KR100278109B1 - 인간 혈장 알부민 발현벡터를 함유한 형질전환 효모 사카로마이세스 세레비시에를 이용한 인간 혈장 알부민의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 인간 혈장 알부민을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 프로모터에 인간 혈장 알부민 cDNA가 연결된 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 사카로마이세스 세레비시에에 도입한 형질 전환 효모 균주를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈장 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈장 알부민의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 이때 형질전환 효모 균주를 완충액 또는 질소원의 첨가로 인해 배지의 pH를 5~6으로 유지하여 발효 배양시켜 발현 분비된 알부민의 분해를 최소화시킴을 특징으로 한다.

Description

인간 혈장 알부민 발현벡터를 함유한 형질전환 효모 사카로마이세스 세레비시에를 이용한 인간 혈장 알부민의 제조 방법

본 발명은 효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 인간 혈장 알부민을 효율적으로 생산하기 위한 고효율 알부민 발현벡터 조립 및 이를 함유한 형질전환체의 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 프로모터와 알부민 자체 또는 효모 유래의 분비 시그날을 포함한 알부민 cDNA를 포함한 알부민 발현벡터의 조립, 이를 함유한 형질 전환 효모의 선별, 완충액 또는 질소원의 첨가로 인해 배지 pH를 5-6으로 유지함으로써 형질전환체에서 발현분비된 알부민의 분해를 최소화시켜 인간 혈장 알부민을 고효율로 배양 생산하는 방법에 관한 것이다.

인간 혈장 알부민 (Human serum albumin; HSA)은 585 개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다 (Peters, T. The plasma proteins, ed. F.W. Putnam, P. 133 (1975), Academic Press Inc). 알부민은 혈장 확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액 보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈장 알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균 또는 바이러스의 오염에 의한 안정성 문제가 최근에 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요하게 되었다.

이와 같은 의학적 중요성으로 인해 유전공학 기법에 의해 여러 미생물 발현시스템을 이용하여 재조합 알부민을 대량 생산하기 위한 시도들이 행하여져 왔다 (Goodey, A.R. TIBTECH. 11, 430(1993)). 원핵 세포인 대장균이나 바실러스(Bacillus)를 숙주로 사용한 경우 알부민 단백질이 응집된 상태로 발현되거나(Latta et al., Bio/Technology, 5, 1309(1987)) 그 분비 효율이 극히 낮은 문제점이 있었다 (Saunders et al., J. Bacteriol. 169, 2917(1987)). 이에 반해 단세포 미생물이면서도 진핵 세포인 효모를 숙주로 사용한 경우 올바르게 만들어진 알부민이 세포배양액으로 효율적으로 분비됨이 보고되었다. 전통적으로 재조합 단백질 생산 숙주로 사용되어 온 제빵효모인 사카로마이세스 세레비시에 (Sleep et al., Bio/Technology 8, 42 (1990), Okabayashi et al., J. Biochem. 110, 103(1991))외에도 새로운 대체효모로 개발된 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)와 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris)를 숙주로 하여 재조합 알부민을 발현 분비하였다 (Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975(1991); Sreekrishan, K. Industrail microorganisms, pp119-126).

재조합 단백질이 외래 숙주에서 발현될 때 유전자 전사(transcription)를 비롯하여 단백질의 안정성에 이르기까지 여러 단계에서 문제점들이 발생 할 수 있다. 각 단백질의 궁극적인 발현 수준은 각 단백질 고유의 특성에 따라 크게 좌우되지만 (Goeddel, D. V. Meth. Enzymol. 185, 3(1990)) 발현 벡터의 여러 구성 요소, 배양배지, 배양 조건 등을 조절함으로써 크게 증가시킬 수 있다. 따라서 단백질을 코딩하는 유전자와 이의 발현을 조절하는 주변 염기 서열 등의 적합한 배합을 지닌 발현벡터를 개발하는 것은 재조합 단백질의 대량생산을 위한 중요한 과정이다. 더 나아가 높은 발현을 유도함과 동시에 발현된 단백질의 안정성을 유지하는 배지 및 배양조건의 최적화를 통해 재조합 단백질의 생산양은 더욱 증가될 수 있다.

