JPS5843076B2 - セルラ−ゼの生産増強法 - Google Patents
セルラ−ゼの生産増強法Info
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- JPS5843076B2 JPS5843076B2 JP3436481A JP3436481A JPS5843076B2 JP S5843076 B2 JPS5843076 B2 JP S5843076B2 JP 3436481 A JP3436481 A JP 3436481A JP 3436481 A JP3436481 A JP 3436481A JP S5843076 B2 JPS5843076 B2 JP S5843076B2
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- Japan
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- cellulase
- enzyme
- medium
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- cellulose
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、トリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４１菌（微
工研菌寄第５８５５号）を窒素源、炭素源を含む培地で
培養してセルラーゼを製造するに際して、セルラーゼ生
産促進物質としてカゼインの酵素氷解物を添加すること
により生産の増強されたセルラーゼを製造する方法に関
するものである。
工研菌寄第５８５５号）を窒素源、炭素源を含む培地で
培養してセルラーゼを製造するに際して、セルラーゼ生
産促進物質としてカゼインの酵素氷解物を添加すること
により生産の増強されたセルラーゼを製造する方法に関
するものである。
一般にセルラーゼはエンド−β−グルカナーゼ、エキソ
−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ等の多様
な酵素成分からなる複合酵素系を指し、その作用として
は、セルロースを分解しこれをグルコースあるいはセロ
オリゴ糖にまで分解することである。
−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼ等の多様
な酵素成分からなる複合酵素系を指し、その作用として
は、セルロースを分解しこれをグルコースあるいはセロ
オリゴ糖にまで分解することである。
近年、セルロース性資源の有効利用を計る上からこのよ
うなセルラーゼの作用が改めて注目され、セルロースの
酵素糖化について多くの研究開発がなされてきている。
うなセルラーゼの作用が改めて注目され、セルロースの
酵素糖化について多くの研究開発がなされてきている。
一方、稲ワラ、トウモロコシの茎、葉およびバガスなと
酵素糖化の原料となる天然のセルロースは、一般に結晶
性が高く、従来のセルラーゼによる加水分解に対して強
い抵抗性を示し、このような高結晶セルロースを充分に
分解するセルラーゼが存在するとはいい難い。
酵素糖化の原料となる天然のセルロースは、一般に結晶
性が高く、従来のセルラーゼによる加水分解に対して強
い抵抗性を示し、このような高結晶セルロースを充分に
分解するセルラーゼが存在するとはいい難い。
本発明者らは、結晶性セルロースの分解力が優れ、かつ
グルコースへの糖化能力の強いセルラーゼ生産菌を、広
く天然界から検索した結果、トリコデルマ・ハルヂアナ
ム（Ｔｒ ｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）の
−菌株、Ｍ−４１株が強力な結晶性セルロース分解活性
とグルコース生成能をもつセルラーゼを培地中に産生じ
、しかもその培養に際してカゼインの酵素氷解物を添加
することにより、セルラーゼの生産が著るしく増強され
ることを見出し本発明を完成するに到った。
グルコースへの糖化能力の強いセルラーゼ生産菌を、広
く天然界から検索した結果、トリコデルマ・ハルヂアナ
ム（Ｔｒ ｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）の
−菌株、Ｍ−４１株が強力な結晶性セルロース分解活性
とグルコース生成能をもつセルラーゼを培地中に産生じ
、しかもその培養に際してカゼインの酵素氷解物を添加
することにより、セルラーゼの生産が著るしく増強され
ることを見出し本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明はトリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４
