SK288130B6 - Xylanase polypeptide, a polynucleotide, a vector, a host cell, method of polypeptide production, method of use of polypeptide - Google Patents

Abstract

Novel polypeptides possessing (endo) xylanase activity are disclosed which can degrade cellulose implant extracts and plant materials. The polypeptides can cleave beta -D-xylan polymers at internal (1-4) bonds between adjacent xylopyranosyl units. The amino acid sequence and encoding DNA sequence is given and the polypeptide was used to treat cellulose in the preparation of edible foodstuffs and animal feed. The polypeptides have both arabinoxylanase and xylosidase activity.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka nových xylanáz, napríklad xylanáz z Talaromyces a ich použitia pri degradácii xylánu v celulóze. Xylanázy sa uplatňujú v pekárstve, pri kŕmení zvierat (na zvýšenie konverzie krmiva) a pri výrobe papiera.

Doterajší stav techniky

Stena rastlinnej bunky má zložitú a variabilnú štruktúru a obsahuje niekoľko sacharidových biopolymérov. Polysacharidy sa vyskytujú najmä vo forme dlhých reťazcov celulózy (hlavnej štruktúrnej zložky steny rastlinnej bunky), hemicelulózy (zahrnujúcej rôzne β-xylánové reťazce, ako napríklad xyloglukány), pektínu a lignínu. Najčastejšie vyskytujúcimi sa hemicelulózami sú xylány a ich deriváty, ako napríklad arabinoxylán a xyloglykán.

Medzi rastlinné hemicelulózy patrí xylán, arabinoxylán, glukuronoarabinoxylán a xyloglukán. Základný reťazec xylánu (Register CAS č. 9014-63-5) sa skladá z β-l,4-viazaných D-xylopyranozylových jednotiek, ktoré sú prípadne substituované bočnými reťazcami, ako napríklad arabinózovými zvyškami a/alebo zvyškami kyseliny glukurónovej. Štruktúra xylánu je:

—4)^-D-Xylp-( 1 ->4)-β-ϋ-Χ_Υ lp(2<-1 A)-( 1 ->4)^-D-Xy lp-( 1 —4)-β-ϋ-Χ_Υ lp(3 <-1 B)-( 1 — (Xylp = jednotka xylopyranozylu; A= jednotka a-(4-0)-metyl-(D-glukuronopyranozylu), niekedy acetyl; a B = jednotka a-(L-arabinofúranozylu), niekedy acetyl).

Sušina suchozemských rastlín obsahuje viac ako 30 % xylánov. Preto je xylán dôležitou zložkou materiálov z prírodných zdrojov, ktoré sa používajú v priemyselných procesoch týkajúcich sa pekárstva, zvýšenia konverzie krmiva pre zvieratá a výroby papiera.

Podstatné rozdiely existujú medzi jednoklíčnolistovými rastlinami (napr. obilniny a trávy) a dvojklíčnolistovými rastlinami (napr. ďatelina, repka a sója) a medzi semenom a vegetatívnymi časťami rastliny. Pre jednoklíčnolistové rastliny je charakteristická prítomnosť arabinoxylánového komplexu ako hlavného hemicelulózového reťazca a základnou štruktúrou hemicelulózy v dvojklíčnolistových rastlinách je xyloglukánový komplex. Dvojklíčnolistové rastliny obsahujú vyššie koncentrácie pektínu ako jednoklíčnolistové rastliny. Semená majú vo všeobecnosti vyšší obsah peptických látok, ale relatívne nižší obsah celulózového materiálu.

Enzýmy, ktoré degradujú celulózu, sa používajú na spracovanie rastlinného materiálu v potravinách, ako aj v krmivárskych aplikáciách alebo ako potravinové alebo krmivové aditívum, a to vďaka ich schopnosti pôsobiť na hlavné substituenty v stene rastlinnej bunky.

Väčšina priemyselne dostupných enzýmov degradujúcich celulózu sú xylanázy s relatívne nízkou molekulovou hmotnosťou a pomerne malou stabilitou pri vysokých teplotách. Ale pre určité aplikácie sa vyžaduje použiť xylanázy s pomerne vysokou termostabilitou. Ak sa xylanáza používa ako aditívum pri kŕmení zvierat, uprednostňuje sa vysoká termostabilita, pretože pri granulovaní krmív pre zvieratá sa používajú vysoké teploty.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu je nová xylanáza, ktorá je schopná štiepiť β-D-xylán, ktorý sa nachádza v rastlinnom materiáli. Xylanáza je tiež schopná hydrolyzovať arabinoxylán (alebo má arabinoxylanázovú aktivitu) a aryl^-D-xylopyranozid (alebo má xylozidázovú aktivitu).

Predložený vynález sa týka (izolovaného) β-xylanázového polypeptidu zahrnujúceho:

(a) aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No: 2; alebo (b) variant aminokyselinovej sekvencie uvedenej v (a), ktorý je schopný štiepiť β-D-xylán; alebo (c) fragment aminokyselinovej sekvencie uvedenej v (a) alebo (b), ktorý je schopný štiepiť β-D-xylán.

Predložený vynález sa ďalej týka polynukleotidu a zahŕňa:

(a) sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID No. 1 alebo sekvenciu kódujúcu polypeptid podľa tohto vynálezu;

(b) sekvenciu, ktorá je komplementárna so sekvenciou, alebo ktorá sa hybridizuje so sekvenciou, ktorá je definovaná v (a);

(c) fragment sekvencie podľa (a) alebo (b);

(d) sekvenciu, ktorá je najmenej na 60 % identická so sekvenciou, ktorá je definovaná v (a), (b) alebo (c); alebo (e) sekvenciu, ktorá je degenerovaná v dôsledku genetického kódu na ktorékoľvek sekvencie definované v (a) až (d).

SK 288130 Β6

Predmetom predloženého vynálezu je tiež:

- vektor (napr. expresný), ktorý obsahuje polynukleotid podľa tohto vynálezu, a ktorý je schopný exprimovať polypeptíd podľa tohto vynálezu;

- bunková línia obsahujúca vektor podľa tohto vynálezu;

- spôsob produkcie polypeptidu podľa tohto vynálezu, ktorý zahŕňa udržiavanie bunkovej línie podľa tohto vynálezu v podmienkach, ktoré sú vhodné na exprimovanie polypeptidu, a v prípade potreby izolovanie polypeptidu;

- spôsob degradácie β-D-xylánu, spôsob zahrnujúci kontaktovanie materiálu obsahujúceho β-D-xylán s polypeptidom podľa tohto vynálezu; a

- spôsob identifikovania zložky so schopnosťou modulovať xylanázovú aktivitu, ktorý zahŕňa kontaktovanie polypeptidu podľa tohto vynálezu s testovanou zložkou v prítomnosti β-D-xylánu a monitorovanie alebo detegovanie akejkoľvek modulácie aktivity.

Podrobný opis vynálezu

A. Polynukleotidy

Predložený vynález sa týka (napr. izolovaného a/alebo purifikovaného) polynukleotidu kódujúceho polypeptid podľa tohto vynálezu. Predložený vynález sa teda týka polynukleotidu kódujúceho xylanázu, ktorej aminokyselinová sekvencia je uvedená v SEQ ID No. 2 (napríklad zrelá sekvencia aminokyselín od 23 po 408). Predložený vynález sa ďalej týka polynukleotidu kódujúceho polypeptíd, ktorého aminokyselinová sekvencia je značne homológna s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID No. 2. Zahrnutý je tiež polynukleotid zvolený z:

(a) polynukleotidu pozostávajúceho z nukleotidovej sekvencie (napríklad polynukleotidov od 69 po 1224) uvedenej v SEQ ID No. 1 alebo jeho komplementu;

(b) polynukleotidu pozostávajúceho z nukleotidovej sekvencie schopnej hybridizácie (napr. selektívnej) s nukleotidovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID No. 1 alebo jeho fragmentu;

(c) polynukleotidu pozostávajúceho z nukleotidovej sekvencie schopnej hybridizácie (napr. selektívnej) s komplementom nukleotidovej sekvencie uvedenej v SEQ ID No. 1 alebo jeho fragmentu; a/alebo (d) polynukleotidu pozostávajúceho z polynukleotidovej sekvencie, ktorá je degenerovaná v dôsledku genetického kódu na polynukleotid definovaný v (a), (b) alebo (c).

Polynukleotid podľa tohto vynálezu môže tiež zahŕňať polynukleotid, ktorý:

(a) kóduje polypeptíd, ktorý má xylanázovú aktivitu, pričom polynukleotidom je:

(1) kódujúca sekvencia SEQ ID No 1 (napríklad polynukleotidy od 69 po 1224);

(2) sekvencia, ktorá sa selektívne hybridizuje s komplementom sekvencie definovanej v (1); alebo (3) sekvencia, ktorá je degenerovaná v dôsledku genetického kódu vzhľadom na sekvenciu definovanú v (1) alebo (2); alebo (b) je sekvenčne komplementárny s polynukleotidom definovanom v (a).

Odkazy na SEQ ID No. 1 môžu byť nahradené zrelou kódujúcou sekvenciou (polynukleotidy 69 až 1224), pokiaľ sa v texte neuvádza inak.

Hybridizovateľné sekvencie

Pojem „schopný hybridizácie“ znamená, že cieľový polynukleotid podľa tohto vynálezu sa môže hybridizovať s nukleovou kyselinou použitou ako sonda (napríklad nukleotidovou sekvenciou uvedenou v SEQ ID No. 1, alebo jej fragmentom alebo jej komplementom) v signifikantne väčšom rozsahu ako s pozadím. Vynález sa tiež týka nukleotidových sekvencií, ktoré kódujú xylanázu, alebo ich variantov, ako aj nukleotidových sekvencií, ktoré sú navyše komplementárne. Nukleotidovou sekvenciou môže byť RNA alebo DNA, teda môže ísť o genómovú DNA, syntetickú DNA alebo cDNA. Výhodne je nukleotidovou sekvenciou DNA sekvencia a najvýhodnejšie sekvencia cDNA. Polynukleotid podľa tohto vynálezu typicky zahŕňa neprerušenú sekvenciu nukleotidov, ktoré sú schopné hybridizácie v zvolených podmienkach s kódujúcou sekvenciou alebo komplementom kódujúcej sekvencie (napr. zrelej) SEQ ID No. 1. Takéto nukleotidy sa môžu syntetizovať podľa metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky¹.

Polynukleotid podľa tohto vynálezu sa môže hybridizovať s kódujúcou sekvenciou alebo komplementom kódujúcej sekvencie (napr. zrelej) SEQ ID No. 1 v signifikantne väčšom rozsahu v porovnaní s jeho hybridizáciou s pozadím. Hybridizácia pozadia sa môže vyskytovať napríklad preto, že v knižnici cDNA sú prítomné ďalšie cDNA. Signálne množstvo (napr. vytvorené interakciou medzi polynukleotidom podľa tohto vynálezu a kódujúcou sekvenciou alebo komplementom kódujúcej sekvencie) má typicky najmenej 10-násobnú, výhodne najmenej 100-násobnú intenzitu interakcií medzi ďalšími polynukleotidmi a (napr. zrelou) kódujúcou sekvenciou SEQ ID No. 1. Intenzita interakcií sa dá merať napríklad pomocou rádioaktívneho označenia sondy, napr. s ³²P. Selektívna hybridizácia sa dá typicky dosiahnuť, ak sa aplikujú podmienky pre nízku stringenciu (0,3 M chlorid sodný a 0,03 M citran sodný pri asi 40 °C), strednú stringenciu (napríklad 0,3 M chlorid sodný a 0,03 M citran sodný pri asi 50 °C) alebo vysokú stringenciu (napríklad 0,3 M chlorid sodný a

SK 288130 Β6

0,03 M citran sodný pri asi 60 °C). Hybridizácia sa môže robiť v akýchkoľvek vhodných podmienkach, ktoré sú známe v danej oblasti techniky¹ a príkladom pre nízku stringenciu môže byť 2 x SSC pri 55 °C, pre strednú stringenciu môže byť 0,5 až 1,0 x SSC pri 60 °C a pre vysokú stringenciu môže byť 0,1 alebo 0,2 x SSC pri 60 °C alebo vyššej teplote (napr. 68 °C), všetko pri 0,5 % SDS.

Modifikácie

Polynukleotidy podľa tohto vynálezu môžu pozostávať z DNA alebo RNA. Môžu byť j edno vláknové alebo dvojvláknové. Môžu to byť tiež polynukleotidy, v rámci ktorých sa nachádza jeden alebo viac syntetických alebo modifikovaných nukleotidov. V danej oblasti techniky je známych veľa rôznych typov modifikácií polynukleotidov. Tieto zahŕňajú metylfosfonátové a fosforotioátové základné reťazce a/alebo pripojené akridínové alebo polylyzínové reťazce na 3'- a/alebo 5 '-koncoch molekuly. V predloženom vynáleze platí, že polynukleotidy opísané v tomto dokumente môžu byť modifikované akoukoľvek metódou známou v danej oblasti techniky.

Odborníci, skúsení v odbore, si budú vedomí toho, že použitím bežných techník sa vytvárajú nukleotidové substitúcie, ktoré neovplyvňujú polypeptidovú sekvenciu kódovanú polynukleotidmi podľa tohto vynálezu, čo poukazuje na použitie kodónu ktoréhokoľvek príslušného hostiteľského organizmu, napríklad takého, v ktorom sa dajú exprimovať polypeptidy podľa predloženého vynálezu.

Kódujúca (napr. zrelá) sekvencia SEQ ID No. 1 sa dá modifikovať pomocou nukleotidových substitúcií, napríklad od/do 1, 2 alebo 3 až 10, 25, 50 alebo 100 substitúcií. Polynukleotid môže byť alternatívne alebo dodatočne modifikovaný pomocou jednej alebo viacerých inzercií a/alebo delécií a/alebo pomocou extenzie na jednom alebo oboch koncoch. Modifikovaný polynukleotid kóduje obvykle polypeptid, ktorý má xylanázovú aktivitu. Pri translácii modifikovanej sekvencie sa dajú uskutočniť degeneratívne substitúcie a/alebo substitúcie, ktoré by mohli viesť ku konzervatívnej aminokyselinovej substitúcii, o čom sa diskutuje neskôr pri odvolaní na polypeptidy.

Homológy

Nukleotidovú sekvencia (napr. jej komplement), ktorá je schopná selektívnej hybridizácie s DNA kódujúcou sekvenciou SEQ ID No. 1 (alebo nukleotidmi 69 - 1224) môže mať najmenej 70 %, najmenej 75 %, najmenej 80 %, najmenej 90 %, najmenej 95 %, najmenej 98 % alebo najmenej 99 % sekvenčnú identitu (alebo homológiu) s kódujúcou sekvenciou SEQ ID No. 1. Môže to byť na úseku najmenej 20, výhodne najmenej 30 alebo 60, napríklad najmenej 100, najmenej 200, výhodnejšie najmenej 300 neprerušených nukleotidov alebo optimálne na úplnej dĺžke SEQ ID No. 1.

Akákoľvek kombinácia skôr uvedených stupňov homológie a určené minimum sa môže použiť na definovanie polynukleotidov podľa tohto vynálezu, pričom sú uprednostňované stringentnejšie kombinácie (t. j. vyššia homológia na dlhších úsekoch). Tak napríklad, polynukleotid, ktorý je najmenej na 80 % alebo na 90 % homológny na 25, výhodne na 30 nukleotidoch sa týka tohto vynálezu, ako aj polynukleotid, ktorý je najmenej na 90 % homológny na 40 nukleotidoch.

Homológy polynukleotidových (alebo proteínových) sekvencii majú typicky najmenej 70 % homológiu, výhodne najmenej 80 %, 90 %, 95 %, 97 % alebo 99 % homológiu, napríklad na neprerušenom úseku najmenej na 20, 25, 30, 100 a viac nukleotidov (alebo aminokyselín). Homológia sa môže vypočítať na základe aminokyselinovej identity (niekedy označovanej ako „tvrdá homológia“).

Napríklad súbor programov „UWGCG Package“ poskytuje BESTFIT program, ktorý sa môže použiť na výpočet homológie (napríklad použiť jeho predvolené nastavenia⁵). Algoritmy PILEUP a BLAST sa môžu použiť na výpočet homológie alebo priradenia sekvencii (napríklad identifikovaním ekvivalentných alebo prislúchajúcich sekvencii, a to napríklad pri ich predvolených nastaveniach^6,7).

Softvér na vykonanie BLAST analýz je verejne dostupný prostredníctvom National Center for Biotechnology Information (http://wwvy.ncbi.nlm.nih.gov/). Tento algoritmus zahŕňa najprv identifikáciu sekvenčného páru s vysokým skóre (HSPs) pomocou identifikácie krátkych „words“ dĺžky W vo vyhľadávanej sekvencii, ktorá sa buď hodí, alebo zodpovedá niektorému pozitívne zhodnotenému prahovému skóre T, ak sa priraďuje s „word“ rovnakej dĺžky v databázovej sekvencii. Hraničiace prahové „word“ skóre ⁶’⁷ sa označuje T. Tieto počiatočné hraničiace nálezy „word“ pôsobia ako základ na začatie skúmania, aby sa zistilo, či obsahujú HSP páry. Nálezy „word“ sa rozširujú na obidva smery pozdĺž každej sekvencie, až pokiaľ sa môže kumulatívne skóre priradenia zvyšovať. Rozšírenia pre nálezy „word“ v každom smere sú prerušené, ak: kumulatívne skóre priradenia pokleslo z jej maximálne dosiahnutej hodnoty o veličinu X; kumulatívne skóre sa blíži k nule alebo ešte nižšie, a to v dôsledku akumulácie jednej alebo viacerých negatívne skórujúcich zvyškov priradení; alebo ak sa dosiahne koniec ktorejkoľvek sekvencie. Parametre BLAST algoritmu W, T a X stanovujú citlivosť a rýchlosť priradenia. Program BLAST používa ako predvolenú hodnotu „word lenght“ (W) 11, BLOSUM62 hodnotu skórovacej matice⁸ priradení (B) 50, pravdepodobnosť (E) 10, M = 5, N = 4 a porovnanie obidvoch vlákien.

Algoritmus BLAST vykonáva štatistickú analýzu podobností medzi dvoma sekvenciami⁹. Jednou mierou

SK 288130 Β6 podobnosti poskytovanou algoritmom BLAST je najmenšia suma pravdepodobnosti (P(N)), ktorá poskytuje indikáciu pravdepodobnosti, s ktorou by sa mohla vyskytnúť možnosť porovnávať dve nukleotidové alebo aminokyselinové sekvencie. Napríklad jedna sekvencia sa považuje za podobnú inej sekvencii, ak je najmenšia suma pravdepodobnosti pri porovnaní prvej sekvencie s druhou sekvenciou menšia ako asi 1, výhodne menšia ako asi 0,1, výhodnejšie menšia ako asi 0,01 a najvýhodnejšie menšia ako asi 0,001.

Priméry a sondy

Polynukleotidy podľa tohto vynálezu zahŕňajú a môžu byť použité ako primér, napr. primér PCR, primér na alternatívnu amplifikačnú reakciu, ako sonda alebo sa polynukleotidy môžu klonovať do vektorov. Takéto priméry, sondy alebo ďalšie fragmenty by mali mať dĺžku najmenej alebo dĺžku až do 20, 25, 30 alebo 40, napríklad najmenej 25, 30 alebo 40 nukleotidov. Typicky môžu mať dĺžku do 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 alebo 300 nukleotidov alebo je počet nukleotidov nižší (dokonca až o niekoľko nukleotidov, napríklad o 5 alebo o 10 nukleotidov) s výnimkou (napr. zrelej) kódujúcej sekvencie SEQ ID No. 1.

Vo všeobecnosti sa priméry produkujú syntetickými postupmi, ktoré zahrnujú krokovú výrobu požadovanej sekvencie nukleovej kyseliny z určitého nukleotidu v určitom čase. Používajú sa na to automatizované technológie, ktoré sú ľahko dostupné v danom odbore techniky. Príklady primérov podľa tohto vynálezu sú uvedené v sekvenciách SEQ ID No. 3 a 4.

