JPS6140787A - ストレプトマイセス属新種の微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の青空 １丘且１ 本発明は、ストレプトマイセス属の新種によるキチナー
ゼの生産に関する。

一般に、セルラーゼはキチナーゼおよびキトビアーゼな
どと呼ばれる多様な酵素成分からなる複合酵素系を指し
ており、その作用としてはキチンを分解してこれをＮ−
アセチルグルコサミンあるいはオリゴ糖にまで糖化する
ことが挙げられる。

キチンは、下等動物、特に節足動物、に多く含まれる、
アミノ糖に属する多糖類の一種である。

その生合成される同は莫大なものであって、年間数十億
トンと推定されており、そのようなところからキチンは
未利用の天然資源として最近脚光を浴びているものの一
つである。

′　　キチンは反応性に乏しく、セルロースより更に安
定であるので、これを酵素、すなわちキチナーゼ、で分
解して低分子化覆ることが考えられる。

先行技術 キチナーゼはカタツムリの消化液等の中に含まれている
とともに、糸状菌や細菌によっても生成づ゛ることが知
られている（たとえば、「化学大辞典」、第２谷、第７
４５頁（共立出版（株））。

微生物によるものとしては、キチン市販品のカタログに
よれば、ストレプトマイセス・グリセウスおＪ：びセラ
チアマルセセンスから得られてＪ３す、よ１こ最近の発
表によれば、アエロモナス属の菌がらも１ｒＪられるよ
うである。

１五旦１ｊ ■ 本発明者らは粉末キチンの分解力がすぐれがっＮ−７セ
チルグルコサミンへの糖化能力の強いキチナーゼ生産菌
を広く土壌中から検索した結果、ストレプトマイセス・
５Ｄ−ＷＡＫ−８３株が強力なキチン分解活性とＮ−ア
セチルグルコサミン生成能を有するキチナーゼを培地中
に産生蓄積する事実を見出して、本発明を完成するに到
った。

従って、本発明によるキチナーゼ生産能を有するストレ
プトマイセス屈新種の微生物は、ストレプトマイセス属
のＷＡＫ−８３株が属する種のものである。

旌呈 本発明によって提供されるキチナーゼは、キチン分解活
性およびＮ−アセチルグルコサミン生成能が大きい。

従って、このキチナーげによればキチン聚有利に分解す
ることができる。

１１些１１亘且里 微生物 本発明に関与する微生物は、ストレプトマイセス属のＷ
ＡＫ−８３株が属する種のものである。

この種（ｓｐｅｃ　ｉ　ｅｓ）の微生物の代表例はスト
レプトマイセス・５ｐ−ＷＡＫ−８３株である。の菌は
、１９８３年１２月に広島県高田郡甲田町株地の土壌か
ら分離されたものであって、■業技術院微生物工業技術
研究所に、昭和５９年７月１３日に「微工研菌寄第７７
１４号（ＦＥＲＭｐ−７７１４）として受託されており
、またその菌学的性質は以下の通りである。なお、以下
において色の記載は、日本色彩研究所の色名帖（新寿堂
）によったものである。

工、形態学的性質 本菌株は各種培地上で気菌糸を形成し、菌糸は分校する
。胞子のうは形成しない。胞子に運動性はない。気菌糸
上に成熟した胞子の色は黄色で、その胞子鎖は真直ぐか
らやや曲っている（　ＲｅｃｊｕＳＦｌｅｘｉｂｉｌｉ
ｓｋ：　ＪｊＱする）。胞子は円筒形（２〜３μｘ０．
８〜１．２μ）で胞子鎖中に２０個ないしそれ以上形成
される。胞子の表面は平滑である。

また、本菌株の著しい特徴は、ペンネット培地／２８℃
／１４日間培養でピクニディウムを作ることである。

■、各種培地上の性状 １　しよ糖・硝酸塩寒天培地 生育：よく胞子形成する。コロニー表面はクリーム色を
呈する。裏面は錆赤色。

２　グルコースのアスパラギン寒天培地生育：非常によ
く胞子形成する。コロニー表面は肉色、川面は紅色。

３　グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：胞子形成
するが、コロニーはあまり店からない。淡黄色コロニー
、裏面は鮭 稗・ ４　殿粉・無ｉ塩寒天培地 生育：よく胞子形成する。コロニー表面は淡黄色、裏面
は灰桃色。

