KR20040004089A

KR20040004089A - 당외쇄 합성 결손 한세눌라 폴리모르파 변이주 및 그를이용한 재조합 당단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20040004089A
Application number: KR1020030043544A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 이상기; 김무웅
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-06-29
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2004-01-13
Also published as: AU2003246286A1; WO2004003205A1

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자를 포함한 핵산 분자, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자의 돌연변이로 인해 당단백질의 과당화가 방지되는 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주, 이 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주, 이 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여, 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

당외쇄 합성 결손 한세눌라 폴리모르파 변이주 및 그를 이용한 재조합 당단백질의 제조 방법{Hansenula polymorpha mutant strains with defect in outer chain biosynthesis and the production of recombinant glycoproteins using the same strains}

본 발명은 당외쇄 합성 결손 한세눌라 폴리모르파 변이주 및 그를 이용한 재조합 당단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자를 포함한 핵산 분자, 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자의 돌연변이로 인해 당단백질의 과당화가 방지되는 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주, 이 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주, 및 이 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여, 외래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

외래 단백질을 대량 발현하는 경우 숙주세포나 목적 단백질의 특징에 따라서 단백질의 발현량, 수용성 여부, 발현 장소, 수식(modification) 등이 각기 다르므로 목적 단백질에 가장 적합한 발현 시스템을 선택해야만 효율적인 생산 시스템을 구축할 수 있다. 대량 발현을 위한 숙주 시스템으로는 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물 및 동물을 포함한 여러 다양한 시스템이 개발되고 있는데, 적은 비용으로 고농도 균체 배양이 용이한 미생물 숙주 시스템이 일차적인 발현 시스템으로 활용되고 있다. 특히 미생물이면서도 진핵생물의 단백질 발현 및 분비 특징을 갖는 효모는 고등 진핵생물 유래의 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 미생물 숙주로 유용하게 사용되고 있다. 효모 발현 시스템이 박테리아 발현 시스템에 비해 갖는 주된 장점은 진핵 미생물로서 진핵 고등 생물과 매우 유사한 단백질 분비기관을 갖추고 있어 분비서열의 절단, 다이설파이드 결합(disulfide bond) 형성, 당화 과정(glycosylation) 등의 단백질 합성 후 수식(post-translational modification)을 통해 활성화된 단백질을 발현 분비시킬 수 있다는 것이다. 더구나 대부분의 효모는 평상시 세포 밖으로 분비하는 단백질 수가 아주 적기 때문에 효모로부터 분비되는 재조합 단백질은 쉽게 회수되고 정제될 수 있는 장점도 있다. 최근에는 산업적 생산 숙주로서 전통 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 갖는 단점들, 예로써 장기간 발효시 발현 벡터의 불안정성, 당단백질의 과당화(hyperglycosylation), 또한 박테리아 발현 시스템에 비해 낮은 생산성 등의 문제점들을 보완하기 위하여 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 비롯한 여러 다른 비전통 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되고 있다(Gellissen, Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 741 (2000)).

