JP2000157262A - β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 - Google Patents
β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 強いβ−１，３−キシラン分解活性を有する
新規なβ−１，３−キシラナーゼを得る。 【解決手段】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）並びにキシロヘキサオース（６糖類）に
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記の
理化学的性質を有する。(a) 分子量；57,000、(b) 等電
点；3.6、(c) 溶解性；水溶性、(d) 至適温度；４０
℃、(e) 至適ｐＨ；ｐＨ 7.5、(f) ｐＨ安定性；ｐＨ
6.0〜9.0、(g) 熱安定性；３０℃まで安定
新規なβ−１，３−キシラナーゼを得る。 【解決手段】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）並びにキシロヘキサオース（６糖類）に
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記の
理化学的性質を有する。(a) 分子量；57,000、(b) 等電
点；3.6、(c) 溶解性；水溶性、(d) 至適温度；４０
℃、(e) 至適ｐＨ；ｐＨ 7.5、(f) ｐＨ安定性；ｐＨ
6.0〜9.0、(g) 熱安定性；３０℃まで安定
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−１，３−キシ
ラナーゼ活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新
規微生物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いた
オリゴ糖、プロトプラストの製造方法に関するものであ
る。
ラナーゼ活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新
規微生物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いた
オリゴ糖、プロトプラストの製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】キシランには、イネ科植物やトウモロコ
シ穂軸のヘミセルロースの主要部分を占めるβ−１，４
−キシランと、紅藻や緑藻の細胞壁に含まれるβ−１，
３−キシランとがある。β−１，４−キシランについて
は、β−１，４−キシラナーゼ（エンド−１，４−β−
キシラナーゼ）が、パルプの漂白に用いる塩素の消費量
を減らすパルプ漂白用酵素として実用化が始まってい
る。
シ穂軸のヘミセルロースの主要部分を占めるβ−１，４
−キシランと、紅藻や緑藻の細胞壁に含まれるβ−１，
３−キシランとがある。β−１，４−キシランについて
は、β−１，４−キシラナーゼ（エンド−１，４−β−
キシラナーゼ）が、パルプの漂白に用いる塩素の消費量
を減らすパルプ漂白用酵素として実用化が始まってい
る。
【０００３】また、食品分野では広葉樹キシランからの
β−１，４−キシロオリゴ糖の生産が行われている。こ
のβ−１，４−キシロオリゴ糖は、甘さは砂糖の３０％
程度で、不凍効果、ビフィドバクテリウム属細菌増殖活
性、保水性向上、食品の腐敗防止等の機能を有する食品
秦材として利用されている。
β−１，４−キシロオリゴ糖の生産が行われている。こ
のβ−１，４−キシロオリゴ糖は、甘さは砂糖の３０％
程度で、不凍効果、ビフィドバクテリウム属細菌増殖活
性、保水性向上、食品の腐敗防止等の機能を有する食品
秦材として利用されている。
【０００４】一方、ある種の紅藻や緑藻の細胞壁に含ま
れる海藻特有の多糖類であるβ−１，３−キシランやそ
の分解物であるβ−１，３−キシロオリゴ糖について
は、セルロースやデンプンなどの多糖類や前述のβ−
１，４−キシラン及びその分解物であるβ−１，４−キ
シロオリゴ糖と比べて非常に研究が立ち後れており、未
だ市販されていないために、海藻細胞壁の構造研究並び
にβ−１，３−キシラナーゼの酵素学的研究に大きな支
障をきたしている。
れる海藻特有の多糖類であるβ−１，３−キシランやそ
の分解物であるβ−１，３−キシロオリゴ糖について
は、セルロースやデンプンなどの多糖類や前述のβ−
１，４−キシラン及びその分解物であるβ−１，４−キ
シロオリゴ糖と比べて非常に研究が立ち後れており、未
だ市販されていないために、海藻細胞壁の構造研究並び
にβ−１，３−キシラナーゼの酵素学的研究に大きな支
障をきたしている。
【０００５】図１はβ−１，３−キシランの化学構造を
示す説明図である。図に示す通り、β−１，３−キシラ
ンは、不溶性の中性多糖類であり、Ｄ−キシロースがβ
−１，３−結合（すなわち、3-0-β-D-xylopyranosyl-D
-xylose）で、直鎖状に繋がった構造をしている。
示す説明図である。図に示す通り、β−１，３−キシラ
ンは、不溶性の中性多糖類であり、Ｄ−キシロースがβ
−１，３−結合（すなわち、3-0-β-D-xylopyranosyl-D
-xylose）で、直鎖状に繋がった構造をしている。
【０００６】近年、海洋生物資源としての海藻類の有効
利用の観点から、また、新規素材物質としてのβ−１，
３−キシロオリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解
力を有するβ−１，３−キシラン分解酵素やβ−１，３
−キシラナーゼ産生能を有する新規な微生物の探索が行
われているが、これらについての知見は非常に乏しいの
が現状である。
利用の観点から、また、新規素材物質としてのβ−１，
３−キシロオリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解
力を有するβ−１，３−キシラン分解酵素やβ−１，３
−キシラナーゼ産生能を有する新規な微生物の探索が行
われているが、これらについての知見は非常に乏しいの
