JPS63209595A - β−1,4−マンノビオ−スの製造法 - Google Patents
β−1,4−マンノビオ−スの製造法Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明はβ−1,4−マンノビオースの製造法、更に詳
細には、糖鎖の合成原料あるいは医薬として有用なβ−
1,4−マンノビオース(以下、単にマンノビオースと
いうことがある)の製造法に関する。
細には、糖鎖の合成原料あるいは医薬として有用なβ−
1,4−マンノビオース(以下、単にマンノビオースと
いうことがある)の製造法に関する。
(従来の技術及びその問題点)
マンノビオースは、D−マンノースがβ−1,4−グリ
コシド結合で2個結合した2tJ!類で、例えばマンナ
ンを酵素又は酸で部分的に加水分解し、加水分解液から
精製・単離することにより得られる。
コシド結合で2個結合した2tJ!類で、例えばマンナ
ンを酵素又は酸で部分的に加水分解し、加水分解液から
精製・単離することにより得られる。
従来、このβ−1,4−グリコシド結合を切断する酵素
としては、例えばアスペルギルス属、バチルス属、トリ
コデルマ属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等に
属する微生物が産生ずるβ−マンナナーゼが知られてい
る。
としては、例えばアスペルギルス属、バチルス属、トリ
コデルマ属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等に
属する微生物が産生ずるβ−マンナナーゼが知られてい
る。
しかしながら、従来知られているβ−マンナナーゼは活
性が低く、これをマンナン等に作用させた場合、いずれ
も加水分解あるいは部分加水分解の結果、マンノビオー
ス以外にD−マンノース、マンノトリオース、その他の
オリゴ糖が生成し、更に糖化率も悪く特にマンノビオー
スのみ生産する目的には有利なものとは云えなかった。
性が低く、これをマンナン等に作用させた場合、いずれ
も加水分解あるいは部分加水分解の結果、マンノビオー
ス以外にD−マンノース、マンノトリオース、その他の
オリゴ糖が生成し、更に糖化率も悪く特にマンノビオー
スのみ生産する目的には有利なものとは云えなかった。
最近、放線菌であるストレプトミセス・エスピー (S
treptoleyces sp、) flh17が産
生するβ−マンナナーゼは、従来のβ−マンナナーゼに
比ベマンノビオースを多量に生成することが報告された
〔Japanese Journal of Trop
ical Agriculture。
treptoleyces sp、) flh17が産
生するβ−マンナナーゼは、従来のβ−マンナナーゼに
比ベマンノビオースを多量に生成することが報告された
〔Japanese Journal of Trop
ical Agriculture。
29 +31.167−172 (1985) )が
、このβ−マンナナーゼによりコブラマンナンを加水分
解して、D−マンノース12重量%(以下、単に%で示
す)、マンノビオース71%、マンノトリオース9%、
オリゴva8%の糖組成物を得ているにすぎない。
、このβ−マンナナーゼによりコブラマンナンを加水分
解して、D−マンノース12重量%(以下、単に%で示
す)、マンノビオース71%、マンノトリオース9%、
オリゴva8%の糖組成物を得ているにすぎない。
つまりストレプトミセス・エスピー417の産生ずるβ
−マンナナーゼは、■活性が低くマンノビオースの生産
効率が悪い、■マンノビオースと共晶を形成するマンノ
トリオースの生産量が多いため、マンノビオースの単離
が困難である、及び■マンノトリオース同様分離が困難
なガラクトマンノオリゴ糖を生成する等の欠点を有して
いた。
−マンナナーゼは、■活性が低くマンノビオースの生産
効率が悪い、■マンノビオースと共晶を形成するマンノ
トリオースの生産量が多いため、マンノビオースの単離
が困難である、及び■マンノトリオース同様分離が困難
なガラクトマンノオリゴ糖を生成する等の欠点を有して
いた。
また、酸による部分加水分解による方法は、マンノビオ
ースのみ製造する目的には不適当である点で、従来のβ
−マンナナーゼによる方法と同様の欠点を有していた。
ースのみ製造する目的には不適当である点で、従来のβ
−マンナナーゼによる方法と同様の欠点を有していた。
(問題点を解決するための手段)
本発明者は、かかる実情において、マンノビオースの製
造に更に適した活性を有するβ−マンナナーゼ含有組成
物を産生ずる微生物を自然界から検索した結果、フィリ
ピンの土壌から分離したペニシリウム(Penicil
lium)属に属する微生物が、■マンナンに対し高い
分解活性を有するβ−マンナナーゼ含有組成物を産生ず
ること、■これをマンナン又はマンナン含有天然物に作
用させた場合、驚くべきことにマンノトリオースをほと
んど生成せずマンノビオースを選択的に生成すること、
かつ、■このβ−マンナナーゼ含有組成物はβ−ガラク
トシダーゼ活性を有するため、コブラマンナンのような
ガラクトマンナンをマンノビオースにまで加水分解する
ことができ、ガラクトマンノオリゴ糖を生成しないこと
を見出し、本発明を完成した。
造に更に適した活性を有するβ−マンナナーゼ含有組成
物を産生ずる微生物を自然界から検索した結果、フィリ
ピンの土壌から分離したペニシリウム(Penicil
lium)属に属する微生物が、■マンナンに対し高い
分解活性を有するβ−マンナナーゼ含有組成物を産生ず
ること、■これをマンナン又はマンナン含有天然物に作
用させた場合、驚くべきことにマンノトリオースをほと
んど生成せずマンノビオースを選択的に生成すること、
かつ、■このβ−マンナナーゼ含有組成物はβ−ガラク
トシダーゼ活性を有するため、コブラマンナンのような
ガラクトマンナンをマンノビオースにまで加水分解する
ことができ、ガラクトマンノオリゴ糖を生成しないこと