이에 본 발명자들은 인체에 대해 병원성이 없고 내독소를 생산하지 않는 GRAS(generally recognized as safe) 미생물이며 현재 여러 효모 시스템 중에서 숙주-벡터 시스템이 가장 잘 확립되어 있는 효모 사카로마이세스 세레비시에를 숙주로 하여 분비 발현율이 우수한 재조합 알부민 발현 벡터를 개발하고 이로써 알부민 단백질을 높은 발현율로 생산할 수 있는 배양조건을 확립하고자 노력하였다. 이와 같은 목적을 달성하기 위하여 5' 비해독 영역 (5'untranslated region; 5'UTR), 프로모터, 시그날 시퀀스, 선별 표지 등 여러 벡터 구성 성분이 HSA 발현에 미치는 영향을 조사하였고 탄소원 및 질소원, 배지 pH 등 여러 배지 조성이 HSA 발현과 안정성에 미치는 영향을 살펴보았다.

본 발명은 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 여러 프로모터를 사용하여 알부민 자체 또는 효모 유래의 분비 시그날을 포함한 알부민 cDNA를 발현하는 알부민 발현벡터들을 제작하였고 이들을 단백질 분해효소를 생산하지 못하는 균주나 갈락토즈를 탄소원으로 이용하지 못하는 균주에 형질전환시켜 알부민 발현주를 확보하고 완충액 또는 질소원의 첨가로 배양 배지의 pH를 5-6으로 유지함으로써 생성된 알부민의 분해를 방지하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 출원전 발명자들에 의거 1998년 2월 J. Microbiol, Biotechnol. (1998), 8(1), 42-48에 논문으로 발표한 바 있습니다. 상기 논문 발표 후 6개월 이내에 특허출원 함으로써 특허법 규정에 의거 신규성 의제를 요청합니다.

제1도는 인간 혈장 알부민을 코딩하는 cDNA의 5'UTR에 대한 도식이다.

제2도는 알부민 발현벡터 pYHSAs 1-10에 대한 도식이다.

제3도는 알부민 발현벡터를 함유하는 효모균주의 배양액과 세포파쇄액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동한 후 웨스턴 블럿 한 결과이다.

제4도는 재조합 알부민의 N-말단 아미노산 분석에 사용된 농축된 효모 배양액을 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동한 후 염색한 결과이다.

제5도는 재조합 단백질의 pI 값을 측정하는 전기영동 결과이다.

제6도는 배양시 완충액을 첨가한 경우의 알부민 생산에 관한 웨스턴 블럿 결과이다.

본 발명은 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 GAL10 프로모터에 5' UTR이 포함된 인간 혈장 알부민 cDNA가 연결된 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 사카로마이세스 세레비시에 2805에 도입한 형질전환 효모 균주를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈장 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈장 알부민의 제조방법을 제공하는 것이다. 또한 이때 형질전환 효모 균주를 완충액 또는 질소원의 첨가로 인해 배지의 pH를 5~6으로 유지하여 발효 배양시켜 발현 분비된 알부민의 분해를 최소화시킴을 특징으로 한다.

한편, GAL10 프로모터에 하기 5' UTR (5' 비해독영역)이 포함된 인간 혈장 알부민 cDNA가 연결된 효모용 알부민 발현벡터와 효모용 알부민 발현벡터 pYHSA5(KCTC-8897P호)를 제공하는 것이다. 이때 5' UTR은 5'-GAATTCGGCACGAGGTCAACCCCACGCCTTTGGCACAATG-3' 을 의미하는 것이다. 또한 알부민 발현 벡터 pYHSA5을 함유한 형질전환 효모 사카로마이세스 세레비시에 2805(pYHSA5)(KCTC-8896P호)도 제공한다.