의학적으로 중요한 인체 단백질의 상당수는 분비 과정 중에 당쇄(oligosaccharide)가 공유결합을 통해 부착되는 당단백질(glycoprotein)이다. 당단백질에 부착된 탄수화물의 구조와 종류가 단백질의 폴딩, 분비, 안정성, 혈장내 반감기 및 항체 유발성 등에 크게 영향을 미치므로 적합한 당화 과정을 거친 재조합 단백질의 생산은 외래 숙주로부터 대량생산을 도모하는 생물공학 분야에서 하나의 관건으로 대두되었다. 사카로마이세스 세레비지에에서 발현되는 재조합 당단백질들의 경우 종종 핵심당쇄(core oligosaccharide)에 40 개 이상의 만노즈(mannose)가 부가적으로 첨가되는 과당화(hypermannosylation)와 인체에 항원으로 작용하는 알파 1,3 결합형 말단 만노즈(α1,3-linked terminal mannose) 존재가 당단백질 생산을 위한 숙주로서의 큰 제한점으로 제기되었다(Romanos et al.,Yeast8,423-488 (1992)). 이에 반해 대체로 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파와 피키아 파스토리스에서 발현 분비된 재조합 단백질들은 비록 본래의 단백질에 비해서는 과당화된 상태로 발현되지만 사카로마이세스 세레비지에에서 발현된 재조합 단백질보다는 전체적인 만노즈 당외쇄(mannose outer chain)의 길이가 상당히 짧다고 보고되었다(Bretthauer and Castellino,Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 193-200 (1999); Kang et al.,Yeast14, 371-381 (1998)). 특히 이들 메탄올자화 효모에는 인체에서 면역원성을 유발하는 알파 1,3 결합형 말단 만노즈가 존재하지 않는다는 점(Montesino et al.Protein Expr. Purif. 14, 197-207 (1998))에서 인체 의료용 단백질 생산 균주로서 전통 효모 사카로마이세스 세레비지에보다 월등한 숙주 시스템으로 여겨지고 있다.

그러나 당단백질의 핵심당쇄(core oligosaccharide) 부분은 효모에서부터 동물세포에 이르기까지 모든 진핵생물에서 공통적으로 형성되는 생합성 중간체이지만, 이 중간체에 첨가되는 당외쇄(outer chain)는 생물의 종류, 세포의 종류 또는 단백질의 종류 등에 따라 각기 다른 형태로 생합성된다. 따라서 효모에서 생산되는 재조합 단백질의 질(quality) 개선을 위한 노력의 일환으로, 원형에 가까운 당쇄가 부착된 당단백질 생산을 위한 숙주를 개발하기 위해서 돌연변이에 의한 당쇄 생합성 결손 변이주를 선별하거나, 분자 유전학적 기술을 통해 당쇄 생합성 관련 유전자를 조작함으로써 재조합 당단백질 생산 균주로 유용한 숙주를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 전통 효모 사카로마이세스 세레비지에의 경우, [³H]만노즈 자살 선별([³H]mannose suicide selection), 소듐 오소바나데이트(sodiumorthovanadate) 내성, 하이그로마이신 B(hygromycin B) 민감성 이용 기술 등 여러 다양한 전략들이 N-결합형 당쇄 생합성 결손 변이주들을 선별하는 데에 유용하게 사용되어 왔다(Herscovics and Orlean, FASEB 7, 540-550 (1999)). 이들 당쇄 생합성 결손 변이주의 기능보완(functional complementation) 실험을 통해 당외쇄 개시(outer chain initiation)에 중요한 역할을 하는OCH1유전자(Ngd29)(Nakanishi-Shindo et al.,J. Biol. Chem. 268, 26338-26345, (1993)), 당외쇄 확장(outer chain elongation)에 핵심역할을 하는MNN9유전자와 면역원성을 유발하는 α1,3-결합형 말단 만노즈 첨가에 관여하는MNN1유전자(Gopal and Ballou, Proc.Natl. Acad. Sci. USA84, 8824, (1987))들이 클로닝되었고 선별된 돌연변이주 자체 또는 유전자 조작을 통해 해당 유전자가 파쇄된 변이주들이 재조합 당단백질 생산을 위한 숙주 균주로 개발되었다(Kniskern et al.,Vaccine12, 1021-1025 (1994); US Patent 5,798,226; US Patent 5,135,854). 그러나 사카로마이세스 세레비지에를 능가하는 재조합 발현 숙주로 각광을 받고 있는 메탄올자화 효모들에 대한 N-결합형 당쇄 생합성 결손 변이주 선별 및 이에 관한 특성 분석연구는 현재까지 거의 보고된 바가 없다.