１株（微工研菌寄第５８５５号）を培養してセルラーゼ
を製造するに際し、培地にセルラーゼ生産促進物質とし
てカゼインの酵素氷解物を添加することによって、セル
ラーゼの生産を増強する方法に関するものである。
１株（微工研菌寄第５８５５号）を培養してセルラーゼ
を製造するに際し、培地にセルラーゼ生産促進物質とし
てカゼインの酵素氷解物を添加することによって、セル
ラーゼの生産を増強する方法に関するものである。
本発明において使用するトリコデルマ・ハルヂアナム（
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ） Ｍ−
４１株の菌学的性質は以下の通りである。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ） Ｍ−
４１株の菌学的性質は以下の通りである。
１、麦芽エキス、デキストロース寒天培地上での生育
麦芽エキス、デキストロース、寒天培地上での生育は早
く、２８°Ｃ３日間の培養で７２〜７５１ｍの直径に達
する。
く、２８°Ｃ３日間の培養で７２〜７５１ｍの直径に達
する。
これらコロニーの性状は羊毛状で胞子を輪絞状に形成す
る。
る。
コロニーは初め白色で胞子形成にしたがって青緑色から
暗青緑色になる。
暗青緑色になる。
培養後期にはココナツツ臭をともなう。
コロニーの裏面は無色。菌糸は、無色、平滑、分岐性で
隔壁を有し横巾は２．５〜５．０μ瓶である。
隔壁を有し横巾は２．５〜５．０μ瓶である。
分生子柄は気生菌糸より生じ、輪生状あるいは樹木状に
分岐、先端はフイアライドとなる。
分岐、先端はフイアライドとなる。
フイアライドは１個側生、２個対生あるいは数個輪生し
、まっすぐあるいはわずかに曲がるびん形で、先端は長
頚状で無色である。
、まっすぐあるいはわずかに曲がるびん形で、先端は長
頚状で無色である。
フイアロ型分生子は分岐先端のフイアライド頂端に６〜
３０個かたまり、球状の分生子頭を形成する。
３０個かたまり、球状の分生子頭を形成する。
これらフイアロ型分生子は球型（直径２〜３μｍ）で表
面滑面、緑色である。
面滑面、緑色である。
２、ポテト、デキストロース、寒天培地上でのコロニー
の状態 ポテト、デキストロース、寒天上でのコロニーの生育は
非常に早く、２８°０３日間で７８〜８０ｍｍの直径に
達する。
の状態 ポテト、デキストロース、寒天上でのコロニーの生育は
非常に早く、２８°０３日間で７８〜８０ｍｍの直径に
達する。
これらコロニーは羊毛状で胞子を分散して豊富に形成す
る。
る。
コロニーの色は青緑色から暗青緑色となる。
コロニーの裏面は無色。
３、生理的性質
■ 生育の範囲（前記麦芽エキス、デキストロース培地
使用） ｐＨ，２，５〜７．５、温度、１７．５〜４０．００Ｃ
申 申■ 最適生育条件（前記麦芽エキス、デキストロース
培地使用） ｐＨ４，５〜７．０１温度２５°Ｃ〜３０°Ｃ以上の菌
学的諸性質をトリコデルマ属に関するリファイの記載（
マイコロジカル・ペーパー１１６巻 １ １９６９年）
と対比し、トリコデルマ・ハルヂアナム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）と同定されるべき微生
物であることを認めた。
使用） ｐＨ，２，５〜７．５、温度、１７．５〜４０．００Ｃ
申 申■ 最適生育条件（前記麦芽エキス、デキストロース
培地使用） ｐＨ４，５〜７．０１温度２５°Ｃ〜３０°Ｃ以上の菌
学的諸性質をトリコデルマ属に関するリファイの記載（
マイコロジカル・ペーパー１１６巻 １ １９６９年）
と対比し、トリコデルマ・ハルヂアナム（Ｔｒｉｃｈｏ
ｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ）と同定されるべき微生
物であることを認めた。
そして、本菌は微工研菌寄第５８５５号として、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
当該酵素の生産に使用される培地の炭素源としては、濾
紙粉末、微結晶性セルロース、一般紙類稲ワラ、パルプ
粕等の植物繊維質が使用でき、窒素源としては、無機ア
ンモニウム塩、硝酸塩、および肉エキス、ペプトン、蛋
白質分解物等の有機窒素源も使用される。
紙粉末、微結晶性セルロース、一般紙類稲ワラ、パルプ
粕等の植物繊維質が使用でき、窒素源としては、無機ア
ンモニウム塩、硝酸塩、および肉エキス、ペプトン、蛋
白質分解物等の有機窒素源も使用される。
その他ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｃａ Ｃｌ ２、Ｃ