따라서 본 발명은 효모 사카로마이세스 세레비시에에서의 알부민 발현 벡터들을 제조하는 과정과 상기 발현 벡터를 함유한 효모 형질전환체의 선별, 이로부터 재조합 인간 혈장 알부민의 발현을 극대화하고 동시에 분비된 HSA의 분해를 최소화하여 고농도로 축적된 재조합 인간 혈장 알부민을 생산하는 공정으로 구성된다.

이하, 본 발명은 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실험균주 및 플라스미드]

HSA 발현을 위한 효모 숙주로는 미국 N1H에서 분주받은 사카로마이세스 세레비시에 2805 (MAT α pep4::HIS3 prb-△1.6R can1 his3-20 ura3-52)와 Dr. Sclafani R. A. (Hovland et al., Gene, 83. 57(1989))로부터 분주받은 334 (MAT a pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gal1), 유 향숙 박사로부터 분주받은 L3262 (MATa ura3-52 leu2-3, 112 his4-34)(Chung et al., J. Biochem. Mol. Biol. 29, 359(1996))를 사용하였다.

효모 발현벡터로는 GAL10 프로모터를 지닌 YEG α-HIR525 (Choi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 587(1994))와 상기 벡터에서 GAL10 대신에 GAPDH 프로모터를 삽입하여 만든 pGAPD-HIR를 사용하였다. PGK(phosphoglyceratekinase)와 CUP1 프로모터를 지닌 발현 벡터로는 pYH-10Zd와 이에서 유래된 pYH-FZd(Chung et al., J. Biochem. Mol. Biol. 29, 359(1996))를 사용하였다.

[인간 혈장 알부민 유전자 확보]

인간 혈장 알부민 (이하, 'HSA'라 칭함)을 코딩하는 유전자는 생명공학 연구소에서 제작한 한국인 태아 간세포로부터 만든 cDNA 라이브러리 (library)의 염기서열을 해독하는 과정에서 pBluescriptSK (Stratagene, La Jolla, CA, USA)에 클로닝되어 있는 2.2 kb 크기의 cDNA 상태로 얻어졌고 이를 pBlue-HSA1이라 명명하였다. 상기 HSA1 cDNA의 염기 서열을 해독한 결과 코딩하는 아미노산들의 배열은 기존에 보고되어 있는 정상적인 알부민 A (Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261 6747 (1986))와 동일하였으나 5'UTR의 염기 배열의 일부는 달랐다 (도 1). HSA1 cDNA의 5'UTR를 제거하기 위해서는 cDNA 개시코돈 바로 앞에 EcoRI 제한효소의 인지 부위를 지닌 24-bp EcoRI/BstEII 올리고 뉴크레오타이드를 합성하여 HSA1의 52-bp EcoRI/BstEII DNA 절편과 교체하여 HSAII cDNA를 제작하였다. HSA 자체 분비 시그날 서열 (signal sequence)대신 효모 클루이베로마이세스 마시아너스(Kluyveromyces marxianus)의 이누리나제 유래의 분비 시그날로 교체하기 위해서는 이누리나제 시그날 서열의 20개 아미노산을 코딩하는 72-bp EcoRI/Asel DNA 절편을 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)으로 얻어 이누리나제 시그날의 마지막 3개의 아미노산을 포함한 완성된 형태의 HSA을 코딩하는 cDNA와 연결하여 INU-HSA cDNA를 제작하였다 (도 1).

