbindelse med hinanden.

Denne fremgangsmåde omfatter også indføring af flere kopier af den udvalgte konstruktion i værten for at tilvejebringe forøgede niveauer af genekspression.

Hvis det er nødvendigt eller ønskeligt, er indføringen af flere konstruktionskopier 30 ledsaget af indføring af flere kopier af gener, der koder for produkter med en regulerende virkning på konstruktionen.

Den foreliggende opfindelse angår også filamentøse fungusceller, der er transformeret med konstruktionerne ifølge opfindelsen.

35 6 DK 176017 B1

Foretrukne værter ifølge opfindelsen er filamentøse fungi af ascomycetes-k\assen, især Aspergillus sp., herunder A. niger, A. nidulans og lignende.

I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen anvendes enten det 5 promotorområde, der er forbundet med Aspergillus n/ger-glucoamylase-genet, eller det promotorområde, der enten er forbundet med alkohol-dehydrogenase I-genet eller aldehyd-dehydrogenase-genet fra Aspergillus nidulans, til fremstilling af et hensigtsmæssigt vektorplasmid.

10 Ethvert eller alle disse promotorområder kan reguleres i værtscellen ved tilsætning af det hensigtsmæssige inducerstof. I alcA og aldA medieres denne induktion af proteinproduktet fra et tredje gen, alcR, som reguleres via promotoren. Alt tyder på, at tilgængeligheden af a/cR-produktet kan begrænse promotorfunktionen af alcA- og aldA-promotorerne, når flere kopier af en konstruktion indeholdende alcA-15 promotoren eller a/dA-promotoren indføres i en vært uden tilsvarende indføring af flere kopier af alcR-genet. I et sådant tilfælde kan den mængde a/cR-produkt, som værten kan producere, være utilstrækkelig til at opfylde behovet hos de adskillige promotorer, der kræver induktion med a/cR-produktet. Transformation af filamentøse fungusværter ved hjælp af flere kopier af konstruktioner indeholdende 20 alcA- eller aldA-promotoren ledsages af indføring af flere kopier af alcR-genet ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen. 1 andre tilfælde kan transkriptionen deaktiveres, fx ved anvendelse af store mængder glucose (og nogle andre carbonkilder) i det medium, der skal anvendes til dyrkning af værten. Ekspression af det produkt, der indkodes af det kodende område og reguleres af promotoren, 25 forsinkes derefter indtil efter slutningen af cellevækstfasen, hvor al glucosen er blevet opbrugt, og genet reaktiveres. Induceren kan tilsættes på dette tidspunkt for at forøge promotorens aktivitet.

Destinationen for protein produktet fra det kodende område, som er blevet udvalgt 30 til ekspression under kontrol af den ovenfor beskrevne promotor, bestemmes af dette kodende områdes nukleotidsekvens. Hvis proteinproduktet naturligt ledes til det ekstracellulære miljø, vil det som nævnt iboende indeholde et sekretionssignalpeptid-kodende område. Proteinprodukter, der normalt befinder sig intracellulært, mangler dette signalpeptid.

35 _ ___ i ' — --- · - 7 DK 176017 B1 I nærværende beskrivelse er det derfor klart, at et "kodende område" koder for et protein, der enten bevares intracellulært eller secerneres. (Dette "kodende område" betegnes undertiden inden for teknikken et strukturgen, dvs. den del af et gen, som koder for et protein.) Hvis proteinet bevares inde i den celle, som 5 producerer det, mangler det kodende område sædvanligvis et signalpeptid-I kodende område. Sekretion af det protein, der indkodes inden for det kodende område, kan være en naturlig konsekvens af cellemetabolisme, i hvilket tilfælde det kodende område iboende indeholder et signalpeptid-kodende område, der er forbundet naturligt i translationslæseramme med et segment fra det kodende io område, der koder for det secernerede protein. I dette tilfælde kræves der ikke indsætning af et signalpeptid-kodende område. Alternativt kan det kodende område manipuleres til indføring af et signalpeptid-kodende område, som er fremmed for den del af det kodende område, som koder for det secernerede protein.

15 i

Opfindelsen beskrives nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1A viser basesekvensen af det DNA, der udgør det kodende område og promotorområdet i alkohol-dehydrogenase I- (a/c4)-genet fra Aspergillus nidulans, 20 fig. IB viser basesekvensen af det DNA, der udgør det kodende område og promotorområdet i aldehyd-dehydrogenase- (a/cM)-genet fra Aspergillus nidulans, fig. 2 viser i diagram en fremgangsmåde til konstruktion af plasmidet pDG6, der er nyttigt ved transformation af en filamentøs funguscelle, 25 fig. 3 viser lineært en del af det i fig. 2 viste plasmid pDG6, fig. 4 viser i diagram plasmidkortene over pGLl og pGL2, fig. 5 viser et udvalg af syntetiske linker-sekvenser til indsætning i plasmidet PGL2, fig. 6 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGL2, 30 fig. 7 viser plasmidkortet over pGL2B og pGL2BIFN, fig. 8 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGL2BIFN, fig. 9 viser plasmidet pALCAlS og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, fig. 10 viser plasmidkortet over pALCAlSIFN og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, 35 fig. 11 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pALCAlSIFN, 8 DK 176017 B1 fig. 12 viser plasmidkortet over pGL2CENDO, fig. 13 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pGL2CENDO, fig. 14 viser plasmidkortet over pALCAlSENDO, fig. 15 viser nukleotidsekvensen af et fragment af pALCAlSENDO, 5 fig. 16 viser plasmidet pALCAlAMY og en fremgangsmåde til fremstilling deraf, og fig. 17 viser nukleotidsekvensen af et segment af det i fig. 16 viste plasmid pALCAlAMY.

Ved den foreliggende opfindelse identificeres et hensigtsmæssigt promotorområde 10 for et fungerende gen i A. niger eller A. nidulans eller lignende. Fremgangsmåder til identifikation af hvert af de gener, som indeholder de ønskede promotorområder, er ens, og af denne grund beskrives den måde, hvorpå alcA-genet og promotoren deri lokaliseres og identificeres. Til dette formål induceres celler af den valgte art til at udtrykke det udvalgte protein, fx alcA, og ud fra disse celler isoleres messenger-| 15 RNA’et. En del deraf, som endnu ikke er identificeret, koder for alcA.

Komplementært DNA til fragmenterne fremstilles ud fra mRNA-fragmenterne og klones i en vektor. Messenger-RNA isoleret fra induceret A nidulans størrelsesfraktioneres for at beriges med a/cA-sekvenser, endemærkes og hybridiseres til de cDNA-kloner, der er fremstillet ud fra a/cA+-stammen. Den klon, 20 der indeholder det cDNA, som hybridiserer til alcA* mRNA, indeholder DNA-kopien af alcA mRNA'et. Dette stykke hybridiseres til en total DNA-genbank fra den valgte Aspergillus-art for at isolere det valgte kodende område, fx alcA og de tilgrænsende områder. Det a/dA-kodende område blev isoleret ved analoge fremgangsmåder.

25

Det kodende område starter ved 5’-enden med en kodon ATG, der koder for methionin sammen med andre kodende områder og proteiner. Hvis det udtrykte proteins aminosekvens er kendt, kan det kodende områdes DNA-sekvens let genkendes. Umiddelbart "opstrøms" for ATG-kodonen findes den kodende del af 30 messenger-RNA'et, foran hvilken promotorområdet ligger.