이에 본 발명의 목적은 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파에서 보다 인체에 적합한 재조합 당단백질을 생산하기 위한 시스템을 개발하기 위한 것으로, 한세눌라 폴리모르파에서 당화 과정 돌연변이주를 선별하거나 한세눌라 폴리모르파 당화 과정에 연관된OCH1유전자 결손 변이주를 제작하여 당외쇄 합성에 의한 과당화가 방지된 균주를 개발하고 이를 재조합 단백질 발현 숙주로 이용하여 원형에 가까운 당쇄가 부착된 재조합 당단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기에서 기술한 목적인 인체 핵심형 당쇄구조와 유사한 N-결합형 당쇄가 부착된 당단백질 생산을 위한 한세눌라 폴리모르파 균주를 개발하기 위해 한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주의 소듐 오소바나데이트에 대한 민감성을 이용하여 이에 대한 내성이 증가된 한세눌라 폴리모르파 돌연변이주들을 1차적으로 선별하고 이로부터 당쇄 생합성 결손 변이주를 선별하는 방법과 당외쇄 생합성 신장개시에 관여하는OCH1유전자를 한세눌라 폴리모르파로부터 클로닝하고 이로부터 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자가 파쇄된 Δoch1돌연변이주를 제작하여, 이들 변이주들을 숙주로 사용하여 외래 당단백질을 발현할 때 부착된 당쇄 구조가 보다 원형 단백질의 당쇄와 비슷한 형태를 지닌 재조합 당단백질을 생산하는 기술을 제공한다.

도 1은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주들간의 소듐 오소바나데이트(sodium orthovanadate)에 대한 내성 차이를 보여준다.

도 2는 한세눌라 폴리모르파 DL42-15 돌연변이주의 표현형을 보여준다. 지수기에 있는 효모를 10배씩 연속적으로 희석하여 5 ㎕씩 스포팅(spotting)한 후 2 일간 배양하였다. A; 4 mM의 소듐 오소바나데이트가 첨가된 YPD 배지, B; 45℃에서의 YPD 배지, C; 0.3% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)가 첨가된 YPD 배지, D; 37℃의 YPD 배지.

도 3은 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자의 염기 서열과 예상하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 4는 한세눌라 폴리모르파와 다른 효모 균주들 간의 Och1p과 Hoc1p의 아미노산 서열을 비교한 것이다. HpOch1p;H. polymorphaOch1 단백질,ScOch1p;Saccharomyces cerevisiaeOch1 단백질, ScHoc1p;Saccharomyces cerevisiaeHoc1단백질, CaOch1p;Candida albicansOch1 단백질. 괄호 안의 숫자는 한세눌라 폴리모르파의 Och1p에 대한 다른 효모 균주의 Hoc1p과 Och1p간의 동일성을 표시한 것이다.

도 5는 한세눌라 폴리모르파의OCH1유전자 파쇄를 유도하기 위한 세포내 유전자 재조합과 팝-아웃 유도에 관한 모식도를 그린 것이다.

도 6은 한세눌라 폴리모르파och1결손 균주의 표현형을 나타낸 것이다. 지수기에 있는 효모를 10 배씩 연속적으로 희석하여 5 ㎕씩 스포팅한 후 2 일간 배양하였다. A; 37℃에서의 YPD 배지, B; 45℃에서의 YPD 배지, C; 40 ㎍/ml의 하이그로마이신 B(hygromycin B)가 첨가된 YPD 배지, D; 0.4% 소듐 데옥시콜레이트가 첨가된 YPD 배지, E; 7 mg/ml의 칼코플로우 화이트(Calcofluor white)가 첨가된 YPD 배지.

도 7은 한세눌라 폴리모르파 DL42-15 돌연변이주와och1결손 균주로부터 발현된 글루코우즈 옥시다제의 당쇄 형성 변화를 웨스턴 블로팅을 통해서 알아본 것이다.