が現状である。
【０００７】このような現状において、本発明者はβ−
１，３−キシラナーゼを産生するビブリオ属細菌ＡＸ−
４株を見いだしている（日本水産学会誌 Vol.58, No.1
2, 2361-2365,1992）。しかし、この菌株から酵素を誘
導するためには、基質として精製キシランを使用せねば
ならず、コスト面等の問題が生じてしまう。また、本出
願人はβ−１，３−キシラン分解活性を有する新規なβ
−１，３−キシラナーゼ及び該酵素産生能力を有するア
ルカリゲネス属細菌ＸＹ−２３４を見出している（特願
平９−１２２８０９号）。すなわち、海藻粉末等β−
１，３−キシランを含む培地でＸＹ−２３４を培養する
ことにより、β−１，３−キシラナーゼを誘導できるこ
とと、この酵素が優れたβ−１，３−キシラン分解活性
を有することを示した。
１，３−キシラナーゼを産生するビブリオ属細菌ＡＸ−
４株を見いだしている（日本水産学会誌 Vol.58, No.1
2, 2361-2365,1992）。しかし、この菌株から酵素を誘
導するためには、基質として精製キシランを使用せねば
ならず、コスト面等の問題が生じてしまう。また、本出
願人はβ−１，３−キシラン分解活性を有する新規なβ
−１，３−キシラナーゼ及び該酵素産生能力を有するア
ルカリゲネス属細菌ＸＹ−２３４を見出している（特願
平９−１２２８０９号）。すなわち、海藻粉末等β−
１，３−キシランを含む培地でＸＹ−２３４を培養する
ことにより、β−１，３−キシラナーゼを誘導できるこ
とと、この酵素が優れたβ−１，３−キシラン分解活性
を有することを示した。
【０００８】しかしながら、上記の菌株を用いて工業的
規模の酵素生産を行うと力価が低く、多くの酵素を得よ
うとすると培養規模が過大となるため、製造コストが増
大する難点があった。このため、より酵素産生能の高い
菌株や、β−１，３−キシラン分解活性の強い新規β−
１，３−キシラナーゼの探索が望まれている。
規模の酵素生産を行うと力価が低く、多くの酵素を得よ
うとすると培養規模が過大となるため、製造コストが増
大する難点があった。このため、より酵素産生能の高い
菌株や、β−１，３−キシラン分解活性の強い新規β−
１，３−キシラナーゼの探索が望まれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、強
いβ−１，３−キシラン分解活性を有する新規なβ−
１，３−キシラナーゼを得ることを目的としている。ま
た、このβ−１，３−キシラナーゼ産生能の高い新規な
菌株を得ることを別の目的とする。更に、このβ−１，
３−キシラナーゼを用いる用途として、キシロオリゴ糖
の製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を
得ることを目的とする。
いβ−１，３−キシラン分解活性を有する新規なβ−
１，３−キシラナーゼを得ることを目的としている。ま
た、このβ−１，３−キシラナーゼ産生能の高い新規な
菌株を得ることを別の目的とする。更に、このβ−１，
３−キシラナーゼを用いる用途として、キシロオリゴ糖
の製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を
得ることを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係る新規なβ−１，３−キシラナーゼは、β−
１，３−キシランを分解し、主にキシロビオース（２糖
類）、キシロトリオース（３糖類）、キシロテトラオー
ス（４糖類）、キシロペンタオース（５糖類）並びにキ
シロヘキサオース（６糖類）にまで低分子化する反応を
触媒する酵素である。尚、具体的な理化学的性質は後に
詳述する。
発明に係る新規なβ−１，３−キシラナーゼは、β−
１，３−キシランを分解し、主にキシロビオース（２糖
類）、キシロトリオース（３糖類）、キシロテトラオー
ス（４糖類）、キシロペンタオース（５糖類）並びにキ
シロヘキサオース（６糖類）にまで低分子化する反応を
触媒する酵素である。尚、具体的な理化学的性質は後に
詳述する。
【００１１】本請求項２に記載された発明に係るβ−
１，３−キシラナーゼ産生微生物は、請求項１に記載さ
れたβ−１，３−キシラナーゼを産生する新規な海洋性
細菌としてビブリオ・アルギノリティクス(Vibrio algi
nolyticus)B-107を開示するものである。
１，３−キシラナーゼ産生微生物は、請求項１に記載さ
れたβ−１，３−キシラナーゼを産生する新規な海洋性
細菌としてビブリオ・アルギノリティクス(Vibrio algi
nolyticus)B-107を開示するものである。
【００１２】本請求項３に記載された発明に係るβ−
１，３−キシラナーゼの製造方法は、請求項１に記載さ
れたβ−１，３−キシラナーゼを製造する方法であっ
て、β−１，３−キシラナーゼを産生する能力を有する
ビブリオ属に属する微生物をβ−１，３−キシランを炭
素源として培養し、その培養上清液から分離・採取する
ものである。
１，３−キシラナーゼの製造方法は、請求項１に記載さ
れたβ−１，３−キシラナーゼを製造する方法であっ
て、β−１，３−キシラナーゼを産生する能力を有する
ビブリオ属に属する微生物をβ−１，３−キシランを炭
素源として培養し、その培養上清液から分離・採取する
ものである。
【００１３】本請求項４に記載されたキシロオリゴ糖の
製造方法は、請求項１に記載されたβ−１，３−キシラ
ナーゼで、β−１，３−キシランを基質として作用させ
るものである。
製造方法は、請求項１に記載されたβ−１，３−キシラ
ナーゼで、β−１，３−キシランを基質として作用させ
るものである。
【００１４】本請求項５に記載されたプロトプラストの
製造方法は、請求項１に記載されたβ−１，３−キシラ
ナーゼを海藻に作用させるものである。
製造方法は、請求項１に記載されたβ−１，３−キシラ
ナーゼを海藻に作用させるものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明におけるβ−１，３−キシ
ラナーゼは、主にキシロビオース（２糖類）、キシロト
リオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖類）、