を見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、次の理化学的性質、■作用
β−マンナナーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性を
有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マン
ノビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成
しない。
有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マン
ノビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成
しない。
■基質特異性
マンナン、ガラクトマンナンに特異的に作用するが、キ
シラン、セルロースには作用しない。
シラン、セルロースには作用しない。
■至適pH及び安定pH範囲
至適pHは約5.8、安定pl+範囲は約4〜約8であ
る。
る。
■至適温度
約40〜約60℃
■pHによる失活の条件(30℃)
pos、sで3時間保持した時の活性を100%とする
とき、p112で約65%、p)14で約90%及びp
H8で約95%の活性がある。
とき、p112で約65%、p)14で約90%及びp
H8で約95%の活性がある。
■温度による失活の条件(pH5,8)温度50℃で3
時間保持した時の活性を100%とするとき、40℃で
約100%、70℃で約40%の活性がある。
時間保持した時の活性を100%とするとき、40℃で
約100%、70℃で約40%の活性がある。
を有する、β−マンナナーゼ含有組成物を、マンナン又
はマンナン含有天然物に作用させる、:とを特徴とする
β−1,4−マンノビオースの製造法を提供するもので
ある。
はマンナン含有天然物に作用させる、:とを特徴とする
β−1,4−マンノビオースの製造法を提供するもので
ある。
本発明で使用されるβ−マンナナーゼ含有組成物として
は、例えばペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ生
産菌を培養して得られる培養液、特に好ましくは培養ろ
液等が挙げられる。ペニシリウム属に属するβ−マンナ
ナーゼ生産菌としては、例えばペニシリウム・ パープ
ルゲナム (Penicillium purpur
ogenum) 、ペニシリウム′クリソゲナム(P、
chrysogenu++)、ペニシリウム゛エクスパ
ンサム(P、expansum) 、ペニシリウム・フ
ニクロサム(P、 funiculosum) %ペニ
シリウム・イサリフォーム(P、isariiform
e)、ペニシリウム・オクロ−クロロン(P、ochr
o−chtoron) 、ペニシリウム・ビスカリウム
(P、pisearium) 、ペニシリウム・パルク
ロサム(P、 verrueu Iosum)、ペニシ
リウム・フォートマンニ(P、wortmanni)等
が挙げられる0例えば、ペニシリウム・パープルゲナム
陽618は本発明者が見出した新閑株であって、次の菌
学的性質を有する。
は、例えばペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ生
産菌を培養して得られる培養液、特に好ましくは培養ろ
液等が挙げられる。ペニシリウム属に属するβ−マンナ
ナーゼ生産菌としては、例えばペニシリウム・ パープ
ルゲナム (Penicillium purpur
ogenum) 、ペニシリウム′クリソゲナム(P、
chrysogenu++)、ペニシリウム゛エクスパ
ンサム(P、expansum) 、ペニシリウム・フ
ニクロサム(P、 funiculosum) %ペニ
シリウム・イサリフォーム(P、isariiform
e)、ペニシリウム・オクロ−クロロン(P、ochr
o−chtoron) 、ペニシリウム・ビスカリウム
(P、pisearium) 、ペニシリウム・パルク
ロサム(P、 verrueu Iosum)、ペニシ
リウム・フォートマンニ(P、wortmanni)等
が挙げられる0例えば、ペニシリウム・パープルゲナム
陽618は本発明者が見出した新閑株であって、次の菌
学的性質を有する。
(1)培地における生育状態
■麦芽寒天培地
麦芽寒天培地での生育は5℃では全く起こらず、25℃
では7日間でコロニーの直径が3〜40に達する。性状
はビロード状である。14日間でコ17二−の直径は7
〜8omに達し、中心部より順次分生子形成し、それに
従ってくすんだ黄緑色、かんらん緑色、灰緑色等を生ず
る。集落裏面に一部赤色部があり、りんご様の芳香がす
る。37℃の生育では7日間ではコロニーの直径が5〜
6c11に達する。14日間ではコロニーの直径が8〜
9cmに達し、良く分生子形成し、色は黄緑から灰緑色
になる。コロニーの裏面は中心部が赤色である。
では7日間でコロニーの直径が3〜40に達する。性状
はビロード状である。14日間でコ17二−の直径は7
〜8omに達し、中心部より順次分生子形成し、それに
従ってくすんだ黄緑色、かんらん緑色、灰緑色等を生ず
る。集落裏面に一部赤色部があり、りんご様の芳香がす
る。37℃の生育では7日間ではコロニーの直径が5〜
6c11に達する。14日間ではコロニーの直径が8〜
9cmに達し、良く分生子形成し、色は黄緑から灰緑色
になる。コロニーの裏面は中心部が赤色である。
■ツアペック寒天培地
ツアペック寒天培地での生育は5℃では全く起こらない
。25℃では7日間でコロニーは直径1〜2c+1に達
し、性状はビロード状である。14日間ではコロニーの
直径が3〜4cmに達するが分生子は形成しない、37
℃の生育では7日間でコロニーの直径が1〜2oである
。14日間でコロニーは4〜50に達し中心部が灰緑色
となる。
。25℃では7日間でコロニーは直径1〜2c+1に達
し、性状はビロード状である。14日間ではコロニーの
直径が3〜4cmに達するが分生子は形成しない、37