I fig. 1A og IB er vist disse dele af den totale DNA-sekvens fra A. nidulans med konventionelle basenotationer. Den i fig. 1A viste del indeholder promotorområdet og det kodende område fra alcA-genet, som koder for enzymet alkohol-35 dehydrogenase I. Den i fig. IB viste del indeholder promotorområdet og det i 9 DK 176017 B1 område, der koder for enzymet aldehyd-dehydrogenase, dvs. aldA. (I begge tilfælde betegner udtrykket "IVS” intervenerende sekvenser.)

Aminosyresekvenserne for disse to enzymer er kendte i andre arter. Ud fra disse er områderne 10 og 10' genkendelige som de kodende områder. Hvert kodende 5 område starter ved 5’-enden ("opstrøms") med methionin-kodonen ATG ved 12. De relevante aminosyresekvenser, der indkodes af det protein-kodende område, er indsat under de respektive rækker i fig. 1A og IB med de konventionelle forkortelser. Umiddelbart opstrøms for kodon 12 findes det område, der koder for messenger-RNA-leder- og promotorrområdet, hvis længde nu skal bestemmes eller 10 i hvert fald bedømmes for at indeholde alle de essentielle strukturelementer, der gør det muligt for det at fungere som promotor. I hver af fig. 1A og IB er vist en sekvens på ca. 800 baser i hvert tilfælde opstrøms for ATG-kodonen 12.

Det kan ved analogi med andre kendte promotorer forudsiges, at alle de 15 funktionelle essentielle elementer sandsynligvis er indeholdt inden for en sekvens med en længde på ca. 1000 baser, formodentlig inden for de viste 800 baser, og mest sandsynligt inden for de første 200-300 baser, dvs. tilbage til omkring stilling 14 i fig. 1A og IB. En essentiel funktion for et promotorområde er at tilvejebringe et sted for nøjagtig transkriptionsinitiering, hvilket vides at være en TATA-20 kassesekvens. En sådan sekvens findes ved 16 på a/cA-promotorsekvensen i fig.

1A og ved 16’ på a/dA-promotorsekvensen i fig. IB. En anden funktion for et promotorområde er at tilvejebringe en hensigtsmæssig DNA-sekvens, der er aktiv til regulering af gentranskriptionen, fx et bindingssted for et regulerende molekyle, som forøger gentranskriptionen, eller for at gøre genet aktivt eller inaktivt.

25 Sådanne regulerende områder findes inden for det i fig. 1A og IB viste promotorområde for henholdsvis alcA- og a/dA-generne.

Den nøjagtige opstrøms 5’-terminal af den DNA-sekvens, der her anvendes som promotorområde, er ikke kritisk, forudsat den omfatter de essentielle funktionelle 30 sekvenser som beskrevet. Overskydende DNA-sekvenser opstrøms for 5'-terminalen er unødvendige, men er sandsynligvis ikke skadelige ved den foreliggende opfindelse.

Når udstrækningen af den sekvens, der indeholder alle de essentielle funktionelle 35 elementer til at udgøre et promotorområde i et givet gen, er blevet bestemt ved de 10 DK 176017 B1 t i nærværende beskrivelse beskrevne teknikker, er næste trin at spalte DNA-kæden på et passende sted nedstrøms for promotorområde-terminalen og at fjerne det protein-kodende område, hvilket hovedsageligt efterlader en sekvens, der omfatter promotorområdet og undertiden en del af det område, der koder for messenger-5 RNA-lederen. Til dette formål skal der lokaliseres hensigtsmæssigt anbragte restriktionssteder, hvorefter DNA’et behandles med de hensigtsmæssige restriktionsenzymer til udførelse af spaltning. Restriktionssteder er genkendelige fra den i fig. 1A viste a/cA-sekvens. Til opstrøms spaltning vælges der et sted tilstrækkeligt langt opstrøms til, at der i den bevarede del er omfattet alle de 10 essentielle funktionelle steder for promotorområdet. Hvad angår nedstrøms spaltning, findes der ikke noget restriktionssted nøjagtigt ved ATG-kodonen 12 i tilfælde af alcA. Det nedstrøms restriktionssted, der er tættest derpå, er sekvensen GGGCCC ved 13, ved hvilket kæden kan spaltes med restriktionsenzymet Apal. Om ønsket kan de tilbageværende nukleotider fra stilling 13 til stilling 12 efter en 15 sådan skæring trinvis fjernes under anvendelse af en exonuklease. Da antallet af sådanne nukleotider, der skal fjernes, kendes, kan exonukleasens virkning standses på hensigtsmæssig måde, når stilling 12 er passeret. Ved at lokalisere et lignende restriktionssted nedstrøms for methionin-kodonen 12 i det a/dA-kodende område vist i fig. IB udskæres dette promotorområde på lignende måde til 20 efterfølgende anvendelse. 1 mange tilfælde er resterende nukleotider ved promotorområdets 5’-terminal ikke skadelige for og griber ikke væsentligt ind i promotorområdets funktion, når blot basetripletternes læseramme er bevaret.

I fig. 2 på tegningen er i diagram vist trinnene i en fremgangsmåde til fremstilling 25 af plasmidet pDG6, som kan anvendes til at danne Aspergillus-transformanter ifølge den foreliggende opfindelse. I fig, 2 er 18 et rekombinant plasmid indeholdende det endogluconase-kodende (cellulase) område 30 fra bakterien Cellulomonas fimi, nemlig et SamHI-endoglucanase-fragment fra C. fimi i den kendte vektor M13MP8. Det indeholder relevante restriktionssteder for fcoRI, 30 HincfUl og SamHI som vist samt andre, der ikke er vist og ikke har betydning for nærværende fremgangsmåde. Henvisningsbetegnelse 20 er et rekombinant plasmid betegnet p5, der er konstrueret ud fra det kendte E. co//-plasmid pBR322 og indeholder et £coRI-fragment fra A. nidulans indeholdende a/cA-promotorområdet, der er fremstillet som beskrevet ovenfor, sammen med en lille 35 del af det a/cA-kodende område, herunder startkodonen ATG. Det har 11 DK 176017 B1 restriktionssteder som vist samt andre restriktionssteder, der ikke anvendes ved den foreliggende fremgangsmåde og derfor ikke er vist. Plasmidet p5 indeholder en DNA-sekvens 22 fra EcoRI-stedet (3’) til W/ntfIII-stedet (5‘), som faktisk er en del af den i fig. 1A i den øverste række viste sekvens fra stilling 15 (sekvensen 5 GAATTC derved udgør et EcoRI-restriktionssted) til stilling 17. Sekvensen 22 i plasmidet 20 har en længde på ca. 2 kb.

Plasmiderne 18 og 20 skæres dernæst med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll for at udskære a/cA-promotorområdet og det endoglucanase-kodende område 30, 10 som ligeres til det med Hindlll spaltede plasmid pUC12 til dannelse af en ny konstruktion, pDG5A, der indeholder disse sekvenser på pUC12 som vist i fig. 2.

Plasmidet pUC12 er et kendt, kommercielt tilgængeligt E. co//-plasmid, som i replikerer effektivt i E. coli, således at der kan fremstilles rigelige kopier af pDG5A, ·.

hvis dette ønskes. Den nye konstruktion pDG5A isoleres fra de øvrige produkter i 15 konstruktionspræparationen. Dernæst forsynes konstruktionen pDG5A med en selekterbar markør, således at senere vundne transformanter af Aspergillus, i hvilke konstruktionen med held er blevet indført, kan selekteres og isoleres. I tilfælde af ArgB' Aspergillus-\/ærter kan der til dette formål hensigtsmæssigt anvendes et ArgB-gen fra A. nidulans. ArgB-genet koder for enzymet ornithin-20 transcarbamylase, og stammer indeholdende dette gen kan let selekteres og isoleres fra ArgB'-stammer ved standardteknikker for udpladning og dyrkning.