[HSA 발현 벡터의 제조]

벡터 pGAPDH-HIR 나 YEGα-HIR525를 먼저 제한효소 Sall으로 절단하여 크리나우 절편 (Klenow fragment) 효소 처리 한 후 EcoRI으로 절단하여 상기한 HSA cDNA 유전자 HSA1와 연결하여 발현 벡터 pYHSA1와 pYHSA5를 각기 완성하였다. EcoRI과 SalⅠ으로 절단된 pGAPDH-HIR에다 HSAII 또는 INU-HSA cDNA를 연결하여 pHSA2와 pHSA3를 각기 제작하였다. 벡터 pYHSA6와 pYHSA7은 pYH-10Zd를 HindⅢ로 절단한 후 크리나우 절편 효소 처리하고 Sacl으로 절단하여 얻은 8kb 벡터 절편과 HSA cDNA 유전자 HSA1 또는 HSAⅡ와 연결하여 완성하였다. 벡터 pYHSA8은 pYH-EZd를 BamHI으로 절단한 후 크리나우 절편 효소 처리하고 SacⅠ으로 절단하여 얻은 8 kb 벡터 절편과 HSA cDNA 유전자 HSA1과 연결하여 제작하였다. 벡터 pYHSA10은 pYHSA5에서 얻은 GAL10 프로모터와 HSA cDNA를 포함하고 있는 3 kb BamHⅠ/HindⅢ 절편을 크리나우 절편 효소 처리한 후 pYH-FZd에서 얻어진 7 kb SalⅠ/SacⅠ 벡터 절편과 연결하여 완성하였다 (도 2).

[신규한 형질전환 효모 세포주의 제조]

상기 효모 균주 2805와 334를 상기 단계에서 제작한 HSA 발현벡터 pHYSA1-10들로 이토 등의 방법(Ito et al., J. Bacteriol. 153, 164 (1983))으로 형질 전환시켜 URA3'로 전환된 균주를 선별하여 인체 혈장 알부민 발현 효모 균주를 제작하였다.

[배지조성 및 배양조건]

유라실 (uracil)이 결핍된 합성 배지 SD-URA (Sherman et al., Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 형질 전환된 효모 세포주를 24 시간 동안 배양한 후 25 ml 발현 배지를 넣은 250 ml 바플드 플라스크 (baffled flask)에서 1% 접종하여 진탕 배양하였다. GAPD 프로모터로부터 발현을 유도할 때는 YPD 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 2%)를, GAL10 프로모터로부터 발현을 유도할 때는 YPDG 배지(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 1%, 갈락토즈 2%)를 발현배지로 사용하였다. 갈락토즈 피딩 (feeding)시에는 YPDG 배지에서 24 시간 배양한 후 배지내 갈락토즈 농도가 2%가 되도록 매 12 시간마다 72 시간까지 갈락토즈를 첨가해 주었다.

[웨스턴 블럿 분석]

총세포 파쇄액은 회수한 균체를 2% SDS를 포함한 용해 완충액 (Kang et al., J. Biotechno1. 48, 15 (1996))에 현탁한 후 글래스 비드로 파쇄한 후 원심분리하여 얻었다. 얻어진 세포 파쇄액과 배양액은 램리 (Laemmli, Nature 227, 680 (1970))의 방법에 따라 SDS-폴리아크릴 아마이드 전기영동을 한 후 Towbin(Towbin, Proc. Nat1, Acad, USA, 76, 4350(1979)) 방법으로 나이트로 셀루로즈 막에 붙인 후 인간 혈장 알부민에 대해 만들어진 폴리 크로날 항체 (미국 시스마사)로 반응시켰다. 알카린 포스파타제가 붙어 있는 항토끼 Ig에 대한 항체 (시그마사)로 부차적 반응을 진행한 후 포스파타제에 의한 색깔 반응으로 분석하였다. 세포 배양액에 있는 HSA의 양은 웨스턴 블럿에서 나타나는 66 kDa 밴드의 감도를 덴시토미터(lmage analysis system, Bio-Rad, Model GS-700)로 읽어 정량하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

여러 알부민 발현 벡터의 발현효율 비교

1) 5'UTR과 시그날 시퀀스가 HSA 발현에 미치는 영향

mRNA의 5'UTR(비해독 영역)를 구성하는 뉴크레오타이드 조성과 길이는 mRNA의 안정성이나 단백질 번역 (translation) 효율에 영향을 줌으로서 최종 단백질 발현양에 영향을 미치게 된다고 알려져 있다 (Donahue와 Cigan, Meth. Enzymol, 185, 366 (1990)). HSA cDNA의 5'UTR 존재 여부가 효모에서 HSA 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 5'UTR를 포함한 HSA 발현벡터에서 150-200% 정도 더 높은 발현율을 나타냈다.