Dlhšie polynukleotidy sa obvykle produkujú použitím rekombinantných postupov, napríklad sa používajú klonovacie techniky PCR (polymerázová reťazová reakcia). Zahrnuje to vytvorenie páru primérov (napr. asi 15 až 30 nukleotidových) pre úsek xylanázy, ktorý, ak sa požaduje klonovať, prináša priméry do kontaktu s mRNA alebo cDNA získanými z cieľovej bunky (napr. kvasinkovej, bakteriálnej, rastlinnej, prokaryotickej alebo bunky húb), výhodne z kmeňa Talaromyces, pri vykonávaní polymerázovej reťazovej reakcie v takých podmienkach, ktoré vedú k amplifikácii požadovaného úseku, izolovaniu amplifikovaného fragmentu (napr. purifikovaním reakčnej zmesi na agarózovom géli) a získaniu amplifíkovanej DNA. Priméry môžu byť skonštruované tak, aby obsahovali vhodné rozpoznávacie miesta pre reštrikčný enzým, aby sa amplifikovaná DNA mohla klonovať do vhodného klonovacieho vektora.

Takéto techniky sa môžu použiť na získanie celej alebo časti xylanázovej sekvencie opísanej v tomto dokumente. Genómové klony prislúchajúce cDNA SEQ ID No. 1 alebo xylanázový gén obsahujúci napríklad intróny a promótorové oblasti patria tiež do rozsahu vynálezu a dajú sa tiež získať analogickým spôsobom (napr. rekombinantnými technikami, PCR, klonovacími technikami), vychádzajúc z genómovej DNA z bunky húb, kvasiniek, bakteriálnej rastlinnej alebo prokaryotickej bunky.

Polynukleotidy alebo priméry môžu byť nosičmi identifikačnej značky, napr. rádioaktívnej alebo nerádioaktívnej značky. Vhodné značky zahŕňajú také rádioizotopy ako napríklad ³²P alebo ³³S, enzýmové značky alebo iné proteínové značky ako napríklad biotín. Tieto značky sa môžu pridať k polynukleotidom alebo primérom podľa tohto vynálezu a dajú sa detegovať pomocou známych technik per se.

Polynukleotidy, označené alebo neoznačené, sa môžu použiť v testoch fúnkčných na základe nukleových kyselín, a to na detekciu alebo sekvenovanie xylanázy alebo jej variantov vo vzorke (napr. húb). Takéto detekčné testy sa obvykle zakladajú na tom, že sa vzorka, (napr. húb) obsahujúca DNA (predpokladanú), uvedie do kontaktu so sondou alebo primérom podľa tohto vynálezu v hybridizačných podmienkach a deteguje sa akýkoľvek duplex vytvorený medzi sondou a nukleovou kyselinou vo vzorke. Takáto detekcia sa dá dosiahnuť použitím techník ako napríklad PCR alebo pomocou imobilizovania sondy na pevnom podklade, odstránením nukleovej kyseliny zo vzorky, ktorá sa nehybridizovala so sondou a potom detegovaním nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizovala so sondou. Alternatívne môže byť vzorka nukleovej kyseliny imobilizovaná na pevnom podklade a množstvo sondy viazané na takýto podklad sa môže detegovať.

Sondy podľa tohto vynálezu môžu byť obyčajne balené v testovacom kite vo vhodnom kontajneri. V takýchto kitoch môže byť sonda viazaná na pevný podklad, ak povaha testu, pre ktorú je kit určený, vyžaduje takéto viazanie. Kit môže tiež obsahovať vhodné činidlá na úpravu vzorky, ktorá sa má sondovať hybridizáciou sondy s nukleovou kyselinou vo vzorke, manipulačné činidlá, návody a podobne.

Výhodne je polynukleotid podľa tohto vynálezu získateľný z rovnakého organizmu ako polypeptid, napríklad z húb, predovšetkým z húb rodu Talaromyces.

Polynukleotidy podľa tohto vynálezu môžu tiež zahŕňať varianty sekvencie SEQ ID No. 1, ktoré majú xylanázovú aktivitu. Varianty sa dajú vytvárať pomocou adícií, substitúcií a/alebo delécií a môžu mať schopnosť štiepiť β-D-xylánový polymér.

Produkcia polynukleotidov

Polynukleotidy, ktoré nemajú 100 % identitu so sekvenciou (napr. zrelou kódujúcou sekvenciou) SEQ ID No. 1, ale patria do rozsahu vynálezu, sa môžu získať mnohými spôsobmi. Takto sa varianty xylanázovej sekvencie opísané v tomto dokumente môžu získať napríklad pomocou sondovania knižníc genómovej DNA zhotovenej z okruhu organizmov, napríklad tých, ktoré sa pokladajú za zdroje polypeptidov podľa tohto vynálezu. Okrem toho, ďalšie homológy xylanázy z húb, rastlín alebo prokaryotov sa môžu získať, a takéto homológy a ich fragmenty vo všeobecnosti budú schopné hybridizácie so sekvenciou SEQ ID No. 1. Takéto sekvencie sa môžu získať sondovaním knižníc cDNA alebo knižníc genómovej DNA z iných druhov a sondovaním takýchto knižníc so sondami obsahujúcimi úplnú SEQ ID No. 1 alebo jej časť v podmienkach strednej až vysokej stringencie (ako sa už skôr opísalo). Sondy nukleovej kyseliny obsahujúce úplnú SEQ ID No. 1 alebo jej časť, sa môžu použiť na sondovanie knižníc cDNA z iných druhov, napríklad tých, ktoré sú opísané ako zdroje polypeptidov podľa tohto vynálezu.

Druhové homológy sa dajú tiež získať pomocou degeneratívnej PCR, pri ktorej sa používajú priméry skonštruované k cieľovým sekvenciám v rámci variantov a homológov kódujúcich konzervované aminokyselinové sekvencie. Priméry môžu obsahovať jednu alebo viac degenerovaných pozícií a dajú sa použiť pre menej stringentné podmienky v porovnaní s tými, ktoré sa použili na klonovanie sekvencií s jednotlivými sekvenčnými primérmi oproti známym sekvenciám.

Alternatívne sa takéto polynukleotidy dajú získať pomocou miestne cielenej mutagenézy xylanázových sekvencií alebo ich variantov. Môže to byť užitočné tam, kde napríklad treba zoslabiť kodónové zmeny na sekvenciách, aby sa optimalizovali kodónové preferencie pre príslušnú hostiteľskú bunku, v ktorej sa majú polynukleotidové sekvencie exprimovať. Ďalšie sekvenčné zmeny sa môžu požadovať, aby sa zaviedli rozpoznávacie miesta pre reštrikčné enzýmy, alebo aby sa zmenili vlastnosti alebo funkcia polypeptidov kódovaných polynukleotidmi.

Vynález zahŕňa dvojvláknové polynukleotidy obsahujúce polynukleotid podľa tohto vynálezu a jeho komplement.

Predložený vynález tiež poskytuje polynukleotidy kódujúce polypeptidy podľa tohto vynálezu opísané v ďalšom texte. Pretože takéto polynukleotidy sú užitočnými sekvenciami na rekombinantnú produkciu polypeptidov podľa tohto vynálezu, nie je nutné, aby boli schopné hybridizácie so sekvenciou SEQ ID No. 1, i keď sa to obvykle požaduje. Inak sa takéto polynukleotidy dajú označiť, používať, a ak treba skonštruovať, ako sa opísalo skôr. Fragmenty DNA sa dajú pripraviť pomocou techniky PCR so špecifickými primérmi^33,34.

B. Polypeptidy

Predložený vynález sa týka (napr. (podstatne) purifikovanej a/alebo izolovanej) xylanázy a jej variantov. Polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu pozostávať hlavne z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID No. 2 alebo jej časti (ako napríklad zrelej sekvencie od pozície 23 po 408) alebo jej variantov. Polypeptidy môžu byť tiež kódované polynukleotidom podľa tohto vynálezu, ako sa opísalo. Odkazy na SEQ ID No. 2 môžu byť nahradené so zrelou sekvenciou (zvyšky Ala²³ až Leu⁴⁰⁸) iba vtedy, ak to iné súvislosti vyžadujú.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu pôsobiť nielen na arabinoxylán, ale tiež na aryl-p-D-xylozidy (takže majú arabinoxylanázovú a xylozidázovú aktivitu).

Polypeptid podľa tohto vynálezu môže byť izolovaný alebo môže byť podstatne purifikovaný. Je zrejmé, že polypeptid môže byť v zmesi s nosičmi alebo rozpúšťadlami, ktoré neinterferujú s určeným cieľom a/alebo funkciou polypeptidu a ešte stále sa považujú v podstate za izolované. Obvykle bude preparát zahŕňať polypeptid, pričom v preparáte bude pripadať na polypeptid podľa tohto vynálezu viac ako 20 %, napr. viac ako 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 95 % alebo 99 % z hmotnosti polypeptidu v preparáte. Toto sú relatívne čisté kompozície: pre niektoré aplikácie sa môže v zmesi nachádzať do 10 %, 5 %, 2 %, 1 % alebo dokonca nie viac ako 0,5 % polypeptidu. Na purifikovanie a/alebo syntézu proteínov podľa tohto vynálezu sa môžu použiť obvykle zaužívané metódy¹. Pre niektoré receptúry (napr. nie pre farmaceutické použitia) môže byť obsah polypeptidu nízky, napríklad od 0,01 % do 10 %, napríklad od 0,1 % do 5 % alebo 2 % alebo dokonca od 0,2 % do 1 %.

Výhodne sa dá polypeptid podľa tohto vynálezu získať z mikroorganizmu, ktorý obsahuje gén kódujúci enzým so xylanázovou aktivitou. Výhodnejším mikroorganizmom sú huby a optimálne vláknité huby. Výhodné mikroorganizmy sú rodu Talaromyces, napríklad druh Talaromyces emersonii (napr. CBS 393.64 alebo 814.70).

Aktivita

Polypeptid podľa tohto vynálezu môže mať jeden alebo viac nasledujúcich charakteristických znakov, menovite:

(1) má β-D-xylanázovú aktivitu;

(2) rozpätie pH optima od 2 do 6, napríklad od 3 do 5, optimálne od 3,5 do 5,0;

(3) optimálnu aktivitu pri teplote od 50 °C do 95 °C, napríklad ako 70 °C až 90 °C, optimálne od 75 °C do 85 °C;

(4) (deglykozylovaný) má molekulovú hmotnosť od 30 do 50 kDa, výhodne od 35 do 45 kDa, optimálne od 40 do 44 kDa alebo (glykozylovaný) od 50 do 75 kDa, výhodne od 55 do 70 kDa, optimálne od 60 do 66 kDa; a/alebo (5) má izoelektrický bod od 3,0 do 3,6.

Polypeptid môže mať EC.3.2.1.8 aktivitu. Výhodne je polypeptid z Rodiny 10 (predtým F-typ).

SK 288130 Β6 „Xylanázová aktivita“ je definovaná ako schopnosť štiepiť celulózu alebo β-D-xylánový polymér (napríklad ako sa zistilo v rastlinách napr. ovse alebo jačmeni). Táto aktivita umožňuje štiepiť β-D-xylán, napríklad medzi susediacimi xylanopyranozylovými koncovými a/alebo nekoncovými jednotkami. Výhodne sa štiepenie vyskytuje na [xylanopyranozyl (1-4) xylanopyranozylovej] väzbe. Dve susediace (napr. nesubstituované) jednotky môže polypeptid prednostne štiepiť uprostred. Môže mať tiež endo-aktivitu (t. j. je endonukleázou). Substrátový polymér môže byť alebo nemusí byť substituovaný. Tak isto môže mať tiež takú exo-aktivitu (t. j. je exoxylanázou), ktorá štiepi koncové xylopyranozylové jednotky. Výhodne polypeptid nemá glukanázovú aktivitu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu byť tiež aktívne (alebo vykazujú aktivitu) na arabinoxylán. Arabinoxylán je podskupinou xylánu s L-arabinofúranozylovými bočnými reťazcami viazanými na C-2 alebo C-3, alebo na obidva, v xylózových zvyškoch hlavného reťazca. Arabinoxylán má CAS registračné č. 98513-12-3. Môže mať štruktúru (1—»4)^-D-xylánu s 3-naviazanými α-L-arabinózovými vetvami. Tento druh xylánu sa spravidla nachádza v xyláne z ovseného ostria.

Touto aktivitou je schopnosť hydrolyzovať neošetrený arabinoxylán. Znamená to, že arabinoxylán nemusí byť ošetrený alebo modifikovaný, napríklad nemusí byť ošetrený s arabinofuranozidázou. Tento enzým môže odstraňovať arabinózové bočné reťazce. Polypeptidy podľa tohto vynálezu sú schopné hydrolyzovať (štiepiť) arabinoxylán, ktorý nebol predtým ošetrený s arabinofuranozidázou.

Arabinoxylán sa môže nachádzať v ovsenom ostrí a táto špecifikácia aktivity polypeptidu (EXU, ako aj PAHBAH aktivita) je stanovená na arabinoxyláne zo pšeničnej múky (pri pomere arabinózy ku xylóze 41 : 59). Skúška na arabinoxylán (ako substrát) sa opisuje v ďalšom texte v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu mať tiež xylozidázovú aktivitu, napríklad môžu byť schopné hydrolyzovať substituované (napr. aryl)^-D-xylozidy (tiež známe ako xylopyranozidy). Napríklad môžu byť schopné hydrolyzovať 4-metylumbelliferyl^-D-xylopyranozid (CAS Register č. 6734-33-4, ktorý sa dá získať od firmy Sigma Chemical Co.). Touto aktivitou je schopnosť uvoľňovať fluorescenčný markér zo substrátu. Tak isto môžu hydrolyzovať (byť aktívne na) 5-bróm-4-chlór-3-indoxyl^-D-xylopyranozid (CAS Registračné č. 207606-55-1). Kombinácia aktivity na arabinoxylán aj na aryl^-D-xylozid je neobvyklá^36,37 a ide o novú kombináciu aktivít polypeptidu majúceho xylanázovú aktivitu.

Varianty a homológy

Polypeptid podľa tohto vynálezu môže zahŕňať aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v SEQ ID No. 2 alebo v podstate homológnu sekvenciu, alebo fragment jednej alebo druhej sekvencie a môže mať xylanázovú aktivitu. Vo všeobecnosti sa uprednostňuje prirodzene sa vyskytujúca aminokyselinová sekvencia uvedená v SEQ ID No. 2.

Polypeptid podľa tohto vynálezu môže predovšetkým zahŕňať:

(a) (zrelú) polypeptidovú sekvenciu SEQ ID No. 2 (zvyšky 23 až 408) alebo úplnú sekvenciu SEQ ID No. 2;

(b) prirodzene sa vyskytujúci variant alebo jeho druhový homológ; alebo (c) protein s najmenej 70 %, najmenej 75 %, najmenej 80 %, najmenej 90 %, najmenej 95 %, najmenej 98 % alebo najmenej 99 % sekvenčnou identitou s (a) alebo (b).

Jedným variantom môže byť ten, ktorý sa vyskytuje prirodzene, napríklad v bunkách húb, baktérií, kvasiniek alebo v rastlinných bunkách, a ktorý môže fungovať v podstate rovnakým spôsobom ako protein so SEQ ID No. 2, napríklad má xylanázovú aktivitu. Podobne druhový homológ proteinu je ekvivalentný k proteinu, ktorý sa vyskytuje prirodzene v iných druhoch, a ktorý môže fungovať ako xylanáza. Varianty zahŕňajú alelické varianty buď z rovnakého kmeňa, ako je polypeptid podľa tohto vynálezu alebo z odlišného kmeňa, ale rovnakého rodu, alebo rovnakého druhu.

Varianty a druhové homológy sa môžu získať pomocou nasledovných postupov opísaných v tomto dokumente na produkciu polypeptidu SEQ ID No. 2 a uskutočnením takýchto postupov na vhodnom bunkovom zdroji, napríklad bakteriálnej bunke, kvasinkovej bunke, bunkách húb alebo rastlinnej bunke. Použiť sa dá tiež sonda opísaná skôr, a to na sondovanie knižníc vytvorených z kvasinkových buniek, bakteriálnych buniek, buniek húb alebo rastlinných buniek, aby sa získali klony obsahujúce varianty alebo druhové homológy. Klony môžu byť manipulované bežnými technikami, aby sa vytvoril polypeptid podľa tohto vynálezu, ktorý potom môže byť produkovaný pomocou rekombinantných alebo syntetických techník známych per se.

Polypeptid podľa tohto vynálezu má výhodne najmenej 70 % sekvenčnú identitu s proteínom SEQ ID No. 2, výhodnejšie najmenej 80 %, najmenej 90 %, najmenej 95 %, najmenej 97 % alebo najmenej 99 % sekvenčnú identitu, a to napríklad na neprerušenom úseku najmenej 40, 60, 100, 150, 200, 300 alebo 400 aminokyselín alebo na úplnej dĺžke SEQ ID No. 2.

Sekvencia polypeptidu SEQ ID No. 2 a jeho varianty a druhové homológy môžu byť tak modifikované, aby poskytli polypeptidy podľa tohto vynálezu. Môžu sa vykonať aminokyselinové substitúcie, napríklad od alebo do 1, 2 alebo 3 až 10, 20, 30, 50 alebo 100 substitúcií. Rovnaký počet delécií alebo inzercií sa môže tiež vykonať. Tieto zmeny môžu byť mimo úsekov, ktoré sú kritické pre fungovanie polypeptidu a tak ešte stále môžu poskytovať aktívny enzým. Modifikovaný polypeptid si vo všeobecnosti zachováva xylanázovú

SK 288130 Β6 aktivitu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu zahŕňajú fragmenty z úplnej dĺžky uvedených polypeptidov a ich variantov vrátane fragmentov sekvencie uvedenej v SEQ ID No. 2. Takéto fragmenty si typicky zachovávajú xylanázovú aktivitu. Fragmenty môžu mať dĺžku najmenej 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200 alebo 250 aminokyselín alebo tento počet aminokyselín môže byť nižší oproti úplnej dĺžke sekvencie (uvedenej v SEQ ID No. 2). Fragmenty alebo varianty zahŕňajú alebo predstavujú väzbovú oblasť β-D-xylánu alebo oblasť štiepenia β-D-xylánu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu v prípade potreby produkovať synteticky, i keď sa obvykle pripravujú rekombinantne, ako sa opisuje v ďalšom texte. Môžu byť modifikované napríklad adíciou histidínových zvyškov alebo T7 značky, aby sa uľahčila ich identifikácia alebo purifikácia, alebo adíciou signálnej sekvencie, aby sa podporila ich sekrécia z bunky.

Pojem „varianty“ označuje polypeptidy, ktoré môžu mať v podstate rovnaký charakter alebo základnú biologickú fúnkčnosť ako xylanáza, a zahŕňajú alelické varianty. Charakteristickým znakom xylanázy je, že je to enzým, ktorý môže štiepiť 1—»4 väzby v β-D-xyláne. Polypeptid, ktorý má v podstate rovnaký charakter ako xylanáza, sa dá identifikovať použitím skúšky na degradáciu celulózy, ako sa opisuje v ďalšom texte.

Varianty SEQ ID No. 2 zahŕňajú tiež sekvencie, ktoré sa líšia od SEQ ID No. 2, ale ktoré nie sú nevyhnutne odvodené z prirodzene sa vyskytujúceho xylanázového proteínu. Tieto varianty sa môžu opísať tak, že majú isté % homológie so SEQ ID No. 2 alebo že majú istý počet substitúcií v rámci tejto sekvencie. Alternatívne môže byť variant kódovaný polynukleotidom, ktorý sa hybridizuje so SEQ ID No. 1.

Podobne sa môžu definovať varianty k variantom SEQ ID No. 1. Preto môžu varianty zahŕňať variantné sekvencie odvodené z ďalších kmeňov Talaromyces. Iné varianty sa môžu identifikovať z ďalších kmeňov Talaromyces vyhľadávaním xylanázovej aktivity a klonovaním a sekvenovaním ako predtým. Varianty môžu zahŕňať deléciu, modifikáciu alebo adíciu jedinej aminokyseliny alebo skupiny aminokyselín v rámci sekvencie proteínu, až kým si peptid udržiava základnú biologickú fúnkčnosť xylanázy.

Konzervatívne substitúcie sa dajú uskutočniť napríklad podľa nasledujúcej tabuľky. Aminokyseliny rovnakej skupiny v druhom stĺpci a výhodne v rovnakom riadku v treťom stĺpci sa môžu vzájomne substituovať. Výhodne, poskladanie alebo aktivita polypeptidu nie sú ovplyvnené substitúciami.