본 발명은 한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주로부터 소듐 오소바나데이트에 대한 내성이 증가된 자연 발생적인 돌연변이주 DL42-15를 선별하는 과정; 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자를 클로닝하여 염기 서열을 분석하는 과정; 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자 파쇄(gene disruption) 과정; 상기 개발된 오소바나데이트 내성 돌연변이주 DL42-15와OCH1유전자 결손 변이주 Δoch1로부터 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 당단백질인 글루코우즈 옥시다제(glucose oxidase)를 발현 분비하여 각각의 균주에서 생산된 글루코우즈 옥시다제의 당화 정도를 관찰하는 과정으로 구성되어 있다. 따라서, 본 발명은 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파로부터 당외쇄 합성 과정이 변형되어 연속적인 만노즈 부착으로 인한 과당화가 방지된 변이주를 개발하고 이를 숙주로 사용하여 인체 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 효모 특유의 당쇄가 결여되고 보다 원형 형태와 가까운 당쇄 구조를 가진 재조합 당단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 과당화가 방지된 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 변이주는 소듐 오소바나데이트(sodium orthovanadate)에 대한 내성이 증가된 자연 돌연변이 균주로 획득되었거나 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자에 돌연변이가 도입된 균주들이다.

본 발명에서 클로닝한 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자의 염기서열(서열번호 1)을 AF490971로 GenBank에 기탁하였다. 또한, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자는 국제기탁기관 Korean Collection for Type Cultures에 2002년 5월 29일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10265BP를 부여받았다. 오소바나데이트 내성 한세눌라 폴리모르파 돌연변이주 DL42-15 또한 국제기탁기관 Korean Collection for Type Cultures에 2002년 5월 29일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10263BP를 부여받았다. 또한, 본 발명의OCH1유전자 결손 변이주 Δoch1도 국제기탁기관 Korean Collection for Type Cultures에 2002년 5월 29일에 기탁하고 수탁번호 KCTC 10264BP를 부여받았다.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 도 3에 도시된 염기 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 도 3에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자의 돌연변이로 인해 당단백질의 과당화가 방지되는 한세눌라 폴리모르파 변이주를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 제공한다.

추가의 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주 유래의 당단백질의 과당화가 방지된 자연 돌연변이주 DL42-15 (기탁번호 KCTC 10263BP)를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 한세눌라 폴리모르파 DL42-15 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 재조합 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여, 외래 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

메탄올을 탄소원으로 하는 피키아 파스토리스 및 한세눌라 폴리모르파를 포함한 메탄올자화 효모는 상업적 또는 의학적으로 중요한 재조합 단백질의 생산에 널리 사용되고 있다.

본원에서 "과당화가 방지된"이란 본 발명에 따른 메탄올자화 효모에서 당단백질이 발현될 때, 메탄올자화 효모의 비-변형 균주인 야생형과 비교하여, 당단백질 상 탄수화물 잔기의 크기가 감소됨을 의미한다.

본원에서 사용되는 "당단백질"이란 용어는 메탄올자화 효모에서, 하나 이상의 아스파라긴 잔기에서 또는 하나 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기에서, 또는 아스파라긴과 세린 또는 쓰레오닌 잔기 상에서 당화가 일어나는 단백질을 의미한다.

본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 당단백질은 예를 들면, 아스퍼질러스 나이거 유래의 글루코우즈 옥시다제, 사카로마이세스 세레비지에 인버타제, HIV 엔벨로프 단백질, 인플루엔자 바이러스 A 헤마글루티닌, 인플루엔자 뉴라미니다제, 보바인 헤르페스 바이러스 타입-1 당단백질 D, 인간 안지오스타틴, 에리스로포이에틴, 사이토킨, 인간 B7-1, B7-2 및 B-7 수용체 CTLA-4, 인간 조직 인자, 성장 인자(예를 들면, 혈소판-유래 성장인자), 조직 플라스미노겐 활성자, 플라스미노겐 활성자 억제제-1, 유로키나제, 인간 라이소솜 단백질, 예를 들면 알파-갈락토시다제, 플라스미노겐, 트롬빈, 인자 XIII 및 면역글로불린 등이 포함되며, 이로써 제한되지 않는다. 이들 당단백질은 치료용 약학 조성물로 사용될 경우 전형적으로 주사, 경구, 비경구 경로 등 당해분야에 공지된 통상의 다양한 방식으로 투여될 수 있다.