효모에서 외래 단백질의 분비가 효모 단백질의 분비 시그날을 사용하는 것이 더 효율적인 경우가 많이 보고되었기에, 효모 클루이베로마이세스 마시아너스(Kluyveromyces marxianus)의 이누리나제 유래 분비 시그날 (Laloux et al., FEBS Lett. 289, 64 (1991))을 HSA 자체 시그날 대신에 사용하여 배양액으로 분비된 HSA 양을 비교해 본 결과 HSA 자체 시그날을 사용한 경우가 약 1.5 배 높은 발현양을 보였다 (표 1).

^a분비 신호 시그날: 인간 혈장 알부민 시그날 (H) 또는 효모 클루이베로마이세스 마시아너스 시그날 시퀀스 (INU)

^b효모 형질 전환체를 YPD 배지에서 1일 배양한 후 웨스턴 블럿에서 감지된 66 kDa 크기의 HSA 밴드를 덴시토미터로 읽어 정량하였다.

2) 프로모터와 선별표지에 따른 발현 효율

HSA 발현을 위한 최적 프로모터를 선택하기 위해 구성적 발현 (constitutive expression)을 일으키는 GAPD와 PGK 프로모터, 유도적 발현 (inducible expression)이 가능한 GAL10과 CUP1 프로모터를 각각 사용하여 본 결과 갈락토즈에서만 발현 가능한 GAL10 프로모터를 이용한 경우에 HSA 발현율이 가장 높았다 (표 2). 발현 벡터에 사용된 선별표지의 종류에 따라 발현 벡터의 카피 수 (copy number)와 안정도가 영향을 받는 예가 보고되어 (Futcher and Cox, J. Bacteriol. 157, 283 (1984)) URA3와 leu2-d를 각각 선별표지로 지닌 발현벡터를 비교한 결과 HSA의 경우에는 그 발현양에 별다른 차이를 보이지 않았다.

^a5'UTR 과 분비 시그날은 HSA1 cDNA에서 유래됨

^b효모 형질 전환체를 YPD 또는 YPDG 배지에서 1일 배양한 후 웨스턴 블럿에서 감지된 66 kDa 크기의 HSA 밴드를 덴시토미터로 읽어 정량하였다.

상기의 방법으로 제조된 재조합 발현 벡터 중 가장 우수한 발현 벡터 pYHSA5를 1998년 7월 14일 한국과학기술연구원 내 생명공학 센터에 기탁번호 KCTC-8897P호로 기탁하였다.

[실시예 2]

여러 다른 효모균주에서의 HSA 발현 및 분비

실시예 1에서 제작한 여러 제조된 벡터를 종합적으로 평가한 결과 5'UTR과 HSA 자체 시그날 시퀀스를 지닌 HSA cDNA1이 GAL10 프로모터로부터 발현되는 벡터 pYHSA5가 가장 효율적인 벡터로 판정되었다. 여러 다른 유전학적 배경을 지닌 효모 사카로마이세스 세레비시에 균주를 숙주로 하여 벡터 pYHSA5로부터 HSA 발현 효율을 상호 비교 분석하였다. 균주 2805는 액포(vacuole)의 주된 단백질 분해효소 PEP4가 결핍된 변이균주인데 야생형 균주 L3262에 비해 25 내지 50% 정도 높은 HAS 발현 수준을 보였다. 균주 334는 갈락토즈 대사 경로의 첫 단계에 관여하는 효소와 글루코즈에 의한 억제 (glucose repression)에 관여하는 단백질이 비활성화된 변이 균주로서 갈락토즈를 탄소원으로 사용하지 않고 GAL 프로모터 발현을 유도하는 유도체로서만 이용하는 특징을 지니고 있다. 균주 334에서 발현되는 HSA 양은 균주 2805보다 다소 낮지만 대량 배양시 비싼 갈락토즈를 소량으로 첨가해도 HSA 발현을 유도할 수 있다는 장점이 있다 (표 3).