ArgS-stammer kan ikke gro på et medium uden arginin.

Til inkorporering af en selekterbar markør kan konstruktionen pDG5A i denne 25 udførelsesform for opfindelsen som vist i fig. 2 ligeres med Xbal-fragmentet 32 fra plasmidet pDG3 (ATCC 53006, jfr. USA-patentansøgning nr. 678.578, Buxton et al., indleveret 5. december 1984), som indeholder ArgB*-genet fra A. nidulans, under anvendelse af Xbal, hvilket giver den nye konstruktion pDG6, som indeholder det endoglucanase-kodende område, a/cA-promotorsekvensen og ArgB-30 genet. Plasmidet pDG6 anvendes derefter ved transformationen til fremstilling af nye Aspergillus-mutantstammer, der indeholder et endoglucanase-kodende område, under kontrol af a/cA-promotoren, hvilket er beskrevet nærmere i eksempel 1.

12 DK 176017 B1 I fig. 3 er i lineær form vist den diagrammatiske sekvens af den funktionelle del af konstruktionen pDG6 fra HindlU-stedet 24 til Hindlll-stedet 26. Det indeholder a/c4-promotorområdet 22, ATG-kodonen 12 og en lille resterende del af det alcA-kodende område nedstrøms for ATG-kodonen som vist i fig. 1, efterfulgt af det 5 cellulase-kodende område 30 fra plasmidet 18.

Plasmidet pDG6 er blot ét eksempel på en vektor, som indeholder en filamentøs funguspromotor bundet til et protein-kodende område, som er fremmed for fungusen. I en anden vektor, der er eksemplificeret heri under henvisning til fig.

10 16, og som betegnes pALCAlAMY, er den filamentøse funguspromotor fra alcA-genet koblet til den naturligt forekommende sekvens, der koder for ot-amylaseenzymet, et produkt, som er fremmed for den transformerede fungusvært. Proteinprodukterne fra vektorerne pDG6 og pALCAlAMY udtrykkes i begge tilfælde af de respektive transformerede værter. Da det α-amylase-kodende område 15 naturligt indeholder et signalpeptid-kodende område, kan dette produkt yderligere secerneres af den transformerede vært under anvendelse af værtens sekretionsmaskineri på trods af dets fremmede forhold til værten.

Identifikation og isolering af promotorområderne i filamentøse fungi gør det 20 således muligt at manipulere værten ved transformation med vektorer, der indeholder disse promotorområder koblet til et ønsket kodende område.

Hvis det kodende område på vektoren kræver et signalpeptid-kodende område, eller den eksisterende signalsekvens skal erstattes med et andet, fortrinsvis mere 25 effektivt signalpeptid-kodende område, kan sådanne signalpeptid-kodende områder integreres mellem promotoren og det segment, der koder for det secernerede protein. Plasmiderne pGL2 (fig. 4) og pALCAlS (fig. 9) udgør mellemkloningsvektorer, der er særligt egnede til dette formål. Hver kan fungere som en kassette og tilvejebringe en promotor, en signalsekvens og et restriktionssted 30 nedstrøms for signalsekvensen, hvilket muliggør indsætning af et protein-kodende område i korrekt transkriptionslæseramme med signalsekvensen.

Det i fig. 4 viste plasmid pGL2 er dannet ud fra pGLl, der indeholder promotoren 40, signalsekvensen 42 og en indledende del 46 af glucoamylase-genet, som alle 35 blev afledt i ét segment fra A. niger-DNA ifølge heri eksemplificerede metoder. 1 ^ - - —- 13 DK 176017 B1 dette segment findes der et SssHII-restriktionssted nær enden af, men dog inden for, glucoamylase-signalsekvensen 42, hvis nukleotidsekvens er vist nedenfor i diagram 1.

5 Diagram 1

5' ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGC GGC CTC GTC TGC

* S/ met ser phe arg ser leu leu ala leu ser gly ley val cys

bssK II

10 ACA GGG TTG GCA AAT GTG ATT TCC AAG^CGC 3 ' .

thr gly leu ala asn val ile ser lys arg

For at tilvejebringe et segment nedstrøms for signalsekvensen, dvs. en linker 44, 15 som er i stand til at modtage et protein-kodende område i læseramme med signalsekvensen 42, udnyttes tilstedeværelsen af BssHII-stedet inde i signalsekvensen og Sstl-stedet nedstrøms derfor. I denne specifikke udførelsesform skæres segmentet 46 ud af pGLl og erstattes med én udvalgt linker ud af tre vist i fig. 5 og betegnet med A, B eller C. Hver linker er i stand til at 20 ligere med SssHII-enden og Sstl-enden. Linkerne er også udformet til at gendanne de terminale kodoner af signalsekvensen, som er gået tabt ved udskæring af segmentet 46 med SssHII. Endvidere definerer hver linker unikke fFcoRV- og 8g/II/A7?oII-steder inden for sin nukleotidsekvens, hvilket muliggør indsætning af det ønskede kodende område i vektoren pGL2.

25

Selektion af den egnede linker foretages med kendskab til i det mindste de første få kodoner af det protein-kodende område, der skal indsættes i linkeren. For at det protein-kodende område kan translateres mærkbart, skal starten af det proteinkodende område enten være direkte koblet til eller være et specifikt antal 30 nukleotider, dvs. i tripletter, fra starten af signalsekvensen. Hvis det proteinkodende område, der skal indsættes, har ét eller to ikke-essentielle nukleotider (eller en ikke-tripletfaktor deraf) ved sit 5'-område, hvilket kan skyldes rutinemæssig udskæring, kan én af de i fig. 5 viste linkere følgelig kompensere for tilstedeværelsen af de ekstra, overflødige nukleotider og anbringe starten af det 35 protein-kodende område i translationslæseramme med signalsekvensen.

14 DK 176017 B1

De aminosyrerester, der indkodes af linkerne A, B og C, er vist under deres nukleotidsekvenser i fig. 5, hvoraf ses virkningen af tilsætning af et yderligere nukleotid til linkersekvensen på læserammen af linkeren og slutteligt på det 5 indsatte protein-kodende område. Ved at udforme linkerne således, at restriktionsstedet altid er nedstrøms for læserammemodifikationen, dvs. én, to eller tre adeninrester i linkerne henholdsvis A, B og C, kan læserammen af det kodende område, der indsættes i restriktionsstedet, bevares ved hensigtsmæssig linkerselektion.

10

Eksempler på plasmider, der benytter plasmidet pGL2 og specifikke linkersegmenter A, B eller C, er pGL2BIFN, der anvender B-linkeren og resulterer i interferon α-2-sekretion, når det anvendes i filamentøse fungi, fx Aspergillus sp., transformation og pGL2CENDO, der anvender C-linkeren og resulterer i 15 endoglucanase-sekretion, når sådanne filamentøse fungi transformeres med det.