생성된 당단백질은 통상의 방법으로 정제될 수 있다. 정제 프로토콜은 정제하고자 하는 특정 단백질의 성질에 의해 결정될 수 있다. 이러한 측정방법은 당업자의 통상의 수준 내에 있다. 예를 들면, 세포 배양 배지를 세포로부터 분리하고 세포로부터 분비된 단백질을 침전, 면역흡착, 분획화 또는 각종 크로마토그래피법과 같은 일상적인 분리기술에 의해 배지로부터 정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

오소바나데이트 내성 돌연변이주 한세눌라 폴리모르파 DL42-15의 선별

일반적으로 5 mM 정도의 낮은 농도로도 효모 성장을 억제하는 소듐 오소바나데이트에 대해 내성이 증가된 사카로마이세스 세레비지에 변이주들의 많은 경우가 골지체에서 일어나는 당화 과정에 관련된 유전자가 변형된 변이주들로 판명되면서 소듐 오소바나데이트 내성이 증가된 변이주를 획득하는 방법은 당쇄 생합성 결손 변이주들을 선별하는 가장 효율적인 방법의 하나로 사카로마이세스 세레비지에와 클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 활용되고 있다(Kanik-Ennulat et al.,Genetics140; 933-943, (1995); Uccelletti et al.Res Microbiol150:5-12, (1999)). 그러나 메탄올자화 효모인 피키아 파스토리스의 경우는 바나데이트에 대한 균주 자체의 내성이 커서 당쇄 생합성 변이주 선별을 위해 바나데이트 내성 이용기술을 적용할 수 없었다(Martinet et al.,Biotechnology Lett. 20, 1171-1177 (1999)). 또 다른 메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파의 경우 CBS 4732와 NCYC 495 균주들도 바나데이트에 대한 균주 자체의 내성이 매우 커서 96 mM 정도의 높은 농도의 바나데이트 존재하에서 성장이 가능한 것으로 보고되었다(Mannazzu et al.,FEMS Microbiol Lett.147: 23-28 (1997): Mannazzu et al.Microbiology144: 2589-2597 (1998)). 그러나 본 발명자들이 재조합 단백질 생산 범용 숙주로 개발한 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주의 경우, 한세눌라 폴리모르파 CBS 4732 및 NCYC 495 균주와는 달리 사카로마이세스 세레비지에와 매우 비슷한 수준의 바나데이트 민감성을 보임이 발견되었다(도 1, 표 1). 또한 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주의 경우 전통 효모 사카로마이세스 세레비지에와 마찬가지로 4 mM 바나데이트가 포함된 YPD 플레이트에서 1/10⁶정도의 빈도로 자연적 돌연변이에 의해 바나데이트 내성 변이주들이 발생됨이 관찰되었다.

오소바나데이트가 포함된 YPD 플레이트에서 효모 균주들의 성장 비교*

균주	소듐 오소바나데이트 (mM)
균주	4	6	8	10	12
S. cerevisiaeL3262 (WT)	± -	-	-	-	-
S. cerevisiaeL3262 (mnn9)	++++	+++	+	-	-
H. polymorphaDL1 (WT)	± -	-	-	-	-
H. polymorphaCBS4732 (WT)	+++++	+++++	+++++	++++	+++