ALIFATICKÉ	Nepoláme	GAP
IL V
Poláme-nenabité	CSTM
N Q
Poláme-nabité	DE
KR
AROMATICKÉ		H F W Y

Modifikácie

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu chemicky modifikovať, napr. potranslačne modifikovať. Napríklad sa môžu glykozylovať (raz alebo viackrát s rovnakými alebo odlišnými sacharidmi) alebo môžu zahŕňať modifikované aminokyselinové zvyšky. Modifikovať sa môžu tiež pomocou adície histidínových zvyškov (na uľahčenie ich purifikácie) alebo pomocou adície signálnej sekvencie (na podporu inzercie do bunkovej membrány). Polypeptid môže mať jednu alebo viac (N) amino- alebo (C) karboxy- zakončených extenzií, napríklad ako amino zakončený metionínový zvyšok, malý peptidový spojovník asi do 20 - 25 zvyškov, alebo (malá) extenzia, ktorá uľahčuje purifikáciu, napríklad ako polyhistidín alebo T7 značka, antigénový epitop alebo (napr. maltózová) väzbová doména¹⁴ (napr. na C-konci). Takéto extenzie sa môžu alebo nemusia pridať prostredníctvom spojovníka.

Polypeptid podľa tohto vynálezu sa môže označovať indikačnou značkou. Indikačnou značkou môže byť akákoľvek vhodná značka, ktorá umožní detekciu polypeptidu. Vhodnými značkami sú rádioizotopy, napr. ¹²⁵I, ³⁵S, enzýmy, protilátky, polynukleotidy a spojovníky ako napríklad biotín.

Polypeptidy môžu byť modifikované tak, aby obsahovali prirodzene sa nevyskytujúce aminokyseliny, alebo aby sa zvýšila stabilita polypeptidu. Ak sa proteíny alebo peptidy produkujú synteticky, tak sa takéto aminokyseliny môžu zaviesť počas produkcie. Modifikácia proteínov alebo peptidov sa dá tiež dosiahnuť na základe buď syntetickej alebo rekombinantnej produkcie.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu tiež produkovať použitím alebo zahrnutím (jednej alebo viacerých) D-aminokyselín. V takýchto prípadoch sa aminokyselinové zvyšky môžu spájať použitím obvyklej N a C sekvencie podľa opisu v tejto prihláške.

Mnoho modifikácií bočného reťazca je známych v danej oblasti techniky a dajú sa uskutočniť na bočných reťazcoch proteínov alebo peptidov podľa predloženého vynálezu. Takéto modifikácie zahŕňajú napríklad modifikácie aminokyselín pomocou redukčnej alkylácie, a to reakciou s aldehydom a nasledovnou redukciou s NaBFLt, amidináciou s metylacetamidom alebo acyláciou s acetanhydridom.

SK 288130 Β6

Sekvencie, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, sa môžu tiež použiť ako štartovacie materiály na skonštruovanie „druhej generácie“ enzýmov. „Druhou generáciou“ xylanáz môžu byť tie, ktoré sa zmenili pomocou techník mutagenézy (napr. miestne cielenou mutagenézou), a ktorých vlastnosti sa odlišujú od vlastnosti štandardného (wild) typu xylanáz alebo rekombinantných xylanáz ako xylanáz produkovaných podľa predloženého vynálezu. Napríklad teplotné alebo pH optimum, špecifická aktivita, substrátová afinita alebo termostabilita sa môžu zmeniť tak, že budú lepšie vyhovovať na aplikáciu v definovanom procese.

Aminokyseliny, ktoré sú esenciálne na aktivitu xylanáz podľa tohto vynálezu, a preto sa výhodne substituujú, sa môžu identifikovať podľa metód dobre známych v danej oblasti techniky, ako miestne cielenou mutagenézou alebo mutagenézou snímania-alanínu¹⁰. Novšie techniky mutácií sa zavádzajú na každý zvyšok v molekule a testuje sa biologická aktivita výsledných mutantných molekúl (napr. xylanázová aktivita), aby sa identifikovali tie aminokyselinové zvyšky, ktoré sú kritické pre aktivitu molekuly. Tak isto sa môžu stanoviť miesta interakcie enzýmu - substrátu, a to analýzou kryštálovej štruktúry stanovenej pomocou takých techník ako jadrová magnetická rezonancia, kryštalografia alebo fotoafinitné značkovanie^11,12,13 alebo molekulárne modelovanie.

Predpokladá sa, že použitím kvasinkových hostiteľských buniek a hostiteľských buniek húb sa zabezpečia také potranslačné modifikácie (napr. proteolytické procesovanie, myristilácia, glykozylácia, trunkácia a fosforylácia tyrozínu, serínu alebo treonínu), ktoré môžu byť potrebné na to, aby produkty rekombinantnej expresie podľa tohto vynálezu mali optimálnu biologickú aktivitu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu poskytovať v takej forme, ktorú nemajú v svojom prirodzenom bunkovom prostredí. A preto musia byť izolované alebo purifikované do značnej miery, ako sa uvádza v predchádzajúcom texte, alebo môžu byť v bunke, v ktorej sa nevyskytujú v prírode, napr. bunke iných druhov húb, živočíchov, kvasiniek alebo baktérií.

C. Aspekty rekombinácie

Vynález sa tiež týka vektorov, ktoré zahrnujú polynukleotid podľa tohto vynálezu vrátene klonovacích a expresných vektorov a spôsobov množenia, transformácie alebo transfekcie takýchto vektorov vo vhodnej hostiteľskej bunke, napríklad v takých podmienkach, v ktorých sa expresia polypeptidu podľa tohto vynálezu vyskytuje. Poskytujú sa tiež hostiteľské bunky zahrnujúce polynukleotid alebo vektor podľa tohto vynálezu, pričom polynukleotid je heterológny s genómom hostiteľskej bunky. Pojem „heterológny“, spravidla vzhľadom na hostiteľskú bunku, znamená, že polynukleotid sa prirodzene nevyskytuje v genóme hostiteľskej bunky, alebo že táto bunka prirodzene neprodukuje polypeptid. Výhodne je hostiteľskou bunkou kvasinková bunka, napríklad kvasinková bunka rodu Kluyveromyces alebo Saccharomyces alebo bunka húb, napríklad rodu Aspergillus.

Polynukleotidy podľa tohto vynálezu sa dajú začleniť do rekombinantne replikovateľného vektora, napríklad klonovacieho alebo expresného vektora. Vektor sa môže použiť na replikáciu nukleovej kyseliny v kompatibilnej hostiteľskej bunke. A tak v ďalšom uskutočnení poskytuje vynález spôsob konštrukcie polynukleotidov podľa tohto vynálezu zavádzaním polynukleotidu podľa tohto vynálezu do replikovateľného vektora, zavádzanie vektora do kompatibilnej hostiteľskej bunky, a pestovanie hostiteľskej bunky v takých podmienkach, ktoré poskytujú replikáciu vektora. Vektor sa dá opätovne získať z hostiteľskej bunky. Vhodné hostiteľské bunky sa opisujú v ďalšom texte v súvislosti s expresnými vektormi.

Vektory

Polynukleotid podľa tohto vynálezu sa môže zaviesť inzerciou do expresnej kazety. Vektorom, do ktorého sa expresná kazeta alebo polynukleotid podľa tohto vynálezu inzerciou zavádza, môže byť akýkoľvek vektor, s ktorým sa dá vhodne pracovať pomocou techník rekombinácie DNA, pričom výber vektora často závisí od hostiteľskej bunky, do ktorej sa má zaviesť. A preto vektor môže byť autonómne replikujúcim sa vektorom, t. j. vektorom, ktorý je extrachromozómovou entitou, replikácia ktorého nezávisí od chromozómovej replikácie, napr. plazmid. Alternatívne, vektorom môže byť ten, ktorý ak je zavedený do hostiteľskej bunky, je integrovaný do genómu hostiteľskej bunky a replikuje sa spolu s chromozómom(ami), do ktorého bol integrovaný.

Výhodne, polynukleotid podľa tohto vynálezu je vo vektore účinne spojený s regulačnou sekvenciou, ktorá je schopná poskytovať expresiu kódujúcej sekvencie prostredníctvom hostiteľskej bunky, t. j. vektor je expresným vektorom. Pojem „účinne spojený“ označuje juxtapozíciu, pri ktorej uvedené zložky sú v takom vzájomnom vzťahu, ktorý im umožňuje fungovať podľa nimi určeného spôsobu. Také regulačné sekvencie ako promótor, zosilňovač alebo ďalší expresný regulačný signál, „účinne spojené“ s kódujúcou sekvenciou sú umiestené tak, že expresia kódujúcej sekvencie sa dosiahne v podmienkach kompatibilných s regulačnými sekvenciami alebo sú sekvencie usporiadané tak, že ich funkcia je v súlade s cieľom, na ktorý sú určené, napríklad iniciovať transkripciu od promótora a postupovať po sekvencii DNA kódujúcej polypeptid.

Vektorom môže byť plazmid, kozmid, vírusový alebo fágový vektor, obvykle poskytnutý so začiatkom replikácie, prípadne promótorom na expresiu polynukleotidu a prípadne zosilňovačom a/alebo regulátorom

SK 288130 Β6 promótora. Prítomná môže byť terminátorová sekvencia, ktorou môže byť polyadenylačná sekvencia. Vektor môže obsahovať jeden alebo viac selektovateľných markerových génov, napríklad gén rezistencie na ampicilín (v prípade bakteriálneho plazmidu) alebo gén rezistencie na neomycín (pre cicavčí vektor). Vektory sa dajú použiť in vitro, napríklad na produkciu RNA alebo sa používajú na transfekciu alebo transformáciu hostiteľskej bunky. Môžu zahŕňať dva alebo viac polynukleotidov podľa tohto vynálezu, napríklad na nadmernú expresiu.

Sekvencia DNA kódujúca polypeptid sa výhodne zavádza do vhodného hostiteľa ako súčasť expresnej kazety (alebo konštruktu), v ktorej je sekvencia DNA účinne spojená s expresnými signálmi, ktoré sú schopné riadiť expresiu DNA sekvencie v hostiteľských bunkách. Transformácia vhodného hostiteľa s expresným konštruktom pomocou transformačných postupov je dostupná a dobre známa skúseným odborníkom³'⁴. Expresný konštrukt sa môže použiť na transformáciu hostiteľa ako časť vektora, ktorý nesie selektovateľný marker, alebo sa môže expresný konštrukt kotransformovať ako samostatná molekula spolu s vektorom, ktorý nesie selektovateľný marker. Vektor môže pozostávať z jedného alebo viacerých selektovateľných markerových génov.

Výhodné selektovateľné markery¹⁵’¹⁶ obsahujú, ale nie sú obmedzené len na tie, ktoré komplementujú defekt v hostiteľskej bunke alebo poskytujú rezistenciu na liečivo. Obsahujú napr. univerzálne markerové gény, ktoré sa dajú použiť na transformáciu väčšiny vláknitých húb a kvasiniek, ako napríklad acetamidázové gény alebo cDNA (gény amdS, niaD,facA alebo cDNA z A. nidulans, A. oryzae alebo A. niger) alebo gény poskytujúce rezistenciu na antibiotiká ako G418, hygromycín, bleomycín, kanamycín, fleomycín alebo rezistenciu na benomyl (benA). Alternatívne sa môžu špecifické selekčné markery použiť ako markery auxotrofie, ktoré vyžadujú prislúchajúce mutantné hostiteľské kmene: napr. URA3 (zo 5. cerevisiae alebo analogické gény z iných kvasiniek), pyrG alebo pyrA (z A. nidulans alebo A. niger), argB (z A. nidulans alebo A. niger) alebo trpC. Vo výhodnom uskutočnení sa selekčný marker deletuje z transformovanej hostiteľskej bunky po zavedení expresného konštruktu tak, aby sa získali transformované hostiteľské bunky schopné produkovať polypeptid bez génov selekčného markera.

Ďalšie markery zahŕňajú ATP syntetázu, subjednotku 9 (oliC), orotidín-5'-fosfátdekarboxylázu (pvrÄ), bakteriálne gény rezistencie na G418 (tieto sa môžu tiež použiť v kvasinkách, ale nie v hubách), gény rezistencie na ampicilín (E. coli), gén rezistencie na neomycín (Bacillus) a uidA gén E. coli kódujúci β-glukuronidázu (GUS). Vektory sa môžu použiť in vitro, napríklad na produkciu RNA alebo použiť na transfekciu alebo transformáciu hostiteľskej bunky.

Pre väčšinu vláknitých húb a kvasiniek platí, že vektor alebo expresný konštrukt sa výhodne integrujú do genómu hostiteľskej bunky, aby sa získali stabilné transformanty. Pre určité kvasinky sú ale dostupné vhodné epizómové vektory, do ktorých sa môže začleniť expresný konštrukt na stabilnú expresiu a dosiahnutie vysokej miery expresie, medzi ktoré napríklad patria vektory odvodené od 2μ plazmidu Saccharomyces a pKDl plazmidu Kluyveromyces alebo vektory obsahujúce AM A sekvenciu (napr. AMA1 z Aspergillus³'²⁰). V prípade, keď sú expresné konštrukty začlenené do genómu hostiteľských buniek, tak sú konštrukty začlenené buď na náhodné lokusy v genóme, alebo na predurčené cieľové lokusy, a to použitím homológnej rekombinácie, keď cieľové lokusy výhodne zahrnujú vysoko exprimovaný gén. Vysoko exprimovaným génom je ten gén, ktorého mRNA môže tvoriť najmenej 0,01 % (hmotnostných %) bunkovej mRNA z celkového obsahu bunkovej mRNA, napr. v indukovaných podmienkach, alebo alternatívne gén, ktorého génový produkt môže tvoriť najmenej 0,2 % (hmotnostných %) bunkového proteínu z celkového obsahu bunkového proteínu, alebo v prípade sekrécie génového produktu, sa môže génový produkt sekretovať v množstve najmenej 0,05 g/1. V ďalšom texte sa uvádza veľa príkladov vhodných vysoko exprimovaných génov.

Vektor alebo expresný konštrukt pre uvedenú hostiteľskú bunku môže zahŕňať nasledovné elementy, ktoré sú navzájom účinne spojené v konzekutívnom poradí od 5'-konca k 3'-koncu na kódujúcom reťazci tej sekvencie, ktorá kóduje polypeptid podľa tohto vynálezu:

(1) promótorovú sekvenciu, ktorá je schopná riadiť transkripciu sekvencie DNA kódujúcej polypeptid v uvedenej hostiteľskej bunke;

(2) prípadne signálnu sekvenciu, ktorá je schopná riadiť sekréciu polypeptidu z uvedenej hostiteľskej bunky do kultivačného média;

(3) DNA sekvenciu kódujúcu zrelú a výhodne aktívnu formu polypeptidu; a výhodne tiež (4) transkripčnú terminačnú oblasť (terminátor), ktorá je schopná ukončiť transkripciu v smere transkripcie sekvencie DNA kódujúcej polypeptid.

V smere transkripcie sekvencie DNA kódujúcej polypeptid môže byť 3'-netranslatovaná oblasť obsahujúca jedno alebo viac transkripčných terminačných miest (napr. terminátor). Začiatok terminátora je menej kritický. Terminátor môže byť napr. natívny so sekvenciou DNA kódujúcou polypeptid. Ale výhodne sa používa kvasinkový terminátor v kvasinkových hostiteľských bunkách a terminátor vláknitých húb sa používa v hostiteľských bunkách vláknitých húb. Výhodnejšie je terminátor endogénny s hostiteľskou bunkou, (v ktorej sa má exprimovať sekvencia DNA kódujúca polypeptid).

Znásobená expresia polynukleotidu kódujúceho polypeptid podľa tohto vynálezu sa dá tiež dosiahnuť

SK 288130 Β6 pomocou selekcie heterológnych regulačných oblastí, napr. promótorových oblastí, oblastí riadiacich sekréciu a/alebo terminačných oblastí, ktorých funkciou je zvyšovať expresiu, a ak sa požaduje, je ich funkciou sekretovať pri hostiteľskej expresii množstvo proteínu, ktorý je predmetom záujmu, a/alebo poskytovať indukovateľnú reguláciu expresie polypeptidu podľa tohto vynálezu.

Okrem natívneho promótora génu kódujúceho polypeptid podľa tohto vynálezu sa na riadenie expresie polypeptidu podľa tohto vynálezu dajú použiť ďalšie promótory. Promótor sa môže zvoliť na základe jeho účinnosti pri riadení expresie polypeptidu podľa tohto vynálezu v požadovanej hostiteľskej expresii.

Promótory/zosilňovače a ďalšie expresné regulačné signály sa môžu zvoliť tak, aby boli kompatibilné s hostiteľskou bunkou, pre ktorú je expresný vektor skonštruovaný. Napríklad sa môžu použiť prokaryotické promótory, predovšetkým tie, ktoré sa dajú použiť v kmeňoch E. coli. Ak sa expresia uskutočňuje v bunkách cicavcov, môžu sa použiť cicavčie promótory. Tkanivovo-špecifické promótory, napríklad bunkovošpecifické promótory hepatocytov sa môžu tiež použiť. Vírusové promótory sa môžu tiež použiť, napríklad dlhá koncová repetícia Moloney vírusu leukémie myší (MMLV LTR), promótor vírusu Rouseho sarkómu (RSV) LTR promótor, SV40 (napr. veľký T antigén) promótor, ľudský cytomegalovírusový (CMV) IE promótor, promótory vírusu herpes simplex alebo promótory adenovírusov, HSV promótory ako napríklad HSV IE promótory alebo HPV promótory, predovšetkým HPV regulačná oblasť v protismere expresie (URR). Kvasinkové promótory zahŕňajú 5. cerevisiae GAL4 a ADH promótory, S. pombe nmt 1 a adh promótor. Cicavčie promótory zahŕňajú metalotioneínový promótor, ktorý môže byť indukovaný ako reakcia na ťažké kovy ako kadmium a β-aktínové promótory. Tkanivovo-špecifické promótory, predovšetkým endotelové alebo špecifické promótory neurónovej bunky (napríklad DDÄHI a DDAHII promótory), sú obzvlášť výhodné.

Rôzne promótory^15, ’⁶, ktoré sú schopné riadiť transkripciu v hostiteľských bunkách podľa tohto vynálezu sa môžu použiť. Výhodne je promótorová sekvencia odvodená z vysoko exprimovaného génu, ako sa definovalo skôr. Príklady výhodných vysoko exprimovaných génov, z ktorých promótory výhodne pochádzajú, a/alebo ktoré sú zahrnuté vo výhodných vopred určených cieľových lokusoch na integrovanie expresných konštruktov, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené len na, gény kódujúce glykolytické enzýmy, ako napríklad triózofosfátizomerázy (TPI), glyceraldehydfosfátdehydrogenázy (GAPDH), fosfoglycerátkinázy (PGK), pyruvátkinázy (PYK alebo PKI), alkoholdehydrogenázy (ADH), ako aj gény kódujúce amylázy, glukoamylázy, proteázy, xylanázy, celobiohydrolázy, β-galaktozidázy, alkoholoxidázy (metanoloxidázy), elongačné faktory a ribozómové proteíny. Špecifické príklady vhodných vysoko exprimovaných génov zahŕňajú napr. gén LAC4 z druhov Kluyveromyces, metanoloxidázové gény (AOX) z Hansenula a (MOX) z Pichia, glukoamylázové gény (glaA) z A. niger a A. awamori, gén A. oryzae TAKA-amylázy, gén gpdA A. nidulas a gény celobiohydrolázy T. reesei.

Príkladmi silných konštitutívnych a/alebo indukovateľných promótorov, ktoré je výhodné použiť pri expresii v hostiteľských bunkách húb^15,16,35, sú tie, ktoré sa dajú získať z promótorových génov húb pre xylanázu (xlnA), z génov húb pre fytázu, ATP-syntetázu, subjednotku 9 (oliC), triózofosfátizomerázu (tpí), alkoholdehydrogenázu (AdhA), α-amylázu (amy), amyloglukozidázu (AG - z génu glaA), acetamidázu (amdS) a glyceraldehyd-3-fostátdehydrogenázové (gpd) promótory.

Príkladmi silných kvasinkových promótorov sú tie, ktoré sa dajú získať z génov pre alkoholdehydrogenázu, laktázu, 3-fosfoglycerátkinázu a triózofosfátizomerázu.

Príkladmi silných bakteriálnych promótorov sú α-amylázové a SPo2 promótory, ako aj promótory z extracelulámych proteázových génov.

Natívny promótor génu kódujúceho xylanázu sa dá nahradiť promótorom, ktorý je regulovaný inak ako natívny promótor.