Medens plasmidet pGL2 anvender en naturligt forekommende signalsekvens, ligger det inden for den foreliggende opfindelses rammer også at anvende vektorer, der indeholder syntetiske signalsekvenser. Et eksempel på en sådan vektor er 20 pALCAlS, som i lighed med plasmidet pGL2 udgør en mellemvektor, i hvilken der kan indsættes et protein-kodende område til dannelse af en vektor, der kan transformere filamentøse fungi. I modsætning til pGL2 anvender pALCAlS imidlertid alcA-promotoren og benytter en syntetisk signalsekvens koblet til denne promotor. pALCAlS er vist i fig. 9, der viser et skema over dets fremstilling, og 25 hvortil der henvises yderligere i eksemplerne. Eksempler på plasmider, der er dannet ud fra pALCAlS, er pALCAlSIFN, som resulterer i sekretion af interferon a-2 fra en filamentøs fungus transformeret dermed, og pALCAl SENDO, som resulterer i sekretion af endoglucanase fra en filamentøs fungusvært. I begge tilfælde opnås der sekretion på trods af, at det secernerede protein er fremmed i 30 forhold til værten.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående, ikke-begrænsende eksempler.

Hvert af nedenstående eksempler 1 og 2 er eksempler på vellykket transformation 35 af en filamentøs fungusvært under anvendelse af vektorer, som har en fra en 15 DK 176017 B1 filamentøs fungus stammende promotor koblet til naturligt forekommende kodende omrider, der ikke er fungale.

5 EKSEMPEL 1

Transformation af A nidulans under anvendelse af pDG6 ATCC 53169.

; Den i fig. 2 viste vektorkonstruktion pDG6 blev først fremstillet ved at følge det i 10 fig. 2 viste fremgangsmådeskema under anvendelse af standardteknikker til ligation og restriktion. Derefter blev konstruktionen pDG6 indført i argB -mutantceller fra Aspergillus nidulans som følger: 500 ml komplet medium (Cove 1966) + 0,02% arginin + 10'5% biotin i en 2 liters 15 konisk kolbe blev inokuleret med 105 konidier/ml af en A. nidulans argB'-stamme og inkuberet ved 30°C og med omrystning ved 250 omdr./minut i 20 timer.

Myceliet blev høstet gennem Whatman-filterpapir nr. 54, vasket med sterilt deioniseret vand og suget tørre. Myceliet blev sat til 50 ml filtersterilt 1,2M MgS04, 10 mM kaliumphosphat, pH 5,8, i en 250 ml’s kolbe, hvortil var sat 20 mg 20 Novozym 234 (Novo Enzyme Industries), 0,1 ml ( = 15.000 enheder) β- glucuronidase (Sigma) og 3 mg bovint serumalbumin for hvert gram mycelium. Spaltningen lodes forløbe ved 37°C under let omrystning i 50-70 minutter, idet der periodisk blev kontrolleret for sfæroplast-dannelse ved hjælp af et lysmikroskop.

50 ml sterilt deioniseret vand blev tilsat, og sfæroplasteme blev skilt fra ikke-25 spaltede fragmenter ved filtrering gennem 30 μπι nylonsigter og høstet ved centrifugering ved 2500 x g i 5 minutter i en udsvingsrotor ("swing out rotor”) i 50 ml’s reagensglas med konisk bund og ved stuetemperatur. Sfæroplasteme blev vasket ved resuspendering og centrifugering 2 gange i 10 ml 0,6M KCI. Antallet af sfæroplaster blev bestemt med et hæmocytometer, og de blev resuspenderet i en 30 slutkoncentration pi 108/ml i 1,2M sorbitol, 10 mM Tris/HCI, 10 mM CaCI2, pH 7,5. Alikvoter på 0,4 ml blev anbragt i plastrør, hvortil der sattes DNA fra pDG6 (samlet volumen 40 μΙ i 10 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, pH 8), og der blev inkuberet ved stuetemperatur i 25 minutter. Alikvoter på 0,4 ml, 0,4 ml og derefter 1,6 ml 60%'s PEG4000, 10 mM Tris/HCI, 10 mM CaCI2, pH 7,5, blev sat til hvert rør sekventielt 35 under let, men grunding blanding mellem hver tilsætning, efterfulgt af yderligere 16 DK 176017 B1 inkubation ved stuetemperatur i 20 minutter. De transformerede sfæroplaster blev derefter sat til hensigtsmæssigt berigede minimalmedier 1%'s agaroverlejringer, ±0,6M KCI ved 45°C, og blev umiddelbart hældt ud i identiske (men kolde) medier på plader. Efter 3-5 dage ved 37°C blev antallet af voksende kolonier talt (F.

5 Buxton et al., Gene 37, 1985, s. 207-214). Fremgangsmåden beskrevet af Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1980, s. 1370-1374) blev også anvendt.

Kolonierne blev opdelt i to grupper. Threonin (11,9 g/liter) og fructose (1 g/liter) blev sat til inkubationsmediet i den ene gruppe til induktion af det deri 10 inkorporerede cellulasegen. Der blev ikke sat inducer til den anden gruppe, som blev deaktiveret ved dyrkning på minimalmedier med glucose som den eneste carbonkilde. Begge grupper blev analyseret for generel proteinproduktion ved hjælp af et BioRad-Assay efterfulgt af dyrkning, filtrering for at skille myceliet fra, frysetørring, formaling og proteinekstraktion med 20 mM Tris/HCI ved pH 7.

15

For at teste for cellulasedannelse blev der fremstillet plader af agarmedium indeholdende cellulase (9 g/liter, carboxymethylcellulose), og små stykker af glasfiberfiltermateriale, der var isoleret fra hinanden, og 75 μg totalt protein fra én af transkonjuganterne blev sat til hvert af filtrene. Pladerne blev inkuberet natten 20 over ved 37°C. Filtrene blev derpå fjernet og pladerne farvet med congo-rødt for at bestemme de steder, hvor cellulase havde været til stede i det totale protein på filtrene, hvilket fremgår ved nedbrydning af cellulase i agarmediet nedenunder.

Pladerne blev affarvet ved vask med 5M NaCI i vand for på synlig måde at detektere forskellene.

25

Af fire transformanter, der var induceret med threonin og fructose, viste tre klart tilstedeværelse af cellulase i det totale proteinprodukt. De ikke-inducerede, glucose-deaktiverede transformanter viste ikke tegn på cellulaseproduktion.

30 Tre kontroltransformanter blev også fremstillet af samme vektorsystem og stammer, men under udeladelse af promotorsekvensen. Ingen af dem producerede cellulase med eller uden inducere. Tilstedeværelsen af det C. /ir'm/'-endoglucanase-kodende område blev verificeret ved, at medium fra threonin-inducerede transformerede stammer udviste reaktivitet med et monoklonalt antistof dyrket 17 DK 176017 B1 mod C. fim/-endoglucanase. Dette monoklonale antistof udviste ingen krydsreaktivitet med endogene A. nidulans-proteiner i kontrolstammer.