℃の生育では7日間でコロニーの直径が1〜2oである
。14日間でコロニーは4〜50に達し中心部が灰緑色
となる。
■ワックスマン氏寒天培地
ワックスマン氏寒天培地での生育は5℃では起こらない
、25℃では7日間でコロニーの直径が4〜5C11に
達し、コロニーの性状は白いビロード状である。14日
間ではコロニーの直径は7〜81に達し、分生子部分の
色は灰緑色で、コロニーの裏面は赤色である。37℃の
生育では7日間でコロニーの直径が4〜51に達し、性
状はビロード状である。14日間でコロニーの直径は7
〜80に達し、コロニーの分生子部分は灰緑色となる。
、25℃では7日間でコロニーの直径が4〜5C11に
達し、コロニーの性状は白いビロード状である。14日
間ではコロニーの直径は7〜81に達し、分生子部分の
色は灰緑色で、コロニーの裏面は赤色である。37℃の
生育では7日間でコロニーの直径が4〜51に達し、性
状はビロード状である。14日間でコロニーの直径は7
〜80に達し、コロニーの分生子部分は灰緑色となる。
■ポテト・デキストロース寒天培地
ポテト・デキストロース寒天培地での生育は5℃では起
こらない、25℃では7日間でコロニーの直径は5〜6
oに達し、性状は白いうすいビロード状である。14日
間ではコロニーの直径は8〜91に達する。37℃の生
育では7日間でコロニーの直径が5〜61に達し、性状
は白いビロード状である。14日間でコロニーの直径は
8〜9Gに達する8分生子の形成は少ない。
こらない、25℃では7日間でコロニーの直径は5〜6
oに達し、性状は白いうすいビロード状である。14日
間ではコロニーの直径は8〜91に達する。37℃の生
育では7日間でコロニーの直径が5〜61に達し、性状
は白いビロード状である。14日間でコロニーの直径は
8〜9Gに達する8分生子の形成は少ない。
(2)生理的、生態的性質
■最適生育条件
pH5〜7
温度32〜37℃
■生育の範囲
pi(4〜8
温度15〜45℃
■その他、顕著な特徴
マンナン含有培地での培養によりβ−マンナナーゼを囲
体外に生産する。
体外に生産する。
(J顕微鏡的所見
■分生子柄
滑面で直径は100〜150X2.5〜3μである。
■ベニシリ
対称の複輪生体である。
■メトレ
4〜6本の末生を持ち、直径は10〜15×3μである
。
。
■フィアライド
4〜6本の輪生を持ち直径は10〜12×2〜2.5μ
である。
である。
■分生子
形状は亜球形で直径は2.5〜3 X 2.5〜3μで
ある。
ある。
以上の菌学的性質を「ア・マニュアル・オブ・ザ・ベニ
シリア(A MANLIAL OF The PENI
CILLI^)」(1949) Cケネス ビー、レー
バー及びチャールズトム (KENNETHB、 R
APERand CHARLES TIIOM))
、[ザ・ジーナス・ペニシリウム・アンド・インク・テ
レオモルフインク・ステーブ・ニーペニシリウム・アン
ド・タラロミセス(The genusPENTCI
LLIUM and it’s teleom
orfhic stateseupenieilli
um and talaromyees)J (197
9) (ジョン アイ、ビット(Jl(ON T、 P
ITTン〕及び「菌M図漏(下) J (1978)
(椿啓介他)に照合し、その菌種を検索したところ、本
菌株は、ペニシリウム・パープルゲナムに属する。
シリア(A MANLIAL OF The PENI
CILLI^)」(1949) Cケネス ビー、レー
バー及びチャールズトム (KENNETHB、 R
APERand CHARLES TIIOM))
、[ザ・ジーナス・ペニシリウム・アンド・インク・テ
レオモルフインク・ステーブ・ニーペニシリウム・アン
ド・タラロミセス(The genusPENTCI
LLIUM and it’s teleom
orfhic stateseupenieilli
um and talaromyees)J (197
9) (ジョン アイ、ビット(Jl(ON T、 P
ITTン〕及び「菌M図漏(下) J (1978)
(椿啓介他)に照合し、その菌種を検索したところ、本
菌株は、ペニシリウム・パープルゲナムに属する。
更に、本菌株は、近似するペニシリウム・パープルゲナ
ム・ストール(Penicillium purpur
ogenu+*5tall)と比較すると、ペニシリウ
ム・パープルゲナム・ストールは、37℃での培養では
25℃での培養に比べ生育が悪く、また、麦芽寒天培地
で集落裏面は無色でツアペック培地で裏面が赤くなると
上記文献に記載されているが、本菌株では、逆に37℃
で生育状態が良く、また麦芽寒天培地で集落裏面に赤い
色素を生産する点で相異する。
ム・ストール(Penicillium purpur
ogenu+*5tall)と比較すると、ペニシリウ
ム・パープルゲナム・ストールは、37℃での培養では
25℃での培養に比べ生育が悪く、また、麦芽寒天培地
で集落裏面は無色でツアペック培地で裏面が赤くなると
上記文献に記載されているが、本菌株では、逆に37℃
で生育状態が良く、また麦芽寒天培地で集落裏面に赤い
色素を生産する点で相異する。
従って、本発明者は、本菌株をペニシリウム・バーブル
ゲナム陽618と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第9189号(FE[2M P−91
89)として苓託した。
ゲナム陽618と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第9189号(FE[2M P−91
89)として苓託した。
β−マンナナーゼ含有組成物を得るためには、ペニシリ
ウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌、例えばペニシ
リウム・バーブルゲナム磁618を栄養源含有培地に接
種して好気的に培養する。
ウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌、例えばペニシ