* S. cerevisiae의 경우 30℃에서 H. polymorpha의 경우 37℃에서 4일 배양후 분석

전통 효모 사카로마이세스 세레비지에의 바나데이트 내성 변이주들 중 당쇄 생합성 과정에 결손을 보이는 변이주들은 공통적으로 야생형 균주에 비해 아미노글라이코사이드(aminoglycoside) 계통의 분자량이 큰 항생제에 대해 민감성의 증가와 더불어 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)와 같은 합성세제에 대한 민감성이 증가되며, 간혹 고온에 대한 민감성도 증가된다고 보고되었다(Dean N.Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 1287-1291 (1995)). 이에 본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 DL-1 균주에서 자발적으로 발생한 250 여개의 소듐 오소바나데이트 내성 돌연변이주들의 하이그로마이신 B를 분석한 결과 대부분의 변이주들(90% 이상)이 하이그로마이신 B에 대한 내성을 보였다. 따라서 이들 변이주들의 소듐 데옥시콜레이트 민감성과 고온에 대한 민감성을 분석하여 정상적인 배양 상태에서는 야생형과 비교할 만한 성장을 보이면서도 바나데이트에 대한 내성 이외에도 45℃에 대한 온도 민감성과 소듐 데옥시콜레이트에 대한 민감성을 보이는 돌연변이주를 최종적으로 선별하고 이를 한세눌라 폴리모르파 DL42-15라 명명하였다(도 2 및 도 3).

<실시예 2>

한세눌라 폴리모르파 OCH1 유전자 확보 및 염기서열 분석

최근에 발표된 한세눌라 폴리모르파의 부분적 게놈 분석 (partial genome sequencing)에 의한 무작위 염기 서열 (Random Sequenced Tag, RST) 정보 (Blandinet al.,FEBS Lett., 487, 76, (2000))로부터 사카로마이세스 세레비지에의 당쇄 생합성 관련 유전자들과 높은 유사성을 보이는 유전자들의 부분적인 염기 서열을 얻을 수 있었다. 본 발명에서는 당외쇄 생합성 초기 단계의 α1, 6-만노즈 부착 과정에 중요한 역할을 하는 사카로마이세스 세레비지에OCH1유전자(ScOCH1)(Jungman and Munro,Embo J., 17, 423, (1998))와 또한ScOCH1과 높은 아미노산 염기서열 동일성을 보이는 사카로마이세스 세레비지에HOC1유전자(ScHOC1)(Neiman et al.,Genetics145, 637-645 (1997))의 C-말단 부분과 상당한 유사성을 보이는 한세눌라 폴리모르파 RST 정보에 근거하여 한 쌍의 합성 올리고뉴클레오타이드,

5'-CAATCAGACCCGGTCTGTCGAGGAGT-3'(서열번호 3),

5'-ACATCAACGTGGAGAACTGGGAGCAC-3'(서열번호 4)를 제조하였다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용한 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 통해 한세눌라 폴리모르파 염색체 DNA로부터 약 0.9 kb 크기의 DNA 절편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편을 프로브(probe)로 사용하여 여러 제한 효소로 절단한 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 염색체 DNA에 대한 서던 블로팅(southern blotting)을 실시하였다. 한세눌라 폴리모르파OCH1유전자(HpOCH1) 전체와 프로모터까지 포함된 DNA 절편을 확보하기 위해, 서던 블로팅에서 프로브와 결합하는 시그널을 보인 여러 염색체 DNA 절편 중에서 5 kb 크기의BglII 절편과 2.3 kb 크기의BamHI 절편을 분리하였다. 이 DNA 절편들을 각각BglII와BamHI으로 절단한 박테리아 플라스미드 피블루스크립트 (pBluescript) KS+ (Stratagen Co.)에 삽입하여 게놈 라이브러리를만든 후 다시 콜로니 PCR 반응으로 검색하여 435개의 아미노산으로 구성된 단백질이 담겨있는 1.3 kb 크기의 코딩 지역(coding region)과 1 kb 크기의 프로모터 지역을 포함하고 있는HpOCH1유전자를 확보하였다(도 3, 서열번호 1). 한세눌라 폴리모르파 Och1 단백질(서열번호 2)은ScOCH1(YGL038C)및ScHOC1(YJR075W) 유전자 산물과 칸디다 알비칸스의 Och1p (AY064420)과 비교하면 약 21-23% 정도의 비교적 낮은 동일성을 보이지만, type II에 해당하는 막단백질(membrane protein)인 만노실트랜스퍼라제(mannosyltransferase)들에서 보고되었듯이 N-말단에는 하나의 막 통과 부위(transmembrane spanning region)로 예측되는 부위가 있으며 활성부위로 예측되는 DXD 모티브(motif)를 지니고 있다(도 4).