5 EKSEMPEL 2

Transformation af A. nidulans under anvendelse af pALCAlAMY ATCC 53380

Vektorkonstruktionen pALCAlAMY blev fremstillet som vist i fig. 16 under 10 anvendelse af rutinemæssige standardteknikker til ligation og restriktion. Under henvisning til fig. 16 blev vektoren indeholdende et Af/nc/III-FcoRI-segment, hvori A. /7/du/ans-alkohol-dehydrogenase I-promotoren 22 befinder sig (som beskrevet tidligere), skåret ved FcoRI-stedet til indsætning af det kodende område af hvede-a-amylasegenet 72, der er indeholdt i et FcoRI-FcoRI-fragment defineret på 15 plasmidet p501 (jfr. S.J. Rothstein et al., Nature 308, 1984, s. 662-665). Eftersom hvede-a-amylase er et naturligt secerneret protein, indeholder dets kodende område 72 et signalpeptid-kodende område 76 og et segment 78, der koder for modent, secerneret a-amylase. Ligation af det kodende område 72 indeholdt i FcoRI-FcoRl-segmentet fra p501 inden for det med FcoRl spaltede sted i pALCAl 20 giver plasmidet pALCAlAMY, i hvilket A/cA-promotoren 22 er operativt forbundet med det u-amylase-kodende område. Den korrekte orientering af det fra p501 stammende α-amylase-kodende område i pALCAlAMY bekræftes ved sekventering hen over ligationsstedet ifølge standardprocedurer. Nukleotidsekvensen af forbindelsen mellem promotorområdet og det kodende område er vist i fig. 17.

25 A. nidulans kan transformeres ved den i eksempel 1 beskrevne procedure, idet prøver af ekstracellulært medium tages fra og påføres på glasfiberfilterpapirer anbragt på 1%'s opløseligt stivelsesagar. Filtrene fjernes efter 8 timer ved 37°C og vendes om på bægerglas indeholdende fast iod (i et 50°C varmt vandbad). Klare 30 pletter er tegn på stivelsesnedbrydning, medens den øvrige stivelse bliver dybt purpurrød, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af secerneret a-amylase.

1 nedenstående eksempel 3-12 tilvejebringes der vektorer, i hvilke der i vektoren indføres et sekretionssignalpeptid-kodende område for at opnå sekretion af et 35 fremmed protein fra en filamentøs fungus transformeret med hele vektoren.

18 DK 176017 B1 EKSEMPEL 3 5 Fremstilling af plasmidet pGL2, en mellemvektor A) Kilde til promotor og signalpeptidsekvens

Glucoamylase-genet fra A. niger blev isoleret ved undersøgelse af en genbank 10 stammende fra DNA, der var tilgængeligt i en stamme af denne mikroorganisme, der er deponeret hos ATCC under deponeringsnummeret 22343. Undersøgelsen blev udført under anvendelse af oligonukleotidprober fremstillet med Biosearch-oligonukleotidsyntese-udstyr og med kendskab til den publicerede aminosyresekvens af glucoamylase-proteinet. Dataene for aminosyresekvensen 15 blev "tilbagetranslateret" til nukleotidsekvensdata, og proberne blev syntetiseret.

Den bestemte genbank, der blev undersøgt, var et med Sat/3A delvis spaltet produkt fra det ovenfor beskrevne A. niger-DNA klonet i BamHI-stedet på det kommercielt tilgængelige plasmid pUC12, som både er levedygtigt i og replikerbart i E. coli.

20

Et W/ndHI-Bg/II-DNA-stykke indeholdende glucoamylase-genet blev subklonet i pUC12. Derefter blev placeringen af det ønskede promotorområde, det signalpeptid-kodende område og det protein-kodende område for glucoamylase identificeret i pUC12 indeholdende det subklonede fragment. BcoRI/fcoRI-25 fragmentet (se fig. 4) viste sig at indeholde en lang, åben translationslæseramme, når det blev sekventeret, og sekvensdataene blev analyseret under anvendelse af sekvensanalyseprogrammer fra Wisconsin Universitet.

I fig. 6 er vist resultater af analyse af nukleotidsekvensen af en del af området af i 30 glucoamylase-genet mellem 5’ fcoRI-stedet og 3' BssHII-stedet inden for Hindlll-Bg/Il-fragmentet. Dette område indeholder glucoamylase-promotoren og det signalpeptid-kodende område.

Inden for dette fragment, dvs. ved nukleotiderne 97-102, findes en "TATA-kasse" 35 48, der tilvejebringer et sted, som kræves af mange eukaryote promotorområder i .___________ __ — - --------— — DK 176017 B1 19 til nøjagtig transkriptionsinitiering (formodentlig et RNA-polymerase Ilbindingssted). Følgelig bekræftes tilstedeværelsen af i det mindste en del af promotorområdet. Det kan endvidere ved analogi med andre kendte promotorområder forudsiges, at alle de funktionelle essentielle elementer 5 sandsynligvis er indeholdt inden for en sekvens med en længde på ca. 1000 baser og mest sandsynligt inden for de første 200 baser opstrøms for startkodonen for det kodende område, dvs. nukleotiderne 206-208 eller "ATG" 49, kodonen for methionin. Promotoren og transkript-lederen ender således ved nukleotid 205.

Identiteten af begyndelsen af promotorområdet er mindre vigtig, selv om 10 promotorområdet skal indeholde RNA-polymerase Il-bindingsstedet og alle de øvrige elementer, der kræves, for at det fungerer. Medens EcoRl-fcoRl-segmentet antages at udgøre hele promotorområdet i glucoamylase-genet, indeholder det i plasmidet pGL2 anvendte plasmid således dette fragment i det meget større W/ndlll-SamHI/Bg/II-segment, hvilket sikrer, at hele promotorområdet korrekt 15 inkluderes i det resulterende plasmid.

Da aminosyresekvensen for moden glucoamylase er kendt (jfr. Svensson et al.,

Characterization of two forms of glucoamylase from Aspergillus niger, Carlsberg Res. Commun. 47, 1982, s. 55-69), kan en nukleotidsekvens for signalpeptidet 20 bestemmes nøjagtigt. Det signalpeptid-kodende område i gener, der koder for secernerede proteiner, vides at starte med methioninresten, der indkodes af ATG-kodonen 49. Bestemmelse af en tilstrækkelig stor indledende del af nukleotidsekvensen 3’ efter ATG-kodonen, giver informationer, ud fra hvilke aminosyresekvensen af denne del kan bestemmes. Ved sammenligning af denne 25 aminosyresekvens med den publicerede aminosyresekvens kan signalpeptidet identificeres som den del af glucoamylase-genet, som ikke har noget modstykke i den publicerede sekvens, hvormed den blev sammenlignet. Det heri definerede glucoamylase-signalpeptid-kodende område er tidligere blevet bekræftet ved denne metode.

30 '

Ved ovennævnte metoder blev det bekræftet, at Hindlll-BamHl/BglU-fragmentet, der resulterede fra delvis Sau3A-spaltning og var inkorporeret i pUC12, indeholdt følgende elementer fra glucoamylase-genet: en indledende, måske irrelevant, sektion, promotorområdet, det signalpeptid-kodende område og den resterende del 35 af det kodende område. Dette fragment, indsat i plasmidet pUC12 ved spaltning i 20 DK 176017 B1 med Hind\U og BamHl/BglU og ligation, er vist skematisk i fig. 4 som plasmidet pGLl. Dette plasmid indeholder alle de elementer, der er nødvendige til replikation og lignende, således at det forbliver selekterbart og replikerbart i E. coli.

5 B) Konstruktion af plasmidet pGL2

Under anvendelse af pGLl som precursor kan der som vist i fig. 4 fremstilles plasmidvektoren pGL2. Restriktionsstedet BssHIl nær ved 3'-enden af signalsekvensen 42 anvendes sammen med det unikke nedstrøms Sstl-sted til 10 indsætning af en syntetisk linkersekvens A, B eller C som defineret i fig. 5. pGLl spaltes således med både fissHII og Sst, hvilket fjerner den indledende del af det glucoamylase-kodende område 46, der er indeholdt deri. Derefter indsættes og ligeres en udvalgt sekvens af de syntetiske linkersekvenser A-C, som er udformet således, at de er omgivet af SssHII/Sstl-kompatible ender, hvilket frembringer 15 plasmidet pGL2. Afhængigt af, hvilken af de tre linkersekvenser, der anvendes, dvs. A, B eller C, identificeres det resulterende plasmid som henholdsvis pGL2A, pGL2B eller pGL2C.