ｏ Ｃｌ ２、Ｆ ｅ Ｓ ０４、Ｍ ｎ Ｓ ０４、
Ｚ ｎ Ｓ ０４等の無機塩類および酵母エキス等を含
む培地が使用される。
ｏ Ｃｌ ２、Ｆ ｅ Ｓ ０４、Ｍ ｎ Ｓ ０４、
Ｚ ｎ Ｓ ０４等の無機塩類および酵母エキス等を含
む培地が使用される。
本菌株の液体培養は、上記培地を使用し、培養温度２０
〜４０℃で培養ｐＨ４，５〜６，５で振盪または通気攪
拌培養すると６〜８日間でセルラーゼ活性は最高となる
。
〜４０℃で培養ｐＨ４，５〜６，５で振盪または通気攪
拌培養すると６〜８日間でセルラーゼ活性は最高となる
。
この時、培地にカゼインの酵素氷解物を添加するとセル
ラーゼの生産量は飛躍的に増加する。
ラーゼの生産量は飛躍的に増加する。
第１表に無機塩とセルロースから成る培地にカゼインの
酵素氷解物を０．１５φ添加した場合としない場合の３
０°Ｃ１８日培養における培養液中のセルラーゼ活性を
示す。
酵素氷解物を０．１５φ添加した場合としない場合の３
０°Ｃ１８日培養における培養液中のセルラーゼ活性を
示す。
第１表に示されたように、カゼインの酵素氷解物を添加
する事により、セルラーゼ生産量は約１５倍と著しく増
加した。
する事により、セルラーゼ生産量は約１５倍と著しく増
加した。
この増強効果はカゼインの酵素氷解物に特異的で、獣肉
酵素分解物（例えばプロテオース・ペプトン１ダイゴ“
大玉栄養化学■製商標）、植物蛋白質分解物（例えは、
ポリペプトン Ｓ 犬五栄養化学■製商標）あるいはカ
セインの酸氷解物（例えは、ＮＺケイス和尤純薬■製商
標）等では代用できない。
酵素分解物（例えばプロテオース・ペプトン１ダイゴ“
大玉栄養化学■製商標）、植物蛋白質分解物（例えは、
ポリペプトン Ｓ 犬五栄養化学■製商標）あるいはカ
セインの酸氷解物（例えは、ＮＺケイス和尤純薬■製商
標）等では代用できない。
なぜ本菌のセルラーゼ産生増強にカゼインの酵素氷解物
のみが特異的な効果をもつのかは不明であるが、分解ネ
＊産物中に含まれ物質がセルラーゼ成分の誘導に密接に
かかわっているものと推定される。
のみが特異的な効果をもつのかは不明であるが、分解ネ
＊産物中に含まれ物質がセルラーゼ成分の誘導に密接に
かかわっているものと推定される。
当該酵素の生産に際し添加するカゼイン酵素氷解物は第
２表に示すとおりｏ、ｏ１％と極微量で充分効果がある
が通常０．０５〜０．２ ％添加される。
２表に示すとおりｏ、ｏ１％と極微量で充分効果がある
が通常０．０５〜０．２ ％添加される。
当該酵素の活性測定法は次に示すような酵素反応による
還元糖の増加を測定する方法（例えばネルソンーソモギ
ー法など）で測定した。
還元糖の増加を測定する方法（例えばネルソンーソモギ
ー法など）で測定した。
１係微結晶性セルロース（商標名アビセルＳＦ旭化戒製
）０．２５ｒｕｌを基質とし、これに適当量の酵素液を
加え、更にｐＨ４，８，０，０５Ｍ、酢酸緩衝液０．５
ＴＩＬｌを加え蒸留水で全量ＬＯｍｌｌとし５０℃で３
０分間反応させた。
）０．２５ｒｕｌを基質とし、これに適当量の酵素液を
加え、更にｐＨ４，８，０，０５Ｍ、酢酸緩衝液０．５
ＴＩＬｌを加え蒸留水で全量ＬＯｍｌｌとし５０℃で３
０分間反応させた。
この条件で１分間に１μｇのグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位とした。
糖を生成する酵素量を１単位とした。
得られた培養液を遠心分離、又は濾過等により菌体を分
離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液として使用
することもできるが、濾液を濃縮しアセトン、エタノー
ル、イソプロパツールなどの有機溶剤を加えて沈降させ
るか、硫安などの塩析剤で沈澱させるなどして、強力な
活性を有する粗酵素剤を得ることができる。
離して得られる培養液は、そのまま粗酵素液として使用
することもできるが、濾液を濃縮しアセトン、エタノー
ル、イソプロパツールなどの有機溶剤を加えて沈降させ
るか、硫安などの塩析剤で沈澱させるなどして、強力な
活性を有する粗酵素剤を得ることができる。
このようにして得られる粗酵素剤は次のような性質を有
する。
する。
（１）作用
濾紙、アビセル、−紋紙類、脱脂綿、ＣＭセルロース、
パルプおよび脱リグニン稲ワラ、バガス等に作用し、こ
れを溶解させグルコース等の還元糖を生成せしめる。
パルプおよび脱リグニン稲ワラ、バガス等に作用し、こ
れを溶解させグルコース等の還元糖を生成せしめる。
（２）至適ｐＨおよび安定性
５００Ｃにおける至適ｐＨは４．８である。
また、ｐＨ３，５〜８．０の範囲で安定であり、この範
囲では５℃、２４時間で９０φ以上の活性が残存する。
囲では５℃、２４時間で９０φ以上の活性が残存する。