キシロペンタオース（５糖類）並びにキシロヘキサオー
ス（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素で
あり、下記理化学的性質を有する。
ラナーゼは、主にキシロビオース（２糖類）、キシロト
リオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖類）、
キシロペンタオース（５糖類）並びにキシロヘキサオー
ス（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒する酵素で
あり、下記理化学的性質を有する。
【００１６】 （ａ）分子量；57，000 （ｂ）等電点；3．6 （ｃ）溶解性；水溶性 （ｄ）至適温度；４０℃ （ｅ）至適ｐＨ；７．５ （ｆ）ｐＨ安定性；６．０〜９．０ （ｇ）熱安定性；３０℃まで安定
【００１７】本発明のβ−１，３−キシラナーゼは微生
物を用いて生産される。このβ−１，３−キシラナーゼ
は、この酵素を生産する微生物を培養して、菌体内また
は培養上清から分離することができる。この酵素を生産
する微生物としては、例えば、本発明では新たに伊勢湾
の魚の腸管より分離されたビブリオ属菌株ＸＹ−２３５
株にＮＴＧ（ニトロソグアニジン）処理することにより
得られた変異株Ｂ−１０７株を用いることができる。こ
のビブリオ属Ｂ−１０７株は生工研菌寄託第１７０４０
号（平成１０年１１月０２日寄託）として既に寄託され
ている。
物を用いて生産される。このβ−１，３−キシラナーゼ
は、この酵素を生産する微生物を培養して、菌体内また
は培養上清から分離することができる。この酵素を生産
する微生物としては、例えば、本発明では新たに伊勢湾
の魚の腸管より分離されたビブリオ属菌株ＸＹ−２３５
株にＮＴＧ（ニトロソグアニジン）処理することにより
得られた変異株Ｂ−１０７株を用いることができる。こ
のビブリオ属Ｂ−１０７株は生工研菌寄託第１７０４０
号（平成１０年１１月０２日寄託）として既に寄託され
ている。
【００１８】尚、本発明のβ−１，３−キシラナーゼを
製造する方法およびその用途に用いる微生物としては、
前記ビブリオ属菌株Ｂ−１０７株とその変種、変異株に
限定されるものではなく、前記β−１，３−キシラナー
ゼ生産能を有するものであればよい。
製造する方法およびその用途に用いる微生物としては、
前記ビブリオ属菌株Ｂ−１０７株とその変種、変異株に
限定されるものではなく、前記β−１，３−キシラナー
ゼ生産能を有するものであればよい。
【００１９】また、β−１，３−キシラナーゼを工業的
規模で生産する場合には、上記の基質を含む培地で酵素
を誘導することにより、培養液の遠心上清（6,000rpm，
２０分）が 0.3U/ml以上の力価を有する菌株が望まし
い。特に緑藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属等の海藻粉末
を基質として、０．３Ｕ／ｍｌ以上の力価を有する酵素
を産生する菌株が作業性、コスト面等から最も望まし
い。このような菌株としては、例えば、前記Ｂ−１０７
株(Vibrio alginolyticus B-107)が挙げられる。なお、
酵素活性の１unit（１Ｕ）は後述するソモジ・ネルソン
(Somogyi-Nelson)法にて１分間に１μmolのＤ−キシロ
ースに相当する還元力を生ずる酵素量と定義した。
規模で生産する場合には、上記の基質を含む培地で酵素
を誘導することにより、培養液の遠心上清（6,000rpm，
２０分）が 0.3U/ml以上の力価を有する菌株が望まし
い。特に緑藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属等の海藻粉末
を基質として、０．３Ｕ／ｍｌ以上の力価を有する酵素
を産生する菌株が作業性、コスト面等から最も望まし
い。このような菌株としては、例えば、前記Ｂ−１０７
株(Vibrio alginolyticus B-107)が挙げられる。なお、
酵素活性の１unit（１Ｕ）は後述するソモジ・ネルソン
(Somogyi-Nelson)法にて１分間に１μmolのＤ−キシロ
ースに相当する還元力を生ずる酵素量と定義した。
【００２０】具体的なβ−１，３−キシラナーゼの製造
方法としては、このβ−１，３−キシラナーゼを産生す
る能力を有する微生物を海藻粉末またはβ−１，３−キ
シランを含有する培地中で培養し、その培養上清液から
分離して精製する方法が挙げられる。この培地は、炭素
源として海藻粉末またはβ−１，３−キシランを含む他
に、窒素源、無機化合物等栄養素を適当量含有するもの
であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用すること
ができる。
方法としては、このβ−１，３−キシラナーゼを産生す
る能力を有する微生物を海藻粉末またはβ−１，３−キ
シランを含有する培地中で培養し、その培養上清液から
分離して精製する方法が挙げられる。この培地は、炭素
源として海藻粉末またはβ−１，３−キシランを含む他
に、窒素源、無機化合物等栄養素を適当量含有するもの
であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用すること
ができる。
【００２１】具体的なβ−１，３−キシランを含む物質
としては、縁藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属から分離し
たβ−１，３−キシランを用いることもできる。培地中
の海藻粉末またはβ−１，３−キシランの濃度はβ−
１，３−キシラン換算で０．１ｍｇ／ｍｌであれば、充
分な酵素誘導を行うことができ、１．０ｍｇ／ｍｌを越
えると、培養時の突沸が起きてしまう場合がある。この
ため、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ、特に、０．２〜０．
５ｍｇ／ｍｌが好ましい。また、両者以外にも炭素源と
して各種糖質、すなわち、グルコース、フルクトース、
マンニトール、ガラクトース、キシロース等を別途に加
えてもよい。