De heri identificerede syntetiske linkersekvenser er hver forsynet med unikke 20 fcoRV- og Sg/II-restriktionssteder som vist i Fig. 5, i hvilke der kan indsættes et ønsket protein-kodende område. Efter indsætningen kan det resulterende plasmid anvendes til at transformere en vært, fx A. niger, A. nidulans og lignende. Tilstedeværelsen af promotorområdet og det signalpeptid-kodende område, som begge genkendes af værten, giver et middel, ved hjælp af hvilket ekspression af 25 det protein-kodende område og sekretion af det således udtrykte protein gøres mulig.

EKSEMPEL 4 30

Anvendelse af plasmidet pGL2 til fremstilling af pGL2BIFN

Et eksempel på anvendeligheden af plasmidet pGL2 er beskrevet nedenfor under henvisning til fig. 7, der skematisk viser konstruktionen af plasmidet pGL2BIFN ud 35 fra pGL2B.

21 DK 176017 B1

Plasmidet pGL2B fremstilles som beskrevet generelt ovenfor for pGL2 med den undtagelse, at den i fig. 5 viste syntetiske linkersekvens "B" indsættes specifikt. Henvisningsbetegnelsen 44 er følgelig ændret i fig. 7 til ,,44B‘’. For at tilvejebringe 5 en åbning i vektoren pGL2B skæres plasmidet med EcoRV ved stedet inde i linkeren 44B. Skæringen medfører stumpe ender, som kan ligeres med et fragment, der flankeres af stumpe ender, under anvendelse af ligaser, der vides at være nyttige til dette specifikke formål.

10 I den i fig. 7 viste udførelsesform indsættes et fragment 60 indeholdende det kodende område for humant interferon a-2 til dannelse af pGL2BIFN. Et DdeI-SamHI-fragment 60 indeholdende det kodende område for humant interferon a-2 blev specifikt skåret ud fra plasmidet pN5H8 (ikke vist) på basis af dette gens kendte sekvens og restriktionskort.

15

Plasmidet pN5H8 kombinerer det kendte plasmid pAT153 med interferon-genet ved et SamHI-sted. Interferon-genet deri er beskrevet af Slocomb et al., "High level expression of an interferon a-2 gene cloned in phage M13mp7 and subsequent purification with a monoclonal antibody", Proceedings of the National Academy of 20 Sciences USA 79, 1982, s. 5455-5459.

For at sammenføje hæfteenderne af interferon-fragmentet i det spaltede fcoRV-sted i pGL2B udfyldes Dde I- og BamHI-hæfteenderne under anvendelse af revers transkriptase og ligeres ved hjælp af en hensigtsmæssig ligase under anvendelse 25 af standardteknikker.

Fordelen ved at vælge linkersekvensen B til indsætning i pGL2 fremgår af fig. 8, som viser læserammen af det interferon α-2-kodende område og dets forhold til den genskabte signalpeptidsekvens med hensyn til nukleotidsekvens og 30 aminosyresekvens, hvis det er hensigtsmæssigt.

Fig. 8 viser en del af promotorområdet 40 5’ i forhold til signalsekvensen forbundet til en del af glucoamylase-signalpeptidsekvensen 42, der begynder med methioninkodonen ATG ved 49 og ender med lysinkodonen AAG ved 50. Selv om 35 det signalpeptid-kodende område strækker sig én rest længere, dvs. til CGC- 22 DK 176017 B1 kodonen for arginin ved 52, er denne sidstnævnte rest i realiteten omfattet af den syntetiske linkersekvens 44B, der er manipuleret således, at der kompenseres for tabet af argininresten under skæring og ligation til indsætning af linkersekvensen.

På denne måde forstyrres den genetiske sekvens af signalet ikke.

5 På lignende måde sørger linkersekvensen for indsætning af det interferon a-2-kodende område uden at ændre dets læseramme. Under henvisning til fig. 7 og 8 resulterer spaltning af linkersekvensen 44B med EcoRV i linkerfragmenterne 44B' og 44B”, der har stumpe ender. Udskæring af det interferon α-2-kodende område 10 ved ødel-stedet resulterer efter udfyldning af de af enzymet dannede hæfteender i den ønskede nukleotidsekvens uden at skade dette kodende områdes sekvens.

Ligation inden for den med EcoRV spaltede linkersekvens af interferonsekvensen udfyldt ved Ødel-stedet bevarer den naturlige læseramme af det interferonkodende område, hvilket ses ved tripletkodon-tilstanden mellem linkerdelen 44B' 15 og det interferon-kodende område 60. Hvis den i fig. 5 viste linker A var blevet valgt, hvilken linker bærer ét nukleotid mindre end linkeren B, ville hele læserammen være blevet forskudt med ét nukleotid, hvilket ville medføre en meningsløs sekvens. Ved at vælge den syntetiske linker B gøres kodoner tilgængelige mellem signalpeptidsekvensen og det interferon-kodende område, 20 hvilket ikke ændrer læserammen for det kodende område, når IF α-2-fragmentet med stumpe ender er orienteret korrekt. Den korrekte orientering selekteres ved at sekventere kloner med indsætninger tværs over ligationsforbindelsen.

25 EKSEMPEL 5

Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med pGL2BIFN ATCC ! 53371 30 Plasmidet pGL2BIFN blev cotransformeret, dvs. med et plasmid indeholdende argB*-genet som beskrevet mere detaljeret i USA-patentansøgning nr. 678.578 af 5. december 1984, i en argB.-stamme af A. nidulans med et separat plasmid indeholdende en selekterbar argB-markør. argB+-transformanter blev selekteret, hvoraf 18 ud af 20 indeholdt 1-100 kopier af det humant interferon α-2-kodende 35 område (detekteret ved Southern-blotanalyse).

23 DK 176017 B1

Flere transformanter blev dyrket på stivelsesmedium for at inducere glucoamylase-promotoren, og det ekstracellulære medium blev analyseret for humant IF α-2 under anvendelse af et CellTech 1F α-2-assaykit.

5 Alle transformanter udviste nogen grad af syntese og sekretion af analyserbart protein. To kontroller, vaertsstammen (ikke transformeret) og én argB+-transformant uden detekterbart humant IF α-2-DNA, udviste ingen detekterbar syntese af IF α-2-protein. 1 et separat forsøg viste transformation af A. niger og ikke A. nidulans med pGL2BIFN under anvendelse af mutatis mutandis samme 10 procedure som beskrevet ovenfor, at A. niger var i stand til at secernere IF α-2.

Selv om promotor- og signalområderne på pGL2BIFN stammer fra A. niger, påvises de således at være operative i både A. nidulans og A. niger.

15 I den foreliggende opfindelse kan der anvendes andre promotorområder end glucoamylase-promotorområdet. Egnede til anvendelse er promotorområderne for alkohol-dehydrogenase 1-genet og aldehyd-dehydrogenase-genet, vist i fig. 1A og IB.