^a숙주 균주 : 사카로마이세스 세레비시에 2805 (MATa pep4::HIS3 prb-△1.6R canl his3-20 ura3-52), L3262 (MATa ura3-52 leu2-3, 112 his4-34), 그리고 334 (MATα pep4-3 prb1-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gall)

^b효모 형질 전환체를 YPDG 배지에서 1일 배양한 후 웨스턴 블럿에서 감지된 66 kDa 크기의 HSA 밴드를 덴시토미터로 읽어 정량하였다.

상기 형질전환 균주 중 가장 성능이 우수한 사카로마이세스 세레비시에 2805(pYHSA5) 균주를 1998년 대전광역시 유성구 어은동 52번지 7월 14일 한국과학기술연구원 부설 생명공학 연구소 내 유전자원센터에 기탁번호 KCTC-8896P호로 기탁하였다.

[실시예 3]

효모에서 발현된 재조합 HSA의 특성 분석

1) 웨스턴 블럿을 동한 면역학적 특성 분석

상기 벡터 pYHSA5를 함유한 효모 균주 2805로부터 발현 분비된 재조합 HSA 단백질을 웨스턴 블럿으로 분석하여 보면 대부분의 재조합 HSA는 사람의 혈장에서 분리된 알부민과 동일한 크기인 66 kDa로 감지되었다 (도 3). 완전한 형태의 66 kDa외에도 배양시간이 오래 진행됨에 따라 45 kDa 크기 정도의 HSA 분해산물이 감지되었는데 그 비율은 총 5% 미만으로 나타났다. 효모에서 발현된 알부민은 인간혈청 알부민을 인지하는 폴리크로날 항체뿐만 아니라 모노크로날 항체와도 반응을 나타내어 효모에서 발현된 재조합 알부민이 사람 알부민과 거의 동일한 형태와 면역학적 특성을 지녔음을 확인하였다.

2) 사카로마이세스 세레비시에에서 발현된 HSA의 N-말단 아미노산 확인

효모 사카로마이세스 세레비시에에서 발현된 HSA의 분비시그날이 정확하게 절단되었는지를 확인하기 위해 먼저 재조합 HSA을 발현하는 효모 배양액을 아미콘 YP10을 사용한 초여과 (ultra filtration) 방법에 의해 농축한 후 (도 4), PVDF 멤브린 (membrane)에 옮긴 다음 66 kDa의 HSA을 N-절단 아미노산 분석을 실시하였다. 그 결과 발현된 66 kDa의 HSA는 N-절단이 D-A-H-D-S 순의 아미노산으로 시작되어 정확하게 절단됨을 확인하였다.

3) 재조합 HSA 단백질의 pI 값 측정

재조합 HSA의 전체적인 전하값을 혈장에서 분리된 알부민과 비교하기 위해 상기 농축된 배양액을 미국 NOVEX사에서 구입한 pI 3-7 범위를 갖는 비변성 측정겔(Isoelectric Focusing Gel)에 전기영동 한 후 웨스턴 블럿하였다. 그 결과 시그마에서 구입한 혈장 알부민과 동일하게 약 pI 4.8 정도 값을 나타내어 재조합 단백질의 전반적인 아미노산 구성이 혈장 알부민과 동일함을 확인하였다 (도 5).