<실시예 3>

한세눌라 폴리모르파 OCH1 유전자 결손 균주의 제작 및 분석

한세눌라 폴리모르파OCH1유전자가 파쇄된 변이주를 제작하기 위해 표 2에 기술된 프라이머들을 사용하여 결합 중합효소 연쇄반응(fusion PCR)과 세포내 유전자 재조합(in vivoDNA recombination)이라는 두 가지의 기술을 도입하여 유전자 파쇄를 시도하였다(Oldenburg et al.,Nucleic Acid Res., 25, 451, (1997)). 일차적인 PCR에 의해서 각각의URA3유전자와OCH1유전자의 N-말단과 C-말단을 확보할 수 있었다. 그리고 2차적인 결합 중합효소 연쇄반응에 의해서HpOCH1유전자의 N-말단과URA3유전자의 N-말단을 결합하였고URA3유전자의 C-말단과HpOCH1유전자의 C-말단을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하여 연결할 수 있었다. 이와 같이 확보한 각각의 DNA 조각 두 개를 효모 세포내로 도입한 후 세포내 유전자 재조합에 의해서HpOCH1유전자가 파쇄된 형질전환체를 선별하였다(도 5). 일차적으로URA3선별 표지로 유라실(uracil)이 결핍된 최소배지에서 자라는 형질전환체들을 골라낸 후 중합효소 연쇄반응에 의해서 야생형 균주와 다르게 증폭된 DNA 조각을 확인하여HpOCH1유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 Δoch1 (leu2 och1::URA3) 균주를 제작하였다. 이와 같이 확보한 Δoch1균주는 야생형 균주에 비해서 성장 속도가 조금 느려지는 것을 볼 수 있었고 45℃에 대한 온도 민감성을 나타냈으며 소듐 데옥시콜레이트와 칼코플로우 화이트(Calcofluor white)의 첨가에 의해서 그 성장이 심하게 저해되고 하이그로마이신 B에 대한 민감성을 보이는 특성을 가지고 있었다(도 6). 이러한 특성은 효모에서 당외쇄 합성이 결손된 돌연변이주에서 나타나는 공통적인 특징으로서 한세눌라 폴리모르파 Δoch1균주는 당외쇄 합성과정에 결함이 있음을 시사하고 있다.

HpOCH1유전자 파쇄를 위한 결합 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머

프라이머	서열	서열번호
OCH1N-S	5'-ACATCAACGTGGAGAACTGG-3'	5
OCH1N-A	5'-AGCTCGGTACCCGGGGATCCTGTCTGTCCACACAACAGG-3'	6
OCH1C-S	5'-GCACATCCCCCTTTCGCCAGCCCATACACTCCTTACTAGG-3'	7
OCH1C-A	5'-CAATCAGACCCGGTCTGTCGAGGAGT-3'	8
URA3N-S	5'-GGATCCCCGGGTACCGAGCT-3'	9
URA3N-A	5'-CACCGGTAGCTAATGATCCC-3'	10
URA3C-S	5'-CGAACATCCAAGTGGGCCGA-3'	11
URA3C-A	5'-CTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3'	12