20 EKSEMPEL 6

Konstruktion af plasmidet pALCAlS, ATCC 53368, en mellemvektor 25 Til anvendelse i nærværende eksempel blev a/cA-promotoren anvendt, hvilken promotor var indeholdt i et 10,3 kb langt plasmid pDG6, der er deponeret hos ATCC i værten E. coli JM83 under deponeringsnummeret 53169. Et plasmidkort over pDG6 er vist i fig. 2 og for nemheds skyld i fig. 9, hvortil der henvises, til belysning af endnu en udførelsesform under anvendelse af a/cA-promotoren.

30 pDG6 omfatter i sit W/ndlll-EcoRI-segment (første forekomst) promotorområdet 22 af a/cA-genet samt en lille 5' del af det a/cA-kodende område 3' af startkodonen, hvilken del er ligeret til det endoglucanase-kodende område 30. pDG6 omfatter endvidere et multipelt kloningssted 62 nedstrøms for det C. Λ/τι/'-endoglucanase-35 kodende område 20.

24 DK 176017 B1

For at genvinde a/cA-promotorområdet 22 blev pDG6 skåret med Pstl og Xhol, hvilket fjernede det meste af det endoglucanase-kodende område 30. I et andet trin blev det lineariserede plasmid 64 tilbageskåret i én retning på kontrolleret måde med exonuklease III (som vil tilbageskære fra Xhol-, men ikke Pstl-spaltede 5 DNA-ender), efterfulgt af beskæring med nukleasen SI. Tiibageskæringen blev tilrettelagt således, at enzymet fjernede nukleotider indtil en stilling 50 baser 5' i forhold til alcA ATG-kodonen, hvilket efterlader TATA-kassen og messenger-RNA-startstedet intakt.

10 Efter tilbageskæring blev vektoren 66 religeret (recirkulariseret), hvilket gav vektoren 68, der bærer Sa/I-Xbal-restriktionssteder umiddelbart nedstrøms for promotorområdet 22. Spaltning af vektoren 68 med Safl/Xbal gør det muligt at indføre et signalpeptid-kodende område på et passende sted i vektoren.

15 Det bestemte signalpeptid-kodende område, der anvendes i nærværende eksempel, blev syntetiseret til gendannelse af et karakteristisk signalpeptid-kodende område, der er identificeret i henhold til standardprocedurer som beskrevet af G. Von Heijne i Eur. J. Biochem., 1983, s. 17-21. Det syntetiske signal blev manipuleret til at give en 5' flankerende sekvens komplementær med et Sa/I-20 spaltningssted og en 3’ flankerende sekvens, hvilket muliggjorde ligation med Xbal-restriktionssekvensen.

Sekvensen af det syntetiske sekretionssignal 68 er vist nedenfor:

Sal I -I

TCGACATGTACCGGTTCCTCGCCGTCATCTCGGCCTTCCTCGCCACTGCCTTCGCCAAG

1---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 59

GTACATGGCCAAGGAGCGGCAGTAGAGCCGGAAGGAGCGGTGACGGAAGCGGTTC

Me tTy r Ar gPh eLe uAl aVa 111 eSe r Al aPh eLe u Al a Th r Al a Ph eAl aLy s

Xba I T

'60------6 4

AGATC

SerArg 25 DK 176017 B1

Sekretionssignalet i sig selv begynder med Met og ender med den fjerde forekomst af Ala, hvilket er vist med pilen.

Efter frembringelse klones den syntetiske sekvens 68, der fungerer som signal, i 5 Sa/I-Xbal-stedet på vektoren 70, hvilket giver plasmidet pALCAlS, som indeholder a/cA-promotorområdet 22 og det syntetiske peptidsignal-kodende område 68. Det forhold, at det signalpeptid-kodende område er indsat opstrøms for det multiple kloningssted 62, er signifikant, idet stedet 62 muliggør kloning af en række protein-kodende segmenter i dette plasmid.

10 pALCAlS udgør således en værdifuld udførelsesform for den foreliggende opfindelse.

15 EKSEMPEL 7

Konstruktion af plasmidet pALCAlSZFN

Som et eksempel på anvendeligheden af pALCAlS henvises der til fig. 10, der viser 20 fremstilling af pALCAlSIFN. Dette plasmid omfatter promotorområdet 22 for alcA-genet og det syntetiske signalpeptid-kodende område 68, som begge stammer fra pALCAlS (fig. 9). Desuden indeholder det det kodende område 60, der koder for humant interferon a-2 stammende fra pGL2BIFN.

25 Til opnåelse af det protein-kodende segment spaltes pGL2BIFN med FcoRl og spaltes delvist med Bgfli (på grund af tilstedeværelsen af indre BgiU-steder).

Indsætning af det protein-kodende område udføres ved spaltning af pALCAlS med BamHl og £coRI, der begge er tilgængelige i det multiple kloningssted 62, samt ligation af dette kodende område deri, hvilket giver pALCAlSIFN.

30

Nukleotidsekvensen af det resulterende plasmid fra et sted 1170 nukleotider nedstrøms for HincfUl til £coRI er vist i fig. 11, idet de relevante steder for restriktionsendonuklease-spaltning er vist. Det fremgår af ark 3 af fig. 11, at det IF α-2-kodende område 60 er i korrekt læseramme med det syntetiske signalpeptid-35 kodende område 68.

26 DK 176017 B1 EKSEMPEL 8

Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med plasmidet pALCAlSIFN

5

Plasmidet pALCAlSIFN, der var fremstillet som beskrevet ovenfor, blev cotransformeret med A. nidulans for at tilvejebringe en selekterbar argB-markør, argS+-transformanterne blev selekteret og undersøgt for tilstedeværelsen af det humant interferon α-2-kodende område, hvorefter de blev dyrket på et 10 threoninholdigt medium for at inducere a/cA-promotoren på samme måde som beskrevet i eksempel 3. Det ekstracellulære medium blev analyseret for humant IF-2 under anvendelse af et CellTech IF α-2-assaykit. 11 ud af 20 transformanter udviste sekretion af interferon induceret i nærværelse af threonin og deaktiveret i nærværelse af glucose.

15 EKSEMPEL 9 PGL2CENDO - ATCC 53372 20 I overensstemmelse med de i de foregående eksempler beskrevne fremgangsmåder blev der konstrueret et vektorplasmid med betegnelsen PGL2CENDO ud fra plasmidet pGL2C ATCC 53367 på analog måde med pGL2BIFN vist i fig. 7, men indeholdende det endoglucanase-kodende område i stedet for det 25 interferon α-2-kodende område og under anvendelse af den syntetiske linkersekvens "C" (fig. 5) i stedet for linkersekvensen "B". Et SamHI-fragment indeholdende det C. fimi endoglucanase-kodende område 30 blev indsat i Bgfll-stedet på pGL2C. A. n/du/ans-transformanter blev fremstillet med dette vektorplasmid og udviste stivelsesreguleret sekretion af cellulase, analyseret som 30 beskrevet i eksempel 1. Kortet over vektorplasmidet pGL2CENDO er vist i fig. 12 på tegningen, hvor 30 betegner det endoglucanase-kodende område (det endoglucanase-kodende område fra Cellulomonas fimi, beskrevet i forbindelse med fig. 2 og eksempel 1), 42 betegner det signalpeptid-kodende område af glucoamylase-genet, og 40 betegner promotorområdet fra glucoamylase-genet.

35 Nukleotidsekvensen er vist i fig. 13 og eksemplificerer, at anvendelse af DK 176017 B1 27 linkersekvensen C (fig. 5) bevarer læserammen for det signalpeptid-kodende område 42 og det endoglucanase-kodende område 30.