リウム・バーブルゲナム磁618を栄養源含有培地に接
種して好気的に培養する。
培養に使用される栄養源としては、例えばコブラミル、
ヤシ殻等由来のマンナン等が好ましい。
ヤシ殻等由来のマンナン等が好ましい。
コプラミルとは、ココナツヤシより油脂を搾油した残渣
で通常マンナンを約45〜50%含有している。窒素源
としては、例えば尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、酵母エキス、ペプトン、コーンステーブリカー
等を使用することができる。培地としては、更にリン酸
二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類を含む
ものが好適に使用される。
で通常マンナンを約45〜50%含有している。窒素源
としては、例えば尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、酵母エキス、ペプトン、コーンステーブリカー
等を使用することができる。培地としては、更にリン酸
二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類を含む
ものが好適に使用される。
培養は、好ましくは培養温度30〜40℃、特に好まし
くは32〜37℃、初発pH5〜6で振盪培養等により
行なうことができる。かかる条件で培養を行なえば、培
養ろ液のβ−マンナナーゼ活性は、通常培養5日前後で
最高に達する。
くは32〜37℃、初発pH5〜6で振盪培養等により
行なうことができる。かかる条件で培養を行なえば、培
養ろ液のβ−マンナナーゼ活性は、通常培養5日前後で
最高に達する。
かくして得られるβ−マンナナーゼ含有組成物を、マン
ナン又はマンナン含有天然物に作用させれば、マンノビ
オースを主成分とする加水分解液が得られる。
ナン又はマンナン含有天然物に作用させれば、マンノビ
オースを主成分とする加水分解液が得られる。
マンナンとしては、例えばココナツヤシ殻、ぞうげヤシ
殻、針葉樹等に由来するものが挙げられる。また、マン
ナン含有天然物としては、例えばココナツヤシ殻、ぞう
げヤシ殻等のマンナンを含有するものであれば何れをも
使用できるが、大量に生産され容易に入手できるものと
してコブラミルが特ムこ好適である。
殻、針葉樹等に由来するものが挙げられる。また、マン
ナン含有天然物としては、例えばココナツヤシ殻、ぞう
げヤシ殻等のマンナンを含有するものであれば何れをも
使用できるが、大量に生産され容易に入手できるものと
してコブラミルが特ムこ好適である。
β−マンナナーゼ含有組成物をマンナン又はマンナン含
有組成物に作用させるには、例えばβ−マンナナーゼ含
有培養液をろ過した後、ろ液に対して好ましくは1〜2
0%(W/V)、特に好ましくは7〜10%(讐/ν)
のコブラミルをこのろ液に加え、好ましくはpH4,5
〜8.0、特に好ましくはpl+5.5〜6,5.40
〜50℃で約2日間攪拌する。
有組成物に作用させるには、例えばβ−マンナナーゼ含
有培養液をろ過した後、ろ液に対して好ましくは1〜2
0%(W/V)、特に好ましくは7〜10%(讐/ν)
のコブラミルをこのろ液に加え、好ましくはpH4,5
〜8.0、特に好ましくはpl+5.5〜6,5.40
〜50℃で約2日間攪拌する。
かかる条件では、約2日間で加水分解が終了する。
かくして得られる加水分解液は、液体クロマj・グラフ
ィ分析によれば、原料の収穫期の差、菌の経時変化、培
養条件等によって異なるが、はぼ次のNMi成を有し、
マンノトリオース及びガラク)−マンノオリゴ糖をほと
んど含まない7 D−マンノース 1〜20% マンノビオース 65〜90% マンノトリオース 1〜3% その他の単糖 5〜15% なお、その他の単糖としては、例えばL−アラビノース
、D−ガラクト−ス、D−グルコース等が含まれる。
ィ分析によれば、原料の収穫期の差、菌の経時変化、培
養条件等によって異なるが、はぼ次のNMi成を有し、
マンノトリオース及びガラク)−マンノオリゴ糖をほと
んど含まない7 D−マンノース 1〜20% マンノビオース 65〜90% マンノトリオース 1〜3% その他の単糖 5〜15% なお、その他の単糖としては、例えばL−アラビノース
、D−ガラクト−ス、D−グルコース等が含まれる。
次いで、加水分解液からマンノビオースを単離する。
加水分解液がD−マンノースを多く含む場合には、この
ままではこの加水分解液からマンノビオースを結晶化す
ることは困難である。また、マンノ1−リオースは水に
対する溶解性が低いため、マンノビオースの結晶化の際
に共晶を生じ、マンノトリオースの含量が多い場合には
分離が困難となる。従って、加水分解液からマンノビオ
ースを単離するにはこれらのことを考慮して行なう必要
がある。尤も、叙上の如くして得られた加水分解液には
、マンノトリオースがほとんど含まれないため、主とし
てD−マンノースの除去を行なえばよく、D−マンノー
スを除去した加水分解液を濃縮、結晶化処理すれば、通
常純度が98%以上のマンノビオースが単離できる。
ままではこの加水分解液からマンノビオースを結晶化す
ることは困難である。また、マンノ1−リオースは水に
対する溶解性が低いため、マンノビオースの結晶化の際
に共晶を生じ、マンノトリオースの含量が多い場合には
分離が困難となる。従って、加水分解液からマンノビオ
ースを単離するにはこれらのことを考慮して行なう必要
がある。尤も、叙上の如くして得られた加水分解液には
、マンノトリオースがほとんど含まれないため、主とし
てD−マンノースの除去を行なえばよく、D−マンノー
スを除去した加水分解液を濃縮、結晶化処理すれば、通
常純度が98%以上のマンノビオースが単離できる。
加水分解液からD−マンノースを除去する方法としては
、例えばD−マンノースを酵母で資化する方法、あるい
はクロマト分離法等が挙げられる。
、例えばD−マンノースを酵母で資化する方法、あるい
はクロマト分離法等が挙げられる。