Promótory vhodné pre rastlinné bunky zahŕňajú promótory napalinosyntázy (nos), oktopinsyntázy (ocs), manopinosyntázy (mas), malej ribulózovej podjednotky (rubisco ssu), histónu, ryžového aktínu, fazeolínové promótory, promótory vírusu mozaiky karfiolu (CMV) 35S a 19S a promótory cirkovírusov. Všetky tieto promótory sú ľahko dostupné v danej oblasti techniky.

Vektor môže ďalej obsahovať sekvencie lemujúce polynukleotid, ktoré umožňujú nárast RNA, ktorá zahŕňa sekvencie homológne s eukaryotickými genómovými sekvenciami, výhodne genómovými sekvenciami cicavcov alebo vírusovými genómovými sekvenciami. Toto umožní zavedenie polynukleotidov podľa tohto vynálezu do genómu eukaryotických buniek alebo vírusov homológnou rekombináciou. Predovšetkým plazmidový vektor zahŕňajúci expresnú kazetu lemovanú vírusovými sekvenciami sa môže použiť na prípravu vírusového vektora vhodného na dodávanie polynukleotidov podľa tohto vynálezu do cicavčej bunky. Ďalšími príkladmi vhodných vírusových vektorov sú vektory zahrnujúce herpes simplex vírusové vektory^18,19 a retrovírusy vrátane lentivírusov, adenovírusov, adeno-asociovaných vírusov a HPV vírusov (ako napríklad HPV-16 alebo HPV-18). Techniky génového prenosu, ktoré využívajú tieto vírusy, sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky. Retrovírusové vektory sa napríklad môžu použiť, aby sa stabilne integroval polynukleotid, čo umožní nárast nezmyselnej (antisense) RNA do hostiteľského genómu. Replikačno-defektné adenovírusové vektory zostávajú naopak epizómové, a preto umožňujú nestálu expresiu.

Vektor môže obsahovať polynukleotid podľa tohto vynálezu, orientovaný v smere transkripcie, na poli

SK 288130 Β6 skytnutie produkcie nezmyselnej RNA. V prípade potreby sa to môže použiť na redukovanie miery expresie polypeptidu.

Hostiteľské bunky a expresia

Vynález sa ďalej týka spôsobu preparovania polypeptidu podľa tohto vynálezu, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky (napr. transformovanej alebo transfekovanej s expresným vektorom podľa opisu v predchádzajúcom texte) v podmienkach, ktoré poskytujú expresiu (pomocou vektora) kódujúcej sekvencie, ktorá kóduje polypeptid a prípadne získanie exprimovaného polypeptidu. Polynukleotidy podľa tohto vynálezu sa môžu začleniť do rekombinantného replikovateľného vektora, napr. do expresného vektora. Vektor sa môže použiť na replikáciu nukleovej kyseliny v kompatibilnej hostiteľskej bunke. A preto v inom uskutočnení sa vynález týka spôsobu konštrukcie polynukleotidu podľa tohto vynálezu zavádzaním polynukleotidu podľa tohto vynálezu do replikovateľného vektora, zavádzaním vektora do kompatibilnej hostiteľskej bunky a pestovaním hostiteľskej bunky v takých podmienkach, ktoré poskytujú replikáciu vektora. Vektor sa dá opätovne získať z hostiteľskej bunky. Vhodnými hostiteľskými bunkami sú baktérie ako napríklad E. coli, kvasinky, cicavčie bunkové línie a ďalšie eukaryotické bunkové línie, napríklad bunky hmyzu ako bunky Sf9 a bunky húb (napr. vláknitých).

Výhodne je produkcia polypeptidu taká, že protein je sekretovaný, a to v prípade, že DNA sekvencia kódujúca zrelú formu polypeptidu v expresnom konštrukte je účinne spojená so sekvenciou DNA kódujúcou signálnu sekvenciu. Výhodne, signálnou sekvenciou je sekvencia natívna (homológna) s DNA sekvenciou kódujúcou polypeptid. Alternatívne signálnou sekvenciou je sekvencia cudzorodá (heterológna) proti sekvencii DNA kódujúcej polypeptid, v tomto prípade je signálna sekvencia výhodne endogénna s hostiteľskou bunkou, v ktorej sa sekvencia DNA exprimuje. Príkladmi vhodných signálnych sekvencií pre hostiteľské bunky kvasiniek sú signálne sekvencie pochádzajúce z génov pre kvasinkový α-faktor. Podobne vhodnou signálnou sekvenciou pre hostiteľské bunky vláknitých húb je napr. signálna sekvencia pochádzajúca z amyloglukozydázového (AG) génu vláknitých húb, napr. A. niger glaA gén. Tento sa môže použiť v kombinácii so samotným amyloglukozidázovým (nazývaným tiež (gluko)amylázovým) promótorom, ako aj v kombinácii s ďalšími promótormi. Hybridné signálne sekvencie sa môžu tiež použiť v súlade s predloženým vynálezom.

Výhodné heterológne sekrečné vedúce sekvencie sú tie, ktoré pochádzajú z amyloglukozidázového (AG) génu húb (glaA - obidve 18 a 24 aminokyselinové verzie napr. z Aspergillus), gén α-faktora (kvasinkový napr. Saccharomyces a Kluyveromyces) alebo α-amylázový gén (Bacillus).

Vektory sa môžu transformovať alebo transfekovať do vhodnej hostiteľskej bunky, ako sa opísalo v predchádzajúcom texte, aby sa dosiahla expresia polypeptidu podľa tohto vynálezu. Tento spôsob môže zahŕňať kultiváciu hostiteľskej bunky transformovanej s expresným vektorom podľa opisu v predchádzajúcom texte v podmienkach, ktoré poskytujú expresiu pomocou vektora kódujúcej sekvencie, ktorá kóduje polypeptid.

Vynález ďalej poskytuje hostiteľské bunky transformované alebo transfekované s polynukleotidom alebo obsahujúce polynukleotid alebo vektor podľa tohto vynálezu. Výhodne je polynukleotid prenášaný vo vektore na replikáciu a expresiu polynukleotidu. Bunky sa vyberajú tak, aby boli kompatibilné s uvedeným vektorom a nimi môžu byť napríklad prokaryotické (napríklad bakteriálne) bunky, bunky húb, kvasinkové alebo rastlinné bunky.

Zvoliť sa môže tiež taký heterológny hostiteľ, v ktorom sa polypeptid podľa tohto vynálezu produkuje vo forme, ktorá je v podstate bez iných celulózu degradujúcich enzýmov. Dosiahnuť sa to dá výberom takého hostiteľa, ktorý obvykle neprodukuje takéto enzýmy, ako napríklad Kluyveromyces lactis.

Vynález zahŕňa spôsoby produkcie polypeptidu podľa tohto vynálezu pomocou rekombinantnej expresie sekvencie DNA kódujúcej polypeptid. Na génovú amplifikáciu a/alebo zámenu expresných signálov, ako napríklad promótorov, sekrečných signálnych sekvencií sa môže použiť sekvencia DNA podľa tohto vynálezu, aby sa dosiahla ekonomická produkcia polypeptidu vo vhodnej homológnej alebo heterológnej hostiteľskej bunke. Homológnou hostiteľskou bunkou je hostiteľská bunka, ktorá je z toho istého druhu, alebo ktorá je variantom v rámci toho istého druhu, akým je druh, z ktorého pochádza sekvencia DNA.

Vhodnými hostiteľskými bunkami sú výhodne prokaryotické mikroorganizmy ako napríklad baktérie alebo výhodnejšie eukaryotické organizmy, napríklad huby, ako aj kvasinky alebo vláknité huby, alebo rastlinné bunky. Vo všeobecnosti sa uprednostňujú kvasinkové bunky pred bunkami húb, pretože sa s nimi dá ľahšie manipulovať. Niektoré proteíny sa ale buď ťažko sekretujú z kvasiniek, alebo v niektorých prípadoch sa nedajú vhodne spracovať (napr. hyperglykozylácia v kvasinkách). V týchto prípadoch by sa mal zvoliť hostiteľský organizmus z húb.

Hostiteľská bunka môže nadmerne exprimovať polypeptid pomocou techník genetickej manipulácie pre nadmernú expresiu, ktoré sú dobre známe³. Hostiteľ môže mať takto dve alebo viac kópií kódujúceho polynukleotidu (a vektor môže mať taktiež dve alebo viac kópií).

Baktérie rodu Bacillus sú veľmi vhodnými heterológnymi hostiteľmi preto, že sú schopné sekretovať proteíny do kultivačného média. Ďalšími vhodnými hostiteľmi sú baktérie z rodov Streptomyces a Pseudomonas.

Výhodnou kvasinkovou hostiteľskou bunkou na expresiu sekvencie DNA kódujúcej polypeptid sú rody

Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia a Schizosaccharomyces. Výhodnejšie je kvasinková hostiteľská bunka zvolená zo skupiny pozostávajúcej z druhov Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (známeho tiež ako Kluyveromyces marxianus, odr. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica a Schizosaccharomyces pombe.

Najvýhodnejšie sú ale hostiteľské bunky húb (napr. vláknitých). Výhodné hostiteľské bunky vláknitých húb sú zvolené zo skupiny pozostávajúcej z rodov Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum. Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia a Talaromyces. Výhodnejšie hostiteľské bunky vláknitých húb sú druhy Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans alebo druh Aspergillus niger Group²³. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené len na Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae a Aspergillus ficuum a ďalšie pozostávajúce z druhov Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum a Thielavia terrestris. Príkladmi výhodných expresných hostiteľov, ktorí patria do rozsahu predloženého vynálezu sú huby, ako napríklad huby druhu Aspergillus²⁴’²⁵ a druhu Trichoderma·, baktérie ako napríklad druhu Bacillus²⁶' ²⁷, napr. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, druhu Pseudomonas·, a kvasinky ako napríklad kvasinky druhu Kluyveromyces²⁸, napr. Kluyveromyces lactis²⁹ a Saccharomyces cerevisiae.

Hostiteľskými bunkami podľa tohto vynálezu môžu byť rastlinné bunky a vynález sa preto rozširuje na transgénne organizmy ako rastliny a časti z nich, ktoré obsahujú jednu alebo viac buniek podľa tohto vynálezu. Bunky môžu heterológne exprimovať polypeptid podľa tohto vynálezu alebo môžu heterológne obsahovať jeden alebo viac polynukleotidov podľa tohto vynálezu. Transgénna (alebo geneticky modifikovaná) rastlina môže preto začleniť (napr. stabilne) do svojho genómu sekvenciu kódujúcu jeden alebo viac polypeptidov podľa tohto vynálezu. Transformácia rastlinných buniek sa môže uskutočniť použitím známych techník, napríklad použitím Ti alebo Ri plazmidu z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid (alebo vektor) môže takto obsahovať sekvencie potrebné na infikovanie rastliny a použiť sa môžu deriváty Ti a/alebo Ri plazmidov.

Alternatívne môže priama infekcia ovplyvniť časti rastliny, ako napríklad list, koreň alebo stopku. Pri tejto technike sa môže rastlina, ktorá má byť infikovaná, poraniť, napríklad narezaním rastliny so žiletkou alebo prepichnutím rastliny ihlou alebo odieraním rastliny brusivom. Rana sa potom inokuluje s Agrobacterium. Rastlina alebo časť rastliny sa potom pestujú na vhodnom kultivačnom médiu a nechajú sa vyvinúť. Regenerácia transformovaných buniek do geneticky modifikovaných rastlín sa dá dosiahnuť použitím známych techník, napríklad pomocou selekcie transformovaných výhonkov použitím antibiotika a subkultivovaných výhonkov na médiu, ktoré obsahuje príslušné živiny, rastlinné hormóny a podobne¹⁷.

Kultivácia hostiteľských buniek a rekombinantná produkcia

Vynález tiež zahŕňa bunky, ktoré boli modifikované na účely exprimovania xylanázy alebo jej variantov. Takéto bunky zahŕňajú nestále alebo výhodne trvalé bunkové línie vyšších eukaryotických buniek, ako napríklad cicavčie bunky alebo bunky hmyzu, nižšie eukaryotické bunky, ako napríklad kvasinkové bunky a bunky (vláknitých) húb alebo prokaryotické bunky ako napríklad bakteriálne bunky.

Existuje tiež možnosť, že proteíny podľa tohto vynálezu sú prechodne exprimované v bunkovej línii alebo na membráne, ako napríklad v expresnom systéme bakulovírusov. Takéto systémy, ktoré sú adaptované na exprimovanie proteínov podľa tohto vynálezu, patria tiež do rozsahu predloženého vynálezu.

Podľa predloženého vynálezu môže byť produkcia polypeptidu podľa tohto vynálezu ovplyvnená kultiváciou mikrobiálnych expresných hostiteľov, ktoré sú transformované s jedným alebo viacerými polynukleotidmi podľa predloženého vynálezu, a to v obvyklom fermentačnom živnom médiu.

Na kultiváciu rekombinantných hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu sa môžu použiť postupy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Pre každú kombináciu promótora a hostiteľskej bunky sú dostupné podmienky kultivácie, ktoré napomáhajú exprimovať sekvenciu DNA kódujúcu polypeptid. Po dosiahnutí požadovanej bunkovej hustoty alebo titra polypeptidu sa kultivácia zastaví a polypeptid sa získa pomocou známych metód.

Fermentačné médium môže zahŕňať známe kultivačné médium obsahujúce zdroj uhlíka (napr. glukózu, maltózu, melasu atď.), zdroj dusíka (napr. síran amónny, dusičnan amónny, chlorid amónny atď.), zdroj organického dusíka (napr. kvasinkový extrakt, sladový extrakt, peptón atď.) a anorganické zdroje živín (napr. fosfát, horčík, draslík, zinok, železo atď.). Prípadne môže byť zahrnutý induktor (napr. celulóza, pektín, maltóza, maltodextrín alebo xylogalakturonan).

Selekcia vhodného média závisí od výberu expresného hostiteľa a/alebo závisí od podmienok regulácie expresného konštruktu. Takéto média sú dobre známe odborníkom skúseným v danej oblasti techniky. Médium môže, ak treba, obsahovať pomocné zložky, ktoré chránia transformovaných expresných hostiteľov pred inými potenciálne kontaminujúcimi mikroorganizmami.

SK 288130 Β6

Fermentácia môže trvať 0,5 - 30 dní. Fermentačnú metóda môže byť vsádzková (batch), kontinuálna alebo vsádzková s pridávaním (fed-batch), a to pri teplote v rozmedzí medzi 0 °C a 45 °C a napríklad pri pH medzi 2 a 10. Výhodné fermentačné podmienky sú pri teplote v rozmedzí medzi 20 a 37 °C a/alebo pH medzi 3 a 9. Vhodné podmienky sa obvykle zvolia na základe výberu expresného hostiteľa a proteínu, ktorý sa má exprimovať.

Po fermentácii sa môžu bunky, ak je to potrebné, odstrániť z fermentačného média pomocou centrifugácie alebo filtrácie. Po zastavení fermentácie alebo po odstránení buniek sa môže polypeptid podľa tohto vynálezu potom získať a ak je to požadované, purifikovať a izolovať obvyklými metódami.

D. Použitie xylanáz a spôsoby spracovania rastlinných alebo celulózových (napr. xylán obsahujúcich) materiálov

Polypeptidy podľa tohto vynálezu, ktoré majú xylanázovú aktivitu, sa môžu použiť na úpravu materiálov, týkajúcich sa húb alebo rastlinných materiálov vrátane rastlinnej pulpy a rastlinných extraktov. Napríklad sa môžu použiť na úpravu obilnín, zeleniny, ovocia alebo extraktov z nich. Obvykle sa polypeptid podľa tohto vynálezu kombinuje s vhodnými (pevnými alebo kvapalnými) nosičmi alebo rozpúšťadlami vrátane tlmivých roztokov pri produkcii kompozície/enzýmového preparátu. Polypeptid môže byť pripojený k nosiču alebo zmiešaný s nosičom, napr. imobilizovaný na pevný nosič. Predložený vynález teda sa ďalej týka kompozície, ktorá zahŕňa polypeptid podľa tohto vynálezu. Polypeptid môže mať tvar vhodný na balenie, transport a/alebo uskladnenie, výhodne taký, aby sa xylanázová aktivita zachovala. Kompozíciami môžu byť pasta, kvapalina, emulzia, prášok, vločka, granulát, peleta alebo iné extrudované formy.

Kompozícia môže ďalej obsahovať prídavné zložky ako napríklad jeden alebo viac enzýmov, napríklad pektinázy vrátane endoarabinanázy a ramnogalakturonázy, celuláz, (rôznych) xylanáz, galakturonáz, mananáz a/alebo xyloglukanáz. Polypeptid je typicky stabilne formulovaný buď do kvapalného alebo suchého stavu. Typicky sa produkt zostavuje ako kompozícia, ktorá môže prípadne obsahovať napríklad stabilizačné tlmivé roztoky a/alebo konzervačné látky. Kompozície môžu tiež obsahovať ďalšie enzýmy, ktoré sú schopné natráviť rastlinný materiál alebo celulózu, napríklad iné celulázy, napr. β-D-jglukanázy. Na určité aplikácie sa uprednostňuje imobilizácia enzýmu na pevnú matricu alebo inkorporácia na alebo do pevných častíc nosiča. Kompozícia môže tiež obsahovať mnoho ďalších enzýmov degradujúcich rastlinný materiál, napríklad celulázy a iné pektinázy.

Polypeptidy a kompozície podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť pri spôsobe spracovania rastlinného materiálu degradáciou alebo modifikáciou celulózových zložiek (napr. xylánu) bunkových stien rastlinného materiálu a materiálu týkajúceho sa húb. Predložený vynález sa preto ďalej týka spôsobu degradácie a modifikácie rastlinnej bunky, pričom spôsob zahŕňa i kontaktovanie rastlinnej bunky alebo bunky húb s polypeptidom alebo kompozíciou podľa tohto vynálezu.

Vynález sa tiež týka spôsobu úpravy rastlinného materiálu, pričom spôsob zahŕňa kontaktovanie rastlinného materiálu s polypeptidom alebo kompozíciou podľa tohto vynálezu na degradáciu alebo modifikáciu celulózového (rastlinného) materiálu. Výhodne je rastlinným materiálom rastlinná pulpa alebo rastlinný extrakt ako napríklad šťavy.

Predovšetkým výhodne zahŕňa degradácia štiepenie xylánových podjednotiek celulózovej zložky steny rastlinnej bunky. Rastlinným materiálom sú výhodne obilniny, zelenina, ovocie alebo zeleninová alebo ovocná pulpa alebo extrakt. Predložený vynález ďalej poskytuje upravený rastlinný materiál získateľný pomocou kontaktovania rastlinného materiálu s polypeptidom alebo kompozíciou podľa tohto vynálezu.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu redukovania viskozity rastlinného extraktu, pričom spôsob zahŕňa kontaktovanie rastlinného extraktu s polypeptidom alebo kompozíciou podľa tohto vynálezu v takom rozsahu, ktorý je potrebný na degradáciu celulózy (alebo xylánu) nachádzajúcej sa v rastlinnom extrakte.