５　チロシン・寒天培地 生育：胞子形成は少ないが、気菌糸は形成する。コロニ
ーはシワ状にはならない。

表面は白色から淡黄色、裏面は鈍赤黄 橙色である。

可溶性色素：なし ６　栄養寒天培地 生育：黄色の基生菌糸上に白色の気菌糸が広がる。胞子
形成はあまり良くない。裏 面は黄橙色。

７　イースト・麦芽寒天培地 生育：シワ状に生育し、反り返った状態とな　　　　−
る。コロニー表面は肌色から淡黄色、 表面は鈍赤黄橙色である。

８　オートミール・寒天培地 生育：シワ状には生育しない。コロニー表面は白色から
淡黄色、裏面は淡黄色であ る。

９　ペプトン・イースト鉄培地 生育：シワ状に生育するが気菌糸をほとんど形成せず、
胞子形成もしない。コロニ ー、表面は淡橙喝色で裏面も同色である。

■、在連理的性 質　生育温度範囲＝２０〜３７℃。最適生育温度は２８
℃。３７℃ではあまり 良くない ２　ゼラチンの液化：陽性 ３　殿粉の加水分解：陽性 ４　ミルクに対する作用：生育しない ５　メラニン様色素の生成：陰性 ■、炭素源の資化性 プリドハム・ゴツトリープ寒天培地に培養して調べた結
果は、下記のとおりである。

生　　育１ Ｌ−アラビノース　　　＋ Ｄ−キシロース　　＋ Ｄ−グリコース　　＋ Ｄ−７ラクトース　　　＋ シュークロース　　　＋ １−イノシトール　　　＋ Ｌ−ラムノース　　− ラフィノース　　− Ｄ−マンニトール　　　＋ 無添加　　　　　　　　− ＊　十生育する、−生育しない ■、同定 以上の諸性質からＷＡＫ−８３株はストレプトミセス属
に属するものと考えられ、胞子鎖が直線状からややカー
ブし、気菌糸が白色しない黄色で、胞子表面が平滑で可
溶性色素を生産しないことから、バーシーズ・マニュア
ル・オブ・デイターミネイティブ・バクテリオロジー第
８版（１９７５年）の中から検索すると、イエロシリー
ズの４６菌種が該当する。しかし、４６菌種の中には本
菌種の著しい特徴の一つであるビクニデイウムを形成す
るものはなく、従って本国は４６菌種とは異なる。ビク
ニディウムを形成する菌種を、バーシーズ・マニュアル
・オブ・デイターミネイティブ・バクイリオロジー第８
版（１９７５年）、シャーリング及びゴツトリーブのＩ
ＳＰ菌株、ならびにワックスマン著「ザ、アクチノマイ
セテス」に記載の既知菌株の中から検索すると、ストレ
プトマイセス・シンデネンシス（ＩＳＰ５２５５）の１
株のみがあげられる。しかし、ストレプトマイセス・シ
ンデネンシスはピンク色のピクニデイウムを形成するが
ＷＡＫ−８３株は淡黄色のビクニディウムを作ることか
ら、両者は全く異なる菌種である。

これらの結果から、本菌株に該当する既知菌株は存在せ
ず、本菌株は新菌種であると認められ、本発明者らはこ
れをストレプトマイセス・Ｓｐ。

Ｎｏ、ＷＡＫ−８３と命名した。

微生物の培養 本菌株の培養には、通常の放線菌の培養方法が用いられ
る。培養基の炭素源としては種々のものが用いられるが
、例えばブドウ糖、殿粉、果糖、グリセリン、マンニト
ール、などを単独でまたは組み合せて用いることができ
る。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム、大豆粉、酵母エキス、ペプトン
、肉エキス、力１ＦミノＭなどが単独でまたは組み合せ
て用いられる。

その他必要に応じて無機塩、例えば食塩、硝酸塩、炭酸
カルシウム、塩化カリウム、塩化コバルト、硫酸鉄など
、ならびに微量の重金属を添加することができる。更に
、菌の発育を助けて主チナーげの生産を促進する有機物
質を適宜に添加することができる。

培養方法としては、固体培地上での培養も可能であるが
、一般酵素生産の方法と同様に液体培養を用いることが
好ましい。培養は好気的条件下で行われ、培養温度は一
般に２０〜３０℃であって、２８℃付近が好ましい。

キヂナーぜの生産は、たとえばタンク培養によって行な
うことができる。その場合は、２〜４日間培養を行うと
キチナーゼが培養液中に生産蓄積される。３８ｆ！ｉ液
中の生産ｍが最大に達した時点で培養を停止し、培養物
から目的のキチナーゼを単離精製する。得られた培養液
を遠心分離かるか、濾過助剤を加えて濾過すれば、粗酵
素液が得られる。

得られた培養液を遠心分離、濾過等に付して菌体を分離
して得られる培養液は、そのまま粗酵素液として使用す
ることもできるが、濾液を濃縮してアセトン、エタノー
ルなどの有礪溶剤を加えて沈降させるか、硫安などの塩
析剤で沈澱させるなどして、強力な活性を有する粗酵素
剤を得ることができる。このようにして得られる粗酵素
剤は、公知の方法によって精製結晶化して精製酸素とす
ることができる。