としては、縁藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属から分離し
たβ−１，３−キシランを用いることもできる。培地中
の海藻粉末またはβ−１，３−キシランの濃度はβ−
１，３−キシラン換算で０．１ｍｇ／ｍｌであれば、充
分な酵素誘導を行うことができ、１．０ｍｇ／ｍｌを越
えると、培養時の突沸が起きてしまう場合がある。この
ため、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ、特に、０．２〜０．
５ｍｇ／ｍｌが好ましい。また、両者以外にも炭素源と
して各種糖質、すなわち、グルコース、フルクトース、
マンニトール、ガラクトース、キシロース等を別途に加
えてもよい。
【００２２】また、窒素源としては、通常の培地の組成
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等（の動植物等の加水分解物）や各種無機アン
モニウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又
は２種以上を用いることができる。特に、ポリペプトン
を用いると、高力価が得られ好ましい。
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等（の動植物等の加水分解物）や各種無機アン
モニウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又
は２種以上を用いることができる。特に、ポリペプトン
を用いると、高力価が得られ好ましい。
【００２３】更に、無機化合物としては、培養される微
生物の必須無機塩として、ナトリウム、カルシウム、マ
グネシウム、鉄、マンガン等のリン酸塩、塩酸塩、硝酸
塩、炭酸塩、酢酸塩等を１種以上用いることができる。
生物の必須無機塩として、ナトリウム、カルシウム、マ
グネシウム、鉄、マンガン等のリン酸塩、塩酸塩、硝酸
塩、炭酸塩、酢酸塩等を１種以上用いることができる。
【００２４】培養には、目的のβ−１，３−キシラナー
ゼを産生する微生物の至適培養条件に応じた培養方法及
び条件が選択される。例えば、好気性微生物であれば、
振盪培養、通気撹拌培養等により大量に培養することが
でき、良好である。
ゼを産生する微生物の至適培養条件に応じた培養方法及
び条件が選択される。例えば、好気性微生物であれば、
振盪培養、通気撹拌培養等により大量に培養することが
でき、良好である。
【００２５】微生物の培養によって産生されたβ−１，
３−キシラナーゼは、通常の方法によって、分離・精製
される。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌
体を通常用いられている手段によって破砕しβ−１，３
−キシラナーゼを抽出して精製される。また、培養液中
に産生されたβ−１，３−キシラナーゼは、微生物を濾
過、遠心分離等の方法で除去して精製される。
３−キシラナーゼは、通常の方法によって、分離・精製
される。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌
体を通常用いられている手段によって破砕しβ−１，３
−キシラナーゼを抽出して精製される。また、培養液中
に産生されたβ−１，３−キシラナーゼは、微生物を濾
過、遠心分離等の方法で除去して精製される。
【００２６】精製方法としては、通常用いられている精
製方法を利用することができる。例えば、塩析、溶媒沈
殿により、β−１，３−キシラナーゼを沈殿させて溶媒
中から分離して、精製することができる。また、沈殿さ
せたものを更にイオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動等により、更に精製
することもできる。
製方法を利用することができる。例えば、塩析、溶媒沈
殿により、β−１，３−キシラナーゼを沈殿させて溶媒
中から分離して、精製することができる。また、沈殿さ
せたものを更にイオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動等により、更に精製
することもできる。
【００２７】得られたβ−１，３−キシラナーゼの用途
としては、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用するこ
とができる。例えば、β−１，３−キシランを基質とし
て作用させることにより、キシロオリゴ糖を製造するこ
とができる。このβ−１，３−キシランから得られるキ
シロオリゴ糖は、海藻細胞壁の構造研究やβ−１，３−
キシラナーゼの酵素学的性質を解明する上での研究用試
薬として利用できるのは前述の通りである。
としては、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用するこ
とができる。例えば、β−１，３−キシランを基質とし
て作用させることにより、キシロオリゴ糖を製造するこ
とができる。このβ−１，３−キシランから得られるキ
シロオリゴ糖は、海藻細胞壁の構造研究やβ−１，３−
キシラナーゼの酵素学的性質を解明する上での研究用試
薬として利用できるのは前述の通りである。
【００２８】また、得られたβ−１，３−キシラナーゼ
の研究試薬の用途しては、例えば、アマノリ等の海藻に
β−１，３−キシラナーゼを作用させることにより、容
易にプロトプラストを単離することができる。
の研究試薬の用途しては、例えば、アマノリ等の海藻に
β−１，３−キシラナーゼを作用させることにより、容
易にプロトプラストを単離することができる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】１．β−１，３−キシラナーゼ高生産株の
取得 β−１，３−キシラン生産能を有する微生物として、伊
勢湾の魚の腸管より分離された、ビブリオ・アルギノリ
ティクス(Vibrio alginolyticus)ＸＹ−２３５株を親株
として、下記の方法によりβ−１，３−キシラナーゼ高
生産株を作出した。
取得 β−１，３−キシラン生産能を有する微生物として、伊
勢湾の魚の腸管より分離された、ビブリオ・アルギノリ