[실시예 4]

효모 사카로마이세스 세레비시에에서 발현된 HSA의 분해

효모 사카로마이세스 세레비시에에서 발현된 재조합 HSA은 사람의 혈장에서 분리된 알부민과 동일한 크기의 66 kDa로 발현되지만 배양시간이 오래 진행됨에 따라 이미 생성되었던 HSA 양이 현저하게 감소되는 현상을 보였다. 인간 혈장에서 분리한 알부민을 효모 배양시 함께 놓고 배양하였을 때도 재조합 HSA 단백질 생산시와 마찬가지로 배양액내에 HSA 양이 감소되었다. 이같은 관찰은 시간이 경과됨에 따라 HSA 단백질이 효모의 단백질 분해효소에 의해 분해됨을 의미하며 상기 HSA 발현 시스템의 경우 배지로 분비된 HSA 분해가 HSA 대량생산의 주된 문제점으로 나타났다. 따라서 배양 조건이 HSA 분해에 미치는 영향을 살펴보기 위해 여러 다른 성분으로 조성된 배지에서 HSA 발현 및 분해 양상을 조사하고 최적 조건을 사용함으로써 HSA 분해를 최소화하고자 하였다.

1) 배지 pH가 HSA 분해에 미치는 영향

배양액으로 분비되는 HSA의 축적을 최대화하기 위한 일환으로 플라스크에서 배양과정중의 배지 조성의 변화를 조사하였다. 그 결과 흥미롭게도 HSA 분해양상이 배양액의 pH 변화와 밀접한 관계가 있음을 알 수 있었다. 완층 용액을 전혀 넣지 않고 배양한 경우는 36시간 이후 배양액의 pH가 5 이하가 되면서 HSA의 분해가 점차 증가한 반면, 0.1 M 포타슘 프탈레이트 (potassium phthalate, pH 5.5) 또는 0.1 M 포타슘 포스페이트 (potassium phosphate, pH 6.7) 완충용액을 넣고 배양한 경우는 pH 5 또는 pH 6 정도로 유지되면서 HSA의 분해가 현저히 감소되었다. 이 경우 완충용액을 넣지 않고 배양한 경우보다 3-4 배정도 증가된 양의 완전한 크기의 HSA 단백질이 배양액에 축적되어 배양 3 일 후에는 약 200mg/l 수준의 HSA이 배지에 축적되었다. 이같은 결과는 배지 pH가 최종적인 HSA 생성량을 결정하는 데에 매우 중요한 요인이 됨을 보여준다 (도 6).

2) 탄소원이 HSA 분해에 미치는 영향

2% 갈락토즈만을 탄소원으로 포함한 YPG (1% yeast extract, 2% peptone, 2% galactose) 배지를 사용한 경우와 비교해 보면 1% 덱스트로즈가 부가적으로 첨가된 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 1% dextrose, 2% galactose)의 경우 HSA분해가 감소되었다. 그러나 GAL10 프로모터로부터 HSA 발현을 계속적으로 유도하기 위해 YPDG 배지로 배양하면서 2% 갈락토오즈를 12 시간 간격으로 피딩(feeding)하면 HSA 분해가 더욱 급격하게 진행됨이 관찰되었다. 이는 배지에 탄소원(2% galactose feeding)만을 계속적으로 공급함으로써 그에 따라 상대적인 질소원(N-source)의 결핍과 더불어 배양액 pH의 급격한 저하가 HSA 분해를 유도하는 주된 원인으로 사료된다. 완충 용액을 첨가하여 배양하면 갈락토즈를 계속적으로 공급하지 않은 경우나 공급한 경우 배지내에 축적된 최종 HSA 양이 거의 동일하였다 (표 4).