（３）最適作用温度および安定性
ｐＨ４，８，２４時間反応で至適作用温度は４５〜５０
℃であった。
℃であった。
また、４５°Ｃ以下では９６時間以上安定でありこの温
度以下ではほぼ１００％活性は残存していた。
度以下ではほぼ１００％活性は残存していた。
（４）阻害剤
本粗酵素剤はＣｕ”、Ｈｇ”、 およびＡｇ＋によっ
て強く阻害される。
て強く阻害される。
（５）精製
粗酵素剤中の夾雑物質はセルロースカラムによる吸着ク
ロマトグラフィー、および通常のイオン交換クロマトグ
ラフィー、セファデックスゲルによるゲル濾過等により
除くことができ、高度に精製された酵素剤を得ることが
できる。
ロマトグラフィー、および通常のイオン交換クロマトグ
ラフィー、セファデックスゲルによるゲル濾過等により
除くことができ、高度に精製された酵素剤を得ることが
できる。
本発明によって得られるセルラーゼは、他種のセルラー
ゼにくらべてはるかに強力な結晶性セルロース分解活性
をもつ。
ゼにくらべてはるかに強力な結晶性セルロース分解活性
をもつ。
本菌の培養濾液と市販セルラーゼ、およびセルラーゼ生
産菌として著名なトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２
６９２１の培養濾液の粗蛋白質あたりの結晶性セルロー
ス分解活性を比較した値を第３表にあげる。
産菌として著名なトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２
６９２１の培養濾液の粗蛋白質あたりの結晶性セルロー
ス分解活性を比較した値を第３表にあげる。
）
上記結晶性セルロース分解活性は、前記の方法により、
また粗蛋白質は５幅トリクロロ酢酸沈澱物を０．ＩＮ水
酸化ナトリウムに溶解し、ローリイ等の方法（ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルケミ３１９４１９３巻２
６５ページ１９５１年により牛血清アルブミンを標準と
して測定した。
また粗蛋白質は５幅トリクロロ酢酸沈澱物を０．ＩＮ水
酸化ナトリウムに溶解し、ローリイ等の方法（ザ・ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカルケミ３１９４１９３巻２
６５ページ１９５１年により牛血清アルブミンを標準と
して測定した。
当該酵素を利用する場合の利点は、結晶性セルロースに
対して従来酵素より一層よく作用することである。
対して従来酵素より一層よく作用することである。
例えば、すべてのセルラーゼ成分を含んだ完全なセルラ
ーゼを生産するとされるトリコデルマ・レーゼイＱＭ９
４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）の培養濾液による、５饅
アビセルの５０℃での氷解率は、２４時間で３ｏ％であ
る（ザ・ジャーナル・オブファーメンテイション・テク
ノロジー５１巻２６７ページ １９７６年）が、本菌の
培養濾液によると４５°Ｃ１２４時間で氷解率は４０％
に達し、５日間でｓｏ％に達する。
ーゼを生産するとされるトリコデルマ・レーゼイＱＭ９
４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）の培養濾液による、５饅
アビセルの５０℃での氷解率は、２４時間で３ｏ％であ
る（ザ・ジャーナル・オブファーメンテイション・テク
ノロジー５１巻２６７ページ １９７６年）が、本菌の
培養濾液によると４５°Ｃ１２４時間で氷解率は４０％
に達し、５日間でｓｏ％に達する。
このように本酵素は結晶性セルロースによく作用するこ
とから、結晶性の高い未利用の天然セルロース資源を分
解して有効利用を計る際に、極めて有用な酵素となりう
る。
とから、結晶性の高い未利用の天然セルロース資源を分
解して有効利用を計る際に、極めて有用な酵素となりう
る。
次に実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例 １
トリコデルマ・ハルヂアナム
（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ） Ｍ
−４１株（微工研菌寄第５８５５号）をポテト・デキス
トロース 寒天スラント（ｐＨ６，０）上で３００Ｇ６
日間培養してよく胞子を形成された後、その−白金耳を
５０ｒＩｌｌ／２００Ｔｒｌｌ容のフラスコの次の紐取
の培地に、各種蛋白質分解物を０．１５％添加し３０℃
で８日間回転振盪培養した。
−４１株（微工研菌寄第５８５５号）をポテト・デキス
トロース 寒天スラント（ｐＨ６，０）上で３００Ｇ６
日間培養してよく胞子を形成された後、その−白金耳を
５０ｒＩｌｌ／２００Ｔｒｌｌ容のフラスコの次の紐取