生産される酵素 上記のようにして得られる粗酵素剤は、下記の性質を有
する。

（１）作用および基質特異性 粉末キチン、キチンフレーク、コロイダルチキン、エチ
レングリコールキチン等に作用し、これを分解させて、
Ｎ−アセチルグルコサミンを生成する。後記第１表をも
参照されたい。

（２）至適１）　ｌ−１および安定性 ３７℃における至適ＤＨは５．５〜６．０である。また
、この酵素はｐＨ３，５〜８．０の範囲で安定である。

（３）最適作用温度および安定性 ｐｌ−（５，５／３時間反応で至適作用温度は３７℃で
あった。また、３０℃以下では２４時間以上安定であっ
た。

（４）精製 粗酵素剤中の夾雑物質はキチンカラムによる吸着クロマ
トグラフィー、および通常のイオン交換クロマ１−グラ
フィー、バイオゲルによるゲル濾過等により除くことが
でき、それによって高度に精製された酵素剤を得ること
ができる。

本発明により生産されるキチナーゼはキチン粉末に対し
て従来の酵素より一層よく作用する特徴がある。例えば
市販されているシグマ社製キチナーゼは４８時間の反応
でゆっくり還元糖を生成するが、本酵素では３時間の反
応上回等ｍの還元糖を生成することができる。第１表は
、本発明により得られるキチナーゼの種々の基質に対す
る活性を示すものである。なお、活性の測定は、エチレ
ングリコールキチンについてはツカモト等の方法（アグ
リ力ルチャ・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
４８巻、第９３１ページ、１９８４年）に準じて行い、
粉末キチンおよびキチンゲルは１％入れたものを基質と
した。酵素活性は、次に示すような酵素反応によるＮ−
アセチルグルコサミンの増加を測定する方法（例えば、
モルガン・エルラン法など）で測定した。１％粉末キチ
ン（牛丼化学製）ｌｒｎｌを基質とし、これに適当濃度
の酵素液１−を加え、更に０．０２５Ｍリン酸−酢酸緩
衝液ｐＨ５，５を３＃ｔｉ！加え、３７℃で３時間反応
させた。この条件で１分間に１μｍｏｌのＮ−アセチル
グルコサミンを生成する酵素ｍを１単位とした。

第１表 二１：平野らの方法により調製した（［バイＡ−ボリマ
ーズ」第１５巻、第１６８５ページ、１９７６年） 表から明らかなように本発明により生成するキチナーＵ
はエチレングリコールキチンとキチンゲルをよく分解す
る。

実験例 実施例 ストレプトマイセス ペンネット培地スラント上で２８℃で４０間培養し、２
．５ｄの殺菌水をスラントに加えて胞子懸濁液を作る。

その２．　５Ｉｄ．を１０ＣＭ！で５００蔵容のフラス
コの次の組成の培地に接種し、温度２８℃で３日間往復
振盪培養した。

培地組成 酵母エキス　　　　　３．（１／リツトルポリペプトン
　　　　３．０ｇ／リットルグルコース　　　　　２．
（１／リツトルコロイダルキチン　　４．０ｇ／リット
ルこの培養液を遠心分離して残漬を除去して得られる粗
酵素液は、キチン粉末に対して１．１２１＋１Ｕ／Ｉｄ
の酵素活性を示した。

Ｌ煮上 コロイダルキチンのｗＪ製法は、下記の通りである。

１００ｍ！の蒸密水に４ｇの粉末キチンを加えたものと
、別に濃硫ｍ１ｏｏＩＲ１とを用意し、それぞれ水中で
３時間あらかじめ冷やしておく、、３時間後、両方をゆ
っくり混ぜ合わせる。ロー斗の中にグラスウールをつめ
たもので濾過する。ン濾過したものを１８０ｄの蒸留水
に加える。そののち、３０００　ｒｐｍで遠心し、残渣
に蒸留水を加えて再び遠心する。この操作を繰り返し、
洗浄液がＤＨ６になるまで繰り返す。

【図面の簡単な説明】

第１図【Ｊ本国ストレプトマイセス、ｓｐ。 ＷＡＫ−８３の胞子の透過型電子顕微鏡写真、第２図は
本国によって作られるピクニディウムの光学顕微鏡写真
、第３図は本国の胞子鎖の光学顕微鏡、第４図は生産さ
れた酵素の至適ｐ　Ｈ１第５図は作用至適温度、第６図
は安定温度範囲をそれぞれ示したグラフである。 出願人代理人　　猪　　股　　　　清 第１図　　　　　　　第２図 第３図 第４図 第ろ図 多８１　度　Ｃ０Ｇン 第６図 温度（℃ 手続補正書 昭和５９年９　月どρ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス属のＷＡＫ−８３株が属する種
   の、キチナーゼ生産能を有するストレプトマイセス属新
   種の微生物。 ２、微生物がストレプトマイセス・ｓｐ・ ＷＡＫ−８３株である、特許請求の範囲第１項記載の微
   生物。