Do rastlinných materiálov a materiálov obsahujúcich celulózu sú zahrnuté rastlinná pulpa časti rastlín a rastlinné extrakty. V rámci tohto vynálezu je extraktom z rastlinného materiálu akákoľvek látka, ktorá sa dá získať z rastlinného materiálu extrakciou (mechanickou a/alebo chemickou), spracovaním alebo inými technikami separácie. Extraktom môže byť šťava, nektár, základ alebo koncentráty vyrobené z nich. Rastlinný materiál môže zahŕňať alebo môže byť odvodený zo zeleniny, napr. mrkvy, zeleru, cibuľky, strukovín alebo strukovinových rastlín (sóje, sójového bôbu, hrachu) alebo ovocia napr. malvice alebo semena rastlín (jabĺk, hrušiek, dule atď.), hrozna, paradajok, citrusov (pomaranč, citrón, limeta, mandarínka), melóny, slivky, čerešne, čierne ríbezle, červené ríbezle, maliny, jahody, brusnice, ananás a ďalšie tropické ovocie, stromy a časti z nich (napr. peľ z borovíc), alebo obilniny (ovos, jačmeň, pšenica, kukurica, ryža). Materiálom, (ktorý sa má hydrolyzovať), môžu byť tiež poľnohospodárske zvyšky ako napríklad repné rezky, kukuričné šúľky, pšeničná slama, (mleté) orechové škrupiny alebo recyklovateľné materiály napríklad (odpadový) papier.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu teda použiť na úpravu rastlinného materiálu vrátane rastlinnej pulpy a rastlinných extraktov. Tak isto sa môžu použiť na spracovanie tekutých alebo pevných potravín alebo zložiek požívatín, alebo sa môže použiť pri extrakcii kávy, rastlinných olejov, škrobu alebo ako zahusťovač potravín.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa typicky používajú ako kompozícia/enzýmový preparát ako sa opísalo v predchádzajúcom texte. Kompozícia sa obvykle pridáva k rastlinnej pulpe, ktorá sa dá získať napríklad pomocou takého mechanického spracovania ako drvenia alebo mletia rastlinného materiálu. Inkubácia kompozície s rastlinou sa typicky uskutočňuje od 10 minút do 5 hodín, napríklad 30 minút až 2 hodiny, výhodne asi 1 hodinu. Teplota spracovania je výhodne 10 - 55 °C, napr. od 15 do 25 °C, optimálne asi 20 °C a môže sa použiť 10 - 300 g, výhodne 30 - 70 g, optimálne asi 50 g enzýmu na tonu materiálu, ktorý sa má spracovať. Každý použitý enzým(y) alebo ich kompozície sa môžu pridávať postupne alebo naraz k rastlinnej pulpe. V závislosti od zloženia enzýmového preparátu sa rastlinný materiál môže najprv macerovať (napr. na kašu) alebo skvapalniť. Použitím polypeptidov podľa tohto vynálezu sa môžu také parametre spracovania ako výťažok extrakcie, viskozita extraktu a/alebo kvalita extraktu zlepšiť.

Alternatívne, alebo okrem uvedeného, sa polypeptid podľa tohto vynálezu môže pridať k surovej šťave získanej lisovaním alebo skvapalňovaním rastlinnej pulpy. Čo sa týka dávkovania, teploty a dĺžky stabilizácie sa spracovanie surovej šťavy uskutočňuje rovnakým spôsobom ako s rastlinnou pulpou. Okrem uvedených enzýmov sa opäť môžu zahrnúť ďalšie enzýmy. Typické podmienky inkubácie sú opísané v predchádzajúcom odseku. Ihneď po inkubácii surovej šťavy s polypeptidom podľa tohto vynálezu sa šťava odstreďovala alebo (ultra) filtrovala, aby sa získal konečný produkt.

Po spracovaní s polypeptidom podľa tohto vynálezu sa (konečný) produkt môže tepelne spracovať, napr. pri 100 °C, pričom sa zvolia podmienky tak, aby sa v čase od 1 minúty až do 1 hodiny čiastočne alebo úplne inaktivoval(i) polypeptid(y) podľa tohto vynálezu.

Kompozícia obsahujúca polypeptid podľa tohto vynálezu sa dá tiež použiť počas prípravy ovocných alebo zeleninových kaší.

Polypeptid podľa tohto vynálezu sa tiež dá použiť v pivovarníctve, vinárstve, destilácii alebo pekárstve. Preto sa môžu použiť pri preparácii takých alkoholických nápojov ako vína a piva. Napríklad môže vylepšovať filtrovateľnosť alebo čírosť (pív, mladého vína alebo vína). Proteín môže napomáhať pri odstraňovaní rozpustených organických látok zo živnej pôdy alebo kultivačných médií, napríklad keď destilačný odpad organického pôvodu sa biokonvertuje do mikrobiálnej biomasy. Xylanáza môže vylepšovať filtrovateľnosť a/alebo redukovať viskozitu v glukózových sirupoch, napríklad v sirupoch z obilnín produkovaných skvapalňovaním (napr. s a-amylázou).

V pekárstve môže polypeptid vylepšovať štruktúru cesta, modifikovať jeho lepivosť alebo vláčnosť, vylepšovať objem bochníka a/alebo štruktúru striedky alebo dodávať lepšie textúrové vlastnosti ako napríklad lomivosť, drobivosť alebo kvalitu striedky. Polypeptid sa môže dodávať v množstve od 100 do 3000 EXU/kg múky, napríklad od 150 do 2000 EXU/kg múky, optimálne od 200 do 1600 EXU/kg múky.

Polypeptidy našli uplatnenie v mnohých priemyselných odvetviach vďaka svojej xylanázovej aktivite. Uplatňujú sa nielen pri produkcii alkoholu, ale tiež pri biometanizácii, výrobe chleba a v pekárstve, zubnej hygiene (napríklad zubných alebo ústnych kompozíciách), pri spracovaní alebo výrobe kože, pri výrobe papiera, liečiv, čaju, pri preparácii alebo spracovaní textilu a spracovaní odpadu. Vynález sa preto týka potravín alebo požívatín, zahŕňajúcich polypeptid, ako napríklad alkoholického nápoja, chleba, cesta alebo čaju. Polypeptid sa môže formulovať do vhodných kompozícií pre ktorékoľvek z týchto použití. Polypeptid sa môže nachádzať vo vodnej zložke (napr. horúca voda), výhodne s jedným alebo viacerými fúngicídmi, aby sa mohol spracovať rastlinný materiál (napr. hľuzy), zvlášť v rámci boja proti cudzopasnému hmyzu, roztočom a hlístam. Pretože polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu degradovať xylán, môžu sa pridávať k potravinám alebo požívatinám (napríklad určených na konzumovanie pre ľudí). Vynález sa tiež týka farmaceutických a veterinárnych kompozícií, ktoré obsahujú polypeptid podľa tohto vynálezu a farmaceutický a veterinárne akceptovateľných nosičov.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu tiež vykazovať fúngicídne účinky. Môžu byť schopné degradovať bunkové steny húb a môžu sa teda upotrebiť pri lýze bunkovej steny húb, aby sa narušili bunky, čím sa uvoľnia intraceluláme proteíny. Takýmto spôsobom sa polypeptidy môžu použiť na preparáciu kvasinkových extraktov a/alebo extraktov húb.

E. Kŕmenie zvierat

Vynález sa ďalej týka požívatín alebo kŕmnych zmesí alebo doplnkov zahŕňajúcich jeden alebo viac polypeptidov podľa tohto vynálezu. Polypeptid môže byť prítomný v krmive v inej koncentrácii, než v akej sa prirodzene vyskytuje. Výhodný je jeho obsah od 0,6 do 35 mg na kg krmiva, ako napríklad 1,5 až 15 mg na kg krmiva, výhodne 3 až 15 mg na kg krmiva. Výhodne je obsah polypeptidu podľa tohto vynálezu v krmive od 1000 do 50000 EXU/kg krmiva, ako napríklad 2500 až 25000EXU/kg krmiva, optimálne od 5000 do 20000 EXU/kg.

Vynález sa tiež týka spôsobu preparácie kŕmnej zmesi polypeptidom podľa tohto vynálezu, spôsobu zahrnujúceho pridávanie jednej alebo viacerých jedlých substancií(e) do krmív alebo prísad(y), výhodne obsahujúcich xylán. Polypeptidy sa môžu pridať ku kŕmnej zmesi samostatne, nie s kŕmnymi látkami alebo prísadami; za sebou alebo v kombinácii s inými kŕmnymi prísadami. Polypeptid môže byť integrálnou časťou jed15

SK 288130 Β6 nej z kŕmnych substancií alebo prísad.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu tiež pridať ku kŕmnym zmesiam s vysokým obsahom celulózy, čím sa vylepší rozklad rastlinnej bunkovej steny, čo umožňuje zvieraťu lepšie využiť rastlinné živiny. Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu pridať ku krmivu alebo siláži, ak sa uprednostňujú vopred namáčané alebo navlhčené kŕmne dávky. Výhodne môžu polypeptidy podľa tohto vynálezu kontinuálne degradovať celulózu v krmive in vivo. Polypeptidy podľa tohto vynálezu na báze húb majú vo všeobecnosti predovšetkým nižšie pH optimá a sú schopné uvoľňovať dôležité živiny v kyslom prostredí ako napríklad v žalúdku zvierat. Predmetom vynálezu sú tiež krmivá (napr. pre zvieratá) alebo požívatiny obsahujúce jeden alebo viac polypeptidov podľa tohto vynálezu.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri produkcii mliečnych substitútov (alebo náhradok) zo sóje. Mliečne náhradky môžu konzumovať ľudia i zvieratá. Typickým problémom pri preparácii týchto mliečnych náhradok je vysoká viskozita sójovej suspenzie, čo vyvoláva nutnosť neželateľne zriediť suspenziu na 10 až 15 % koncentráciu sušiny. Enzýmový preparát obsahujúci polypeptid podľa tohto vynálezu sa môže pridať k suspenzii alebo počas spracovania suspenzie, čo umožňuje spracovanie pri vyššej (typicky pri 40 až 50 %) sušine. Enzým sa môže tiež použiť na preparáciu produktu(ov) upravujúceho(ich) chuť, napr. zo sóje.

Kompozícia môže ďalej zahŕňať (predovšetkým, ak sa zostavovala na kŕmenie zvierat) jeden alebo viac ionofórov, oxidačných činidiel, povrchovoaktívnych činidiel, bachor ochraňujúce aminokyseliny, enzýmových zosilňovačov alebo enzýmy, ktoré sa môžu prirodzene produkovať v gastrointestinálnom trakte zvierat, ktoré sa majú kŕmiť.

Ak sa pridáva ku krmivám (vrátane siláže) pre prežúvavce alebo monogastrické zvieratá (napr. hydina a ošípané) krmivá môžu obsahovať také obilniny ako jačmeň, pšenicu, kukuricu, raž, alebo ovos alebo obilné vedľajšie produkty ako napríklad pšeničné otruby alebo kukuričné otruby, alebo rastlinné materiály ako napríklad sóju a iné strukoviny. Enzým(y) môžu signifikantne zvýšiť rozrušenie rastlinných bunkových stien, čo vedie k lepšiemu využitiu rastlinných živín zvieraťom. Môže to viesť k zvýšenej rýchlosti rastu a/alebo konverzii krmiva. Polypeptidy podľa tohto vynálezu sa môžu pridať do krmiva (priamo alebo ako prídavok alebo prísada) alebo namiesto toho sa môže pridať polypeptidom spracovaná kŕmna prísada (napr. celulóza/xylán).

Proteín môže redukovať viskozitu krmiva (obsahujúceho xylán): proteín môže pokračovať v hydrolyzovaní xylánu in vivo. Proteíny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým aplikovateľné do krmív pre zvieratá, pretože môžu byť stále aktívne vo veľmi kyslom prostredí, aké je v žalúdku zvierat.

Predovšetkým výhodný spôsob na (exogénny) prídavok modifikovanej xylanázy je pridávanie polypeptidu podľa tohto vynálezu ako transgénneho rastlinného materiálu a/alebo (napr. transgénneho) semena. Polypeptidy môžu byť takto syntetizované pomocou heterológnej génovej expresie, napríklad sa môže gén, kódujúci požadovaný enzým klonovať do rastlinného expresného vektora, a to pri riadení vhodnými rastlinnými expresnými signálmi, napr. tkanivovo-špecifickým promótorom, ako napríklad špecifickým promótorom zo semien. Expresný vektor obsahujúci gén kódujúci polypeptid sa môže potom transformovať do rastlinných buniek, a transformované bunky sa môžu selektovať na základe regenerácie v celých rastlinách. Takto získané transgénne rastliny sa môžu pestovať a zberať a tie časti rastlín, ktoré obsahujú heterológny (vzhľadom na rastlinu) polypeptid, sa môžu zahrnúť v jednej z kompozícií buď samotné, alebo po ďalšom spracovaní. Obvyklé metódy (heterológnej) expresie enzýmov v (transgénnych) rastlinách vrátane spôsobov špecifickej expresie enzýmov v semenách sú známe³⁰. Heterológny polypeptid sa môže nachádzať v semene transgénnych rastlín alebo sa môže nachádzať v iných rastlinných častiach ako napríklad v koreňoch, steblách, listoch, dreve, kvetoch, kôre a/alebo plode. Rastlina môže byť jednoklíčnolistovou alebo dvojklíčnolistovou. Vhodnými rastlinami môžu byť obilniny, ako napríklad ovos, jačmeň, pšenica, kukurica a ryža. Výhodne polynukleotid podľa tohto vynálezu je natrvalo začlenený do genómu rastliny.

Prídavok polypeptidu vo forme transgénneho rastlinného materiálu, napr. trasgénne semeno, môže vyžadovať spracovanie rastlinného materiálu tak, aby sa enzým stal dostupným, alebo aby jeho dostupnosť bola prinajmenšom zlepšená. Takéto techniky spracovania môžu zahŕňať rôzne mechanické (napr. mletie a/alebo drvenie) alebo termomechanické spracovania ako napríklad extrúziu alebo expanziu.

Predložený vynález sa tiež týka spôsobu podporovania rastu a/alebo konverzie krmiva pre monogastrické zvieratá alebo neprežúvavce, pričom spôsob zahŕňa kŕmenie zvierat polypeptidom podľa tohto vynálezu. Vhodnými zvieratami sú hospodárske zvieratá, monogastrické zvieratá a/alebo neprežúvavce ako napríklad ošípané (prasiatka), hydina (ako napríklad kurčatá, morky), teľatá alebo teliatka alebo vodné (napr. morské) živočíchy (napríklad ryby).

Skúšky stanovenia aktivity enzýmov degradujúcich celulózu

Do rozsahu predloženého vynálezu patrí tiež použitie polypeptidov podľa tohto vynálezu na skríningové spôsoby identifikácie zlúčenín, ktoré môžu pôsobiť agonisticky alebo antagonistický, a ktoré môžu modulovať xylanázu. Vo všeobecnosti môžu takéto skríningové spôsoby zahŕňať kontaktovanie polypeptidu podľa

SK 288130 Β6 tohto vynálezu s testovanou zložkou a potom meranie aktivity alebo inkubovanie polypeptidu podľa tohto vynálezu s testovanou látkou a potom detegovanie akejkoľvek modulácie xylanázovej aktivity. Činidlá, ktoré sa viažu s polypeptidom podľa predloženého vynálezu sa dajú tiež identifikovať pomocou väzobných skúšok.

Modulátorová aktivita sa môže stanoviť pomocou kontaktovania buniek, ktoré exprimujú polypeptid podľa tohto vynálezu s látkou, ktorá je predmetom záujmu a monitorovaním vplyvu pôsobenia polypeptidov. Bunky môžu exprimovať polypeptid in vitro a výhodne sa skúška uskutočňuje in vitro, použitím buniek exprimujúcich rekombinantný polypeptid.

Skúšky a substráty opísané v tomto dokumente umožňujú identifikáciu a potvrdenie xylanázovej aktivity. Tieto skúšky sa môžu použiť na detegovanie ďalších enzýmov degradujúcich celulózu, napríklad enzýmov so xylanázovou aktivitou. Substrát, ktorý sa môže použiť na túto skúšku môže zahŕňať xylán.

Vynález sa ďalej týka skúšky na identifikovanie alebo detegovanie polypeptidu, ktorý je schopný degradovať celulózu. Aktivitou môže byť xylanáza alebo to môže byť pektínová lyáza, polygalakturonáza, esteráza, celuláza, xyloglukanáza, galaktonáza, arabinanáza alebo ramnogalakturonáza. Skúška sa môže týkať:

(a) poskytovania vhodného substrátu, napríklad substrátu pre kandidujúcu zložku (obvykle polypeptid), (ako sa opísalo); a (b) kontaktovania substrátu s kandidujúcou zložkou a detegovania produkcie akéhokoľvek produktu xylanázovej aktivity.

Uvedené skúšky sa môžu využiť na identifikovanie modulátorov xylanázovej aktivity. Takéto zlúčeniny môžu redukovať mäknutie ovocia, čím sa umožní lepší vývoj chuti a farby ovocia a tiež sa predĺži trvanlivosť a/alebo prepravný čas. Preto sa tieto skúšky môžu použiť na identifikáciu inhibítorov polypeptidov podľa tohto vynálezu, ktoré sú schopné inhibovať mäknutie ovocia.

Výhodné špecifiká a charakteristické znaky jedného uskutočnenia vynálezu sú aplikovateľné na ďalšie uskutočnenia mutatis mutandis.

Vynález je ďalej opísaný formou odkazov na nasledovné príklady, ktoré sú určené len na ilustrovanie a nie sú limitujúce.

Stručný opis sekvencií

SEQ ID No. 1 je sekvencia DNA kódujúca xylanázu podľa tohto vynálezu z Talaromyces emersonii;

SEQ ID No. 2 je amínokyselinová sekvencia xylanázy; a

SEQ ID No. 3 a SEQ ID NO. 4 sú syntetické PCR priméry, ktoré sa hybridizujú so SEQ ID No. 1.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Techniky štandardného molekulárneho klonovania ako napríklad izolácia DNA, gélová elektroforéza, modifikácie nukleových kyselín použitím reštrikčných enzýmov, Southemove analýzy, trasformácia E. coli, presun kolónií a hybridizácie na filtroch atď. sa uskutočnili štandardnými technikami^1,2. Syntetické oligodeoxynukleotidy sa získali od firmy ISOGEN Bioscience (Maarssen, Holandsko). Analýzy sekvencie DNA sa uskutočnili na DNA sekvenátore Applied Biosystems 373A podľa inštrukcií dodávateľa.

Označovanie DNA a hybridizácie sa vykonávali podľa ECL™ priameho označovania nukleovej kyseliny a podľa detekčných systémov (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Anglicko) alebo podľa štandardných techník rádioaktívneho označovania¹.

Príklad 1

Izolácia RNA z T. emersonii a syntéza cDNA

Kmeň T. emersoni CBS 393.64 sa fermentoval v prostredí obsahujúcom xylán. V rôznych časových intervaloch sa mycélium a supematanty kultúry zbierali filtráciou použitím Miracloth filtračného pásu. Mycélium sa dôkladne premylo demineralizovanou vodou a nadbytočná voda sa povytláčala do papierových utierok. Mycélium z určitých zvolených časov (na základe meraní celulázy v supernatantoch kultúry) sa okamžite zmrazilo v kvapalnom dusíku a rozomlelo na jemný prášok v trecej miske použitím tíčika. Získaný prášok sa preniesol do sterilnej 50 ml skúmavky a odvážil sa; na každých 1 - 1,2 g rozomletého mycélia sa pridalo 10 ml činidla TRIzol (Gibco/BRL) (max. 25 ml do každej skúmavky). Prášok mycélia sa ihneď solubilizoval za intenzívneho vírivého miešania (1 min.), potom sa nechal inkubovať 5 minút pri laboratórnej teplote za občasného premiešania. Chloroform sa pridal v 0,2 objeme (vzhľadom na pôvodný objem TRIzol-u) (teda 2 ml na každých pôvodne použitých 10 ml TRIzol-u), zmiešal sa a nechal 10 minút pri teplote miestnosti. Potom sa zmes 30 minút centrifúgovala pri 4 °C a 6000 g. Vrchná vodná fáza sa preniesla do ďalšej skúmavky a celková RNA sa vyzrážala prídavkom 0,5 objemu (z pôvodného objemu TRIzol-u) izopropylalkoholu (teda 5 ml izopropylalkoholu na každých 10 ml pôvodne použitého TRIzol-u). Po 10 minútach zrážania pri laboratórnej teplote sa RNA získala 30 minútovou centrifugáciou pri 6000 g. Supematant sa odstránil a sediment RNA sa premyl jedným objemom 70 % etanolu. Po odstránení etanolu sa sediment RNA vysušil na vzduchu. Vysušený sediment RNA sa rozpustil v 3 ml GTS tlmivého roztoku (100 mM Tris HCI, pH 7,5,

M guanidíntiokyanátu, 0,5 % laurylsarkozinátu sodného). Na stanovenie kvality a koncentrácie nukleových kyselín sa použilo 10 μΐ roztoku RNA.

Uskutočnila sa analýza severných odtlačkov³ a izolovaná RNA sa ďalej purifikovala^1,3. Na izoláciu mRNA sa použil modifikovaný protokol (použitím separácie samospádom namiesto centrifugácie) podľa purifikačného kitu od firmy PHARMACIA (kat. č. 27-9258-02)³. Na syntézu cDNA sa použil kit „cDNA Synthesis KIP‘ od firmy STRATAGENE, a to podľa návodov výrobcu, okrem mnohých optimalizácií na použitie pGBFIN vektorov s významnejšími zmenami, ktoré už boli opísané³.

Množstvo syntetizovanej cDNA sa stanovilo pomocou vyzrážania s TCA a potom sa cDNA analyzovala elektroforeticky v alkalických agarózových géloch³.