ティクス(Vibrio alginolyticus)ＸＹ−２３５株を親株
として、下記の方法によりβ−１，３−キシラナーゼ高
生産株を作出した。
【００３１】（供試菌株）ビブリオ・アルギノリティク
ス(Vibrio alginolyticus)ＸＹ−２３５株
ス(Vibrio alginolyticus)ＸＹ−２３５株
【００３２】（変異株の取得方法）上記ＸＹ−２３５株
を親株に、化学変異剤ＮＴＧ（ニトロソグアニジン）で
変異処理を施し、酵素高生産株の分離を試みた。まず、
１００ｍｌ容三角コルベンに、炭素源としてスリコギズ
タ海藻粉末（β−１，３−キシランを含む）下記組成の
基本培地２０ｍｌを加え、これにＸＹ−２３５株を接種
し、２５℃で振盪培養もしくは静置培養した。次に、培
養経過５時間目の菌体をＭＥＳバッファーに懸濁後、Ｎ
ＴＧ処理濃度２００μｇ／ｍｌ，２５℃、１５分の条件
で処理した。これにより得られた処理菌体を基本培地の
プレートで２日間培養し、出現したコロニーを選択プレ
ートに移し、１日培養後、周囲が透明になっているコロ
ニーを選択し、再度基本培地にて２０時間試験管振盪培
養を行い、酵素活性（力価）を測定した。なお、選択プ
レートとは、上記基本培地を半量の水に溶解後、超音波
破砕機で１０分処理し、１２１℃、３０分滅菌後、遠心
分離した上清を培地主成分として作製したものである。
を親株に、化学変異剤ＮＴＧ（ニトロソグアニジン）で
変異処理を施し、酵素高生産株の分離を試みた。まず、
１００ｍｌ容三角コルベンに、炭素源としてスリコギズ
タ海藻粉末（β−１，３−キシランを含む）下記組成の
基本培地２０ｍｌを加え、これにＸＹ−２３５株を接種
し、２５℃で振盪培養もしくは静置培養した。次に、培
養経過５時間目の菌体をＭＥＳバッファーに懸濁後、Ｎ
ＴＧ処理濃度２００μｇ／ｍｌ，２５℃、１５分の条件
で処理した。これにより得られた処理菌体を基本培地の
プレートで２日間培養し、出現したコロニーを選択プレ
ートに移し、１日培養後、周囲が透明になっているコロ
ニーを選択し、再度基本培地にて２０時間試験管振盪培
養を行い、酵素活性（力価）を測定した。なお、選択プ
レートとは、上記基本培地を半量の水に溶解後、超音波
破砕機で１０分処理し、１２１℃、３０分滅菌後、遠心
分離した上清を培地主成分として作製したものである。
【００３３】（生菌数測定）培養液をＭＥＳバッファー
（ｐＨ７．５）にて希釈し、ＴＣＢＳ寒天培地（ニッス
イ社製）プレートで−晩培養し、コロニーカウント法に
より算出した。
（ｐＨ７．５）にて希釈し、ＴＣＢＳ寒天培地（ニッス
イ社製）プレートで−晩培養し、コロニーカウント法に
より算出した。
【００３４】（力価の測定）ネルソン・ソモギー法を用
いて、β−１，３−キシラナーゼの酵素活性を測定し
た。培養液の遠心上清（６０００ｒｐｍ，２０分）を酵
素液とした。酵素液０．２ｍｌ，１００ｍＭＭＥＳバッ
ファー（ｐＨ７．５）０．３ｍｌを試験管に入れ４０℃
で５分予熱後、基質溶液（精製キシラン１．０％を１０
０ｍＭ ＭＥＳバッファーに溶解したもの）０．５ｍｌ
を加え、１５〜３０分反応させた。アルカリ性銅試薬を
１．０ｍｌ加えて反応を停止し、試験管口をガラス玉で
塞ぎ、沸騰水中で１５〜３０分加熱する。冷却後、この
液に砒素モリブデン酸試薬１．０ｍｌを加えよく撹拌
し、１５分室温で放置する。この液にさらに１０ｍｌの
蒸留水を加えよく撹拌する。１０００ｒｐｍ，２分間遠
心後、５００ｍｌで吸光度を測定し、対照との吸光度差
から力価を算出した。
いて、β−１，３−キシラナーゼの酵素活性を測定し
た。培養液の遠心上清（６０００ｒｐｍ，２０分）を酵
素液とした。酵素液０．２ｍｌ，１００ｍＭＭＥＳバッ
ファー（ｐＨ７．５）０．３ｍｌを試験管に入れ４０℃
で５分予熱後、基質溶液（精製キシラン１．０％を１０
０ｍＭ ＭＥＳバッファーに溶解したもの）０．５ｍｌ
を加え、１５〜３０分反応させた。アルカリ性銅試薬を
１．０ｍｌ加えて反応を停止し、試験管口をガラス玉で
塞ぎ、沸騰水中で１５〜３０分加熱する。冷却後、この
液に砒素モリブデン酸試薬１．０ｍｌを加えよく撹拌
し、１５分室温で放置する。この液にさらに１０ｍｌの
蒸留水を加えよく撹拌する。１０００ｒｐｍ，２分間遠
心後、５００ｍｌで吸光度を測定し、対照との吸光度差
から力価を算出した。
【００３５】上記の変異処理により、ＸＹ−２３５株よ
りもβ−１，３−キシラナーゼ力価の高い株が得られ
た。この中で、最も活性の高かった株に対し、再度上記
の操作を行った結果、０．３Ｕ／ｍｌ（培養液上清）以
上の力価を有するＢ−１０７株及びＢ−１３３株が得ら
れた。図２は得られたＢ−１０７株、Ｂ−１３３株及び
ＸＹ−２３５株（親株）のβ−１，３−キシラナーゼ力
価を示すグラフである。
りもβ−１，３−キシラナーゼ力価の高い株が得られ
た。この中で、最も活性の高かった株に対し、再度上記
の操作を行った結果、０．３Ｕ／ｍｌ（培養液上清）以
上の力価を有するＢ−１０７株及びＢ−１３３株が得ら
れた。図２は得られたＢ−１０７株、Ｂ−１３３株及び
ＸＹ−２３５株（親株）のβ−１，３−キシラナーゼ力
価を示すグラフである。
【００３６】（基本培地） ＮａＣｌ ３．０％ ポリペプトン ０．５％ イーストエキス ０．３％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％ 海藻粉末（スリコギズタ） ０．３％ ｐＨ７．５，１２１℃、３０分滅菌
【００３７】２．菌学的性質 このβ−１，３−キシラナーゼ生産能の高いＢ−１０７
株は、Bergeys' MamalSystematic Bacteriologyの記載
に準拠して同定を行ったところ、次に示す結果からビブ
リオ・アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)に属
していることが判明した。この微生物の形態は、次の表
１に示すものである。また、表２に生理学的試験結果を
示す。この表１及び表２の結果より、本微生物は海洋性
細菌ビブリオ・アルギノリティクスであることが確認さ
れた。なお、本菌株をビブリオ・アルギノリティクスＢ
−１０７株と命名した。
株は、Bergeys' MamalSystematic Bacteriologyの記載