D−マンノースを酵母で資化する方法は常法に従って実
施するこ吉ができる。この場合、酵母はD−マンノース
を資化するがマンノI・リオースは資化しない。
施するこ吉ができる。この場合、酵母はD−マンノース
を資化するがマンノI・リオースは資化しない。
また、クロマ1−分離法は、加水分解液を例えば金属塩
型イオン交換樹脂、ゼオライト等の無機物担体を充填し
たカラムに通し、マンノビオース画分を採取することに
より行なわれる。
型イオン交換樹脂、ゼオライト等の無機物担体を充填し
たカラムに通し、マンノビオース画分を採取することに
より行なわれる。
(作用)
本発明に係るβ−マンナナーゼ含有組成物が、これをマ
ンナン等に作用させた場合、後記実施例に示す如く、マ
ンノビオースを極めて選択的に生成する作用機序は次の
ようであると考えられる。
ンナン等に作用させた場合、後記実施例に示す如く、マ
ンノビオースを極めて選択的に生成する作用機序は次の
ようであると考えられる。
すなわち、本発明に係るβ−マンナナ−・ゼ含有組成物
のβ−マンナナーゼはエンド型β−マンナナーゼと考え
られる。そし2て、このエンド型β−マンナナーゼはマ
ンナンをランダムに切断する。しかし、一旦生成したマ
ンノビオースには全く作用せず、マンノトリオースへの
作用性がやや弱い。
のβ−マンナナーゼはエンド型β−マンナナーゼと考え
られる。そし2て、このエンド型β−マンナナーゼはマ
ンナンをランダムに切断する。しかし、一旦生成したマ
ンノビオースには全く作用せず、マンノトリオースへの
作用性がやや弱い。
7、マンノース単位に切断されたものは再結合によって
211!以上の糖に合成される。このため、通常は、最
終的にはマンノビオースとマンノトリオースの混合物が
生成する。
211!以上の糖に合成される。このため、通常は、最
終的にはマンノビオースとマンノトリオースの混合物が
生成する。
しかしながら、本発明に係るβ−マンナナーゼ含有組成
物の活性は極めて高いため、マンノトリオースの生成量
が少なくなっている。このβ−マンナナーゼ含有組成物
の活性は、例えばこれにマンナン等のみ加えることによ
り作用させる場合、8u/培養液ll11以上であるこ
とが好ましく、活性の低下に従いマンノトリオースの生
成量は増加する。
物の活性は極めて高いため、マンノトリオースの生成量
が少なくなっている。このβ−マンナナーゼ含有組成物
の活性は、例えばこれにマンナン等のみ加えることによ
り作用させる場合、8u/培養液ll11以上であるこ
とが好ましく、活性の低下に従いマンノトリオースの生
成量は増加する。
このことは、例えば後記実施例1において、培養液を希
釈し、酵素活性を低下させた以外は実施例1と同様にマ
ンナンに作用させたところ、48時間加水分解後のる液
中の糖含有量が減少したのみならず、マンノトリオース
含有率が増加したことによって裏づけられる。
釈し、酵素活性を低下させた以外は実施例1と同様にマ
ンナンに作用させたところ、48時間加水分解後のる液
中の糖含有量が減少したのみならず、マンノトリオース
含有率が増加したことによって裏づけられる。
(実施例)
次に実施例、参考例及び比較例により本発明を説明する
。
。
なお、本発明に係るβ−マンナナーゼ含有組成物の活性
は次に示す方法で測定した。
は次に示す方法で測定した。
pH5,8のマツクルへインバッファー水溶14mβ、
蒸溜水5Illと粉砕した脱脂コブラミル150■を1
5分間50℃でインキュベートし、被検液l111を加
え50℃で30分間反応させた。反応液に生じた還元糖
をソモギー法により定量する。被検液l Illが1分
間に還元糖1■を遊離する時の値を1単位(u)と定義
する。
蒸溜水5Illと粉砕した脱脂コブラミル150■を1
5分間50℃でインキュベートし、被検液l111を加
え50℃で30分間反応させた。反応液に生じた還元糖
をソモギー法により定量する。被検液l Illが1分
間に還元糖1■を遊離する時の値を1単位(u)と定義
する。
参考例1
β−マンナナーゼ生産菌、ペニシリウム・パープルゲナ
ム患618は、次の方法により分離した。
ム患618は、次の方法により分離した。
フィリピンの土壌0.5gを滅菌水IQm6で懸濁し、
その0.5mff1を滅菌水10ml1に懸濁し、更に
その0.5+wIlを滅菌水10mffに懸濁し、その
−滴をシャーレ中のマンナン寒天培地に滴下し、表面に
広げる。生えてきたコロニー中周囲に透明帯(マンナン
溶解部分)のあるものを分離、採取し、約500検体を
スラント化した。この各スラントを100III!坂ロ
フラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナーゼ活性を測
定し、活性のあるものを50検体選択した。更に100
mj!坂ロフラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナー
ゼ活性を測定し、最も活性のある本面を得た。
その0.5mff1を滅菌水10ml1に懸濁し、更に
その0.5+wIlを滅菌水10mffに懸濁し、その
−滴をシャーレ中のマンナン寒天培地に滴下し、表面に
広げる。生えてきたコロニー中周囲に透明帯(マンナン
溶解部分)のあるものを分離、採取し、約500検体を
スラント化した。この各スラントを100III!坂ロ
フラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナーゼ活性を測
定し、活性のあるものを50検体選択した。更に100
mj!坂ロフラスコで振盪培養を行ないβ−マンナナー
ゼ活性を測定し、最も活性のある本面を得た。
参考例2
コブラミル4%、KHgPOn 1%、門ESO4・7
B、00.05%、ペプトン0.9%、酵母エキス0.
2%、コーンステーブリカー0.5%からなる液体培地
(pH5,4) 10011nを500mj!坂ロフ
ラスコに採取し、定法により加熱殺菌した。これにペニ
シリウム・パープルゲナム阻618の1白金耳を接種し