Príklad 2

Preparácia knižnice cDNA z mRNA T. emersonii

Hotovosť (pool) cDNA, ktorá sa získala v príklade 1, sa klonovala „tupými koncami“, ligovala s adaptormi a natrávila pomocou reštrikčných enzýmov³.

Klonovanie cDNA do expresného vektora pGBFIN-11³ vyžaduje prítomnosť £coRI miesta na 5'-konci aXhoi miesta na 3'-konci cDNA. Preto sa najprv zvolilo vlákno oligonukleotidu používaného ako primér a adaptorové sekvencie (Pharmacia), aby sa splnil predpoklad na usporiadanie expresného vektora.

Získané cDNA sa separovali fŕakcionáciou na základe ich veľkosti cez sefarózovú matricu CL-2B, pričom frakcionované individuálne veľkosti cDNA sa analyzovali nedenaturujúcou gélovou elektroforézou³. Na skonštruovanie cDNA knižnice vo vektore pGBFIN-Ι 1 sa dve veľkosti cDNA získali vyrezaním 0,5 kb a 1,0 kb. Na pGBFIN-Ι 1 sa pripravila hotovosť tohto vektora, celkom dvojnásobne netráveného (£coRI - Xhol), (ligácia pozadia < 1 %). Selektované hotovosti cDNA sa ligovali do pGBFNll vektora a transformovali do E. coli XLIO-Gold bakteriálnych buniek, aby sa vytvorili dve primáme cDNA knižnice Transformačné frekvencie obidvoch hotovostí cDNA boli > 1,0 x 10⁶.

Z frakcií obidvoch E. coli cDNA knižníc sa náhodne selektovali kolónie a izolovala sa plazmidová DNA. Analýzou tejto plazmidovej DNA sa ukázalo, že inzercia v obidvoch DNA knižniciach bola medzi 90 až 95 %.

Okrem toho sa uskutočnil presun kolónií z frakcie knižnice a vytvorené filtre sa potom hybridizovali s T. emersom gpdA génom kódujúcim glyceraldehyd-3-fostátdehydrogenázu. V ďalšom sa DNA izolovala a prostredníctvom reštrikčnej analýzy sa ukázalo, že všetky plazmidy obsahujú samostatné inzerty v správnej orientácii. Sekvenovaním 5-koncov cDNA v rámci plazmidov obsahujúcich T. emersoni gpdA. sa ukázalo, že >85 % malo úplnú dĺžku.

Príklad 3

Transformácia expresnej knižnice do A. niger

Z knižnice cDNA E. coli sa izolovala DNA podľa opisu uvedeného v predchádzajúcom texte. Celková plazmidová DNA sa natrávila 4 hodiny pri 37 °C s Not\, aby sa odstránili plazmidové sekvencie pochádzajúce z E. coli. Po purifikácii sa DNA rozpustila v sterilnej demineralizovanej vode.

Na mnohonásobné transformácie A. niger DS2978³ sa použilo 1,5 x 10⁷ až 3,0 x 10⁷ protoplastov alO pg plazmidovej DNA na každú transformáciu. Transformanty sa selektovali podľa prítomnosti amdS selekčného markera pomocou rastu na acetamide ako jedinom zdroji dusíka. Pretože aj selekčný marker amdS aj expresná kazeta cDNA sa nachádzajú na integrujúcom sa fragmente, ktorý rástol na acetamide, poukazuje to na prítomnosť cDNA expresnej kazety.

Asi po 7 - 10 dňovej inkubácii pri 30 °C sa purifikovalo 10000 transformantov; transformanty Aspergillus niger sa transferovali automaticky (automatom na zbieranie kolónií Flexys™) z transformačných platní na 96 sond MTP Master Plates (MP) obsahujúcich 150 μΐ dobre stuhnutého selektívneho média (SM) (obsahujúceho na 1000 ml: 0,52 g KCI, 1,52 g K₂ HPO₄, 0,52 g MgSO_4> 20 g glukózy, 1 g acetamidu, 0,1 M MES tlmivého roztoku, 15 g agaru, 1 ml roztoku stopových prvkov (obsahujúceho na jeden liter: 2,2 g ZnSO₄ x 7 H₂O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO₄ x 7 H₂O, 0,17 g COCI₂ x 6 H₂O, 0,16 g CuSO₄ x 5 H₂O, 0,15 g NaMoO₄ x 2 H₂O, 5,0 g EDTA, pH 6,5)) pH 5,5. Transformanty sa pestovali na selektívnom médiu SM 5 dní pri 34 °C. Takto vytvorený súbor MP platní sa použil na inokulovanie platní MTP na pestovanie a nasledujúcu enzýmovú detekciu a na nazhromaždenie platní (BP) knižnice cDNA, ktoré sa skladovali pri -80 °C.

Príklad 4

Analýza expresnej knižnice T. emersonii

Ako replikačná matrica sa použili 5-dňové platne MP a replika plátovaná na ďalšie platne selektívneho média (SM), ktoré obsahujú 0,075 % AZCL-xylánu (obsahujúceho na jeden liter: 0,52 g KCI, 1,52 g K₂ HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g glukózy, 1 g acetamidu, 0,1 M MES tlmivého roztoku, 15 g agaru, 1 ml roztoku stopových prvkov (obsahujúceho na jeden liter: 2,2 g ZnSO₄ x 7 H₂O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO₄ x 7 H₂O,

SK 288130 Β6

0,17 g COCI₂ x 6 H₂O, 0,16 g CuSO₄ x 5 H₂O, 0,15 g NaMoO₄ x 2 H₂O, 5,0 g EDTA, pH 6,5)) pH 5,5,

0,75 g AZCL-xylán (Megazyme, Austrália).

Ihneď inokulované platne sa inkubovali pri 34 °C 48 hodín a potom 6 hodín pri 65 °C. Platne sa vyhodnotili pred inkubáciou a po inkubácií pri vysokej teplote. Pozitívne kolónie vykazovali xylanázovú aktivitu prejavujúcu sa modrým difúznym halo.

Klony s pozitívnou xylanázovou aktivitou z tohto prvého skríningu sa reinokulovali na ďalšie SM médium a pestovali 5 dní pri 34 °C. Takto získaná matricová platňa sa potom replikovala na selektívnom médiu a na selektívnom médiu obsahujúcom 0,075 % (hmotnosť/objem) AZCL-xylán (Megazyme). S AZCL-xylánovou platňou sa postupovalo podľa už opísaného postupu.

Platne SM sa inkubovali 48 hodín pri 34 °C a potom sa plne naplnili agarom, obsahujúcim xylán z ovseného ostria (5 g agarózy, 0,5 g xylánu z ovseného ostria (Sigma kat. é. X0627)), pripraveným do jedného litra 50 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 7). Vrchný agar ihneď stuhol a plame sa nechali 4 hodiny pri 65 °C. Na vizualizáciu aktivity sa platne vyfarbovali s roztokom červene Kongo (10 g červene Kongo na jeden liter fosfátového tlmivého roztoku, pH 7,0) 15 minút. Vyfarbovací roztok sa odhodil a platne sa premyli 1 M NaCl. Tento premývací krok sa opakoval dvakrát. Pozitívne klony sa identifikovali podľa halo, ktoré sa prejavilo zblednutím na červenom (Kongo) pozadí. Nakoniec sa identifikovalo 9 kmeňov s pozitívnou xylanázovou aktivitou.

Transformanty Aspergillus produkujúce xylanázu sa identifikovali pomocou platňovej xylanázovej skúšky a pestovali sa fermentáciou v trepačkových bankách³. Vzorky média sa odobrali po 5 dňoch fermentácie a analyzovala sa v nich xylanázová aktivita, ako sa uvádza v ďalšom texte.

Supematant (ak je potrebné vopred nariedený) sa päťkrát zriedil 0,25 M acetátovým tlmivým roztokom, pH 4,5. Nariedený supematant v množstve 20 μΐ sa transferoval na mikrotitračné platne a 50 μΐ substrátu (4 % (hmotnosť/objem) RBB-Xylánu („Remazol Brilliant Blue“) (rozpusteného pri 70 °C v demineralizovanej vode)) sa pridalo a dôkladne zmixovalo pipetovaním hore a dolu. Reakčná zmes sa inkubovala 30 minút pri teplote miestnosti. Reakcia sa zastavila pomocou prídavku 200 μΐ 96 % etanolu a 10 minútovou inkubáciou pri teplote miestnosti. Po ukončení reakcie sa mikrotitračné platne centrifugovali 10 minút pri 2500 otáčkach za minútu v centrifúge Beckman GPK pri teplote miestnosti. Na nový mikrotitračný tanier sa transfere valo 100 μΐ supematantu a absorbancia modrej farby sa merala spektrofotometricky pri 620 nm na prístroji Anthosreader (Protón and Wilton). Špecifická aktivita sa vypočítala z kalibračnej krivky použitím xylanázového štandardu rozpusteného v 0,25 M tlmivom roztoku acetátu sodného, pH 4,5.

Príklad 5

Genetická analýza pozitívnych transformantov

Pozitívne (opakovane potvrdené) transformanty identifikované v príklade 4 sa pestovali na kvapalnom médiu, mycélium sa zozbieralo a celková (chromozómová) DNA sa izolovala použitím systému Puregene Isolation System (Biozym B. V.) na izoláciu DNA z vláknitých húb. Izolácia a purifikácia DNA sa uskutočnila podľa dodávateľského protokolu, ale s nepatrnou modifikáciou; krok 3 a 4 použitý pri vyzrážaní proteínu sa opakoval.

Chromozómová DNA sa použila ako matrica na PCR reakciu použitím primérov 12207 (SEQ ID No. 4) a 11937 (SEQ ID No. 3), aby sa amplifikoval(i) inzert(y), ktoré sa nachádzajú v expresnej kazete integrovanej do chromozómovej DNA.

Priame polymerázové reťazové reakcie (PCR) sa uskutočnili s transformantami podľa upravenej verzie známeho protokolu⁴, až na to, že získané mycélium sa potom spracovalo s Glucanexom™' (Novo Nordisk) v koncentráciách 5 mg/ml namiesto s NOVOzyme.

Do reakcií PCR sa zahrnul eLONG-ázový™ B tlmivý roztok (Life Technologies, Breda, Holandsko), dNTP (200 pM z každého), 1 μΐ eLONG-ázovej™ enzýmovej zmesi Enzýme Mix, 1 - 5 μΐ matrice a 10 až 30 pmol z každého oligonukleotidu na konečný objem 50 μΐ. Optimálne množstvo oligonukleotidov sa stanovilo experimentálne pre každú zakúpenú sériu. V priemere sa použilo 10 až 30 pmol. Reakcie sa uskutočnili pri nasledovných podmienkach cyklovania: lx (2 min.) 94 °C, 35x (1 mm 94 °C, 1 min. 55 °C, 6 min. 72 °C), lx (7 min. 72 °C). Vzorky sa naniesli na agarózové gély na analýzy PCR produktov.

Takto získaný PCR produkt sa subklonoval do E. coli pcr2.1 klonovacieho vektora (Invitrogén, podľa inštrukcií od dodávateľa), pričom sa získal plazmid pGBXEA-1. Kmeň E. coli prechovávajúci plazmid pGBXEA-1 sa uložil do depozitu v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam, Holandsko pod prístupovým číslom CBS 102183.

Subklonovaný PCR produkt sa sekvenoval. Získaná nukleotidová sekvencia kódujúcej oblasti je uvedená v SEQ ID NO 1 a dedukovaná aminokyselinová sekvencia proteínu SEQ ID NO 2. Tento proteín sa pomenoval XEA.

Príklad 6

Charakterizácia xylanázy Talaroymyces emersonii

Definícia endoxylanázovej jednotky (EXU) pre tento opis patentu

Jednotka xylanázovej aktivity (EXU) je definovaná ako množstvo enzýmu (endo I endo-l,4-p-xylanázy z

Asp. nigrer³¹), ktoré uvoľňuje 4,53 pmol redukujúcich sacharidov (meraných ako xylózové ekvivalenty) za minútu v skúšobných podmienkach. Skúšobné podmienky zahŕňajú: 5 mg/ml arabinoxylánu zo pšeničnej múky (Megazyme, Austrália, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) v 100 mM tlmivom roztoku citrátu sodného (pH 3,5), teplotu 40 °C a reakčný čas 60 minút. Reakcie sa zastavili pomocou prídavku 1 M NaOH. Detekcia sa robila kolorimetricky pri 420 nm po inkubácii vzorky s hexakyanoželezitanom počas 15 minút vo vriacej vode. Hexakyanoželezitanové činidlo sa pripravilo rozpustením 1,17 g „KFe(CN)“ a 19,5 g bezvodého uhličitanu sodného v 1 litri vody.

Viskozimetrická skúška

Okrem vyšše uvedeného absolútneho stanovenia xylanázovej aktivity sa použila príbuzná metóda, ktorá sa zakladá na znížení viskozity roztoku pšeničného arabinoxylánu (Megazyme, Austrália, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) pri prídavku určitého množstva enzýmu. Pšeničný arabinoxylán sa rozpustil v 0,425 M tlmivom roztoku citrátu sodného (pH 3,5) na koncentráciu 8,3 mg/ml. Substrát sa inkuboval pri 55 °C 10 minút. Potom sa pridalo malé množstvo enzýmu (v rozpätí 0,01 - 0,05 jednotiek/ml), aby reakcia mohla prebiehať. Viskozita vzorky sa stanovila po 60 minútovom reakčnom čase, vzhľadom na referenčnú vzorku, ktorá sa inkubovala s Aspergillus niger endoxylanázovým³¹ štandardom so známou EXU aktivitou. Absolútne aktivity v EXU pre štandard sa stanovili metódou stanovenia redukujúcich sacharidov použitím hexakyanoželezitanu, ako sa opísalo v predchádzajúcom texte. Viskozita sa stanovila manuálne použitím Haake prístroja s padajúcou guľôčkou.

Analýza aktivity pomocou redukujúcich sacharidov

Enzýmová aktivita podľa XPU definície sa merala detegovaním redukujúcich sacharidov použitím hydrazidu kyseliny 4-hydroxybenzoovej (PAHBAH). Jedna jednotka XPU aktivity je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré treba na uvoľnenie jedného pmol redukujúcich sacharidov produkovaných za minútu zo pšeničného arabinoxylánu pri pH 5,0 a 60 °C počas 15 minút pri použití kalibračnej krivky na D(+)xylózu. Modifikáciou tejto dobre známej skúšky³² je toto PAHBAH činidlo: 0,05 M citran trojsodný, 0,1 M Na₂SO₃, 0,02 M CaCI₂. 0,5 M NaOH a 0,1 M hydrazid kyseliny p-hydroxybenzoovej (PAHBAH). Konečné pH bolo 12. Činidlo obsahujúce PAHBAH v alkalickom roztoku sa skladovalo pri teplote miestnosti a používalo len jeden deň. Absorbancia sa merala pri 420 nm. Blank sa pripravil pridaním 100 μΐ 0,1 M tlmivého roztoku acetátu sodného namiesto enzýmového roztoku. Xylanázová aktivita sa stanovila zmiešaním 100 μΐ (zriedeného) enzýmového roztoku so 400 μΐ 0,35 % pšeničného arabinoxylánu (Megazyme) v 0,1 M tlmivom roztoku acetátu sodného (pH 5,0). Eppendorfove nádoby so substrátom sa vopred inkubovali 5 minút pri 60 °C. Reakcia sa naštartovala pridaním enzýmového roztoku. Po 15 minútach sa reakcia zastavila pridaním 1,0 ml PAHBAH činidla. Eppendorove nádoby sa zahriali 5 minút pri 100 °C a potom chladili na ľade. Vzorky sa centrifúgovali pri vhodnej rýchlosti, aby sa odstredili akékoľvek pevné materiály, napr. 1 minútu pri maximálnej rýchlosti na centrifúge Beckman Microfúge E. Absorbancia sa merala pri 420 nm. Blank sa pripravil pridaním 100 μΐ 0,1 M tlmivého roztoku acetátu sodného namiesto enzýmového roztoku. Merací rozsah je 0,01 - 0,1 XPU/ml.

Purifikácia xylanázy

K 43 ml bezbunkovej živnej pôdy sa pridalo 10,45 g síranu amónneho a nanieslo sa na sefarózovú kolónu (Etyl Sepharose™) použitím „Ákta explorer 100 (Pharmacia Biotech) Column“ - 15 ETH zdroj (kód 17-0146-01, Pharmacia Biotech) (D = 1,6 cm, I = 4,8 cm, V = 9,6 ml). Kolóna sa ekvilibrovala so 100 mM acetátom sodným a na 40 % nasýteným síranom amónnym pH 5,0. Elúcia sa uskutočnila v 20-násobných kolónových objemoch lineárneho gradientu až po 100 mM acetát sodný (pH 5,0). Veľkosť frakcie = 5 ml. Prietoková rýchlosť = 10 ml/minútu. Vlnové dĺžky monitora = 280 nm, 254 nm, 214 nm. Vo frakciách sa testovala xylanáza a analyzovala sa pomocou HPLC vylučovacej chromatografie (SEC).

Frakcie s najčistejšou xylanázou sa naniesli na sefakrylovú (Sephacryl S200) kolónu nasledovne: Zariadenie „Ákta explorer 100 (Pharmacia Biotech) Column“ - HiPrep 16/60 Sephacryl S200 HR (Pharmacia Biotech). Ekvilibrácia a elúcia sa uskutočnili so 100 mM acetátom sodným (pH 5,0). Prietoková rýchlosť = = 1 ml/min. Veľkosť frakcie = 4 ml. Vlnové dĺžky monitora = 280, 254, 214 nm. Čistota elučných frakcií sa analyzovala pomocou HPLC-SEC, SDS-PAGE a natívnou PAGE.

SK 288130 Β6

Koncentrácia proteínu

Koncentrácia proteínu sa stanovila meraním OD₂₈₀ Xylanáza (zrelá) z T. emersonii obsahuje 11 Trp zvyškov (v pozíciách 72, 108, 115, 121, 148, 300, 302, 308, 322, 377 a 385) a 23 Tyr zvyškov (v pozíciách 36, 51, 109, 141, 146, 161, 167, 169, 174, 192, 193, 196, 200, 218, 281, 306, 316, 326, 332, 348, 395, 403 a 404). Vypočítaný molámy extinkčný koeficient bol 89530 M'^cm'¹. Molekulová hmotnosť bola 41637 g/mol. Optická hustota OD₂₈₀1 mg/ml XEA bola 2,15.

Špecifická aktivita xylanázy z T. emersonii (XEA)

Špecifická aktivita sa stanovila použitím metódy stanovenia redukujúcich sacharidov PAHBAH metódou pri 40 °C a 60 °C. Špecifická aktivita XEA bola 150 XPU pri teplote 40 °C a 500 XPU pri teplote 60 °C. Koncentrácia proteínu sa stanovila meraním OD₂₈₀.

Teplota °C	Špecifická aktivita(XPU/mg)
40	150
60	500

Sekvencia na N-koncoch

Zistilo sa, že purifikovaná zrelá XEA má sekvenciu aminokyselín na N-koncoch takúto: Ala-Gly-LeuAsn-Thr-Ala (v zrelej sekvencii je prvým Ala zvyškom Ala²³ v SEQ ID No. 2).

Izoelektrický bod (IEP)

Prístroj, systém „Phast systém“ (Pharmacia Biotech), gély „IEF 3-9 Phastgels“ (Pharmacia Biotech). Pracovné protokoly na manipuláciu a vyfarbovanie gélov (Coomassie) poskytol výrobca. Pomocou izoelektrickej fokusácie pri použití „PhastGel IEF3“ sa stanovila hodnota IEP asi na 3,3.

Molekulová hmotnosť

Elektroforéza SDS-PAGE sa uskutočňovala pomocou systému „Phast systém“ (Pharmacia Biotech), gélov „Phastgels“ (Pharmacia Biotech), pásikov SDS-tlmivý roztok/pásikov natívneho tlmivého roztoku (Pharmacia Biotech).

Spracovanie vzorky: jeden objem tlmivého roztoku (500 mM Tris HCI pH 6,8, 10 % SDS, 0,1 % brómfenolovej modrej) a 4 objemy vzorky sa zmiešali a nechali prevrieť 3 minúty. Na prácu s gélmi a vyfarbovanie (Coomassie alebo striebro) sa použili metódy podľa štandardného systému „Phast systém“. Molekulová hmotnosť stanovená pomocou SDS-PAGE použitím markerov molekulovej hmotnosti (Pharmacia) bola 63 kD. Molekulová hmotnosť vypočítaná na základe aminokyselinového zloženia je 41637 Daltonov.