に準拠して同定を行ったところ、次に示す結果からビブ
リオ・アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)に属
していることが判明した。この微生物の形態は、次の表
１に示すものである。また、表２に生理学的試験結果を
示す。この表１及び表２の結果より、本微生物は海洋性
細菌ビブリオ・アルギノリティクスであることが確認さ
れた。なお、本菌株をビブリオ・アルギノリティクスＢ
−１０７株と命名した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】すなわち、グラム陰性で単極毛を有し、Ｏ
Ｆテストでは発酵性がなく、カタラーゼならびにオキシ
ダーゼテスト陽性、グルコース培地から酸を酸性しガス
非酸性であった。
Ｆテストでは発酵性がなく、カタラーゼならびにオキシ
ダーゼテスト陽性、グルコース培地から酸を酸性しガス
非酸性であった。
【００４１】ビブリオ・アルギノリティクスＢ−１０７
株の炭素源としての糖の利用性等を調べた。結果を表３
に示す。
株の炭素源としての糖の利用性等を調べた。結果を表３
に示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】３．β−１，３−キシラナーゼの精製 産生されたβ−１，３−キシラナーゼを精製した。すな
わち、本菌株を上記の条件で大量培養し、遠心分離して
得られた培養上清液に７５％飽和になるように固形硫酸
アンモニウムを加えた。４℃で１日放置後、遠心分離
し、生じた沈殿を少量の５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ
７．５に溶解し、同緩衝液で透析後、透析内液を塩析酵
素液として用いた。
わち、本菌株を上記の条件で大量培養し、遠心分離して
得られた培養上清液に７５％飽和になるように固形硫酸
アンモニウムを加えた。４℃で１日放置後、遠心分離
し、生じた沈殿を少量の５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ
７．５に溶解し、同緩衝液で透析後、透析内液を塩析酵
素液として用いた。
【００４４】塩析酵素液を陰イオン交換クロマトグラフ
ィー(Q-Sepharose FF)、ゲル濾過クロマトグラフィー(T
oyopearl HW-55)、疎水クロマトグラフィー(Ether-Toyo
pearl 650S)、陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono Q
HR5/5)で分画したところ、ポリアクリルアミドディス
ク電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動とで
均−に精製されていることが判明した。
ィー(Q-Sepharose FF)、ゲル濾過クロマトグラフィー(T
oyopearl HW-55)、疎水クロマトグラフィー(Ether-Toyo
pearl 650S)、陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono Q
HR5/5)で分画したところ、ポリアクリルアミドディス
ク電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動とで
均−に精製されていることが判明した。
【００４５】４．β−１，３−キシラナーゼの酵素学的
性質 得られたβ−１，３−キシラナーゼの分子量、当電点、
溶解性、至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度、金属イオン
の活性に与える影響等を測定した。金属イオンの活性に
与える影響は、各金属塩を反応系での最終濃度が金属イ
オンで１ｍＭになるよう添加し、金属塩無添加（脱イオ
ン水）での活性を１００として各金属イオンの相対活性
を測定した。結果を次の表４，５に示す。また、精製β
−１，３−キシラナーゼのβ−１，３−キシランに対す
る作用様式を調べた。その結果を表６に示す。
性質 得られたβ−１，３−キシラナーゼの分子量、当電点、
溶解性、至適ｐＨ，ｐＨ安定性、至適温度、金属イオン
の活性に与える影響等を測定した。金属イオンの活性に
与える影響は、各金属塩を反応系での最終濃度が金属イ
オンで１ｍＭになるよう添加し、金属塩無添加（脱イオ
ン水）での活性を１００として各金属イオンの相対活性
を測定した。結果を次の表４，５に示す。また、精製β
−１，３−キシラナーゼのβ−１，３−キシランに対す
る作用様式を調べた。その結果を表６に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
【表６】
【００４９】５．β−１，３−キシランからのキシロオ
リゴ糖の製造 β−１，３−キシランからオリゴ糖を調製する方法とし
て酸による加水分解がある。しかしながら、酸加水分解
法は100 ℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、
オリゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よく
オリゴ糖を調製することが困難である。それに対して、
前記β−１，３−キシラナーゼを用いる方法では室温で
効率よくオリゴ糖を調製することが可能である。
リゴ糖の製造 β−１，３−キシランからオリゴ糖を調製する方法とし
て酸による加水分解がある。しかしながら、酸加水分解
法は100 ℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、
オリゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よく
オリゴ糖を調製することが困難である。それに対して、
前記β−１，３−キシラナーゼを用いる方法では室温で
効率よくオリゴ糖を調製することが可能である。
【００５０】すなわち、100ml 容三角フラスコに1%β−
１，３−キシランを含む20mM酢酸緩衝液を20ml注入し、
ビブリオ・アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)