^a배양 배지의 최종 pH

^b3일 배양 후 배지에 축적된 완전한 크기의 HSA 농도

^c효모 추출물(1% w/v), 펩톤(2% w/v), 갈락토오즈 (2% w/v)

^d효모 추출물(1% w/v), 펩톤(2% w/v), 덱스트로즈(1% w/v), 갈락토오즈(2% w/v)

^e24시간 배양 후 12 시간마다 갈락토오즈 (2% w/v) 공급

* 완층 용액 0.1M 인산칼륨 (pH 6.5) 첨가

3) 질소원이 HSA 분해에 미치는 영향

일반적으로 질소원의 결핍은 프로테아제들의 발현을 유발시킨다고 알려져 있으므로 질소원의 첨가여부가 HSA 분해를 감소시킬 수 있는지를 조사하였다. 0.3M 아르기닌이 포함된 YPDG 배지의 경우 HSA 분해가 상당히 감소되었으나 0.3M 라이신의 경우 별 다른 영향을 미치지 않았다. 갈락토오즈 공급과 함께 YP (1% yeast extract & 2% peptone)가 동시에 공급하였더니 균체량의 증가와 함께 분해 산물도 감소할 뿐 아니라 66 kDa HSA의 축척도 증가하여 최종 300 mg/l정도의 HSA이 배양액에 축적되었다. HSA 분해가 감소된 경우들은 배지내의 pH 저하폭이 비교적 적은 경우이어서 산성 pH가 프로테아제의 유도 및 그 활성에 영향을 주는 것으로 판단된다 (표 5).

^a배양 배지의 최종 pH

^b3일 배양 후 배지에 축적된 완전한 크기의 HSA 농도

^c효모 추출물(1% w/v), 펩톤(2% w/v), 갈락토오즈 (2% w/v)

^d24시간 배양 후 12 시간마다 갈락토오즈 (2% w/v) 공급

^d24시간 배양 후 12 시간마다 갈락토오즈 (2% w/v)와 YP (Yeast extract 1%, peptone 2%) 공급

^f효모 추출물 (1% w/v), 펩톤 (2% w/v), 덱스트로즈 (1% w/v), 갈락토오즈 (2% w/v), 0.3 M 아르기닌

^g효모 추출물 (1% w/v), 펩톤 (2% w/v), 덱스트로즈 (1% w/v), 갈락토오즈 (2% w/v), 0.3 M 라이신

^hYPDG+G buffered with 0.1M 인산칼륨 (pH 6.5) 첨가

상기 배양 배지 조성의 영향을 종합해보면 완충용액을 첨가하거나 질소원의 공급으로 배양 배지의 pH가 5 이상으로 유지해주는 것이 HSA 분해를 억제하는데 매우 효과적임을 알 수 있다.

본 발명의 효과는 조립된 HSA 발현벡터로 형질전환된 효모 균주를 완충용액이 첨가된 배지에서 배양하면 고효율로 발현 분비된 재조합 HSA 단백질을 분해되지 않은 완전한 형태로 배지에 축적된 상태로 얻을 수 있어, 알부민의 수요가 급증하고 있는 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

1. 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 GAL10 프로모터에 5'UTR 이 포함된 인간 혈장 알부민 cDNA가 연결된 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 사카로마이세스 세레비시에 2805에 도입한 형질전환 효모 균주를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈장 알부민을 고효율로 발현시킴을 특징으로 하는 인간 혈장 알부민의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 형질전환 효모 균주를 완충액 또는 질소원의 첨가로 인해 배지의 pH를 5~6으로 유지하여 발효 배양시켜 발현 분비된 알부민의 분해를 최소화시킴을 특징으로 하는 인간 혈장 알부민의 제조 방법.
3. GAL10 프로모터에 하기 5' UTR (5' 비해독영역)이 포함된 인간 혈장 알부민 cDNA가 연결된 효모용 알부민 발현벡터.

   5'-GAATTCGGCACGAGGTCAACCCCACGCCTTTGGCACAATG-3'

   (밑줄친 ATG는 알부민의 개시코돈)
4. 제3항에 있어서, 효모용 알부민 발현벡터 pYHSA5 (KCTC-8897P호).
5. 알부민 발현 벡터 pYHSA5을 함유한 형질전환 효모 사카로마이세스 세레비시에 2805(pYHSA5) (KCTC-8896P호).