Okrem toho sa molekulová hmotnosť stanovila pomocou gélovej permeačnej chromatografie použitím štandardov molekulovej hmotnosti na gélovú filtráciu (BIORAD. kat. č. 151-1901). Molekulová hmotnosť stanovená vysokoúčinnou „HP-SEC“ bola 42 kD. (Na HP-SEC sa použila kolóna TSK G3000SW (kat. č. 05103, Toso Haas). Vzorky sa eluovali 0,1 M fosforečnanom sodným (pH 7) pri 1 ml/min. a pri teplote miestnosti. Detekcia sa uskutočnila pri 280 nm. Zdá sa, že vysoká molekulová hmotnosť, ktorá sa zistila pomocou SDS-PAGE, je nadhodnotená. Je to pravdepodobne spôsobené glykozyláciou xylanázy. Deglykozylácia

Purifikovaný enzým v množstve 5 μΐ (cca. 5 mg/ml) sa zmiešal s 20 μΐ 0,5 % SPS a 25 μΐ 1 % merkaptoetanolu. Zmes sa nechala prevrieť 4 minúty. Po ochladnutí sa pridalo 20 pl N-glykozidázy F (500 U/ml) a 20 μΐ 3 % Tritonu X-100 v 1 M tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (pH 7). Potom nasledovala inkubácia cez noc pri 37 °C a deglykozylácia sa merala pomocou SDS-PAGE. Aminokyselinová sekvencia naznačuje 2 glykozylačné miesta (Asn⁵⁶ a Asn¹²³, pozri SEQ ID No. 2).

Z SDS-PAGE vidno, že N-glykozidáza F pôsobí okrem toho aj na xylanázové migráty a molekulová hmotnosť je nižšia ako pri xylanáze, na ktorú sa s ňou nepôsobilo, alebo ako pri vopred upravenej xylanáze (var so SDS a β- merkaptoetanolom). Takže prekvapujúco vysoká molekulová hmotnosť pozorovaná pri SDS-PAGE je pravdepodobne spôsobená glykozyláciou.

Profil pH a teplotný profil

Xylanázová aktivita v bezbunkovej živnej pôde sa stanovila pri rôznom pH a rôznych teplotách. Xylanázová aktivita sa analyzovala metódou stanovenia redukujúcich sacharidov metódou PAHBAH pri pH 4 a rôznych teplotách (pozri tabuľka 1A) alebo pri 60 °C a rôznych pH (tabuľka 1 B). Z tabuľky 1 A vidno, že teplotné optimum XEA je okolo 80 °C. Z tabuľky 1 B vidno, že pH optimum XEA je medzi pH 4 a pH 5 (ak sa pokusy uskutočnili dvakrát, sú uvedené obidve hodnoty).

Tabuľka IA

Závislosť aktivity xylanázy od teploty

Teplota (°C)	Aktivita (μΜ xylóza/15 min.)	Relatívna aktivita (%)
30	20-30	10
40	40-50	19
50	90 - 100	40
60	120-130	52
70	195 -205	83
80	235 - 245	100
90	65-75	29

Tabuľka 1B

Závislosť aktivity xylanázy od pH

PH	Aktivita (μΜ xylóza/15 min.)	Aktivita (μΜ xylóza/15 min.)
3,0	118,1	123,4
3,5	141,8	127,8
4,0	145,2	148,3
4,5	140,8	149,1
5,0	17,9	124,8
5,5	91,7	99,1
6,0	57,3	60,1

Tepelná stabilita

Diferenčná kalorimetrická analýza (DSC) snímania teploty vyrovnávania (unfolding)

Teplota, pri ktorej je XEA neposkladaná (teplota vyrovnania XEA) sa stanovila pomocou DSC. Použili sa tieto podmienky merania: tlmivý roztok acetát sodný (pH 5), 2 - 4 mg/ml a rýchlosť zahrievania 2,5 °C/min. Zistená teplota vyrovnania (Td) XEA bola 80,1 °C.

Meranie T 50

Teplota T 50, je teplota, pri ktorej sa stráca po 20 minútovej inkubácii 50 % reziduálnej aktivity, a tak predstavuje mieru tepelnej stability. Inkubácie T 50 sa uskutočnili nasledovne. Vzorka xylanázy sa zriedila tak, aby konečná koncentrácia xylanázy bola v rámci meracieho rozsahu PAHBAH testu (XPU jednotiek). Potom sa zriedila s 0,1 M tlmivým roztokom acetátu sodného (pH 5,0) obsahujúceho 1 mg/ml BSA, na zabránenie vzniku špecifických väzieb a denaturácie na povrchu skúmaviek. Tlmivý roztok sa vopred na 5 minút zahrial na 60 °C, 70 °C, 80 °C, 85 °C a 90 °C v termomiešačkách a potom sa pridala xylanáza. Vzorky sa zahrievali 20 minút a chladili ľadom. Aktivita sa merala pomocou PAHBAH testu.

V tabuľke 2 je uvedená reziduálna aktivita v percentách, vzhľadom na neinkubovanú kontrolu, po 20 minútovej inkubácii pri uvedenej teplote. Z tejto tabuľky sa dá odvodiť, že T50 bola 82 °C.

Tabuľka 2

Tepelná stabilita XEA xylanázy

Teplota °C	Reziduálna aktivita (%)
40	100
50	104
60	103
70	99
75	90
80	85
85	8
90	1

Okrem toho sa merali hodnoty T 50 pri rôznych hodnotách pH a v prítomnosti EDTA. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.

SK 288130 Β6

Tabuľka 3

Stanovenie vplyvu pH a kovových iónov na stabilitu XEA. (' pH 7 a 8 príliš málo preukazných údajov v oblasti nízkych teplôt). _

PH	T50 (°C)
3	73
3,5	77
4	80
4,5	80
5	81
5 + (EDTA)	81
6	75
7*	<72
81	<72

XEA je najstabilnejšia v oblasti hodnôt pH od pH 4 do pH 5. Pod pH 3,5 a nad pH 5,5 začína tepelná stabilita klesať, ale je stále signifikantne lepšia ako väčšina doteraz známych xylanáz z húb. Prítomnosť EDTA neovplyvňuje T 50. Znamená to, že tepelná stabilita XEA nezávisí od kovových iónov s kladným nábojom, ktoré vytvárajú komplexy s EDTA.

Príklad 7

Použitie Talaromyces xylanázy (XEA) pri kŕmení zvierat

Pokus sa uskutočnil s brojlerovými samčekmi (Cobb). Od prvého do piateho dňa veku boli v podlahových kotercoch a poskytovalo sa im komerčné krmivo brojlerový štartér. Od piateho dňa veku sa zvieratá náhodne rozdelili do 54 klietok na základe ich individuálnych hmotností. Do jednej klietky sa ustajnilo 15 brojlerov vo veku 5-19 dní. Od 19 dňa sa počet zvierat v klietke znížil na 12. Narábalo sa naraz so šiestimi klietkami. Pretože klietka je experimentálnou jednotkou, znamená to, že išlo o šesť opakovaní každého ošetrenia.

Klietky sa umiestnili do umelo vyhrievanej, osvetlenej a vetranej haly pre brojlery, pri použití trojväzbového klietkového systému. Každá klietka mala podlahový priestor 0,98 m² a mala drôtenú podlahu. Miestnosť bola osvetlená 24 hodín denne, ale intenzita svetla sa postupne znižovala počas pokusu. Teplota sa tiež znižovala postupne: od 28 °C v priebehu prvého týždňa do 23 °Č v priebehu posledného týždňa. Vlhkosť sa udržiavala počas pokusu na asi 60 %. Zvieratá boli očkované podľa obvyklého očkovacieho programu proti infekčnej bronchitíde a Newcastlestskej chorobe.

Tento pokus zahŕňal deväť ošetrení. Ku kŕmnej dávke na báze pšenice (pozri tabuľka 4) sa nepridal žiaden enzým (kontrola) alebo sa pridalo množstvo ekvivalentné asi 2500, 5000, 10000 alebo 25000 EXU/kg krmiva buď Talaromyces endoxylanázy (XEA) alebo Aspergillus niger endoxylanázy (Endol, endo-l,4-p-endoxylanázy³¹ komerčne dostupnej od DSM N. V., Agri Ingredients, Delft, Holandsko) ako kontrola. Enzýmy sa pridali ku krmivu vo forme granulovaného produktu, ktorý sa zamiešal do premixu pred zamiešaním premixu do kŕmnej dávky. Kŕmne dávky v tvare granúl sa poskytli zvieratám ad libitum. Počas granulačného procesu nesmela byť teplota granúl vyššia ako 70 °C. Voda bola dostupná vždy čerstvá.

Prírastok živej hmotnosti (BWG) a koeficient konverzie krmiva (FCR) sa stanovili v období 5. - 19. dňa veku a v období 5.-33. dňa veku.

Tabuľka 4

Zloženie krmiva a obsahy hlavných živín__

Zložka	Obsah (%)
Pšenica	50,0
Raž	10,0
Sójová múčka	20,0
Plnotučná sója (opekaná)	1,5
Maniok	1,69
Mäsová a kostná múčka	5,5
Rybia múčka	2,0
Zmesný živočíšny tuk	6,0
Minerálny a vitamínový premix	1,0
Vápenec	0,85
Hydrofosforečnan vápenatý	0,75
Soľ	0,3
L-lyzín.HCL	0,16
DL-metionín	0,22

SK 288130 Β6

Zložka	Obsah (%)
L-treonín	0,03
ME^rojlery (MJ/kg)	12,0
Hrubý proteín (%)	21,4
Hrubý tuk (%)	8,5
Stráviteľný lyzín (%)	1,06
Stráviteľný metionín + cysteín (%)	0,78

Kŕmna dávka obsahovala vitamíny a stopové prvky v množstvách, ktoré sú obvyklé v Holandsku. Ku kŕmnym dávkam sa nepridali žiadne stimulátory rastu s prísadou antibiotík ani kokcidiostatiká.

Výsledky tohto pokusu sú prezentované v tabuľke 5, v ktorej sú uvedené priemerné BWG a FCR u brojlerov pre dve obdobia. Enzýmové prídavky sú uvedené v jednotkách aktivity (EXU). Pri narastaní BWG sa FCR znižuje, pričom FCR je množstvo krmiva (g) potrebné na rast.

Tabuľka 5

	BWG (g/kohútik)	FCR(g/g)
5. - 19. deň	5. - 33. deň	5 - 19. deň	5. - 33. deň
Kontrola	647	1665	1,486	1,749
Talaromyces (XEA, vynález)
+ 2500 EXU/kg	668	1696	1,447	1,666
+ 5000 EXU/kg	683	1757	1,419	1,647
+10000 EXU/kg	662	1736	1,444	1,673
+ 25000 EXU/kg	676	1731	1,429	1,656
Aspergillus niger Endol (na porovnanie)
+ 2500 EXU/kg	682	1742	1,440	1,659
+ 5000 EXU/kg	682	1730	1,458	1,704
+ 10000 EXU/kg	672	1686	1,417	1,662
+ 25000 EXU/kg	696	1743	1,466	1,685

Tak prírastok, ako aj FCR sú signifikantne zvýšené (P <0,05) v kŕmnych dávkach obsahujúcich enzýmy po 14 dňovom experimentálnom období, ako aj po celkovom experimentálnom období. Malé rozdiely sa pozorovali medzi rôznymi dávkami, ale XEA enzým bol taký dobrý ako (ak nie lepší než) komerčne dostupný enzým.

Príklad 8

Pekárska účinnosť endoxylanázy Talaromyces emersonii (XEA)

Preparácia chleba určeného na konzervovanie v plechovkách (tin bread) štandardným pekárenským postupom sa uskutočnila 2 minútovým zmiesením 3500 g pšeničnej múky (zmes 80 % „Kolibri“ a 20 % „Ibis“ pšeničných múk (Meneba, Holandsko) pri asi 21 °C), 77 g lisovaných kvasníc (Konings), 70 g soli, 25 ppm kyseliny askorbovej, 10 ppm α-amylázy z húb Fermizyme™P₂oo (DSM N. V., Bakery Ingredients, Delft, Holandsko) a rôznych množstiev endoxylanázového XEA enzýmu a 2030 ml vody (8-15 °C) v skrutkovicovom miesiči (Hobart) (pri rýchlosti 1) a asi 6 minútovým zmiesením (pri rýchlosti 2) pri spotrebe 125 Wh (Watthodín) energie. Teplota cesta bola 28 °C. Spracovanie cesta strojom sa porovnávalo s cestom, ktoré ručne pripravil skúsený pekár.

Ihneď po zmiesení sa cesto rozdelilo na 6 rovnakých dielov po 875 g, zaoblilo a nechalo vykysnúť 35 minút, v kabinete určenom na kysnutie, pri 34 °C a 85 % RH (relatívnej vlhkosti). Po skončení tejto fázy sa cestá vytvarovali a umiestnili do pekárskej formy a dali na 75 minút na konečné vykysnutie do kabinetu určeného na kysnutie pri 38 °C a 87 % RH. Potom sa úplne vykysnuté cestá piekli v elektrickej peci pri 210 °C 30 minút. Po ochladení na teplotu miestnosti sa objem bochníkov chleba zisťoval metódou pretlačovania pomocou poklepu cez kaliber. Po 16-24 hodinách uskladnenia v uzatvorených polyetylénových vrecúškach pri teplote miestnosti ohodnotil kvalitu striedky skúsený pekár. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Dávkovanie množstva XEA (EXU/kg múky)	Objem bochníka	Manipulácia s cestom	Pekárska účinnosť (stupnica 0 -10)	Kvalita striedky (stupnica 0-10)
(ml)	(%)
0	4123	100	ľahká, cesto je nelepivé	6	6
176	4420	107	ľahšia, cesto je nelepivé	7	7
527	4756	115	ľahšia, cesto je nelepivé	7,5	7
1581	4794	116	ľahká, cesto je slabo lepivé	7,5	7,5

SK 288130 Β6

Cestá mali veľmi dobrú kvalitu. Iba pri najvyššej dávke endoxylanázy XEA sa vyskytla počas spracovania cesta slabá lepivosť. Táto slabá lepivosť však neovplyvňovala spracovateľnosť ciest strojom. Všetky cestá obsahujúce endoxylanázovú aktivitu XEA boli veľmi vláčne a ľahko manipulovateľné.

Na základe týchto pekárenských výsledkov sa prišlo k záveru, že endoxylanáza XEA je veľmi účinná pri zlepšovaní kvality chleba, čo sa týka tak objemu bochníka, ako aj kvality striedky. I napriek veľkým objemom bochníkov bola štruktúra striedky stále veľmi pravidelná a jemná.

Príklad 9 a porovnávací príklad 10

Porovnanie pekárskej účinnosti enzýmu (XEA) Talaromyces emersonii s endoxylanázou z Asp. niger

Pekárska účinnosť XEA sa porovnávala v holandskej výrobe chleba určeného na konzervovanie v plechovkách s bežne používanou endoxylanázou z húb Aspergillus niger. Táto endoxylanáza z A. niger je komerčne dostupná a dodáva sa v čistej forme, t. j. ako Fermizyme™ HSP_6Ooo Enzým Fermizyme™ HSP_6Ooo je dobrým prostriedkom, ktorý sa dá použiť pri výrobe chleba, i keď môže viesť k lepivosti cesta a nie vždy poskytuje dostatočný nárast objemu bochníka.

Opakoval sa presný postup podľa príkladu 7, až na to, že sa použili rôzne množstvá buď endoxylanázy XEA, alebo Fermizyme™ HSP₆₀oo·

Výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Príklad č.	Dávkovanie množstva (EXU/kg múky)	Objem bochníka (ml) (%)	Manipulácia s cestom	Lomivosť & drobivosť (stupnica 0-10)	Kvalita striedky (stupnica 0-10)
9: endoxylanáza XEA	0	4170	100	Dobrá, cesto je nelepivé	6	6
	264	4430	106	Dobrá, cesto je nelepivé	6,5	7,5
	528	4647	111	Dobrá, cesto je nelepivé	7	7,5
	1056	4761	114	Cesto je vláčne, nelepivé	7,5	8
	1584	4880	117	Cesto je vláčne, málo kypré, nelepivé	5#	7,5
10: Fermizyme™ HSPeooo	0	4170	100	Dobrá, cesto je nelepivé	6	6
	264	4304	103	Cesto je vláčne, nelepivé	6,5	6
	528	4355	104	Cesto je vláčne, málo lepivé	6,5	7
	1056	4539	109	Cesto je vláčne, lepivé, málo kypré	7	7,5
	1584	4698	113	Cesto je vláčne, lepivé, málo kypré	7,5	8

# Objem bochníka bol príliš veľký, a tak vznikal rozprasknutý tvar chleba

Z týchto výsledkov vyplýva, že endoxylanáza XEA nespôsobuje lepivosť cesta a zvyšuje objem bochníkov vo väčšej miere, než ako tomu je pri použití Fermizyme™ HSP. Okrem toho na dosiahnutie určitej veľkosti objemu bochníka sa potrebovalo menej endoxylanázových jednotiek na kilogram múky, keď sa použila XEA namiesto Fermizyme™ HSP. Kvalita lomivosti a drobivosti bola podobná pri ekvivalentných objemoch. Štruktúra striedky, ktorá sa dosiahla prídavkom XEA bola najmenej taká dobrá ako tá, ktorá sa dosiahla s Fermizyme™ HSP.

Súhrnne rieši endoxylanáza XEA niektoré problémy pri používaní Fermizyme™ HSP pri výrobe cesta a chleba. Žiadna lepivosť sa nezaviedla do cesta, získali sa väčšie objemy bochníkov a i napriek veľkým objemom bochníkov bola štruktúra striedky stále veľmi pravidelná a jemná.

Príklad 11

Skúšky stability po granulovaní

Kukuričný škrob (4543 g) sa umiestnil do Erweka ™ Z-miešačky. Potom sa ku škrobu počas miešania pridalo 1069 g fermentačného ultrafiltrátu obsahujúceho xylanázu podľa tohto vynálezu (vsádzka XEA 502-8m, ktorá mala 43553 EXU/g a 6,7 % sušinu), aby sa získala mokrá zmes, ktorá má asi 15000 EXU/g (ak sa vysuší na 94 % sušinu). Po pridaní tekutej zložky pokračovalo miešanie ďalších 10 minút.

Vo vákuovej vysúšacej komore (40 °C) sa zmes vysušila na 94,5 % sušinu za 12 hodín, potom sa pomlela v Erweka™ Freewitt mlynčeku s 1 mm sitom. Tento postup sa týka príkladu 11 A.

SK 288130 Β6

Rovnaký postup sa opakoval použitím vsádzky Lyxasan™ Batch OP 0036 (obsahujúcej endo-l,4-p-endoxylanázu³¹, ktorá je komerčne dostupná od DSM N. V., Agri Ingredients, Delft, Holandsko). Ku 5885 g škrobu sa pridalo 1984 g UF (ultrafiltrátu), ktorý má 42550 EXU/g a 3,7 % sušinu. Zmes sa vysušila na 94 % sušinu a pomlela ako v príklade 11 A (toto predstavuje porovnávací príklad 11 B).

Treťou vzorkou je komerčný produkt, ktorého potiahnutá forma sa nazýva Biofeed Wheat CT, dostupný od Novo Nordisk, Dánsko. Tento produkt, ktorý je potiahnutý tukom obsahuje G-typ xylanázy z Thermomyces lanuginosis (porovnávací príklad 11 C).