、35℃で5日間振盪培養した。この培養液をろ過した
後マンナンの加水分解活性を測定したところ14.80
/培養液meであった。
B、00.05%、ペプトン0.9%、酵母エキス0.
2%、コーンステーブリカー0.5%からなる液体培地
(pH5,4) 10011nを500mj!坂ロフ
ラスコに採取し、定法により加熱殺菌した。これにペニ
シリウム・パープルゲナム阻618の1白金耳を接種し
、35℃で5日間振盪培養した。この培養液をろ過した
後マンナンの加水分解活性を測定したところ14.80
/培養液meであった。
実施例1
51のジャファーメンタ−にコプラミル4%、xo、p
o、 1%、MgSO4・711□00゜05%、ペプ
トン0.9%、酵母エキス0.2%、コーンステープリ
カー〇、5%からなる液体培地(p)15.4) 3
(!を入れ、定法により加熱殺菌した。これに参考例
2と同じ方法で調製した培養液300II11を種菌と
して接種した後、35℃で4日間培養した。この培養液
の酵素活性を測定したところ16.2u/培養液mI!
であった。
o、 1%、MgSO4・711□00゜05%、ペプ
トン0.9%、酵母エキス0.2%、コーンステープリ
カー〇、5%からなる液体培地(p)15.4) 3
(!を入れ、定法により加熱殺菌した。これに参考例
2と同じ方法で調製した培養液300II11を種菌と
して接種した後、35℃で4日間培養した。この培養液
の酵素活性を測定したところ16.2u/培養液mI!
であった。
この培養液をろ過したところ2.8eのろ過液が得られ
た。このろ過液にコブラミル280gを加えpH5,8
,50℃で48時間加水分解した後ろ過したところ2,
512のろ過液を得た。このろ過液を液体クロマトグラ
フィーで分析したところ下記の糖組成であった。
た。このろ過液にコブラミル280gを加えpH5,8
,50℃で48時間加水分解した後ろ過したところ2,
512のろ過液を得た。このろ過液を液体クロマトグラ
フィーで分析したところ下記の糖組成であった。
D−マンノース 1.2%
マンノビオース 84,2%
マンノトリオース 1.9%
その他の単tJ! 12.7%
実施例2
実施例1で得られた加水分解ろ過液11にパン酵母2g
を加え35℃で2日間培養した。この買化液をろ過した
後IJ!組成を分析したところ次の通りであった。
を加え35℃で2日間培養した。この買化液をろ過した
後IJ!組成を分析したところ次の通りであった。
■)−マンノース 0.1%
マンノビオース 91.5%
マンノトリオース 2.1%
その他の単糖 6.3%
このろ過液を75%迄濃縮したところ59gの濃縮液が
得られた。この濃縮液に30m1のエタノールを加え1
日間結晶化させたところ23.5 gのマンノビオース
が得られた。このものの純度は98.1%、融点191
〜192℃であった。
得られた。この濃縮液に30m1のエタノールを加え1
日間結晶化させたところ23.5 gのマンノビオース
が得られた。このものの純度は98.1%、融点191
〜192℃であった。
実施例3
実施例1で得られた加水分解ろ過液II!を定法により
イオン交換樹脂で脱塩した後50%迄濃縮したところ8
8gの濃縮液が得られた。
イオン交換樹脂で脱塩した後50%迄濃縮したところ8
8gの濃縮液が得られた。
次にポリスチレンスルフォン酸型陽イオン交換樹脂SK
−IBS (三菱化成工業特製、50〜100メツシユ
)300sij!をジャケット付きカラム(内径’l、
4 cs X長さ80e+m)に充填し、これに5%
塩酸水溶液を流し水洗した後、次いで5%水酸化ナトリ
ウム水溶液を流し水洗して樹脂をナトリウム型とした。
−IBS (三菱化成工業特製、50〜100メツシユ
)300sij!をジャケット付きカラム(内径’l、
4 cs X長さ80e+m)に充填し、これに5%
塩酸水溶液を流し水洗した後、次いで5%水酸化ナトリ
ウム水溶液を流し水洗して樹脂をナトリウム型とした。
このカラムを60℃に保温しながら上記で調製した濃縮
液30gを塔上部より供給し、次いで水で連続的に溶出
してフラクシロンコレクターにより分画した。この際の
溶出液の流速は100震I!、7時で、各分画容重ば1
01Illであった。各フラクションを液体クロマトグ
ラフィで分析した。その結果を第1表及び第1図に示4
″。
液30gを塔上部より供給し、次いで水で連続的に溶出
してフラクシロンコレクターにより分画した。この際の
溶出液の流速は100震I!、7時で、各分画容重ば1
01Illであった。各フラクションを液体クロマトグ
ラフィで分析した。その結果を第1表及び第1図に示4
″。
このフラクション魚14〜22を集めた液の糖組成は次
の通りであった。
の通りであった。
D−マンノース 0.6%
マンノビオース 90.5%
マンノトリオース 2.5%
その他の単糖 6.4%
この液を75%迄濃縮したところ12.3 gの濃縮液
が得られたゆこの濃縮液にエタノール61m1を加え1
日間結晶化したところ7.6gのマンノビオースが得ら
れた。純度は98.2%、融点191〜192℃であっ
た。
が得られたゆこの濃縮液にエタノール61m1を加え1
日間結晶化したところ7.6gのマンノビオースが得ら
れた。純度は98.2%、融点191〜192℃であっ
た。
(以下余白)
第 1 表 華位re /
m j!比較例1 参考例2において、β−マンナナーゼ生産菌として、ペ
ニシリウム・パープルゲナム磁618の代りにストレプ
トミセス・エスピー阻17を用いた以外は参考例2と同
様に操作して培養液を得た。
m j!比較例1 参考例2において、β−マンナナーゼ生産菌として、ペ
ニシリウム・パープルゲナム磁618の代りにストレプ
トミセス・エスピー阻17を用いた以外は参考例2と同
様に操作して培養液を得た。
次いでこの培養液を種菌として用いて実施例1と同様に
して培養液を得た。この培養液のβ−マンナナーゼ活性
は5.3 u /培養液Iagであった。
して培養液を得た。この培養液のβ−マンナナーゼ活性