Ｂ−１０７株のβ−１，３−キシラナーゼ溶液(0.65uni
t/ml) を1.5ml 加え、37℃、24時間反応させた。反応フ
ラスコを沸騰水浴中に15分間浸漬して反応を停止し、冷
却後遠心分離した。得られた上澄液を蒸留水で平衡化し
た活性炭カラム（２×４０cm）に通した。最初蒸留水で
溶出し、次いで、９，１４，２９，５０及び７５％のエ
タノールで段階的にオリゴ糖を溶出した。
１，３−キシランを含む20mM酢酸緩衝液を20ml注入し、
ビブリオ・アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)
Ｂ−１０７株のβ−１，３−キシラナーゼ溶液(0.65uni
t/ml) を1.5ml 加え、37℃、24時間反応させた。反応フ
ラスコを沸騰水浴中に15分間浸漬して反応を停止し、冷
却後遠心分離した。得られた上澄液を蒸留水で平衡化し
た活性炭カラム（２×４０cm）に通した。最初蒸留水で
溶出し、次いで、９，１４，２９，５０及び７５％のエ
タノールで段階的にオリゴ糖を溶出した。
【００５１】６．プロトプラストの製造 アマノリ１ｇを５％パパインと、０．５Ｍマンニトール
（ソルビトールでもかまわない）含有２０ｍＭ ＭＥＳ
緩衝液ｐＨ７．５（海水もしくは人口海水でもかまわな
い）３０ｍｌを入れた１００ｍｌ容コルベンに加え、２
２℃、１５分間振盪した。葉状体を０．５Ｍマンニトー
ル（ソルビトールでもかまわない）、２％ＮａＣｌを含
む２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５（海水もしくは人
口海水でもかまわない）で数回洗浄した後、メスで数mm
片に切断した。
（ソルビトールでもかまわない）含有２０ｍＭ ＭＥＳ
緩衝液ｐＨ７．５（海水もしくは人口海水でもかまわな
い）３０ｍｌを入れた１００ｍｌ容コルベンに加え、２
２℃、１５分間振盪した。葉状体を０．５Ｍマンニトー
ル（ソルビトールでもかまわない）、２％ＮａＣｌを含
む２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．５（海水もしくは人
口海水でもかまわない）で数回洗浄した後、メスで数mm
片に切断した。
【００５２】次いで、２０ｍＭ客三角フラスコに分注し
た細胞壁分解酵素（β−１，４−マンナナーゼ（ヤクル
ト薬品工業社製）、本発明のβ−１，３−キシラナー
ゼ、βアガラーゼ（特開平８−２９４３８９号公報に記
載）の各１unit）に葉状体断片を投入し、２２℃で振盪
した。未分解の葉状体を取り除くために４０μｍのナイ
ロンネットで濾別し、ネットを通過したプロトプラスト
を遠心分離（TOMY LC-121，７０×ｇ，５分間）して集
め、次いで、０．５Ｍ及び０．２Ｍマンニトール（ソル
ビトールでもかまわない）を含むＡＳＰ１２（ＮＴＡ）
培地（海水もしくは人口海水でもかまわない）で順次遠
心洗浄した。その結果、アマノリ１ｇから約１×１０７
個のプロトプラストを得た。
た細胞壁分解酵素（β−１，４−マンナナーゼ（ヤクル
ト薬品工業社製）、本発明のβ−１，３−キシラナー
ゼ、βアガラーゼ（特開平８−２９４３８９号公報に記
載）の各１unit）に葉状体断片を投入し、２２℃で振盪
した。未分解の葉状体を取り除くために４０μｍのナイ
ロンネットで濾別し、ネットを通過したプロトプラスト
を遠心分離（TOMY LC-121，７０×ｇ，５分間）して集
め、次いで、０．５Ｍ及び０．２Ｍマンニトール（ソル
ビトールでもかまわない）を含むＡＳＰ１２（ＮＴＡ）
培地（海水もしくは人口海水でもかまわない）で順次遠
心洗浄した。その結果、アマノリ１ｇから約１×１０７
個のプロトプラストを得た。
【００５３】
【発明の効果】本発明は以上説明した通り、β−１，３
−キシラナーゼは、β−１，３−キシランを分解してキ
シロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオー
ス、キシロペンタオース、キシロヘキサオースなどへの
低分子化反応を触媒する等の特徴を有する新規な酵素で
あり、本発明ではこのβ−１，３−キシラナーゼを得る
ことができる。
−キシラナーゼは、β−１，３−キシランを分解してキ
シロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオー
ス、キシロペンタオース、キシロヘキサオースなどへの
低分子化反応を触媒する等の特徴を有する新規な酵素で
あり、本発明ではこのβ−１，３−キシラナーゼを得る
ことができる。
【００５４】また、本発明では、このβ−１，３−キシ
ラナーゼを産生する新規な微生物ビブリオ・アルギノリ
ティクス(Vibrio alginolyticus)Ｂ−１０７株を得るこ
とができる。
ラナーゼを産生する新規な微生物ビブリオ・アルギノリ
ティクス(Vibrio alginolyticus)Ｂ−１０７株を得るこ
とができる。
【００５５】更に、このβ−１，３−キシラナーゼを産
生する微生物をβ−１，３−キシランを炭素源にして培
養し、その培養上清液から分離して精製することによ
り、製造することができる。
生する微生物をβ−１，３−キシランを炭素源にして培
養し、その培養上清液から分離して精製することによ
り、製造することができる。
【００５６】また、このβ−１，３−キシラナーゼを用
いる用途として、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、β−１，３−キシランを基質として作用させること
により、キシロオリゴ糖を製造することができる。この
β−１，３−キシランから得られるオリゴ糖は海藻細胞
壁多糖の研究用試薬として有用である。
いる用途として、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、β−１，３−キシランを基質として作用させること
により、キシロオリゴ糖を製造することができる。この
β−１，３−キシランから得られるオリゴ糖は海藻細胞
壁多糖の研究用試薬として有用である。
【００５７】更に、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、細胞壁にβ−１，３−キシランを含む海藻（アマノ