Všetky tri vzorky sa testovali v granulačnom pokuse pri troch rôznych teplotách. Ku krmivu pre zvieratá (zloženie je uvedené v tabuľke 8 v ďalšom texte) sa pridala enzýmová zmes v dvoch rôznych koncentráciách, a to 0,24% (11 A) a 0,1 % (11 B, 11 C). Po zmiešaní sa krmivo zahrievalo parou v kondicionéri až na teplotu 65 °C, 75 °C alebo 85 °C a potom sa granulovalo cez 65 mm hrubý prievlak s otvormi, ktoré mali priemer 5 mm a okamžite sa ochladilo. Reziduálna aktivita v granulách sa potom merala a výsledky sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 8

Zloženie krmiva pre zvieratá__

Suroviny	Obsah (%)
Kukurica	20,00
Pšenica	30,00
Sója (tepelne upravená)	10,00
Sója (múčka) (46,7 % čistoty)	22,50
Maniok	5,07
Rybia múčka (70 % čistoty)	1,50
Pérová múčka (hydrolyzovaná)	1,00
Sójový olej	1,30
Živočíšny tuk	4,50
Vitamínovo-minerálny premix (kukurica)	1,00
Vápenec	1,300
Hydrofosforečnan vápenatý	1,20
Soľ	0,32
L-lyzín	0,12
DL-metionín	0,19

Tabuľka 9

Stabilita enzýmov po granulách

Reziduálna aktivita (%)	Príklad 1 IA	Porovnávací príklad 11 B	Porovnávací príklad 11 C
65 °C	84	64	86
75 °C	82	16	83
85 °C	66	4	56

Z tabuliek vidno, že stabilita XEA proteínu podľa tohto vynálezu pri vysokej teplote (85 °C) poskytuje omnoho lepšie výsledky stability ako v súčasnosti predajný komerčný produkt.

Príklad 12

Aktivita na aryl-P-D-xylozidy

Dva substráty, a to 5-bróm-4-chlór-3-indoxyl-P-D-xylopyranozid (CAS Reg. č. 207606-55-1, nazývaný tiež X-b-D-xyl) a 4-umbelliferyl-p-D-xylopyranozid (CAS Reg. č. 6734-33-4, nazývaný tiež 4-MU-b-D-xyl) sa použili na skríning xylozidázovej aktivity. Pridali sa priamo do média. Kmene vytvárajúce knižnicu sa zo30 radili na 96. sondách na platniach. Takto sa Master platne replikovali ľahšie na detekčné médium. Knižnica sa pestovala na selektívnom médiu (0,52 g/1 KCI, 1,52 g/1 K₂HPO₄, 0,52 g/1 MgSO₄, 2 % glukóza, 10 mM acetamid, 1/1000 stopových prvkov (2,2 g ZnSO₄ x 7 H₂O, 1,1 g H₃BO₃, 0,5 g FeSO₄ x 7 H₂O, 0,17 g CoCl₂ x 6 H₂O, 0,16 g CuSO₄ x 5 H₂O, 0,15 g NaMoO₄ x 2 H₂O, 5,0 g EDTA, pH sa nastavilo na 6,5 s KOH a sterilizovalo sa cez filter 0,45 pm), pH sa nastavilo s KOH (10 N na pH 6)), obsahujúcom buď X-b-D-xyl (v množstve 200 mg/1) alebo 4-MU-b-D-xyl (v množstve 150 mg/1). V minimálnom objeme dimetylformamidu (DMF) sa vopred rozpustila X-b-D-xyl. Platne sa inkubovali 48 hodín pri 33 °C a potom sa inkubovali 6 hodín pri 65 °C. Platne sa vyhodnocovali pred 6 hodinovou inkubáciou a po 6 hodinovej inkubácii pri 65 °C. Platne X-xyl sa analyzovali priamo na základe prítomnosti (alebo neprítomnosti) tyrkysovomodrého halo,

SK 288130 Β6 ktoré sa tam vytvorilo. Detekcia xylozidázovej aktivity na 4-MU-xyl platniach sa preskúšala pomocou osvetlenia platne UV lampou pri vlnovej dĺžke 310 nm. Pozitívne klony boli obklopené modrým fluoreskujúcim halo.

SEKVENČNÁ LISTINA <110> DSMN.V.

<120> Talaromyces Xylanases <130> N80068A <140> PCT/EPOO/09257 <141> 2000/09/21 <150> EP 99203100.5 <151> 1999-09-22 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1227 <212>DNA <213> Talaromyces emersonii <220>

<221>CDS <222> (1)..(1227) <400> 1

atg

gtt

cgc

ctc

agt

cca

gtc

ttg

ctc

gcc

tcc

atc

gca

ggc

tct

ggc

48

Met

Val

Arg

Leu

Ser

Pro

Val

Leu

Leu

Ala

Ser

íle

Ala

Gly

Ser

Gly

1

5

10

15

ctg

cct

cta

gcc

caa

gca

gca

ggc

ctc

aac

aca

gcc

gcc

aaa

gcc

atc

96

Leu

Pro

Leu

Ala

Gin

Ala

Ala

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Ala

Lys

Ala

íle

20

25

30

ggc

ctg

aaa

tac

ttt

ggc

aca

gcg

acc

gac

aac

ccc

gag

ctg

agc

gac

144

Gly

Leu

Lys

Tyr

Phe

Gly

Thr

Ala

Thr

Asp

Asn

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

35

40

45

acc

gcg

tac

gag

acg

cag

ctc

aac

aac

acg

cag

gat

ttc

ggg

cag

ttg

192

Thr

Ala

Tyr

Glu

Thr

Gin

Leu

Asn

Asn

Thr

Gin

Asp

Phe

Gly

Gin

Leu

50

55

60

acg

ccg

gcg

aat

tcg

atg

aag

tgg

gat

gcc

acc

gag

ccc

gag

cag

aat

240

Thr

Pro

Ala

Asn

Ser

Met

Lys

Trp

Asp

Ala

Thr

Glu

ProGlu Gin Asn

65

70

75

80

gtc

ttc

acg

ttt

agc

gcc

ggc

gat

cag

att

gcc

aac

ttggcc aag gcg

288

Val

Phe

Thr

Phe

Ser

Ala

Gly

Asp

Gin

íle

Ala

Asn

LeuAla Lys Ala

85

90

95

aat

ggc

cag

atg

ttg

cgg

tgt

cat

aat

ctt

gtt

tgg

tac

aat

cag

ttg

336

Asn

Gly

Gin

Met

Leu

Arg

Cys

His

Asn

Leu

Val

Trp

Tyr

Asn

Gin

Leu

100

105

110

ccg

tcg

tgg

gtc

acc

agt

ggc

tcc

tgg

acc

aac

gag

acg

ctg

ctt

get

384

Pro

Ser

Trp

Val

Thr

Ser

Gly

Ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Ala

115

120

125

gcc

atg

aag

aat

cac

atc

acc

aac

gtc

gtt

acc

cat

tac

aag

ggc

cag

432

Ala

Met

Lys

Asn

His

íle

Thr

Asn

Val

Val

Thr

His

Tyr

Lys

Gly

Gin

130

135

140

tgc

tac

gca

tgg

gat

gtc

gtt

aat

gag

gcc

ctc

aac

gac

gac

ggc

acc

480

Cys

Tyr

Ala

Trp

Asp

Val

Val

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Asp

Asp

Gly

Thr

145

150

155

160

SK 288130 Β6

tac

cgc

age

aac

gtc

ttc

tac

cag

tac

atc

ggt

gag

gcg

tac atc

ccc

Tyr

Arg

Ser

Asn

Val

Phe

Tyr

Gin

Tyr

íle

Gly

Glu

Ala

Tyr íle

Pro

165

170

175

atc

gcc

ttc

gcg

acg

gcc

gcc

gcc

gcc

gac

ccc

aac

gcc

aag ctg

tac

íle

Ala

Phe

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Pro

Asn

Ala

Lys Leu

Tyr

180

185

190

tac

aac

gac

tac

aac

atc

gag

tac

ccg

ggg

gcc

aag

gcg

acg gcg

gcg

Tyr

Asn

Asp

Tyr

Asn

íle

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr Ala

Ala

195

200

205

cag

aac

ctg

gtc

aag

ctg

gtg

cag

tcg

tac

ggc

gcg

cgc

atc gac

ggc

Gin

Asn

Leu

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

íle Asp

Gly

210

215

220

gtc

ggc

ctg

cag

tcg

cac

ttc

atc

gtg

ggc

gag

acg

ccc

age acc

age

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

His

Phe

íle

Val

Gly

Glu

Thr

Pro

Ser Thr

Ser

225

230

235

240

tcc

cag

cag

cag

aac

afeg gcc gcc ttc acg gcg ctg ggc gtc gag gt<

Ser

Gin

Gin

Gin

Asn

Met

Ala

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Gly

Val Glu

Val

245

250

255

gcc

atc

acc

gag

ctc

gac

atc

cgc

atg

cag

ctg

ccc

gag

acg gaa

gcc

Ala

íle

Thr

Glu

Leu

Asp

íle

Arg

Met

Gin

Leu

Pro

Glu

Thr Glu

Ala

260

265

270

ctg

ctg

acg

cag

cag

gcc

acc

gac

tac

cag

age

acc

gtg

cag gcc

tgc

Leu

Leu

Thr

Gin

Gin

Ala

Thr

Asp

Tyr

Gin

Ser

Thr

Val

Gin Ala

Cys

275

280

285

gcc

aac

acc

aag

ggc

tgc

gtc

ggc

atc

acc

gtc

tgg

gac

tgg acc

gac

Ala

Asn

Thr

Lys

Gly

Cys

Val

Gly

íle

Thr

Val

Trp

Asp

Trp Thr

Asp

290

295

300

aag

tac

tcg

tgg

gtg

ccc

age

acc

ttc

tcg

ggc

tat

ggc

gac gcc

tgt

Lys

Tyr

Ser

Trp

Val

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Gly.

Asp Ala

Cys

305

310

315

320

ccc

tgg

gac

gcc

aac

tac

cag

aag

aag

ccc

gcg

tac

gaa

ggc atc

ctc

Pro

Trp

Asp

Ala

Asn

Tyr

Gin

Lys

Lys

Pro

Ala

Tyr

Glu

Gly íle

Leu

325

330

335

act

ggg

ctt

gga

cag

acg

gtc

acc

age

acc

acc

tac

atc

atc tcg

ccg

Thr

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

Thr

Thr

Tyr

íle

íle Ser

Pro

340

345

350

acg

acg

tet

gtc

gga

acg

ggc

acg

acg

acc

tcg

age

ggc

gga age

ggc

Thr

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Gly

Gly Ser

Gly

355

360

365

ggc

acg

act

ggc

gtg

gcc

cag

cat

tgg

gag

cag

tgc

ggt

gga ctg

ggc

Gly

Thr

Thr

Gly

Val

Ala

Gin

His

Trp

Glu

Gin

Cys

Gly

Gly Leu

Gly

370

375

380

tgg

act

ggt

ccg

acg

gtt

tgc

gca

agt

ggc

tac

act

tgc

act gtc

atc

Trp

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Cys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Cys

Thr Val

íle

385

390

395

400

aat

gag

tat

tac

tcg

cag

tgt

ctg

taa

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Cys

Leu

405 <210>2 <211> 408 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400>2

Met

Val

Arg

Leu

Ser

Pro

Val

Leu

Leu

Ala

Ser

íle

Ala

Gly

Ser

Gly

1

5

10

15

Leu

Pro

Leu

Ala

Gin

Ala

Ala

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Ala

Lys

Ala

íle

20

25

30

Gly

Leu

Lys 35

Tyr

Phe

Gly Thr

Ala 40

Thr

Asp

Asn

Pro

Glu 45

Leu

Ser

Asp

Thr

Ala

Tyr

Glu

Thr

Gin

Leu

Asn

Asn

Thr

Gin

Asp

Phe

Gly

Gin

Leu

50

55

60

Thr

Pro

Ala

Asn

Ser

Met

Lys

Trp

Asp

Ala

Thr

Glu

Pro

Glu

Gin

Asn

65

70

75

80

Val

Phe

Thr

Phe

Ser

Ala

Gly

Asp

Gin

íle

Ala

Asn

Leu

Ala

Lys

Ala

85

90

95

Asn

Gly

Gin

Met

Leu

Arg

Cys

His

Asn

Leu

Val

Trp

Tyr

Asn

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Ser

Trp

Val

Thr

Ser

Gly

Ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Ala

115

120

125

Ala

Met

Lys

Asn

His

íle

Thr

Asn

Val

Val

Thr

His

Tyr

Lys

Gly

Gin

130

135

140

Cys

Tyr

Ala

Trp

Asp

Val

Val

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Asp

Asp

Gly

Thr

145

150

155

160

Tyr

Arg

Ser

Asn

Val

Phe

Tyr

Gin

Tyr

íle

Gly

Glu

Ala

Tyr

íle

Pro

165

170

175

íle

Ala

Phe

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Pro

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

180

185

190

Tyr

Asn

Asp

Tyr

Asn

íle

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr

Ala

Ala

195

200

205

Gin

Asn

Leu

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

íle

Asp

Gly

210

215

220

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

His

Phe

íle

Val

Gly

Glu

Thr

Pro

Ser

Thr

Ser

225

230

235

240

Ser

Gin

Gin

Gin

Asn

Met

Ala

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Gly

Val

Glu

Val

245

250

255

Ala

íle

Thr

Glu

Leu

Asp

íle

Arg

Met

Gin

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Ala

260

265

270

Leu

Leu

Thr

Gin

Gin

Ala

Thr

Asp

Tyr

Gin

Ser

Thr

Val

Gin

Ala

Cys

275

280

285

Ala

Asn

Thr

Lys

Gly

Cys

Val

Gly

íle

Thr

Val

Trp

Asp

Trp

Thr

Asp

290

295

300

Lys

Tyr

Ser

Trp

Val

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ala

Cys

305

310

315

320

Pro

Trp

Asp

Ala

Asn

Tyr

Gin

Lys

Lys

Pro

Ala

Tyr

Glu

Gly

íle

Leu

325

330

335

Thr

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

Thr

Thr

Tyr

íle

íle

Ser

Pro

340

345

350

Thr

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

355

360

365

Gly

Thr

Thr

Gly

Val

Ala

Gin

His

Trp

Glu

Gin

Cys

Gly

Gly

Leu

Gly

370

375

380

Trp

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Cys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Cys

Thr

Val

íle

385

390

395

400

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Cys

Leu

405 <210>3 <211> 28 <212>DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér #1 <400> 3 tatagcgaaa tggattgatt gtacgctc <210>4

SK 288130 Β6 <211> 26 <212>DNA » <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: primér #2 <400> 4 atccccagca tcattacacc tcagtg 26

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   tým, že štiepi (1-4) väzby alebo su- vyznačujúci sa tým, že vyznačujúci sa tým, že

   1. Xylanázový polypeptid zahŕňajúci:

   (i) aminokyselinovú sekvenciu od aminokyseliny 23 po 408 v SEQ ID No. 2, alebo (ii) variant, ktorý má aspoň 90 % identitu aminokyselinovej sekvencie s aminokyselinami 23 po 408 v SEQ ID No. 2, ktorý je schopný rozštiepiť xylán, alebo (iii) variant aminokyselinovej sekvencie od aminokyselín 23 po 408 v SEQ ID No. 2, ktorý má až do 50 aminokyselinových substitúcií a ktorý je schopný rozštiepiť xylán, alebo (iv) fragment aminokyselinovej sekvencie od aminokyseliny 23 po 408 v SEQ ID No. 2, ktorý je schopný rozštiepiť xylán.
2. 2. Polypeptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že variant (ii) má aspoň 95 % identitu aminokyselinovej sekvencie s aminokyselinami 23 po 408 v SEQ ID No. 2 alebo fragment (iv) má dĺžku aspoň 150 aminokyselín alebo variant (iii) má až do 30 aminokyselinových substitúcií.
3. 3. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa sediace xylopyranozylové jednotky v β-D-xyláne.
4. 4. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, má arabinoxylanázovú a xylozidázovú aktivitu.
5. 5. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, sa dá získať z:

   (a) húb, alebo (b) organizmu rodu Talaromyces, prípadne druhu Talaromyces emersonii.
6. 6. Polynukleotid zahŕňajúci:

   (a) sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID No. 1 kódujúcu xylanázu alebo jej komplement, alebo (b) sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorý má xylanázovú aktivitu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, (c) aspoň 100 nukleotidový fragment zo sekvencie nukleovej kyseliny SEQ ID No. 1 kódujúci xylanázu alebo jej komplement, (d) sekvenciu, ktorá má aspoň 95 % identitu s kódujúcou sekvenciou SEQ ID No. 1 kódujúcu xylanázu, (e) sekvenciu nukleovej kyseliny SEQ ID No. 1 kódujúcu xylanázu alebo jej komplement, alebo materskú sekvenciu Seq ID No. 1 modifikovanú až do 100 nukleotidovými substitúciami, (f) sekvenciu kódujúcu xylanázu, ktorá je degenerovaná dôsledkom genetického kódu na sekvencií nukleovej kyseliny SEQ ID No. 1 alebo jej komplement, (g) sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid majúci xylanázovú aktivitu, ktorou je:

   (1) kódujúca sekvencia od nukleotidu 69 po 1224 v SEQ ID No. 1, alebo (2) sekvencia, ktorá je degenerovaná dôsledkom genetického kódu s ohľadom na sekvenciu definovanú v (1), alebo (h) sekvenciu komplementárnu s polynukleotidom definovaným v (g).
7. 7. Polynukleotidová sekvencia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že fragment podľa (c) má dĺžku aspoň 200 báz alebo identitu podľa (d) aspoň 98 percentnú alebo počet modifikovaných nukleotidov podľa (e) až do 50.
8. 8. Polynukleotid podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že ide o DNA sekvenciu.
9. 9. Vektor zahŕňajúci polynukleotidovú sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 8.
10. 10. Vektor podľa nároku 9, ktorý je expresným vektorom, keď sekvencia DNA podľa nároku 8 je účinne spojená s regulačnou sekvenciou.
11. 11. Hostiteľská bunka, ktorá zahŕňa, ako heterológnu sekvenciu, polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 8.
12. 12. Hostiteľská bunka, ktorá exprimuje, ako heterológny proteín, polypeptid podľa ktoréhokoľvek z náro30

    SK 288130 Β6 kov 1 až 5.
13. 13. Hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa nároku 9.
14. 14. Spôsob produkcie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž5, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13 v podmienkach, v ktorých sa exprimuje polypeptid.
15. 15. Kompozícia zahrnujúca polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
16. 16. Kompozícia podľa nároku 15, ktorá ďalej zahŕňa polypeptid s celulázovou, endo-arabinanázovou, ramnogalakturonázovou alebo polygalakturonázovou aktivitou.
17. 17. Spôsob úpravy rastlinného alebo xylán obsahujúceho materiálu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kontaktovanie materiálu s proteínom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo s kompozíciou podľa nároku 15 alebo nároku 16.
18. 18. Spôsob úpravy podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa degradáciu, hydrolýzu alebo modifikáciu xylánu v materiáli alebo degradáciu, alebo modifikáciu stien rastlinných buniek.
19. 19. Spôsob úpravy podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa štiepenie xylopyranozyl orp-D-xylánových subjednotiek a/alebo materiálu zahrnujúceho rastlinu, rastlinnú dužinu, rastlinný extrakt alebo požívatiny alebo ich zložky.
20. 20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17ažl 9, vyznačujúci sa tým, že redukuje viskozitu materiálu, degraduje alebo hydrolyzuje xylán nachádzajúci sa v materiáli alebo vylepšuje čírosť, alebo filtrovateľnosť materiálu.
21. 21. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 alebo kompozície podľa nároku 15, alebo nároku 16, na úpravu rastlinného materiálu, vyznačujúce sa tým, že zlepšuje filtrovateľnosť a/alebo redukuje viskozitu tekutín obsahujúcich xylán, zlepšuje filtrovateľnosť alebo čírenie alkoholických nápojov napr. piva, vína alebo ovocných alebo zeleninových štiav, hydrolyzuje poľnohospodárske rezíduá, umožňuje recykláciu materiálov obsahujúcich papier pri výrobe papiera na zahusťovanie požívatín a/alebo extrakciu požadovaných materiálov napr. kávy, rastlinného oleja, škrobu, pri výrobe rastlinnej dužiny, šťavy alebo extraktu, zlepšuje objem bochníka, kvalitu chleba alebo redukuje lepivosť cesta.
22. 22. Krmivo pre zvieratá, potravina alebo požívatina, vyznačujúce sa tým, že obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5,
23. 23. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 pri varení piva, výrobe piva alebo vína, destilácii, recyklovaní, biometanizácii, v zubnej hygiene, pri spracovaní kože, výrobe papiera, úprave ovocných alebo zeleninových štiav alebo extraktov, spracovaní alebo výrobe textilu, pekárstve alebo pri výrobe chleba, pri úprave kvetových hľúz, pri príprave potravín alebo požívatín alebo ako krmív pre zvieratá.
24. 24. Potravina alebo požívatina podľa nároku 22, ktorou je alkoholický nápoj, chlieb, cesto alebo čaj.
25. 25. Transgénny rastlinný organizmus alebo jeho časť, vyznačujúci sa tým, že obsahuje bunku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.