の培地に、各種蛋白質分解物を０．１５％添加し３０℃
で８日間回転振盪培養した。
この培養液を遠心分離し、残渣を除去して得られる各種
粗酵素液中のセルラーゼ活性を第２表に示す。
粗酵素液中のセルラーゼ活性を第２表に示す。
第２表にみられるごとく、カゼインの酵素氷解物である
バクトペプトンおよびバクトドリプトンによりセルラー
ゼは顕著に増強され、他の蛋白質分解物ではほとんど効
果が認められなかった。
バクトペプトンおよびバクトドリプトンによりセルラー
ゼは顕著に増強され、他の蛋白質分解物ではほとんど効
果が認められなかった。
実施例 ２
実施例１と同様な培地にバクトペプトン
（ＤＩＦＣＯ社製商標）０．１５％を添加した培地３０
０ＴＬｌを２１容のフラスコにとり１２０’ＣＩ５分間
殺菌した後、トリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４１（微
工研菌寄第５８５５号）の胞子を５白金耳接種し、実施
例１と同様に培養して培養濾液２８０ｙｄを得た。
０ＴＬｌを２１容のフラスコにとり１２０’ＣＩ５分間
殺菌した後、トリコデルマ・ハルヂアナムＭ−４１（微
工研菌寄第５８５５号）の胞子を５白金耳接種し、実施
例１と同様に培養して培養濾液２８０ｙｄを得た。
濾液の微結晶性セルロース分解活性は１３３Ｕ／ｍｌで
あった。
あった。
培養液を限外濾過器（バイオエンジニアリング社製・ダ
イアフィルターＧＯ−０５Ｔ使用）により濃縮後減圧乾
燥して、微結晶性セルロース分解活性１８０Ｕ／ｍ９を
示す粗酵素粉末１８０■を得た。
イアフィルターＧＯ−０５Ｔ使用）により濃縮後減圧乾
燥して、微結晶性セルロース分解活性１８０Ｕ／ｍ９を
示す粗酵素粉末１８０■を得た。
第１図は当該酵素の至適ｐＨ１第２図は安定ｐＨ範囲、
第３図は作用至適温度を示すものである。
第３図は作用至適温度を示すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ トリコデルマ・ハルヂアナム （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）を炭
素源、窒素源を含む培地で培養してセルラーゼを製造す
るに際し、セルラーゼ生産促進物質としてカゼインの酵
素氷解物を添加することを特徴とするセルラーゼの生産
増強法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3436481A JPS5843076B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | セルラ−ゼの生産増強法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3436481A JPS5843076B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | セルラ−ゼの生産増強法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57146579A JPS57146579A (en) | 1982-09-10 |
| JPS5843076B2 true JPS5843076B2 (ja) | 1983-09-24 |
Family
ID=12412103
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3436481A Expired JPS5843076B2 (ja) | 1981-03-09 | 1981-03-09 | セルラ−ゼの生産増強法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5843076B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6265575A (ja) * | 1985-09-17 | 1987-03-24 | Sony Corp | 磁気記録装置 |
-
1981
- 1981-03-09 JP JP3436481A patent/JPS5843076B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6265575A (ja) * | 1985-09-17 | 1987-03-24 | Sony Corp | 磁気記録装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57146579A (en) | 1982-09-10 |
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