リ、イワズダ等）に作用させることにより、容易に細胞
壁を溶解し、プロトプラストを単離することができると
いう効果がある。
は、細胞壁にβ−１，３−キシランを含む海藻（アマノ
リ、イワズダ等）に作用させることにより、容易に細胞
壁を溶解し、プロトプラストを単離することができると
いう効果がある。
【図１】β−１，３−キシランの化学構造を示す説明図
である。
である。
【図２】Ｂ−１０７株、Ｂ−１３３株及びＸＹ−２３５
株（親株）のβ−１，３−キシラナーゼ力価を示すグラ
フである。
株（親株）のβ−１，３−キシラナーゼ力価を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:63） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:89） (72)発明者 志村 喜作 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 (72)発明者 三沢 宏 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 EE02 LL01 LL02 LL05 LL10 4B064 AF04 CA02 DA01 DA10 DA16 DA20 4B065 AA55X AA88X AC14 BA10 BB18 CA31
Claims (5)
- 【請求項１】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）並びにキシロヘキサオース（６糖類）に
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記の
理化学的性質を有する新規なβ−１，３−キシラナー
ゼ。 (a) 分子量；57,000 (b) 等電点；3.6 (c) 溶解性；水溶性 (d) 至適温度；４０℃ (e) 至適ｐＨ；ｐＨ 7.5 (f) ｐＨ安定性；ｐＨ 6.0〜9.0 (g) 熱安定性；３０℃まで安定 - 【請求項２】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼを産生する新規な海洋性細菌であるビブリオ・
アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)B-107。 - 【請求項３】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼを製造する方法であって、 β−１，３−キシラナーゼを産生する能力を有するビブ
リオ属に属する微生物をβ−１，３−キシランを炭素源
として培養し、その培養上清液から分離・採取すること
を特徴とするβ−１，３−キシラナーゼの製造方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼで、β−１，３−キシランを基質として作用さ
せることを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼを海藻に作用させることを特徴とする海藻細胞
のプロトプラストの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10336991A JP2000157262A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10336991A JP2000157262A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000157262A true JP2000157262A (ja) | 2000-06-13 |
Family
ID=18304467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10336991A Pending JP2000157262A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000157262A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509626A (ja) * | 2000-09-21 | 2004-04-02 | デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| US9127174B2 (en) | 2006-01-20 | 2015-09-08 | Ezaki Glico Co., Ltd. | Aqueous composition for conductive coating |
-
1998
- 1998-11-27 JP JP10336991A patent/JP2000157262A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509626A (ja) * | 2000-09-21 | 2004-04-02 | デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| JP4878428B2 (ja) * | 2000-09-21 | 2012-02-15 | ベーアーエスエフ・アクチエンゲゼルシャフト | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| US9127174B2 (en) | 2006-01-20 | 2015-09-08 | Ezaki Glico Co., Ltd. | Aqueous composition for conductive coating |
| US9315678B2 (en) | 2006-01-20 | 2016-04-19 | Ezaki Glico Co., Ltd. | Affinity of hardly soluble or insoluble substance solvent by water-soluble xylan |
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