は5.3 u /培養液Iagであった。
従って、本発明に使用されるβ−マンナナーゼ含有組成
物は、ストレプトミセス・エスピー阻17の培養液に比
べ3倍以上のβ−マンナナーゼ活性を有することが明ら
かとなった。
物は、ストレプトミセス・エスピー阻17の培養液に比
べ3倍以上のβ−マンナナーゼ活性を有することが明ら
かとなった。
更にこの培養液をろ過し2.71のろ液を得た。
このろ液にコブラミル140gを加え、pH6,8,4
0℃で48時間加水分解した後ろ過したところ、2.5
1のろ液を得た。このろ液の#M組成は下記のようであ
った。
0℃で48時間加水分解した後ろ過したところ、2.5
1のろ液を得た。このろ液の#M組成は下記のようであ
った。
D−マンノース 10.5%
マンノビオース 63.5%
マンノトリオース 9,8%
オリゴ糖 11.2%
その他の単F 5.0%
従って、本発明の方法では、マンノトリオース及びオリ
ゴ糖(主にガラクトマンノオリゴ糖)をほとんど含まな
い糖液を製造できることが明らかとなった。
ゴ糖(主にガラクトマンノオリゴ糖)をほとんど含まな
い糖液を製造できることが明らかとなった。
(発明の効果)
本発明のマンノビオースの製造法は、叙上の如く、ペニ
シリウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌の産生ずる
β−マンナナーゼ含有組成物をマンナン等に作用せしめ
るものであるため、マンノトリオース及びガラクトマン
ノオリゴ糖をほとんど含まないマンノビオース含有tu
i成物を得ることができ、これからマンノビオースを分
離するための精製工程が簡略化し容易なものとなった結
果、従来困難であったマンノビオースの大量生産を可能
にした。
シリウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌の産生ずる
β−マンナナーゼ含有組成物をマンナン等に作用せしめ
るものであるため、マンノトリオース及びガラクトマン
ノオリゴ糖をほとんど含まないマンノビオース含有tu
i成物を得ることができ、これからマンノビオースを分
離するための精製工程が簡略化し容易なものとなった結
果、従来困難であったマンノビオースの大量生産を可能
にした。
マンノビオースは、従来試薬として販売されておらず、
従って用途開発研究が行なわれてなかった。近年、動物
細胞壁に存在する糖鎖の研究が進み、#M鎖が抗原抗体
に関与していることが判明した。この糖鎖中にはマンノ
ビオース骨格が存在しており、マンノビオースが安価に
製造出来るならばこの#N鎖の合成原料として使用でき
る。更に転移酵素を使用することによりマンノースを含
む新規な糖を製造することができ、医薬品として有用で
ある。
従って用途開発研究が行なわれてなかった。近年、動物
細胞壁に存在する糖鎖の研究が進み、#M鎖が抗原抗体
に関与していることが判明した。この糖鎖中にはマンノ
ビオース骨格が存在しており、マンノビオースが安価に
製造出来るならばこの#N鎖の合成原料として使用でき
る。更に転移酵素を使用することによりマンノースを含
む新規な糖を製造することができ、医薬品として有用で
ある。
第1図は実施例3における糖を含む濃縮液の溶出曲線を
示す図面である。
示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 次の理化学的性質、 (1)作用 β−マンナナーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性を
有し、マンナンに作用して、主としてβ−1,4−マン
ノビオースを生成し、マンノトリオースをほとんど生成
しない。 (2)基質特異性 マンナン、ガラクトマンナンに特異的に作用するが、キ
シラン、セルロースには作用しない。 (3)至適pH及び安定pH範囲 至適pHは約5.8、安定pH範囲は約4〜約8である
。 (4)至適温度 約40〜約60℃ (5)pHによる失活の条件(30℃) pH5.8で3時間保持した時の活性を100%とする
とき、pH2で約65%、pH4で約90%及びpH8
で約95%の活性がある。 (6)温度による失活の条件(pH5.8)温度50℃
で3時間保持した時の活性を100%とするとき、40
℃で約100%、70℃で約40%の活性がある。 を有する、β−マンナナーゼ含有組成物を、マンナン又
はマンナン含有天然物に作用させることを特徴とするβ
−1,4−マンノビオースの製造法。 2 β−マンナナーゼ含有組成物がペニシリウム属に属
するβ−マンナナーゼ生産菌を培養して得られる培養液
又は培養ろ液である特許請求の範囲第1項記載のβ−1
,4−マンノビオースの製造法。 3 ペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌が
ペニシリウム・パープルゲナムNo.618(微工研菌
寄第9189号)である特許請求の範囲第2項記載のβ
−1,4−マンノビオースの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62042844A JP2591948B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | β−1,4−マンノビオースの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62042844A JP2591948B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | β−1,4−マンノビオースの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63209595A true JPS63209595A (ja) | 1988-08-31 |
JP2591948B2 JP2591948B2 (ja) | 1997-03-19 |
Family
ID=12647305