<실시예 4>

한세눌라 폴리모르파 변이주로부터 발현 분비된 재조합 당단백질의 분석

상기 실시예 1 및 실시예 3에서 개발된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 DL42-15 균주와 Δoch1균주에서 발현 분비되는 재조합 당단백질의 당화 상태를 조사하기 위해서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 당단백질인 글루코우즈 옥시다제(Glucose oxidase, GOD)를 한세눌라 폴리모르파 변이주들에서 발현 분비하였다. 당단백질인 GOD는 8개의N-결합형 당화가 일어날 수 있는 8개의 아미노산 서열이 존재한다(Frederick et al.,J. Biol. Chem., 265, 3793 (1990)). 한세눌라 폴리모르파에서 GOD를 발현 분비하기 위해 N-말단 부분에 알파-아밀레이즈(α-amylase) 유래의 분비신호 서열이 융합되어 있는 GOD 유전자를 pDLMOX-Hir (Kang et al.,Yeast14, 371 (1998)) 벡터에 삽입되어 있는 Hir 유전자와 교체함으로써 pDLMOX-GOD를 제작하였다(Kim S. Y. Ph. D. Decertation, Yonsei University, Korea, 2001). GOD 발현 벡터 pDLMOX-GOD로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주와 DL42-15, Δoch1변이주들을 메탄올이 2% 첨가된 YPM (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 메탄올) 배지에서 배양하여 GOD를 발현 분비하였다. 배양액으로 분비된 GOD를 폴리아크릴아미드 젤에 걸어 나이트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)에 이동시킨 뒤, GOD 항체에 의한 웨스턴 블로팅을 통하여 당단백질인 GOD의 당화 상태를 관찰하였다. 도 7A에서 볼 수 있듯이 DL42-15와 Δoch1균주에서 분비된 GOD는 야생형 균주에서 발현 분비된 GOD보다 균일하게 작은 크기로 발현되었다. 이는 한세눌라 폴리모르파 DL42-15와 Δoch1균주들의 경우 당단백질의 과당화가 방지됨을 시사하고 있다. 당단백질에 부착된 당쇄를 효소적으로 제거할 수 있는 엔도글라이코시데이즈 에이치(endoglycosidase H)를 처리하여 당쇄가 제거된 GOD를 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과, DL42-15와 Δoch1균주에서 발현된 GOD 단백질만의 크기는 야생형 균주에서 발현된 GOD 단백질의 크기와 같았다(도 7B). 이와 같은 결과는 DL42-15 및 Δoch1균주에서 발현되는 재조합 당단백질의 경우 단백질에 부착된 당쇄의 크기가 작아짐에 의해서 전체적인 당단백질의 크기가 야생형에서 발현된 재조합 당단백질에 비해 작아짐을 뒷받침하고 있다. 따라서 본 발명에서 개발된 한세눌라 폴리모르파 변이주인 DL42-15 및 Δoch1균주는 인체 유래의 당단백질 생산을 위한 숙주로 사용될 경우에 야생형 균주와는 달리 과당화가 방지되므로 인체에서 만들어지는 당쇄 구조와 보다 가까운 형태의 당쇄가 부착된 당단백질을 생산할 수 있을 것으로 사료된다.

이상 상기 실시예들을 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 개발된 한세눌라 폴리모르파 DL42-15 돌연변이주와 Δoch1결손 균주는 당쇄가 부착된 당단백질을 생산할 경우에 야생형 균주에 비해서 과당화가 방지되므로 원형 당단백질에 부착된 당쇄 구조와 보다 가까운 형태로 당단백질을 생산하기 위한 숙주로 이용될 수 있다. 특히 한세눌라 폴리모르파는 의료용 재조합 단백질 대량생산을 위한 숙주로 각광을 받고 있음을 고려할 때, 본 발명은 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

도 3에 도시된 염기 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자인 핵산 분자 (기탁번호 KCTC 10265BP).
도 3에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자의 돌연변이로 인해 당단백질의 과당화가 방지되는 한세눌라 폴리모르파 변이주.
제4항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 Δoch1변이주(기탁번호 KCTC 10264BP).
제4항의 한세눌라 폴리모르파 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제6항에 있어서, 한세눌라 폴리모르파HpOCH1유전자가 파쇄된 Δoch1변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
한세눌라 폴리모르파 DL1 균주 유래의 당단백질의 과당화가 방지된 자연 돌연변이주 DL42-15 (기탁번호 KCTC 10263BP).
제8항의 한세눌라 폴리모르파 DL42-15 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주.
제6항, 제7항 또는 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여, 외래 단백질을 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 외래 단백질이 당쇄가 부착된 당단백질의 과당화가 방지된 방법.