5 EKSEMPEL 10

Konstruktion af plasmidet pALCAlSENDO ATCC 53370 I overensstemmelse med de i de foregående eksempler beskrevne 10 fremgangsmåder blev der konstrueret et vektorplasmid betegnet pALCAlSENDO ved at kombinere det med EcoRI lineariserede plasmid pALCAlS som beskrevet i eksempel 5 (fig. 9) med et EcoRI-fragment fra plasmidet pDG5B (se fig. 2) (pDG5 med den omvendte orientering af HindUl-fragmentet i pUC12) og indeholdende det endoglucanase-kodende område 30. Kortet over pALCAlSENDO er vist i fig. 14, og 15 nukleotidsekvensen af dets relevante område er vist i fig. 15. I disse figurer har promotorområdet stammende fra alcA henvisningsbetegnelsen 22, det syntetiske signalpeptid-kodende område har henvisningsbetegnelsen 68, og det endoglucanase-kodende område har henvisningsbetegnelsen 30.

20 EKSEMPEL 11

Ekspression og sekretion fra A. nidulans transformeret med pALCAlSENDO og pGL2CENDO

25 A. nidulans blev cotransformeret med en selekterbar argB*~markør og plasmidet pALCAlSENDO eller pGL2CENDO, der var fremstillet som beskrevet ovenfor. Af de vundne cotransformanter udviste flere varierende niveauer af cellulase-sekretion (dvs. endoglucanase), hvilket blev bedømt på carboxymethylcelluloseplader og de 30 monoklonale antistof-testsystemer som beskrevet i eksempel 1. Begge plasmidtransformanter udviste sekretion, som blev reguleret af den bundne promotor. Plasmidet pGL2CENDO blev induceret med stivelse, og pALCAlSENDO blev induceret med threonin.

35 EKSEMPEL 12 28 DK 176017 B1

Ekspression og sekretion fra A. niger transformeret med pGL2CENDO

5 A. niger blev cotransformeret med en selekterbar argB*-markør og plasmidet pGL2CEND0. Flere af transformanterne udviste varierende niveauer af endoglucanase-sekretion, hvilket blev bedømt som beskrevet i eksempel 1. Denne sekretion blev induceret af tilstedeværelsen af stivelse i mediet.

10 EKSEMPEL 13

Forøget kopital af regulerende gener 15 I Aspergillus nidulans aktiveres a/oA-promotoren i nærværelse af den hensigtsmæssige inducer såsom ethanol under indvirkning af genproduktet fra alcR, det positive regulerende gen for alcA.

Forsøg med flerkopi-transformanter (indeholdende flere alcA-promotorer) antyder, 20 at a/c/?-genproduktet begrænser promotorfunktionen af de forskellige alcA-promotorer, der kræver stimulering.

Forøgelse af kopitallet for alcR-genet forøger ekspressionen af alcR og afhjælper denne situation. Beviset herpå er som følger: 25

Transformanter med flere kopier af a/oA-promotoren fusioneret til sit eget kodende område (ADH I) på en flerkopi-a/c/?-baggrund (hvilket har vist sig at overproducere a/cR-messenger-RNA) vokser ikke godt på ethanol. Dette skyldes formodentlig den hurtige akkumulering af aldehyder, produktet fra ADH-nedbrydning af ethanol.

30 ADH-aktivitet i disse stammer er høj. Den forøgede ADH-aktivitet på grund af forøget kopital er formentlig grunden til disse iagttagelser.

Transformanter med flere kopier af a/oA-promotoren fusioneret til interferon a-2 på en flerkopi-a/cR-baggrund giver signifikant højere niveauer af secerneret 29 DK 176017 B1 interferon. I disse stammer har mange flere af a/cA-promotorerne, til forskel fra dem med enkelt-kopi alcR, adgang til det a/c/?-regulerende protein.

Foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse giver således midler til 5 indføring af et kodende område i en filamentøs fungusvært, som, når den transformeres, vil secernere det ønskede protein. Særlig nyttige mellemplasmider til dette formål er pALCAlS og pGL2 (A, B eller C).

Nyttige transformationsvektorer, der er dannet ud fra disse plasmider, omfatter 10 pALCAlSIFN, pGL2BIFN, pALCAlSENDO og pGL2CENDO. Kulturer af disse og andre, heri nævnte plasmider holdes for tiden i en permanent levedygtig tilstand i laboratorierne hos Allelix Inc., 6850 Goreway Drive, Mississauga, Ontario, Canada.

Plasmiderne vil blive holdt i denne tilstand under hele behandlingsperioden af nærværende patentansøgning og vil i denne periode være tilgængelige for 15 eksperter. Efter udstedelse af patent på nærværende ansøgning vil disse plasmider uden begrænsninger være tilgængelige fra ATCC-deponeringsmyndigheden, anerkendt under Budapest-traktaten. De forskellige deponeringers deponeringsnumre fremgår af nedenstående tabel: 20 Plasmid Vært Deponeringsnummer Deponeringsdato pDG6 E. CO//JM83 53169 7. juni 1985 PGL2A " 53365 16. december 1985 pGL2B ' " 53366 16. december 1985 pGL2C " 53367 16. december 1985 25 pALCAlS " 53368 16. december 1985 pALCAlSENDO " 53370 16. december 1985 pALCAlSIFN " 53369 16. december 1985 PGL2BIFN " 53371 16. december 1985 PGL2CENDO " 53372 16. december 1985 30 pALCAlAMY " 53380 20. december 1985 j

Claims (10)

30 DK 176017 B1

1. Fremgangsmåde til ekspression af et protein i Aspergillus niger, kendetegnet ved, at der anvendes en DNA-konstruktion indeholdende et 5 protein-kodende område i operativ forbindelse med en promoter, hvor promoteren er fremmed for det protein-kodende område.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at promotoren stammer fra et filamentøst fungusgen. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at promotoren stammer fra et Aspergillus sp.-gen, fx en promotor stammende fra alkohol-dehydrogenase I-genet fra Aspergillus nidulans, en promotor stammende fra aldehyd-dehydrogenase-genet fra Aspergillus nidulans 15 og en promotor stammende fra glucoamylase-genet fra Aspergillus niger.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at funguscellerne dyrkes under hensigtsmæssige vækstbetingelser. 20

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at fungusen dyrkes under betingelser, under hvilke tilstedeværelsen af stoffer, der inducerer eller deaktiverer den transkriptionsfremmende funktion af promotoren, reguleres. 25

6. Filamentøs funguscelle, kendetegnet ved, at den er af arten Aspergillus niger og er transformeret med en DNA-konstruktion som beskrevet i et hvilket som helst af kravene 1-5.

7. Filamentøs funguscelle ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de indeholder flere kopier af konstruktionerne.

8. Filamentøs funguscelle ifølge krav 7, kendetegnet ved, at transformanterne udtrykker større mængder af 35 regulerende genprodukter end normalt. 31 DK 176017 B1

9. Filamentøs funguscelle ifølge krav 8, kendetegnet ved, at de større mængder end normalt af regulerende genprodukter skyldes flere kopier af gener, som regulerer den 5 transkriptionsfremmende funktion af en promotor, der er omfattet af konstruktionen.

10. Filamentøs funguscelle ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den indeholder flere kopier af en konstruktion 10 omfattende en promotor stammende fra alkohol-dehydrogenase I-genet og flere kopier af a/c/?-genet.