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62042844A Expired - Lifetime JP2591948B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | β−1,4−マンノビオースの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2591948B2 (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001064932A1 (fr) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Fuji Oil Co., Ltd. | Procede de production d'une farine de copra modifiee |
WO2004048587A1 (ja) * | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Itochu Feed Mills Co., Ltd. | β−1,4−マンノビオース含有組成物 |
WO2008001770A1 (fr) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Fuji Oil Company, Limited | Composition et agent antiallergiques, et aliment, boisson et aliment pour animaux contenant lesdits composition ou agent |
WO2008001769A1 (fr) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Fuji Oil Company, Limited | Substance ou agent activant l'immunité intestinale, aliments, boissons et aliments pour animaux la ou le contenant |
JP2008007505A (ja) * | 2006-06-26 | 2008-01-17 | Fuji Oil Co Ltd | 抗炎症作用組成物及び剤、並びにこれらを含有する飲食物及び飼料 |
JP5605440B2 (ja) * | 2011-01-26 | 2014-10-15 | 不二製油株式会社 | マンノビオース含有組成物の製造方法 |
-
1987
- 1987-02-27 JP JP62042844A patent/JP2591948B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001064932A1 (fr) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Fuji Oil Co., Ltd. | Procede de production d'une farine de copra modifiee |
WO2004048587A1 (ja) * | 2002-11-26 | 2004-06-10 | Itochu Feed Mills Co., Ltd. | β−1,4−マンノビオース含有組成物 |
JPWO2004048587A1 (ja) * | 2002-11-26 | 2006-03-23 | 不二製油株式会社 | β−1,4−マンノビオース含有組成物 |
JP2010183909A (ja) * | 2002-11-26 | 2010-08-26 | Fuji Oil Co Ltd | β−1,4−マンノビオース含有組成物 |
JP4570959B2 (ja) * | 2002-11-26 | 2010-10-27 | 不二製油株式会社 | β−1,4−マンノビオース含有組成物 |
US8999374B2 (en) | 2002-11-26 | 2015-04-07 | Fuji Oil Co., Ltd. | Method of inhibiting salmonella in livestock and poultry |
WO2008001770A1 (fr) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Fuji Oil Company, Limited | Composition et agent antiallergiques, et aliment, boisson et aliment pour animaux contenant lesdits composition ou agent |
WO2008001769A1 (fr) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Fuji Oil Company, Limited | Substance ou agent activant l'immunité intestinale, aliments, boissons et aliments pour animaux la ou le contenant |
JP2008007505A (ja) * | 2006-06-26 | 2008-01-17 | Fuji Oil Co Ltd | 抗炎症作用組成物及び剤、並びにこれらを含有する飲食物及び飼料 |
JP5605440B2 (ja) * | 2011-01-26 | 2014-10-15 | 不二製油株式会社 | マンノビオース含有組成物の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2591948B2 (ja) | 1997-03-19 |
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